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UMIVERDIDADE DE SAO PAULO

FACULDADE DE CIENCIAS FARMACEUTICAS


DEPARTAMENTO DE ANALISES CLNICAS E TOXICOLGICAS
LABORATORIO DE BIOLOGAI MOLECULAR ALPLICADA AO DIAGNSTICO

Apostila de noes de Biologia molecular

Prof. Dr. Mario H. Hirata


Profa. Dra Rosrio D. C., Hirata

1999

NDICE
Tpico

Pgina

Aula nmero 1:
Introduo ......................................................................................................................................... 2
Estrutura do DNA e RNA ....................................................................................................................... 2
Replicao, transcrio e traduo ....................................................................................................... 4
Organizao do genoma de eucariotos, procariotos e viral .................................................................. 7
Enzimas de restrio e suas aplicaes............................................................................................... 10
Aula nmero 2:
Extrao do DNA genmico ........................................................................................................... 13
Aula nmero 3:
Princpios de eletroforese...............................................................................................................
Fatores que influenciam na eletroforese ........................................................................................
Tipos de suporte.............................................................................................................................
Tipos de eletroforese .....................................................................................................................
Aplicaes da eletroforese nas tcnicas moleculares ...................................................................

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22
23

Aula nmero 4:
Reao de polimerizao em cadeia (PCR) ...................................................................................
Princpios da reao de PCR ...............................................................................................................
Protocolo geral para PCR .....................................................................................................................
Fatores que influenciam na PCR ..........................................................................................................
Escolha de iniciadores para PCR .........................................................................................................

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Aula nmero 5:
PCR no Diagnstico das Doenas genticas ..................................................................................
Polimorfismo e mutaes .....................................................................................................................
Diagnstico de alguns polimorfismos por PCR ....................................................................................
Polimorfismo de apolipoprotena ..........................................................................................................
Polimorfismo de receptores da LDL .....................................................................................................

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Aula nmero 6:
PCR no diagnstico de Doenas infecto-contagiosas ------------------------------------------------------- 46
Meningites bacterianas -------------------------------------------------------------------------------------------------- 47
Tuberculose ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 50
Infeco pelo virus da Hepatite C -------------------------------------------------------------------------------------- 59
Infeco pelo virus HIV --------------------------------------------------------------------------------------------------- 64
Aula nmero 7:
PCR e RFLP na identificao de indivduos .................................................................................... 68

APLICAO DA PCR EM LABORATRIO CLNICO E MEDICINA FORENSE


Aula nmero 1

Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata


Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

INTRODUO
Os avanos nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para

o entendimento da etiologia das doenas humanas. As tcnicas de recombinao dos cidos nucleicos tm
permitido aos pesquisadores identificar os vrios genes responsveis por doenas hereditrias, avaliar os
mecanismos de infeco dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciao e
proliferao celular (principalmente nos processos neoplsicos), entre outros. A biologia molecular vem
tambm apresentando aplicao bastante expressiva na pesquisa de marcadores genticos teis no
diagnstico laboratorial. Por outro lado, as diferenas nas sequncias do DNA, observadas entre as espcies
ou entre os indivduos, so extremamente teis para as anlises forenses, os testes de paternidade, a
identificao de antgenos de histo-compatibilidade, a identificao de allelos mutantes, a identificao de
gneros e espcies de bactrias, fungos, leveduras, vrus e outros.
Nesta apostila sero abordados os princpios bsicos de biologia molecular, bem como sero
descritas as aplicaes da tcnica de PCR no diagnstico clnico e nos testes de identificao.

ESTRUTURA DOS CIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA)


As informaes genticas so armazenadas nos cidos nucleicos.

H dois tipos de cidos

nucleicos: cido desoxiribonucleico (DNA) e cido ribonucleico (RNA). O DNA encontrado principalmente
nos cromossomos no ncleo das clulas, enquanto RNA est presente no citoplasma, havendo muito pouco
nos cromossomos.
Os cidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotdeos. Cada nucleotdeo constituido por
=

uma base nitrogenada, uma molcula de acar e um grupamento de fosfato (PO4 ). H dois tipos de
acar nos cidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas
so as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA
contm A, C, G e T, enquanto que o RNA contm U em vez de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotdeos
esto ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotdica. Essa cadeia formada por ligaes entre
o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotdeo e o carbono 3 do acar do nucleotdeo adjacente (Figura
1B).
Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotdica simples, enquanto que o DNA composto
de duas cadeias polinucleotdicas pareadas, dispostas em direo contraria, sendo denominadas
antiparalelas (Figura 1B). As ligaes covalentes do esqueleto de acar-fosfato localizam-se na parte
3

externa da estrutura e as bases nitrogenadas esto projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na
molcula de DNA segue uma sequncia em que cada base de uma cadeia pareada com outra base na
segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina
sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla
hlice, onde o ngulo e a distncia entre um nucleotdeo e outro sempre constante.

(A)

(B)
5 fosfato

CH 2OH
5

3 hidroxila
OH

OH

CH2

O
A

OH

2-deoxiribose

CH 2

P
P
CH 2

CH 2OH
5

OH

CH2
P

P
2

OH

CH2

OH

ribose

CH 2

P
P
CH 2

(C)

CH2
P

CH3

O H

H
N

N
(para a cadeia)

H N

N
N

OH

3 hidroxila

5 fosfato

(para a cadeia)

(para a cadeia)

(para a cadeia)

Timina

Adenina

Citosina

Guanina

Figura 1. Caractersticas estruturais das molculas dos cidos nucleicos. (A) Molcula do acar. (B)
Representao diagramtica do arranjo antiparalelo das duas cadeias polinucleotdicas do DNA. P
representa o grupo fosfato. (C) Pareamento da bases na molcula de DNA mostrando as pontes de
hidrognio.

