AISLAMIENTO, SELECCION Y PRESERVACION DE

CEPAS FERMENTADORAS DE PAJA DE TRIGO

PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

INTEGRANTES:

• AGUIRRE PABLO

• ALMEIDA ALEXANDRA

• CUICHAN CRISTINA

• FLORES MIRYAN

• HUERTAS CATALINA
 NOVENO SEMESTRE
AISLAMIENTO, SELECCION Y PRESERVACION DE CEPAS FERMENTADORAS DE
PAJA DE TRIGO PARA PRODUCCIÓN DE BIOETANOL

1.- INTRODUCCION:
El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados
mayoritariamente en combustibles no renovables. De otro lado, el consumo global de
combustibles genera enormes cantidades de gases contaminantes que son liberados a la
atmósfera. Este tipo de contaminación ha causado cambios en el clima del planeta, por lo
que se ha convertido en una de las problemáticas de opinión pública. La única forma de
encarar esta problemática es mediante recursos energéticos renovables. Para ello, la
biotecnología ofrece múltiples alternativas tecnológicas. Una solución renovable está
representada en los materiales lignocelulósicos (paja de trigo) y los cultivos de plantas
ricas en energía.
En el mundo se llevan a cabo gran cantidad de estudios para desarrollar a gran escala la
producción de etanol a partir de biomasa lignocelulósica.
Se considera que la denominada biomasa lignocelulósica, que incluye residuos agrícolas,
forestales, así como residuos agroindustriales, de la industria de alimentos y de otras
industrias, comprende aproximadamente el 50% de la biomasa en el mundo, esta
biomasa es un recurso que puede ser procesado de diferentes formas para la obtención
de una gran variedad de productos además del EtOH, el metanol, hidrógeno y
electricidad.
El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol), el cual puede ser
utilizado como oxigenante de la gasolina, elevando su contenido en O 2, lo que permite
una mayor combustión de la misma disminuyendo las emisiones contaminantes.

2.- JUSTIFICACIÓN:
Este trabajo de investigación ve la necesidad de proyectarse para menguar la
contaminación del medio ambiente y el poco abastecimiento de combustibles.
La matriz energética en cuanto a tipos de combustible, proviene en una proporción
considerable de fuentes de energía renovables como el etanol originado por la
fermentación de glucosa proveniente de celulosa entre otros (VER ANEXO 1). El alcohol
es una fuente de bioenergía que no produce emisiones de gas, analizado desde el punto
de vista vital.
Los materiales lignocelulósicos a partir de la paja de trigo son un recurso relativamente
abundante y ubicado fuera de las cadenas alimenticias lo que los hace una materia prima
poco costosa para la fabricación de etanol industrial con un buen rendimiento (VER
ANEXO 2) y una alternativa a la quema de rastrojos dejados después de las cosechas de
cereales.
El trigo se cultiva prácticamente en todas las partes del mundo. Es el cultivo al que se le
dedica más proporción de tierras cultivables. Se calcula unas 230 millones de hectáreas
de superficie mundial destinada a este cultivo. El primer país productor del mundo es
Turquía que acoge más del 20 % de la producción mundial. En América, Estados Unidos
existe un 3 % de la producción mundial.
La proporción de emisiones de CO2 evitada a través del etanol, constituye,
aproximadamente, el 85% del total de emisiones. Esta sustitución equivale a la retirada de
la atmósfera de un promedio de 2036010 toneladas de CO2 al año.
Este trabajo beneficiará principalmente al sector público, ya que no se invertiría tanto en la
importación de combustibles y además se beneficiaría toda la población por la no
contaminación del medio ambiente.

3.- ANTECEDENTES:
La producción mundial de trigo totaliza 567 millones de toneladas, en el Ecuador en 2008
se cosechó 629.601 toneladas, con un desecho aproximado de 1500 toneladas, siendo en
mayor parte paja de trigo. La mayor producción de esta gramínea a nivel nacional se
concentra en la provincia de Pichincha y específicamente el 40% corresponde al cantón
Rumiñahui en los sectores de Rumipamba, Patichubamba y San Antonio.

