AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACIÓN DEL TRICHODERMA COMO

AGENTE DE BIOCONTROL DE MICROORGANISMOS QUE ATACAN A CULTIVOS DE

TOMATE RIÑON.

1. INTRODUCCION

La mayoría de las enfermedades de plantas provocadas por microorganismos fúngicos y

bacterias, generalmente se controlan con una amplia variedad de fertilizantes y fungicidas
químicos, los cuales se aplican al suelo, semillas, follaje y fruto. El control biológico
involucra microorganismos cuya actividad biológica disminuye el daño causado por los
patógenos de las plantas.

El tomate riñón, una fuente valiosa de vitaminas y sales minerales se cultiva en casi todo
el mundo, su nivel de consumo es alrededor del 48.43%.
La producción en el Ecuador de tomate riñón en el 2005 fue de 58778 has, las plagas
destruyen anualmente cerca del 35% de las cosechas, con una pérdida económica de
USD 315.

El género Trichoderma es un hongo anaeróbico facultativo, habitante natural del suelo de

pH 6-7, que contiene materia orgánica mayor al 2%; tiene la capacidad de sobrevivir en el
habitad donde es cultivado el tomate, en climas cálidos, templados de 24ºC - 25ºC y
50% - 60% de humedad.

El interés que tiene este hongo como agente de biocontrol, es la producción de

metabolitos secundarios, como enzimas líticas y sustancias supresoras de crecimiento,
que en combinación con pequeñas cantidades de antibióticos y en contacto con hifas del
hongo huésped, inhiben su germinación y la elongación de su tubo germinal.

El problema se desata en la compra y aplicación excesiva de agroquímicos en el control

fitosanitario, que además de causar serios disturbios al medio ambiente y a la salud de los
consumidores y de los mismos productores, corresponde a un alto porcentaje de los
costos de producción, por lo que es necesario reducir su uso desarrollando sistemas de
agricultura orgánica y tecnologías que permitan de forma fácil, económica y efectiva
obtener biofertilizantes, con la calidad y cantidad suficiente para su aplicación masiva en
áreas de cultivo.

Además en el país se requiere innovar nuevas tecnologías para mejorar la producción, ya

que esta tiene un costo de USD 900 por tonelada métrica, en apenas 88.933
kilogramos/hectárea frente 252.688 kilogramos/hectárea que constituye la media del
Continente Americano.

En Cuba a partir de 1990 se iniciaron estudios para el biocontrol de hongos en los suelos
de hortalizas, obteniendo así aislamientos del Trichoderma que fueron seleccionados por
su capacidad hiperparásita.

Con el biocontrol se busca la regulación de la abundancia de organismos indeseables a

través de la autodefensa y la competencia de la planta con organismos patógenos y su
tasa de producción sana.
2. MARCO TEORICO

2.1 CARACTERÍSTICAS DEL TOMATE RIÑÓN

Las enfermedades del tomate se producen por varios microorganismos, para reducir este
problema se utilizan organismos biocontroladores de enfermedades como Trichoderma. El
tomate tiene nutrientes que ayudan a que estos hongos crezcan; su composición química
promedio es la siguiente:

Tabla 1. Composición Química del Tomate por cada 100g de Tomate Fresco

ELEMENTO CANTIDAD
Agua 93.5 %
Proteína 0.9 g
Grasa 0.1 g
Carbohidratos 3.3 g
Fibra 0.8 g
Fósforo 19 mg
Calcio 7 mg
Hierro 0.7 mg
Vitaminas A, B1, B2 1.2 mg
Vitamina C 20 mg
Niacina 0.6mg
Fuente: California Tomato Board, U.S.
Departament of Agriculture, 2000

2.2 CARACTERISTICAS DEL MICROORGANISMO ANTAGONISTA

Tabla 2. Metabolitos y Necesidades Mínimas del Trichoderma para Producción de Biomasa

Grupo Trófico Quimioheterótrofa

Fuente de Carbono Peptona
Fuente de Energía Dextrosa
Donador de electrones Dextrosa
Aceptor de electrones Oxígeno
Fuente de Nitrógeno Peptona

Estos hongos antagonistas actúan mediante la ruptura de paredes hifales del hongo
fitoparásito, penetrando sus hifas y aprovechando sus nutrientes. Produce toxinas como
tricodermin y harzianopeiridona causando antagonismo por fungistasis y también
produciendo enzimas líticas que destruyen las paredes celulares de los esclerocios o
estructuras de resistencia del hongo.
El Trichoderma ha desarrollado mecanismos para atacar y parasitar a otros hongos y así,
aprovechar una fuente nutricional adicional. Las formas de acción de trichoderma como
biocontrolador son:
1. Micoparasitismo y Antibiosis
2. Competición por nutrientes y espacio
3. Desactivación de las enzimas de los patógenos
4. Tolerancia al estrés por parte de la planta, al ayudar al desarrollo del sistema radicular.
5. Solubilización y absorción de nutrientes inorgánicos
6. Resistencia inducida
3. MARCO METODOLOGICO

3.1 DISEÑO DEL MEDIO

Todos los medios de cultivo utilizados contienen los nutrientes suficientes para asegurar
el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc). Un medio
de cultivo frecuente, utilizado para el cultivo de hongos y levaduras contiene agar
Dextrosa y peptonas.
Los seres heterótrofos, toman la glucosa de otros seres vivos o la sintetizan a partir de
otros compuestos orgánicos. Otra posibilidad es la síntesis de glucosa a partir de
moléculas no glucosídicas, proceso conocido como gluconeogénesis. Este azúcar simple
es derivable de la conversión de almidón.
La alta concentración de dextrosa y el pH ligeramente ácido del medio, facilita el
crecimiento de los hongos patógenos e inhibe el desarrollo de otros microorganismos.