E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molcula de DNA a relao entre as purinas e pirimidinas
era constante na maioria das espcies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, igual a da
pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina igual da pirimidina citosina. Essa
caracterstica importante definida pela propriedade fisico-qumica das molculas com formas semelhantes
se atrairem mutuamente com significante afinidade (fora de atrao de Van Der Waals), somada fora de
atrao entre os tomos de cargas opostas (ligaes inicas ou pontes de hidrognio). Essas propriedades
so bastante especficas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultnea com significante
energia de interao, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF
se baseia na especificidade da interao das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas
4

com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. importante salientar que a ligao
entre a A e T ou U ocorre por interao de 2 pontes de hidrognio, enquanto que entre a C e a G a ligao se
d por 3 pontes de hidrognio (ligao mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as
bases; a sequncia de uma das cadeias polinucleotdicas do DNA complementar a outra (cadeia
complementar).
A estrutura secundria de dupla hlice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, est
disposta linearmente. Entretanto, pode ser tambm circular como nas bactrias, plasmdeos e certos vrus, e
pode ser tambm de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposio da molcula de
DNA nos organismos superiores de particular importncia, onde a informao gentica est amplamente
concentrada nos cromossomas dentro do ncleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem
menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA
compactado na forma super-enrolada em vrios nveis: primrio, duplex; secundrio, ao redor das proteinas
ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; tercirio, enrolado com os nucleossomas formando
um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternria, formando voltas ou loops. Esta disposio
super-enrolada a forma natural do DNA.

Propriedades dos cidos nucleicos


Os cidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos fsicos e qumicos. Em
condies fisiolgicas, a estrutura de dupla hlice do DNA bastante estvel. No entanto, se essa estrutura
for submetida a alta temperatura (90C a 100C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela
se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociao, desnaturao ou melting. Da
mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condies de associao (temperatura a 65C, ou pH
prximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente,
obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem
exatamente complementares. Esse fenmeno de associao tambm denominado de renaturao,
hibridizao ou annealing.

Esses processos de desnaturao e renaturao so essenciais para

manipulao dos cidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o
isolamento, comparao e identificao desses compostos. Outra propriedade fsica muito importante dos
cidos nucleicos a sua capacidade de absorver energia na regio do ultravioleta, apresentando o pico de
absorbncia mxima em 260 nm. Esta propriedade til tanto para a quantificao quanto para avaliar a
pureza dessas substncias.

REPLICAO, TRANSCRIO E TRADUO

Replicao
Toda vez que uma clula se divide, todo o seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo
em absoluto as informaes genticas contidas na clula precursora, esse processo denomina-se
5

replicao. A replicao ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de
dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a sntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a
replicao ocorrer necessrio que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita
simples, ssDNA). Esse um processo energeticamente desfavorvel e ocorre com a ao conjunta de uma
proteina DNA-especfica e vrias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, ento, de forma
independente e separada. A replicao pode ter incio em vrios stios, mas cada origem de replicao
utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha sintetizada pela ao catalizadora da DNA
polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma
sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa
polimerase sintetiza DNA na direo de 5' para 3', a sntese de uma das cadeias complementares realizada
de forma contnua enquanto que a outra sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia
discontnua so ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e
manuteno da integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da dupla fita, assim
como no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem tambm, alm da funo de
sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica ou "a correo de leitura" na qual os nucleotdeos
incorretamente incorporados so removidos. Essa propriedade fundamental para a manuteno a
integridade da sequncia original.

Figura 2. Representao da molcula de DNA durante a replicao: as duas cadeias precursoras so


separadas e as cadeias complementares que so sintetizadas.

Transcrio
A sntese protica no resultante da leitura direta da sequncia nucleotdica do DNA. Sabemos que
o DNA est localizado no cromossoma do ncleo da clula e a sntese protica ocorre quase que na sua
totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informaes genticas contidas na sequncia
nucleotdica do DNA tm que ser transferidas para uma molcula intermediria que pode mover-se para o
citoplasma, o RNA mensageiro (mRNA), e que ordena, ento, a sntese da proteina. O processo de sntese
de mRNA conhecido por transcrio e o tamanho da molcula de mRNA definido pela sequncia de
aminocidos que o cido nucleico codifica.
Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de mRNA para cada
gene.

A indicao de qual fita do DNA deve ser transcrita orientada por uma sequncia especfica
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denominada promotor, localizada antes (upstream) da sequncia a ser transcrita, que reconhecida pela
RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente
monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao
ocorre na direo 5 - 3. Isto significa que cada molcula de mRNA ser identica sequncia nucleotdica da
fita de DNA que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (RNA ribossmico,
rRNA) no citoplasma, onde ocorre a sntese protica.
O material gentico de certos virus (retrovirus) o RNA e a informao gentica segue, portanto, a
direo reversa (de RNA para DNA). Este processo conhecido por transcrio reversa, na qual a sintese
de DNA dirigida pelo RNA e a enzima responsvel denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem
importante funo no ciclo vital dos retrovrus.

Traduo
A relao entre a sequncia de nucleotdeos do DNA e a sequncia de aminocidos da proteina
correspondente denominada cdigo gentico. Esse cdigo universal e encontrado em todos os
organismos vivos. O cdigo gentico lido em grupos de trs nucleotdeos, cada um codificando um
aminocido (Tabela 1). Cada sequncia de trinucleotdeo denominada codon e a sequncia de condons
que codifica um polipeptdeo especfico denominada cistron.

Tabela 1. O cdigo gentico


a.

a.

1 base(5)
U
Phe
U
Phe
Leu
Leu
Leu
C
Leu
Leu
Leu
Isoleu
A
Isoleu
Isoleu
Met*
Val
G
Val
Val
Val
* codon de iniciao

C
Ser
Ser
Ser
Ser
Pro
Pro
Pro
Pro
Treo
Treo
Treo
Treo
Ala
Ala
Ala
Ala

2 base
A
Tir
Tir
Terminao
Terminao
His
His
Glu
Glu
Asp
Asp
Lis
Lis
AcAsp
AcAsp
AcGlu
AcGlu

a.