PARÁMETROS DE BIOMASA DEL TRIGO EN EL ECUADOR EN EL AÑO 2008

TONELADAS
RUBRO %
METRICAS
PAJA 67.30 1295.73
TRIGO CON CASCARA SECO
32.70 629.65
Y LIMPIO
TOTAL BIOMASA 100 1925.38

La mayoría de esta paja se quema después de las cosechas de cereales. Las emisiones
de CO2 en América Latina se incrementaron por encima del promedio mundial. Las
emisiones por la quema alcanzan la mitad del promedio mundial.
Los procesos agrícolas comprenden el 54% de las emisiones de metano,
aproximadamente el 80% de las emisiones de óxido nitroso, y prácticamente todas las
emisiones de dióxido de carbono vinculadas a la utilización de la tierra.
Cerca de un tercio del calentamiento de la atmósfera y el cambio climático obedece a la
agricultura. En general se reconoce que gran parte el dióxido de carbono procede de la
agricultura, sobre todo de la deforestación y la quema de biomasa.

4.- PROBLEMA:
Los residuos que se generan de la cosecha de este cereal son acumulados en la
naturaleza ocasionando grandes problemas de contaminación ambiental ya que estos
desechos se los quema y la consecuente generación de CO2, así como la producción de
otros gases como el metano (CH4), monóxido de carbono (CO), dióxido de nitrógeno
(NO2) y otros gases si se convierten en emisiones netas a la atmósfera.
La agricultura es un sector primordial en la economía de la región; emplea una proporción
importante de la población económicamente activa. Un cambio climático afecta de forma
negativa a las regiones agrícolas de América Latina, especialmente en la América Latina
tropical, disminuyendo la cantidad de suelos disponibles para el cultivo debido a un riesgo
elevado de desertificación y la disminución del rendimiento debido a los cambios de los
patrones climáticos.

5.- OBJETIVOS:
Objetivo General:
• Aislar, seleccionar y preservar cepas fermentadoras de paja de trigo para la
producción de bioetanol.

Objetivos Específicos:
 • Recolectar sustratos (paja de trigo) de diferentes lugares que posean
características similares provenientes del cantón Rumiñahui.
• Diseñar el medio de cultivo más adecuado para el crecimiento óptimo de los
microorganismos productores de bioetanol a partir de paja de trigo.
• Establecer una selección de microorganismos mediante condiciones adecuadas
de: pH, concentración de nutrientes y temperatura; así como factores de
adaptación y selección más convenientes.
• Preservar las cepas seleccionadas con características biotecnológicas obtenidas al
final del bioproceso, mantenga las características biotecnológicas mediante la
técnica de crioconservación.

6.- MARCO TEORICO:

El etanol se produce típicamente a partir de melazas de caña de azúcar y del almidón
contenido en granos y cereales, o a partir de la celulosa; que es el componente principal
de las paredes de célula de las plantas y el compuesto orgánico más abundante en la
tierra.
Entre los constituyentes estructurales de la paja de trigo (VER ANEXO 3) se encuentra la
lignina esta no contiene azúcares, pero encierra a la celulosa y hemicelulosa que sí los
contienen.
Los materiales lignocelulósicos son los que ofrecen un mayor potencial para la producción
de bioetanol, el uso de residuos de procesos agrícolas, forestales o industriales, con alto
contenido en biomasa. Estos residuos pueden ser la paja de cereal o cáscaras de cereal o
de arroz.

Grupo Trófico:

• Fuente de Energía: química (quimiotrofo)

• Fuente de electrones: compuestos orgánicos (organotrofo)
• Fuente de Carbono: compuestos orgánicos (heterótrofo)

Cepas Quimioheterorganotrofas

Fórmula Maestra:

(C6H12O6)2n Hidrólisis
→ C6H12O6
ácida

C6H12O6 + 2NH3 Cepas fermentado ras

→ 2C2H6O + 2H2O + 2CHON + ATP

Par oxido reductor:

C6H12O6/ C2H6O = oxidaciòn

NH3 /CHON = reducción

7.- MARCO METODOLÓGICO:

Los residuos de biomasa contienen mezclas complejas de carbohidratos, llamados
celulosa, hemicelulosa y lignina. Para obtener los azúcares de la biomasa, ésta es tratada
con ácidos o enzimas que facilitan su obtención. La celulosa y hemicelulosa son
hidrolizadas por enzimas o diluidas por ácidos para obtener sacarosa, que es entonces
fermentada. Los principales métodos para extraer estos azúcares son tres: la hidrólisis
con ácidos concentrados, con ácidos diluidos y la hidrólisis enzimática.
La bioconversión de los materiales lignocelúlosico (paja de trigo), comprende tres etapas;
la primera es la obtención de una solución de azúcares fermentables derivados de
biomasa por medio de una hidrólisis ácida o enzimática y la segunda la conversión de
estos monómeros en el producto de interés comercial (fermentación de esos azúcares en
etanol), y la tercera la separación y purificación del etanol, generalmente por destilación.
La fabricación del bioetanol presenta las siguientes fases en el proceso:
• Dilución: Es la adición del agua para ajustar la cantidad de azúcar en la mezcla o
la cantidad de alcohol en el producto.