Las peptonas son productos solubles en agua, que se obtiene por hidrólisis
particularmente de una proteína o varias proteínas. Este material contiene una mezcla de
aminoácidos libres, péptidos y proteosas que se mantienen en la solución después de
calentarlas a 100º C. La presencia de metales alcalinos o fosfatos puede causar la
precipitación de la peptona a un pH neutral. Por ésta razón las peptonas producidas a un
pH neutro se utilizan para las fórmulas de los medios.

En general las proteínas empleadas en la producción de peptonas son de dos tipos,

proteínas animales (caseína, gelatina, carne) y proteínas vegetales (cáscaras de tomate).
Las peptonas se obtienen a través de varios tipos de procesos de digestión como ácido,
alcalino y enzimático.

Con la adición de antibióticos antibacterianos (cloranfenicol o gentamicina), se logra la

inhibición de bacterias saprofitas.

Un nuevo medio de cultivo se prepara con cáscara de tomate como base; en este medio
las peptonas proveen la fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento de los
microorganismos, la dextrosa actúa como fuente de energía y el agar es agregado como
agente solidificante.

Tabla 3. Características del medio diseñado

FUENTE COMPUESTO CANTIDAD

Fuente de C Extracto de cáscaras de

500 ml
tomate (Peptonas)
Fuente de N

Fuente de Energía Dextrosa 10 g

Agar-Agar Agente solidificante 17.0

Agua Agua destilada 1000 ml

pH ≈ 7.2
3.1.1 AGAR JUGO DE TOMATE

COMPOSICION

Jugo de tomate 20g/l

Agar-agar 10g/l
Dextrosa 10g/l
Medio minimal 1.5g/l

PREPARACION

Suspender 41.23g en un litro de agua destilada hervir hasta disolver completamente y

llevar al autoclave a 121oC.

3.2 METODOS DE AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACION DE LAS CEPAS

DE TRICHODERMA

3.2.1 MUESTREO

Las muestras deben ser representativas, se toman aleatoriamente del perfil del suelo
aledaño a la base de las plantas de tomate, de 0 a 40 cm de profundidad.

Se toman también muestras de raíces, tallos, hojas y frutos de la plantan, tanto en mal
como en buen estado.

3.2.2 AISLAMIENTO

Pesar 10g del suelo y disolver en 90ml de peptona estéril, realizar diluciones de
10-1 hasta 10-8.
Sembrar por duplicado en cajas estériles en medio PDA, incubar por 7 dias a
27oC.
Identificar los microorganismos según los parámetros establecidos en el Manual
de Bergey.
Seleccionar la mejor cepa.

3.2.3 SELECCIÓN

PRUEBAS DE ENFRENTAMIENTO

Realizar un cultivo dual en cajas con medio PDA + gentamicina (0.5%).

Colocar discos de 4mm de diámetro de trichoderma vs. Patógenos a una distancia
de 7cm
Controlar el crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos durante 7
dias a 27oC.
Realizar el control biológico de los cultivos duales:

En un extremo de la placa de petri con Agar Dextrosa de pH 5,5, se coloca un

disco de agar de 4 mm de diámetro con micelio del patógeno y en el extremo
opuesto otro disco de 4 mm con micelio del antagonista a 5 cm aproximadamente
 entre ellos; el cultivo se incuba a 25±1 ºC durante 5 días, haciéndose mediciones
cada 24 h del crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos.

El antagonismo se comprueba por la competencia de nutrientes y espacio, se

valora comparando las variables en la velocidad del crecimiento, por medio de:

Radio de Crecimiento Antagonista (RCA) y Radio de Crecimiento Patógeno

(RCP): midiendo los radios con un calibrador o pie de rey.

Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR): se medirá empleando

la fórmula PICR = (R1 – R2)/R1 x 100 donde R1 es el radio del patógeno
testigo y R2 es el radio del patógeno en enfrentamiento.

Micoparasitismo (MICMO): se realizan observaciones macroscópicas de los

cultivos duales, tomándose como índice de micoparasitismo, la invasión del
antagonista sobre la superficie del micelio patógeno, teniéndose en cuenta la
escala siguiente:

Esporulación de antagonista sobre patógeno1

Grado Capacidad antagónica
0 Ninguna invasión de la superficie de la colonia del hongo patógeno
1 Invasión de ¼ de la superficie de la colonia del hongo patógeno
2 Invasión de ½ de la superficie de la colonia hongo patógeno
3 Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno.
Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno
4
esporulación sobre ella.

Se comprueba micoparasitismo, por medio un microscopio binocular, con aumento

de 100x, donde se analizan las interacciones de las hifas antagonistas con las del
patógeno, ya sea por enrollamiento o por penetración.

Observar y elegir la cepa con la mejor capacidad antagonista.

3.2.4 PRESERVACION

Inocular la cepa en agua de peptona a 30oC por 3 días a 180rpm.

Sembrar en PDA e incubar 7 días a 27oC.
Realizar discos de 4mm aproximadamente, colocarlos en un criovial que contiene
un agente crioprotector (20%glicerol).
Congelar a -18 oC.

1
Elías y Arcos (1984) citada en Ezziyyani et al. (2004)