3 base (3)
G
Cis
Cis
Terminao
Trip
Arg
Arg
Arg
Arg
Ser
Ser
Arg
Arg
Gli
Gli
Gli
Gli

U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G

O processo de decodificao pelo qual a informao gentica presente na molcula de mRNA dirige
a sntese proteica denominado traduo. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de
transferncia ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotdeos em comprimento e
de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molcula, adquire a forma de uma folha de
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trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotdeo de sequncia varivel forma o anti-codon que pode parear
com um codon da molcula de mRNA. Na outra extremidade da molcula de tRNA est uma sequncia para
ligao a um aminocido especfico. Portanto, um codon particular no mRNA relacionado atravs de um
tRNA a um dado aminocido. Na traduo, o ribossoma liga-se primeiramente a um stio especfico na
molcula de mRNA (codon de iniciao, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma,
ento, se movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para
adicionar aminocios ao final da cadeia polipeptdica em alongamento. A traduo finalizada quando o
ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminao ("stop codon"). A direo da leitura de 53, sendo que a sequncia de nucleotdeos da fita de DNA corresponde sequncia de aminocidos da
proteina traduzida na direo do N-terminal para o C-terminal.
Em princpio as sequncias de bases nos cidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase
de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificao se inicia. Para uma dada sequncia
UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as trs fases de leitura possveis so :
UUA GCA AAG CUG CGA A
UAG CAA AGC UGC GAA U
AGC AAA GCU GCG AAU G
Entretanto, o cdigo gentico no se sobrepe, pois a fase de leitura ditada pelas sequncias de iniciao
e de terminao da traduo presentes na molcula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por
mutaes que removem ou inserem bases na sequncia nucleotdica. Esse tipo de alterao conhecido
como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da funo da proteina produzida.

Fluxo da informao gentica intracelular


Replicao e Transcrcio
do RNA

Transcrio

Replicao

DNA

Proteinas

RNA

Traduo
Transcrio reversa

ORGANIZAO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL

Estrutura Gnica
Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequncia de nucleotdeos na qual
esto dispostos muitos genes.

O gene uma unidade de herana constituida por uma sequncia

nucleotdeos que carrega as informaes necessrias para a sntese de um dado polipeptdeo. O gene
uma entidade estvel mas pode sofrer mutaes, sendo que a nova forma do gene herdada de modo
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estvel, exatamente como a forma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas,
denominadas alelos, que determinam a expresso de alguma caracterstica particular.
Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genmico no totalmente
transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplide (gamtico) humano compreende 3 x 10

kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milho de genes, mas
somente 3000 locos de doena foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que
conferem as caractersticas normais como altura e inteligncia, uma grande poro do DNA genmico no
tem funo definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funes importantes,
incluindo o controle de ao gnica.
Genes que so responsveis pela sntese de enzimas especficas ou peptdeos so denominados de
genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais.

Controle da expresso gnica


Nas clulas existem mecanismos moleculares que controlam o nmero e a quantidade das proteinas
produzidas. As diferenas na sntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que
as molculas de mRNA so transcritas a partir do DNA (controle transcricional) ou traduzidas (controle
traducional)

Processamento ps-transcricional do mRNA


A transcrio e a traduo nos procariotos so processos concomitantes mas nos eucariotos so
processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrio ocorre no
ncleo e a traduo no citoplasma. Durante a passagem do ncleo para o citoplasma, o mRNA transcrito
(denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro.
Nos procariotos, a sequncia de nucleotdeos do gene colinear com a sequncia de aminocidos
de uma dada protena, entretanto, nos eucariotos a sequncia codificante geralmente interrompida por
sequncias adicionais.
A maioria dos genes dos eucariotos so compostos por regies codificadoras denominadas exons e
regies no-codificadoras denominadas introns. Estes introns so sequncias posteriormente removidas
durante o processamento do transcrito primrio. Esse processo denominado processamento do RNA ou
RNA splicing.

Aps a remoo dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequncia AAUAAA

extremidade 3 do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucariticos possuem 100 a 200
resduos de adeninas ligadas extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A
polimerase. Antes que ocorra a remoo dos introns, o mRNA sofre a adio de resduos de 7-metilguanosina (Caps) na extremidade 5, denominada metilao Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA
torna a molcula mais estvel e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutaes que
ocorrem nas regies de juno dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA
maduro que codifica para uma protena diferente da original.

Alguns genes complexos tem molculas de mRNA muito grandes, que so processadas de
diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que so traduzidos em polipeptdeos diferentes.
Esse processo denominado processamento alternativo (alternative splicing) e ocorre no mesmo tecido
mas em diferentes estgios de desenvolvimento e diferenciao e pode tambm ocorrer em diferentes
tecidos.

Estrutura gnica dos procariotos


Existem regies especficas no DNA, denominadas promotores que identificam o stio de incio da
transcrio do RNA (regio na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrio).
Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metablica so
adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequncias
regulatrias. Este conjunto denominado operon, sendo que a sequncia que regula a expresso desses
genes denominada operador. O operador encontra-se antes (upstream) da sequncia do promotor, nas
posies de -35 a -10 antes do incio da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulao destes operons
obedece a condies nutricionais ou ambientais. O estmulo da expresso de uma enzima em resposta
presena de um substrato particular denominada induo. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte
de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrlise de seus
componentes, glicose e galactose, pela enzima -galactosidase. A presena de lactose (indutor) induz a
sntese de -galactosidase por ativao do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligao da
RNA polimerase ao DNA e a taxa de sntese do mRNA da -galactosidase. Na ausncia do indutor o operon
reprimido pela ao do repressor. O repressor liga-se a uma sequncia especifica no operador,
bloqueando a ligao da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a sntese de mRNA que codifica
para a galactosidase.

Estrutura gnica dos eucariotos


Os promotores dos eucariotos so elementos que sinalizam o stio onde a transcrio deve iniciar-se
e, possivelmente, controlam o nvel de expresso do gene associado. Geralmente esto localizados cerca
de 30 bases upstream do codon de iniciao (ATG) e ompreendemsquencias denominadas boxes ou
motifs. As mais frequentes so as TATA, CAT e CG boxes.
Alm dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequncias regulatrias adicionais
conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou
depois, upstream ou downstream) e que potenciam a taxa de transcrio. importante salientar que estes
amplificadores no so especficos e potenciam a transcrio de qualquer promotor que estiver na sua
vizinhana.

