PRCTICA N 1

TCNICAS DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

I.
OBJETIVOS:
Determinacin y diferenciacin de un mtodo quimico continuo y discontinuo
Descripcin de las tcnicas ms comunes para determinar actividad enzimtica y ejecucin de
algunas de ellas.
determinacin de la actividad enzimtica en diferentes mtodos
II.
INTRODUCCIN
Las tcnicas que permiten seguir el curso de una reaccin enzimtica pueden ser de dos tipos: discontinuas y
continuas; en el primer tipo, las observaciones no se hacen directamente en la mezcla de reaccin sino en
alcuotas tomadas a diferentes tiempos, lo que nos proporciona un nmero dado de puntos por separado.
Otra alternativa ms frecuentemente utilizada es la determinacin de la reaccin a un tiempo determinado,
lo que nos permite el anlisis puntual de los productos formados en ese tiempo. En este caso, para seguir el
curso de la reaccin en el tiempo, se requiere de la preparacin de mezclas de incubacin por separado, en
las que se detiene la reaccin a tiempos diferentes, para as poder construir la curva cintica.
Usualmente se requiere de por lo menos tres puntos para la determinacin de la velocidad; uno a tiempo
cero, el segundo despus de un intervalo de tiempo adecuado y el tercero despus de aproximadamente
dos veces ese tiempo; esto permite chequear la linealidad de la curva en el intervalo de tiempo
seleccionado. Las tcnicas discontinuas usualmente consisten en estimaciones qumicas del sustrato o del
producto de la reaccin.
En las tcnicas continuas por el contrario, las observaciones se realizan en la mezcla, mientras ocurre la
reaccin, de modo que haciendo un nmero largo de lecturas o mediante un registro automtico, se pueden
trazar u obtener directamente las curvas cinticas.
La mayora de las tcnicas utilizadas para seguir las reacciones enzimticas son de tipo continuo y son
preferibles mientras sea posible. Con este tipo de tcnicas solo es necesario tomar un nmero suficiente de
lecturas para estar seguros de que se ha obtenido una lnea recta. En muchos casos se puede utilizar un
registrador automtico en cuyo caso, la velocidad es la pendiente del trazado obtenido. En otros casos, el
instrumento puede brindarnos directamente la velocidad.
Existen muchas tcnicas para determinar la actividad de una enzima, algunas de las cuales pasaremos a
definir a continuacin:
1) Tcnicas Espectrofotomtricas
Si el sustrato o el producto absorben luz a una longitud de onda determinada, la reaccin puede ser
monitoreada siguiendo los cambios en la absorbancia a esa longitud de onda, esto es respaldado
por la ley de Lambert y Beer:
A=.c.l
Esto es generalmente verdadero para cualquier longitud de onda de luz visible (rango 400 700
nm) o ultravioleta cercano (de 200 a 400 nm).
Las determinaciones de velocidad deben hacerse preferiblemente, a partir de procedimientos
donde la absorbancia aumente en el tiempo y no a la inversa, debido a que en las etapas
tempranas, que son las mas cruciales de la reaccin, se opera en la parte ms sensible de la escala
de absorbancia (las de menor valor). Se prefieren instrumento de lectura directa, acoplados a
registradores automticos que permiten seguir el curso de la reaccin grficamente.
Existen dos problemas principales en los mtodos espectrofotomtricos; en primer lugar, solo
pueden ser utilizados satisfactoriamente en las zonas de bajas absorbancias; valores altos, adems
de reducir la sensibilidad, producen desviaciones de la ley de Lambert y Beer debido a interacciones
de las molculas de soluto en soluciones concentradas. En segundo lugar, se pueden introducir