• Conversión: Es el proceso de convertir la celulosa en azúcares fermentables.

• Fermentación: La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por

las levaduras, básicamente (VER ANEXO 4).

• Destilación o Deshidratación: Es la operación de separar, mediante calor, los

diferentes componentes líquidos de una mezcla (etanol/agua) (VER ANEXO 5).

DISEÑO DE MEDIO DE CULTIVO PARA LA OBTENCIÓN DE CEPAS

FERMENTADORAS A PARTIR DE LA PAJA DE TRIGO

Pretratamiento:
Se obtiene por fermentación de la celulosa (previa hidrólisis de paja de trigo + H2SO4
concentrado 70 -77% una proporción de 1:25/por cada parte de biomasa), caracterizado
porque comprende las etapas de: selección de la cepa fermentadoras; preparar una
suspensión del microorganismos en un medio de cultivo, se toman alícuotas del
microorganismo y se siembran en tubos inclinados, se colocan los tubos en una
incubadora a 28 - 30°C durante 20 - 30 horas, propagación del inóculo, el cual se realiza a
partir de una siembra en cajas petri que contienen mezcla de agar-agar y medio YM, se
incuba por 72 horas a 28 - 30°C; se escogen las colonias productoras más grandes y se
siembra nuevamente; se hace suspensión; se inocula en forma estéril en un matraz de
propagación; simultáneamente a la paja de trigo se le somete a un tratamiento térmico-
ácido para disminuir el contenido de metales que lleva consigo, a una cantidad de paja; se
le agrega una cantidad equivalente de agua natural; se le agrega de 3 a 10 ml de ácido
sulfúrico concentrado; y se somete a calentamiento de 100 – 130°C durante un tiempo de
3 - 20 min; siembra del medio de producción que consiste en adicionar el inóculo
propagado al jarabe obtenido en el tratamiento térmico-ácido de la paja; fermentación del
medio de producción, que se lleva a cabo transfiriendo el inóculo de incubación en forma
estéril a un fermentador junto con el medio de producción obtenido en la etapa anterior
manteniendo una temperatura de 28 – 30°C con un pH de 6.5 - 7.5 durante un tiempo de
40 - 50 hrs; el producto de fermentación se somete a precipitación con una solución de
cloruro de potasio y alcohol isopropílico para llevar a cabo la recuperación; se seca a 40 -
65 grados C, obteniéndose un polisacárido (VER ANEXO 6).

Aislamiento, Selección e Identificación de cepas fermentadoras.

Los microorganismos se aislan de fuentes que se caracterizan por tener altos contenidos
de hemicelulosa y celulosa. Las levaduras aisladas se purifican por medio de repiques
sucesivos. Posteriormente se hace una selección entre las cepas que presentan mayor
potencial para metabolizar la celulosa. Para ello se emplea un medio mínimo selectivo
cuya composición en porcentaje p/v es:
 Componentes % p/v
Glucosa 1.5
(NH4)2SO4 0.5
KH2PO4 0.5
Agar-Agar 2.0
Microorganismos y preparación del inoculo:
Las levaduras se siembran en cajas de petri en medio Agar Sabouraud y se incuban por
24 horas a 35°C. Después de ese tiempo, se toma una asada del cultivo fresco y se
inocula en 100 ml del medio Sabouraud liquido, en matraces a 200 rpm por 24 horas a
35°C.

Conservación de los microorganismos

Existen varios métodos para la conservación de cepas de interés biotecnológico, la que
aplicaremos en el bioproceso será la crioconservación.

• Este es un método a largo plazo ya que:

• Suprime los procesos metabólicos de la célula y el crecimiento del sistema
biológico manteniendo la viabilidad.
• Sus ventajas más marcadas son que ahorran resiembras y evitan contaminación y
mutación al tratarse siempre de la primera generación inoculada.
• Las cepas se conservan por periodos ilimitados.
• Reducen espacio y costo de mantenimiento.

El líquido contenido en los crioviales esta especialmente formulado para asegurar la

supervivencia del mayor número de cepas durante largo tiempo y una recuperación
cuantitativa optimizada.