A eficincia da expresso de um gene em um tecido especfico depende da adequada

combinao e integrao dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes.


O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que so replicas de genes ativos mas
no produzem um produto reconhecvel, geralmente ocorrem devido a mutaes acumuladas no gene.

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Transposons so elementos genticos mveis que se deslocam de uma regio para outra do
genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localizao destes segmentos de
DNA no genoma instvel. Estes transposons contm os genes que codificam para as enzimas necessrias
sua insero e para remobilizao para outro stio. Geralmente, a insero de um transposon produz
mutao ou rearranjo cromossmico varivel que abole a funo do gene que recebe esse elemento mvel.

Polimorfismo de DNA
A anlise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequncias
entre os indivduos. Mini e microsatlites so sequncias curtas, repetidas consecutivamente, que esto
distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza
repetitiva faz com que sejam instveis durante a replicao do DNA de gerao para gerao. A
consequncia que o nmero de repeties dentro de uma sequncia varia largamente entre os indivduos.
Em funo dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivduo, exceto gmeos idnticos, ter um
padro ou perfil de DNA pessoal (Fingerprinting). Esses perfis so usados para estabelecer a identidade
dos indivduos em diversas situaes.
As sequncias de microsatlites mais comuns no DNA humano so CA ou GT, dependendo de qual
das fitas de DNA est sendo lida, pois h milhares dessas sequncias espalhadas no DNA humano. O
tamanho da repetio pode ser muito varivel e pode fornecer excelentes marcadores genticos para
estudar o comportamento fenotpido das famlias. A maioria dessas sequncias repetitivas no produz efeito
deletrio, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a sndrome do X frgil,
causada pela expanso de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repeties.

Verificou-se tambm que

disturbios neurolgicos na distrofia miotnica e na doena de Huntington, esto associados a alteraes no


tamanho dos microsattiles. Esta descoberta forneceu a base cientfica para o fenmeno de antecipao no
qual os disturbios genticos tornam-se mais severos nas geraes subsequentes.

IMPORTNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR


Muitas enzimas que atuam na replicao e transcrio tem sido purificadas e a sua atividade

biolgica usada in vitro para reaes moleculares especficas diretas. A maioria dessas enzimas isolada
de bactrias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas so utilizadas das mais diversas formas, a saber:
clonagem e amplificao de genes de interesse, preparo de sondas de cidos nucleicos, ensaios de
hibridizao, entre outras aplicaes.
As nucleases representam uma categoria de enzimas especficas de cidos nucleicos que
hidrolizam as ligaes fosfo-diester dos polmeros de cidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases
podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou
podem atuar somente em ligaes internas (endonucleases). As nucleases podem ser especficas para

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DNA ou RNA. As nucleases DNA-especficas podem catalizar apenas cadeias nicas (por exemplo, a S1
nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I).
As endonucleases de restrio so nucleases encontradas naturalmente em bactrias e so
denominadas enzimas de restrio porque restringem sua atividade a DNA estranhos.

O DNA do

hospedeiro no atacado porque os stios vulnerveis a suas prprias enzimas so protegidos por um
processo denominado metilao do DNA. Cada enzima designada de acordo com o organismo do qual
derivada. A EcoRI, por exemplo, uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima
desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrio reconhecem sequncias de 4, 5 ou 6 nucletdeos.
Muito poucas reconhecem sequncias maiores. Algumas so denominadas isosquisomeros, por clivar em
diferentes stios dentro de uma mesma sequncia (Ex. XmaI e SmaI) e por clivar o mesmo stio mesmo
sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. HindIII e HsuI). Outras enzimas reconhecem diferentes
sequncias com o mesmo stio interno (Ex. BamHI e Sau3A). Para cada regio da molcula de DNA onde a
sequncia especfica ocorre, a enzima de restrio corta ambas as cadeias de forma reprodutvel, formando
extremidades assimtricas ou coesivas (stick-end) ou simtricas ou cegas (blunted-end). Estas enzimas
so utilissmas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutveis e para preparar DNA
de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem.
As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicao, catalizam a formao de ligaes fosfodiester entre dois segmentos de cidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presena de um molde
complementar, no entanto, as RNA ligases no tem essa exigncia para o processamento do mRNA.
As Polimerases catalizam a sntese do polmero de cido nucleico complementar usando uma
cadeia precursora como molde. Essas enzimas so fundamentais para a clonagem e ampificao de genes.
A Taq DNA polimerase, por exemplo, uma enzima extremamente til para a amplificao do DNA in vitro
pela reao de polimerizao em cadeia (PCR).
A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovrus, cataliza a sntese de DNA a partir de
moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante funo no ciclo vital dos vrus, mas pode ser usada in
vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrio
reversa constitui-se um mtodo til para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA)
a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biolgicas
utilizando esse mtodo..

Enzimas de restrio e suas aplicaes


Tecnologia de DNA recombinante
Como vimos, as endonucleases de restrio so enzimas que clivam a molcula de DNA em stios
sequncia-especficos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de
DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutvel podem ser produzidos e
esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molcula
de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo molculas de DNA recombinado biologicamente
funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinao foram utilizados os vetores plasmidiais para
12

carrear fragmentos de DNA estranhos.

Plasmideos so pequenos pedaos de DNA circular extra-

cromossmicos que ocorrem naturalmente no citoplasma das bactrias e se replicam independentemente do


DNA bacteriano hospedeiro. Utilizando uma endonuclease particular, o plasmdeo pode ser aberto e um
fragmento de DNA estranho pode ser inserido, por ao de uma DNA ligase, produzindo um plasmdeo
recombinate. Os plasmdeos fornecem veculos teis para carregar fragmentos de DNA ou genes e, quando
transfectados em bactrias (usualmente Escherichia coli), podem produzir clones que ao serem replicados in
vivo, produziro cpias mltiplas do fragmento de DNA incorporado.

Identificao de genes
O DNA extrado de um fragmento de tecido, de leuccitos ou de clulas do lquido amnitico, contm
milhares de genes, embora em algumas clulas muitos destes genes estejam desligados ou reprimidos e
somente relativamente poucos estejam ativos.