errores cuando hay un valor de absorbancia de fondo alto, o cuando la muestra contiene material
en suspensin.
Las tcnicas espectrofotomtricas son ampliamente utilizadas para seguir el curso de una reaccin
enzimtica y son preferidas a cualquier otra tcnica por su sencillez, simplicidad y sensibilidad. Un
ejemplo clsico son las enzimas de xido-reduccin que utilizan como cofactor al NAD+, donde se
aprovecha la propiedad que tiene esta sustancia en su forma reducida (NADH), de absorber
selectivamente luz a una longitud de onda de 340nm.
2) Tcnicas Fluorimtricas
Los compuestos fluorescentes son aquellos que absorben la luz a una longitud de onda
determinada y luego emiten luz de una longitud de onda mayor. En general la fluorimetra es varias
veces (unas 100 veces) ms sensible que la espectrofotometra; sin embargo, los efectos de
fluorescencia varan con la temperatura, por lo que es muy importante controlarla.
Los coenzimas NADH y NADPH tienen la propiedad de fluorescencia, absorbiendo luz a 340 nm y
emitindola a 460 nm; por consiguiente, las reacciones que utilizan estos coenzimas, pueden ser
seguidas a travs de estas tcnicas. Se utilizan ampliamente en el estudio de reacciones de
hidrlisis, empleando sustratos sintticos no fluorescentes, los cuales son esteres de alcoholes o
aminas altamente fluorescentes. Por ejemplo, la enzima triacilglicerol lipasa puede ser monitoreada
por la siguiente reaccin:
lipasa
dibutiril fluorescena
fluorescena
en esta reaccin el producto es fluorescente
Es importante indicar que tanto tirosina como triptfano fluorescen a 330-350 nm; si se tiene en
cuenta que estos aminocidos estn presentes en las enzimas, estos producen un alto fondo de
emisin en la regin UV. Por esta razn es que es aconsejable restringir el uso de fluorimetra en los
anlisis enzimticos a la deteccin de sustancias que emiten luz en la regin visible.
3)

Tcnicas Electroqumicas
Muchas reacciones enzimticas involucran la produccin de un cido o base a partir de un
compuesto neutral (o viceversa), por lo que el curso de esas reacciones puede ser seguido
mediante el cambio del pH, a medida que la reaccin procede. Sin embargo existe un problema, el
cambio del pH puede producir la inactivacin de la enzima, adems, el efecto amortiguador que
tiene la misma enzima, (por ser una protena), y/o el del buffer empleado, pueden influir en los
cambios antes mencionados.

La mejor forma de monitorear el curso de estas reacciones es mediante el uso de un pH-stat; este
equipo consiste en un pH metro acoplado a una jeringuilla automtica que acta como bureta, y un
circuito para desconectar el motor de la bureta, cuando el pH de la mezcla de reaccin se
encuentra en el valor original fijado. A medida que la reaccin procede y el pH de la misma empieza
a cambiar, se conecta el motor que fuerza el lcali (o el cido) de la bureta a la celda de reaccin (la
cual se mantiene en constante agitacin), para recobrar el valor original de pH.
Un registrador automtico acoplado a este instrumento permite obtener el grfico de la cantidad
de lcali o cido aadida en relacin con el tiempo de reaccin. De este modo el pH se mantiene
aproximadamente constante y la cantidad de lcali (o cido) requerida para esto, es una medida de
la velocidad de reaccin. Este tipo de tcnica se usa ampliamente para monitorear la hidrlisis de
esteres.
4) Tcnicas Radioqumicas:
La utilizacin de sustratos radiactivos permite el uso de tcnicas radioqumicas. Los istopos mas
frecuentemente usados con propsito de marcaje son hidrgeno-3 (tritio), carbono-14, fsforo-32,
azufre-35 y yodo-131. Todos estos istopos emiten radiacin beta (electrones) durante su
desintegracin.

Para la utilizacin de estas tcnicas se requiere que la reaccin proceda durante un tiempo fijo,
posteriormente el sustrato se separa del producto por tcnicas cromatogrficas o electroforesis y la
concentracin del producto se determina indirectamente por medicin de la radioactividad de la
fraccin de producto.
32
131
Las emisiones beta de alta energa P o I) pueden ser detectadas directamente con un contador
3
14
35
Geiger-Mller, mientras que las emisiones de baja energa ( H, C, S) son usualmente
monitoreadas por un contador de centelleo lquido.
Un ejemplo tpico de anlisis enzimtico con este procedimiento es la medicin de la actividad de
colinesterasa, utilizando acetil colina marcada con carbono 14:
14