8.- FACTIBILIDAD:
El laboratorio es apto para la obtención de cepas fermentadoras a través del uso de
residuos agrícolas mediante procesos biotecnológicos haciendo posible la obtención de
productos con un valor agregado. En el Laboratorio se busca desarrollar metodologías y
técnicas de tratamiento de residuos lignocelulósicos, (por fermentación) para su
conversión efectiva en enzimas lignocelulolíticas. Para alcanzar estos objetivos, se
plantea llevar a cabo la caracterización química y física de los residuos vegetales
seleccionados, los cuales se escogerán con base en su disponibilidad y capacidad de
conversión y algo muy importante en base a su rendimiento. Se obtendrán cepas
fermentadoras, de las cuales no todas tendrán buenos resultados, para ello, se realizará
un seguimiento de las diferentes actividades enzimáticas involucradas, así como de la
biomasa celular formada, los polisacáridos sintetizados y los sustratos consumidos. Se
evaluará la capacidad de producción de azúcares fermentables por parte de las enzimas
producidas mediante la obtención de etanol por fermentación.

9.- BIBLIOGRAFIA:
• http://redalyc.uaemex.mx/pdf/304/30400802.pdf
• http://www.fuhem.es/media/ecosocial/File/Boletin%20ECOS/Boletin%201/dossier
%20agro%20combustibles/Art.Sastre%20et%20al._def.pdf
• http://www.bibliodigital.udec.cl/sdx/UDEC2/tesis/2006/maturana_c/doc/maturana_c
.pdf
• http://www.inaut.unsj.edu.ar/Files/1815_08.pdf
• www.creas.bligoo.com/.../Publicaciones_cientificas.html
 • www.plataformasinc.es/.../Los-expertos-estiman-en-500-las-revistas-cientificas-
espanolas-de-calidad -

ANEXOS
ANEXO 1:

Cantidad de etanol obtenible a partir de algunos productos

agrícolas primarios y secundarios*
L de etanol/T de Biomasa
Producto L etanol/ha
producto1 (T/ha)
Caña de azúcar 70 3500 9
Melaza 270
Yuca 180 2100 7
Sorgo azucarero
85 3000 5
(grano)
Camote 125 1900
Maíz (grano) 370 2400 3
Remolacha
3000 6
azucarera
Madera2 160 3200
Papa (tubérculo) 80 5000 5
(parte aérea) 250 1400
Residuos de poda 300 700 - 1200

ANEXO 2:
ANEXO 3:

Composición de la Paja de Trigo

Porcentaje en peso
Componente
(%)
Agua 15.0
Lignina 21.0
Celulosas 53.5
Cenizas 10.5

ANEXO 4: Los principales microorganismos productores de etanol

Bacterias Levaduras
Zymomonas mobilis. Saccharomyces cerevisiae.
Clostridium acetobutylicum Pichia stipitis
Klebsiella oxytoca Pachysolen tannophilus
Escherichia coli Candida shehate
 ANEXO 5:

MATERIA MATERIA
CELULOSICA LIGNOCELULOSICA

PREHIDRÓLISIS
Lignina
ACIDA
HIDRÓLISIS
FERMENTACIÓN
ENZIMÁTICA
BIOMASA
FERMENTACIÓ
LIGNOCELULÓSICA (paja
N
de trigo)
HIDRÓLISIS DESHIDRATACI ALMACENAMIENTO
DESTILACIÓN
ACIDA ÓN BIOETANOL

DETOXIFICACIÓN
Ilustración 1 Flujograma de producción de bioetanol a partir de
residuos Azúcar
celulósicos y lignocelulósicos
DEL HIDROLIZADO
FERMENTACIÓ
ALCOHOL
N
DESTILACIÓ
BIOETANOL
N
Aislamiento, selección
Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis,
Levadura unicelular e identificación de Anaerobio facultativo
cepas
ANEXO 6: Brillante
Utilidades Microorganismos y Bacilos gram (-).
s
preparación del Blancas
Invertas
inoculo Móviles (flagelo) o
a cremas
Etanol Medios y condiciones Borde
Colonias en medio
de producción de regular
Standar
No exigente bioetanol
nutricionalmente Roma
frutado
Otras características.
Osmotolerante
Oxidasa, Indol, NO3:
↑[Azúcar] Negativo

Tolera
Fermentación Glucosa
↑[Etanol]
Fructosa
Colonias
Sacarosa
Crema o
blanco

Húmedo y
brillante

Bordes
irregulares

Ilustración 2 Flujograma de Metodología y Caracterización de Cepas

Fermentadoras en la Paja de Trigo