A identificao de um gene ou sequncia nucleotdica

especifica em todo esse DNA pode ser realizada atravs do mtodo de Southern blot (E.M. Southern,
1975). Nesse mtodo, as enzimas de restrio so utilizadas para fragmenttar o DNA e os fragmentos
resultantes so separados por eletroforese e identificados por hibridizao de cidos nucleicos, utilizando
uma sequncia de nucleotdeos especfica (sonda gentica) que capaz de reconhecer o gene de
interesse.

Polimorfismo de restrio
Em muitas doenas, o defeito gentico desconhecido e a produo de sondas gene-especficas
muito difcil ou no possvel. Entretanto, o gene produtor da doena pode estar muito proximo (ligado) a um
stio de reconhecimento de uma enzima de restrio particular. Sabe-se que variaes nas sequncias de
DNA ocorrem aleatoriamente atravs do genoma inteiro e no esto associados a uma doena especfica.
Estas variaes (alteraes de bases) resultam na perda de um stio de restrio existente ou de aquisio
de um novo sitio. Tais alteraes nas sequncias de DNA significam que os fragmentos, produzidos por uma
enzima de restrio particular, tero diferentes comprimentos entre diferentes indivduos e podem ser
reconhecidos por suas mobilidades em eletroforese. Eles so denominados polimorfismos de tamanho de
fragmento de restrio (RFLP) e so herdados como caractersticas genticas simples obedecendo as leis
mendelianas de herana. Se for demonstrado, em estudos de famlias, que um gene produtor de doena
est ligado a um RFLP, este pode, ento, fornecer um meio de detectar o gene defeituoso sem efetivamente
conhece-lo.

Literatura recomendada
Emery, A.E. An Introduction to Recombinant DNA in Medicine, 2a. Ed., 1995, A.E.H Emery & S. Malcon, eds.,
Johon Wiley & Sons Ltda, Chichester, England, 206 pg.
Lewin, B. Genes V., B. Lewin, ed., 1994, Oxford University Press, New York, USA, 1272 pg.
Strachan, T. Human molecular Genetics. T. Strachan & A.P.Read, eds., 1996, Bios Scientific Publications
Ltd., Oxford, UK, 596 pg.
Watson, J. Recombinant DNA, 2a. Ed., J. Watson, M. Gilman, J. Witkowrk, M. Zoller, 1992, Scientific
American Inc., New York, USA, 626 pg.
13

Aula nmero 2

EXTRAO DE DNA GENMICO


Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Marcos de Oliveira Machado

INTRODUO
O potencial de aplicaes das tcnicas de DNA recombinante em laboratrios de Bioqumica Clnica

esto se tornando altamente evidentes, especialmente para a anlise do diagnstico das vrias doenas
genticas e de outras mais. Correntemente, as anlises de DNA para o diagnstico esto disponveis
somente para algumas desordens genticas, mas o campo de estudo est rapidamente se expandindo e
novas anlises esto sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnstico envolve a
extrao de DNA dos leuccitos humanos. Tradicionalmente essas tcnicas de extrao consomem muito
tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos mtodos populares para esse fim, envolve
digesto com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (1015 ml), ou utilizam solventes orgnicos como o fenol, clorofrmio e lcool isoamlico, os quais so altamente
txicos. Embora esses mtodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade
de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferncia dos extratos de DNA para
recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vrios filtros comerciais ou
colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferncia cruzadas de
amostras ou a introduo de contaminantes. Tais tcnicas no so bem apropriadas para o uso na rotina dos
laboratrios clnicos. Portanto, um mtodo simples, rpido e econmico necessrio para a introduo das
anlises de DNA nos laboratrios de Bioqumica Clnica.
Os estudos de ligao gentica utilizando a tcnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de
restrio (RFLP), a reao em cadeia da polimerase (PCR), a tcnica de transferncia de DNA (Southern
blot), e outras, necessitam que o DNA extrado esteja em boas condies de uso; ou esteja livre de
contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reao.
O uso da tcnica de precipitao salina para a extrao de DNA utilizando como detergente o Triton
X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgnicos e o alto custo e demorada digesto da proteinase K.
Esta tcnica envolve a desidratao e precipitao das protenas celulares com soluo de cloreto de sdio
concentrada. O DNA extrado fica livre de RNA, de protenas e da degradao de enzimas. A quantidade e a
qualidade do DNA extrado muito boa comparada com as outras tcnicas de extrao. O DNA apropiado
para as tcnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digesto com enzimas de restrio.

14

PREPARAO E ANLISE DE CIDOS NUCLEICOS


Os mtodos de isolamento e purificao dos cidos nucleicos consistem de trs etapas: (1) lise das

clulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mdodo enzimtico ou qumico para remover as protenas
contaminantes e outras macromolculas; e (3) precipitao alcolica para isolamento do DNA. Os protocolos
bsicos geralmente so aplicveis a um ampla variedade de materiais.

1. Isolamento de DNA genmico de tecidos e clulas:


O mtodo bsico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o
detergente inico SDS, extrao fenlica das proteinas e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo til
para preparao de DNA genmico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mnimo
de consumo de tempo e trabalho. O DNA genmico produzido adequado para amplificao por PCR ou
para a disgesto com enzimas de restrio e anlise de transferncia de DNA. Uma quantidade substancial
de RNA acompanha o DNA genmico, o que dificulta a quantificao por espectroscopia no UV. Algumas
amostras de DNA no amplificam bem por PCR ou no so completamente digeridas com enzimas de
restrico e devem, portanto, ser reextraidas.
Outro mtodo compreende a solubilizao dos tecidos ou clulas com SDS, que inativa as DNAses
endgenas. A proteinase K usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digesto com Rnase para
remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princpio anterior. Este
mtodo adequado para extrair DNA genmico para anlise de DNA por Southern blot ou construo de
bibliotecas genmicas. Porm no adequado para extrair DNA de tecidos pois no h etapa de ruptura do
tecido conectivo..
O protocolo mais adequado rotina laboratorial para avaliao de polimorfismos e mutaes
genticas compreende a lise celular com SDS, remoo das proteinas por precipitao com cloreto de sdio
concentrado (salting-out) e isolamento do DNA genmico por precipitao etanlica.