14

CH3-COO-CH2-CH2N (CH3)3
CH3-COOH + HO-CH2-CH2N+(CH3)3
Acetilcolina
cido actico
colina
Despus de la incubacin, el sustrato que no reaccion y la colina deben ser eliminados en una
resina de intercambio inico y se determina la radioactividad de la fraccin de cido actico.
Los procedimientos radioqumicos son extremadamente sensibles pero tienen algunas desventajas,
la peligrosidad en la manipulacin de radioistopos y las etapas de separacin que deben
realizarse.
5) Tcnicas microcalorimtricas:
La microcalorimetria en el anlisis enzimtico est ganando cada vez mas importancia por su
sensibilidad, ausencia de interferencias y sus posibilidades casi universales de aplicacin.
En la mayora de las reacciones, se gana o se pierde calor (entalpa), a medida que la reaccin
procede. En microcalorimetra la reaccin se lleva a cabo bajo condiciones controladas en un
calormetro y se monitorea el cambio de temperatura; estos cambios son muy pequeos, del orden
de 0,01 a 0,0001C, por lo que se requiere del uso de termostatos de alta precisin, conjuntamente
con sensores de temperatura muy sensibles.
Pueden ser utilizadas reacciones secundarias con el buffer para incrementar la seal y as aumentar
la sensibilidad del procedimiento. Por ejemplo, un protn producido por la reaccin primaria puede
ser atrapado por el buffer con produccin de calor; en este sentido el Tris es muy til debido a que
su calor de protonizacin es alto. La actividad de la hexoquinasa puede ser estimada de esta forma,
utilizando el buffer Tris a pH 8.
6)

Tcnicas qumicas:
Actualmente muchas reacciones enzimticas son seguidas con mtodos discontinuos, donde a
determinados intervalos de tiempo se requiere de la estimacin de la cantidad de sustrato o del
producto por tcnicas qumicas.
Un ejemplo clsico es la determinacin de proteasas frente a sustratos naturales cfomo
hemoglobina, casena, etc. Esta tcnica requiere de la adicin de cido tricloroactico a la mezcla
de reaccin despus de transcurrido un tiempo definido (que garantice el periodo de velocidad
inicial). Los filtrados o sobrenadantes que contienen los productos de la reaccin, solubles en TCA,
pueden ser estimados mediante su absorbancia a 280nm o la adicin, en medio alcalino, del
reactivo Folin Ciocalteau (se produce un complejo de color azul debido a la reaccin de los grupos
aromticos presentes en estos productos (Phe, Tyr y Trp) que absorben luz a una longitud de onda
entre 650 y 750 nm). En cualquiera de los dos casos, la actividad enzimtica puede expresarse en
trminos de micromoles de tirosina por unidad de tiempo.
En la presente prctica determinaremos la actividad de la enzima ureasa utilizando un mtodo
discontinuo y un mtodo continuo. La enzima empleada, cuyo nmero EC es 3.5.1.2, ha sido
purificada previamente a partir de semillas de frijol (Merck); la reaccin que cataliza es la siguiente:

NH2
O=C
+
2H2O

2NH3
+
H2CO3
NH2
Uno de los productos formados del amoniaco, a travs de una tcnica qumica, reacciona con el
reactivo de Nessler (K2HgI4) en medio alcalino, formando un complejo de color castao cuya
intensidad cumple con la ley de Lambert y Beer y puede ser evaluado en el espectrofotmetro
utilizando una longitud de onda de 420nm.
Asimismo, los dos productos de la reaccin se ionizan cuando esta se realiza en agua destilada,
+
=
formando amonio (NH4 ), bicarbonato (HCO3 ) y carbonato (CO3 ), cuyos pKs son respectivamente,
9,25, 6,35 y 10,25. Esto determina un aumento en la conductividad de la mezcla, la cual puede ser
evaluada con un conductmetro (tcnica electroqumica)
III.

PARTE EXPERIMENTAL:
EXPERIMENTO 1.DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA UTILIZANDO UNA TCNICA QUMICA
DISCONTINUA:

Objetivos:
Determinacin de la actividad de ureasa usando el mtodo discontinuo
Determinar como funciona el mtodo discontinuo
Materiales y mtodos:
Tubos de ensayo
Buffer fosfato 0.05M ph 7.4
Solucin de urea 0.3M
Solucin de ureasa
Reactivo de nessler

Equipos
Bao maria
Espectrofotmetro

Mtodo:
Quimico discontinuo

Procedimiento:

En un tubo de ensayo coloque 2,4 ml de buffer fosfato 0,05M pH 7,4 Adicione 0,4 ml de
solucin de urea 0,3M, mezcle bien y retire una alcuota de 0,2 ml a otro tubo de ensayo.
Preincube el tubo madre por 5 minutos como mnimo a 20C.
Sin retirar el tubo del bao mara, adicione 0,3 ml de una solucin de ureasa que contiene 5,0
mg de la enzima por ml., disuelta en buffer fosfato 0,05M pH 7,4 EDTA 0,05mM. Mezcle bien
y vuelva a incubar (ese instante constituye el tiempo cero).
Retire muestras de 0,2 ml cada 3 minutos (unas 5 muestras) y realice con ellas (as como con la
primera alcuota) una determinacin de amonio
Prepare 6 tubos de ensayo previamente, conteniendo cada uno de ellos 4,3 ml de agua
destilada y 0,5 ml de reactivo de Nessler. Enumrelos.
Recepcione en estos tubos los 0,2 ml que vaya retirando de la muestra de incubacin.
Mezcle bien y deje en reposo a temperatura ambiente por 10 minutos.
Cumplido el reposo, lea sus absorbancias en el espectrofotmetro a una de 420nm o en el
fotocolormetro usando filtro azul.
El tubo blanco lo constituye la primera alcuota

Resultados:
Tabla 1: mtodo discontinuo en la actividad enzimtica de la ureasa
N tubos
Tiempo de
incubacin
Absorbancia

Blanco
-

1
0 min.

2
2 min

3
4 min.

4
6 min.

5
8 min

6
10 min.

0.086

0.269

0.488

0.535

0.627

absorbancia

Grafica : tiempo de incubacin vs absorbancia

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

4
6
tiempo (min)

10

Discusin y conclusiones
Con este mtodo podemos observar que a medida que pasa el tiempo de incubacin la actividad de
la enzima crece eso lo comprobamos con el incremento de la absorbancia.
La variacin de la lnea es debido a que el mtodo usado no es preciso.
Anexos:

ureasa

Alcuotas de la
solucin de urea
con
la
enzima
ureasa
y
el
reactivo de nessler

EXPERIMENTO 2:
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR UNA TCNICA ELECTROQUMICA CONTINUA.Objetivos:
Determinacin de la actividad enzimtica de la ureasa por la tcnica electroqumica continua
Determinacin del orden de reaccin de la enzima
Materiales y mtodos
Ureasa
Solucin de urea 0.03M
Equipos
Agitador magntico
Conductmetro
Ph metro
Mtodo
Electroqumico continuo
Procedimiento:
En un beaker de 50 ml, coloque 30 ml de solucin de urea 0,03M.
Ponga el recipiente sobre un agitador magntico e introduzca en l, el electrodo de un
conductmetro, teniendo la precaucin de que no choque con el imn giratorio.
Asimismo, introduzca en el recipiente el electrodo de un pH metro; fije ambos electrodos con
soportes universales. Verifique que el imn del agitador no golpee a ninguno de los dos electrodos y
que el nivel del lquido dentro del beaker sea suficiente para una correcta medicin de la
conductividad y del pH; si no es as, puede agregar un poco de agua destilada.
Adicione en forma rpida y en plena agitacin, 10 mg de ureasa (pulverizada previamente en un
mortero); ese instante viene a ser el tiempo cero, determine en este, el pH y la conductancia. Se
trabaja a temperatura ambiente.
A partir del tiempo cero, mida pH y conductancia cada 30 segundos por unos 8 minutos.
Resultados:
Haga a continuacin una representacin del sistema empleado:

Figura 1: El sistema empleado est constituido por el pH metro, el agitador magntico y el conductmetro

Tabla 2: resultados del cambio de ph y conductancia despus de cada 30 segundos

Tiempo de incubacin ( en
segundos)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
360
390
420
450
480

Conductancia ( Siemens)

pH

12.9
32.9
45.7
56.8
67.0
76.5
85.5
95.1
104.2
112.7
120.7
128.8
136.7
144.5
152.2
159.8
164.3

6.09
8.22
8.39
8.47
8.52
8.55
8.60
8.62
8.65
8.67
8.70
8.73
8.73
8.75
8.76
8.80
8.78

Grafica2: tiempo de incubacin vs conductancia

conductacncia (
Siemens )

200
150
100
50

200
400
600
tiempo de incubacion
(segundos)

Grafica 3: tiempo de incubacin vs Ph

8.88
Ph

8.78
8.68
8.58
8.48
0

tiempo (min)