2. Isolamento de RNA de clulas ou de amostras biolgicas


A maioria dos procedimentos de purificao e concentrao de RNA so semelhantes aos utilizados
na purificao de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para precipitao
do RNA. essencial que toda gua usada diretamente ou nos tampes seja tratada com dietilpirocarbonato
(DEPC) para inativar as RNases.
O mtodo mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilizao simultanea
do tecido ou clulas e inativao de Rnases endgenas na presena de isotiocianato de guanidina, com
subsequente separao do RNA do DNA e das protenas por ultracentrifugao em gradiente de cloreto de
csio. Dois outros mtodos que no requerem ultracentrifugao podem se utilizados: (1) lise com
detergente no-inico para proporcionar um mtodo rpido para preparao de amostras de RNA
citoplasmtico e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoo das proteinas pela extrao fenlica
em pH cido, seguida de precipitao do RNA.

O segundo mtodo frequentemente utilizado para

isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biolgicas


15

Outros mtodos de isolamento e identificao do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por
cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separao eletrofortica do RNA em gel de agarose contendo
formaldeido para deteco e quantificao de espcies especficas de RNA por Northern blotting e
hibridizao; entre outros.

3. Isolamento de DNA genmico de bactrias


As bactrias de uma cultura lquida saturada so lisadas e as proteinas removidas por digesto com
proteinase K. Os debris de parede celular, polissacardeos e as proteinas remanescentes so removidas pela
extrao fenlica e o DNA genmico recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaao com etanol.

PURIFICAO E CONCENTRAO DE DNA DE SOLUES AQUOSAS


Os procedimentos de isolamento de dsDNA e ssDNA a partir solues aquosas so teis quando

proteinas ou solutos necessitam ser removidos, ou quando solues de DNA necessitam ser concentradas.
O protocolo bsico apropriado para purificao de DNA a 1 mg/mL a partir de volumes menores que 0,4 ml.

1. Extrao fenlica e precipitao etanlica


Um dos mtodos mais teis e usados para isolamento e concentrao de cidos nucleicos de
solues aquosas a extrao com fenol/clorofrmio seguida de precipitao com etanol.

Durante a

extrao orgnica, as proteinas contaminantes so denaturadas e mantidas na fase orgnica ou na interface


entre as fases orgnica e aquosa, enquanto que os cidos nucleicos permanecem na fase aquosa. O fenol
usado nesse protocolo deve ser tamponado para prevenir que os produtos oxidados presentes no fenol
danifiquem os cidos nucleicos. Alcool amlico frequentemente adicionado mistura fenol/clorofrmio
quando ocorre a formao excessiva de espuma durante a extrao.
Durante a precipitao com etanol, os sais e outros solutos como os resduos da extrao
fenol/clorofrmio permanecem em soluo enquanto os cidos nucleicos formam um precipitado que pode
ser facilmente separado por centrifugao. Na presena de altas concentraes de ctions monovalentes
(0,1 a 0,5 M), o etanol induz uma transio estrutural nas molculas de cido nucleico promovendo a
agregao e precipitao das mesmas. Entretanto, como vrios sais e pequenas molculas orgnicas so
solveis em etanol a 70%, a precipitao etanlica e lavagem do sedimento elimina os sais no DNA. Embora
cloreto de sdio, acetado de sdio, e acetato de amonio sejam capazes de induzir a precipitao, mais
difcil remover cloreto de sdio devido a sua baixa solubilidade em etanol a 70%. O sal recomentado para a
maioria das aplicaes de rotina deste mtodo o acetato de sdio a 0,3 M (concentrao final), que mais
solvel em etanol que cloreto de sdio a 0,3 M e, portanto, menos facilmente precipitvel com a amostra de
cido nucleico. Para amostras contendo dodecil sulfato de sdio (SDS), o sal recomendado cloreto de
sdio 0.2 M, pois o SDS solvel em etanol nessas condies.
Solues de DNA diludas: quando solues de DNA esto diluidas (< 10 g/mL) ou quando menos
que 1 g de DNA est presente, deve-se aumentar a proporo de etanol para o volume aquoso (3:1) e
o

aumentar o tempo de precipitao (4 a 16 horas), incubando-se a -20 C (ou em gelo seco). A centrifugao
16

para separao do DNA precipitado deve ser feita a baixa temperatura para assegurar o mximo de
recuperao do DNA dessas solues.
Pequenas quantidades de DNA (nanogramas): pode-se utilizar um cido nucleico carreador, como
o tRNA de E. coli, levedura ou fgado bovino, em concentraes de 10 g/mL. Nessa condio o DNA
coprecipitado com o tRNA. O tRNA no interfere com a maioria das reaes enzimticas, mas ser
eficientemente fosforilado pela T4 polinucleotdeo quinase e no poder ser usado se esta enzima for usada
em marcaes subsequentes. Recuperao de pequenas quantidades de fragmentos curtos de DNA e
oligonucleotdeos pode ser aumentada pela adio de cloreto de magnsio a uma concentrao inferior a 10
mM antes da adio do etanol. Entretanto, o DNA precipitado de solues mais concentradas que 10 mM de
ons magnsio ou fosfato so dificeis de dissolver e devem ser dulidas antes da precipitao com etanol. Se
a amostra de DNA est em baixa concentrao em um grande volume, o volume pode ser reduzido pela
extrao repetida com sec-butanol (2-butanol). Cabe lembrar que apenas a gua removida com essa
extrao, todos os solutos e sais so concentrados com os cidos nucleicos. Aps essa etapa, o cido
nucleico deve ser extraido com fenol/clorofrmio e precipitado com etanol.
DNA em grandes volumes aquosos: a extrao pode ser simplesmente ampliada usando o mesmo
procedimento. (tubos de poliestireno no resistem a mistura fenol/clorofrmio). As etapas de centrifugao
temperatura ambiente no podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g), pro 5 minutos. O precipitado
etanlico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforada por 15 minutos em fotor de angulo
o

fixo a 10.000 rpm (8000 x g), a 4 C. Tubos de vidro devem ser siliconizados para facilitar a recuperao de
pequenas quantidades de DNA (< 10g).
Remoo de oligonucleotdeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotdeos (< 30 bp) e nucleotdeos
no incorporados usados na marcao ou outras reaes de modificao do DNA podem ser efetivamente
removidos das solues contendo DNA por duas etapas de precipitao com etanol na presena de acetato
de amonia. Este procedimento no suficiente para remover completamente grandes quantidades de
ligadores (linkers) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia no recomendvel se a
amostra de cido nucleico for fosforilada na extremidade 5 pela T4 quinase ou na extremidade 3 com a
transferase terminal, pois os ons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas.
Variaes do procedimento de precipitao: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se
deseja manter mnimo o volume dos cidos nucleicos precipitados. O isopropanol menos voltil que o
etanol e , portanto, mais difcil de remover por evaporao.

Alguns sais so menos solveis em

isopropanol, e podem ser precipitados com os cidos nucleicos. recomendado que a precipitao com
isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitao onvencional com etanol

para eliminar

isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de ltio pode ser usado como o sal de precipitao,
pois o cloreto de ltio muito mais solvel no etanol e o precipitado resultante relativamente isento de sal.
Cloreto de ltio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a
transcrio reversa aps precipitao.
Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por
duas etapas de precipitao seletiva com cloreto de ltio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitao
convencional com etanol.
17

Solues concentradas de cidos nucleicos: se a concentrao de cidos nucleicos muito alta (


> 300 g/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitao etanlica. Se um
precipitado visvel formado, no necessrio esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar
o precipitado por centrifugao.

2. Fracionamento dos cidos nucleicos


Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento
dos cidos nculeicos. Tcnicas cromatogrficas so apropriadas para algumas aplicaes e podem ser
usados para separao dos plasmdeos do DNA genmico, bem como separao de DNA genmico dos
debris no lisado celular.

A eletroforese, entretanto, tem muito mais resoluo que mtodos alternativos e

geralmente o mtodo de fracionamento de escolha. As separaes eletroforticas podem ser analticas ou


preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que
8

10 Da. Uma variedade de sistemas eletroforticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa de
variao. Alm disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridizao aps a
separarao eletrofortica de uma mistura complexa (Southern blot). Este mtodo tem contribuido
grandemente para ao mapeamento e identificao de sequencias de cpia nica ou mltipla em genomas
complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.

3. Purificao e isolamento de DNA


Os protocolos utilizados para purificao de DNA so geralmente divididos em trs categorias: (1)
eluio do DNA de um gel de agarose por dilise, (2) dissoluo do gel de agarose e recuperao do DNA
o

por ligao a partculas de vidro, e (3) eluio pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fuso a 70 C,
e recuperao do DNA pela extrao fenlica e precipitao etanlica ou usando uma matrix que liga
especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, h vrios sistemas de purificao de fragmentos de DNA
no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de cido nucleico que pode ser eficientemente
isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgnicos e de outras substncias na eficincia de ligao da
matriz; e no tipo de solvente que usado para eluir o oligonucletdeo ou o polinucleotdeo da matriz.
Matriz de slica (vidro) - na presena de iodeto de sdio, DNA e RNA ligam-se seletivamente matriz
de slica. Outras substncias presentes (sais, solventes, nucleotdeos, proteinas, nucleotdeos etc) so
lavados com uma soluo de etanol tamponada. O polinucleotdeo ligado eluido em um reduzido volume de
tampo Tris-EDTA (TE) ou gua.
Resina de purificao - uma resina de purificao com propriedades similares aos sistemas de
1

matriz de slica (Magic , Promega). Esta matriz liga polinucleotdeos de dupla fita mais eficientemente que os
de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp
ou oligonucleotdeos.
Adsoro - um sistema de purificao de cidos nucleicos, que contm um adsorvente estvel
(NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotdeos
contendo menos que 12 resduos. A ligao no afetada por altas concentaes de sais, ureia, ou outras

18

substncias, mas inibida por alguns solventes orgnicos. O material no ligado removido com gua e o
DNA ou RNA (mas no proteinas) quantitativamente eluido com um solvente alcolico.
Gel filtrao - os cidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas
de gel filtrao ou colunas de centrifugao (spin columns).

QUANTIFICAO DOS CIDOS NUCLEICOS


A concentrao de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absoro no UV ou a

concentrao de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem
ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plstico ou vidro podem ser usadas para
a regio do visvel. Um mtodo alternativo o mtodo de placa de brometo de etdio agarose. .

Literatura recomendada
Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994,
Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p.
Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates
and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY.
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes,
2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

19

Aula nmero 3

PRINCPIOS DE ELETROFORESE
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

INTRODUO
Eletroforese uma tcnica de separao que envolve o movimento de partculas com cargas em

soluo, sob ao de um campo eltrico. Portanto, qualquer partcula ou molcula carregada pode se mover
nessas condies, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas.
A separao eletrofortica das partculas pode ser realizada em meio lquido(eletroforese livre de Tisellius)
ou em um suporte inerte.
A carga eletrica aplicada sob a soluo realizada atravs de eletrodos que so colocadas na
soluo. Um ion migra atravs da soluo na direo ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partcula
carregada positivamente(catiosn)

migra

para o polo negativo (catodo), enquanto as partculas

negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).