10

INTERROGANTES:
1.- Comente el resultado de la primera grfica y haga la discusin correspondiente
A medida que pasa el tiempo la absorbancia incrementa, en los primeros 4 minutos la reaccin es de primer
orden, los dos minutos seguidos nos muestra una reaccin de orden cero y finalizando observamos una
reaccin de primer orden nuevamente.
Este mtodo discontinuo presenta mayor error debido a que las reacciones no se dan en un mismo tiempo
ya que se toman alcuotas y por el error humano los volmenes no son iguales
2.- Comente el resultado de la segunda grfica y haga la discusin correspondiente
En la primera grafica podemos observar que a medida que el tiempo de incubacin incrementa la
conductancia.
La grafica nos muestra que la reaccin es de primer orden eso nos quiere decir que la velocidad de reaccin
depende de la concentracin del sustrato
3.- Comente el resultado de la tercera grfica y haga la discusin correspondiente
En la tercera grafica podemos observar el incremento de ph a medida que pasa el tiempo, hay un momento
en el cualse mantiene estable y otro en el cual decrece

4.- Cul seria el tiempo ms apropiado para determinar actividad enzimtica en cada uno de los mtodos
empleados?

Mtodo continuo
6 minutos ya que despus hay variacin de la actividad de la enzima por diversos factores
Mtodo discontinuo
4 minutos ya que la velocidad de reaccin de la enzima varia en las distintas alicuotas

5.- A medida que pasa ms el tiempo la reaccin deja de ser de primer orden. A que cree que se deba
esto?
A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada
enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones del
mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A medida que
se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad, en esta zona la
reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reaccin es
independiente de esta.
si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variamos la concentracin de substrato se obtiene
una curva hiperblica
Al principio un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de
reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a
disminuir; vemos que a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de
reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que
se obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (vm) de la reaccin
enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato [S], a la semivelocidad mxima
de reaccin ( v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o km, la cual es
una caracterstica para cada enzima. La inversa dekm, o 1/ km, mide aproximadamente la afinidad de la
enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de km, mayor ser la afinidad de la enzima por el
substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado
preferentemente por la enzima con mayor afinidad

7.- Qu ventajas muestra el mtodo continuo sobre el discontinuo?

La mayor ventaja que presenta el mtodo quimico continuo es que la medicin se hace en el mismo medio
En el metodo discontinuo no, ya que se tienen que sacar diferentes alcuotas y tratarlas con reactivos para la
deteccin del ion deseado

8.- Haga las reacciones qumicas de la ionizacin del amoniaco y del cido carbnico

Formacin del ion carbnico

H

Formacin del ion amonio

9.- Qu comentario le sugiere la variacin del pH durante el periodo de incubacin?

A medida que se liberan los iones habr variacin de ph y debido a que el EDTA captura iones eso tambin
interfiere en la variacin de Ph
10.- Determine los porcentajes de cada forma inica de los productos al pH promedio en el que se realiz
el experimento:

+:

NH4 67.61%
CO3H : 66.61%
2CO3 82.56%

11.- Existe un mtodo ms apropiado para determinar el amonio qumicamente y es utilizando el reactivo
de Berthelots, el cual forma un complejo de color azul cuya intensidad se mide a 546 nm de longitud de
onda. Averige al respecto.

El la reaccion de Berthelot el amonio reacciona con el hipoclorito dando cloramina que en

presencia de fenol y catalizado por el nitroprusiato producen un derivado indolfenolico de color
azul en medio alcalino, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de urea.y cuya absorvancia se
puede detectar espectrofotometricamente a 640 nm
La reaccin va as:

catalizador

Los anillos estn para sustituidos todo el tiempo, y el catalizador utilizado suele ser nitro
5
ferricianuro
potsico,
K2[Fe(CN) (NO)]

La concentracin de urea es directamente proporcional a la concentracin de amoniaco, que a su

vez es directamente proporcional al valor de absorbancia medido.
La reaccion de berthelot modificada presenta en su misma problemas de interferencia,
dependiendo de las condiciones de reaccion, puede detectarse la existencia de proporciones
variables de aminas primarias (aminoacidos) y urea. Este problema es mas evidente en las tecnicas
que utilizan temperaturas mas altas para el desarrollo de color.
El metodo de berthelot detecta amonio, que es destilado continuamente de la muestra. Este
metodo aunque esta libre de interferencias, requiere un circuito analitico grande y complicado.
Otro problema con los metodos basados en la reaccion de berthelot es el uso del fenol que es
toxico y volatil y la formacion del aun mas toxico o-clorofenol
Bibliografa
http://payala.mayo.uson.mx/Programa/cin%C3%A9tica.htm
http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cinetica.htm