PRINCPIOS BSICOS DA ELETROFORESE

Terminologia:
nion: partcula carregada negativamente ou on
ction: partcula carregada positivamente
tampo: Uma mistura de substncias que doam e aceitam proton com a funo de manter a concentrao
do proton (pH) constante ou dentro de um valor prximo. Um tampo pode ser feito com uma mistura de um
cido fraco com o respectivo sal. Ex: cido actico e acetato de sdio.
Condutividade: a propriedade de uma substncia conduzir a corrente eltrica. Numa soluo inica, a soma
do produto da concentrao da carga e a mobilidade da mesma.
eletrodos: substncias em contato com um condutor. A substncia esto conectadas a fonte eltrica.
Fonte eltrica: Equipamento

que transforma corrente alternada em corrente contnua, que possa ser

controlada por um potenciometro, que permite variar a tenso, a corrente, a carga eltrica que se quer aplicar
no sistema. Esse equipamento, pode medir a tenso eltrica (em Volts), a corrente eltrica(Amperagem), e a
potncia eltrica (Watts).
eletro-osmose; tendncia da soluo se mover em relao a uma substncias estacionria adjacente,
quando uma diferena de potencial aplicada.
fora inica: a soma da concentrao de todos ions na soluo, medido pelo quadrado de suas cargas.
mobilidade: a velocidade de uma partcula ou ion que dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa
de quanto rpido um ions se movimenta em um campo eltrico.
20

Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substncia sob certas condies. Geralmente menor que a
mobilidade devido a menor carga, ou resistncia do suporte ou meio.
poder de resoluo: E a habilidade de separar substncias que migram muito prximas.
gel: uma malha de fibras, ou de polmeros que slida, mas retm uma grande quantidade de solventes
nos poros ou nos canais internos das malhas.

FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAO E MOBILIDADE


ELETROFORTICA
A aplicao de um campo eltrico a uma soluo que contm partculas carregadas pode separ-los.

A separao depende de vrios fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Fora aplicada nas
partculas (voltagem), carga da partcula, pH do meio, condutividade do meio, resistncia da matrix,
conformao da partcula, fora inica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc
1. Fora na partcula
A fora exercida em uma partcula carregada depende do campo eltrico, voltagem ou volts por
centmetro, e a carga da partcula, Q. A fora sob a partcula carregada o produto:

Feletrica=QV
A fora eltrica, Feletrica, quando exercida na partcula, causar o seu movimento. No entanto, o
movimento da partcula no solvente ser tambm influenciado pela resistncia, devido a viscosidade, a
resistncia, a qual exerce uma fora proporcional a velocidade:

Fresistncia= fv
A constante de proporcionalidade, f chamada de coeficiente de frico (medida de resistncia de
uma partcula oferece quando em movimento em um solvente).
2. Coeficiente de frico depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partcula
Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimtrica a partcula,
menor seu movimento atravs do solvente. O coeficiente de frico de uma grande partcula tais como
proteinas uma propriedade caracterstica de cada elemento.
3. Mobilidade da partcula
Quando um campo eltrico aplicado em uma partcula carregada, ela inicia a migrao. A fora
eletrofortica e a fricional se ope uma a outra, e a velocidade dessa aumenta at as foras se igualarem
(Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcana em um campo eltrico, V, determinado por
duas propriedades das partculas - sua carga e seu coeficiente de frico. Consequentemente, o valor de v/V
tambm uma propriedade caracterstica das partculas e importante o suficiente para receber o seu
prprio nome: mobilidade.
4. Efeito do pH do meio

21

Cada on possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a soluo contm uma
substncia a qual o pK prximo do pH do meio, esta substncia ocorre em ambas as formas: a carregada e
a no carregada.
A frao com uma carga ser dependente do pK da substncia e o pH da soluo. Quando o pH
igual ao pK de um cido fraco, somente 50% das partculas estaro carregadas. Uma unidade de pH abaixo
da pKa, 90% das partculas estaro sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substncia
varia com o pH, a sua mobilidade efetiva tambm varia com o pH.
O pH da soluo escolhido de tal forma, que a partcula a ser separada pela eletroforese, se
mantenha em um estado mximo de carga, para sua mxima separao. Os tampes so substncias
inicas por si, portanto, exercem a funo de manterem o pH o mais prximo possvel da ideal e fazem parte
do processo.
5. Condutividade e movimento dos ons
Em qualquer sistema eltrico, a corrente produzida proporcional a voltagem aplicada;

V = resistncia X Corrente

ou

V =

corrente___
condutividade

Na eletroforese, a corrente um fluxo de ons(em ambas direes). A condutividade a soma das


concentraes multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um on com maior
mobilidade efetiva carreia uma maior frao da corrente
A voltagem, condutividade, e a corrente portanto esto todos relacionados. Se a condutividade est
aumentada pelo aumento da concentrao salina a corrente se mantm constante, a voltagem deve
decrescer. Se decresce a voltagem reduz a fora eltrica, F eletrica, nas partculas carregadas, diminuindo o
movimento das macromolculas. O aumento do tempo seria necessrio para uma separao, e a resoluo
diminui devido ao aumento da difuso. Se a condutividade est aumentada numa voltagem fixa, a corrente
deve aumentar, portanto aumentando o calor eltrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento
proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distrbios convectivo nas
solues, a qual distorce o padro eletrofortico e pode tambm desnaturar as macromolculas. Desde que
o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletrio, resultados timos
podem ocorrer quando se conserva a concentrao dos ions e portanto a condutividade em valores
moderados.
6. Carga e conformao
Como j se discutiu, o que determina a migrao eletrofortica a carga da partcula que se quer
separar. Muitas vezes, a distribuio das cargas no esto desvinculadas a sua conformao estrica,
portanto, pode-se alterar a carga de uma partcula dependendo de sua conformao, principalmente em se
tratando de macromolculas. As macromolculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns
eletrlitos ligados fortemente, portanto levando a uma alterao na sua mobilidade.
7. Atmosfera inica e o potencial zeta
Contra-ons, ou ons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar prximos a grupos
carregados das macromolculas. No entanto, eles no chegam a neutralizar as cargas das macromolcuals
mas, por sua vez esto localizados prximos dos grupos carregados das macromolculas, formando uma
dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera inica.
22

As macromolculas movem-se com a camada de hidratao e com os contra ions. Esses reduzem a carga
efetiva das macromolculas, a um nvel dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia
produzida pela carga efetiva das macromolculas na superfcie de contato, que a regio limite do complexo
macromolecular na soluo e o material que o est envolvendo.
8. Suportes
A grande meta da eletroforese a separao de uma mistura heterognea de substncias inicas
seja ela macromolculas ou ons simples, em zonas completamente identificveis.

Os suporte devem

permitir a penetrao do material a ser separado o mximo possvel e ainda delimitar o fluxo de volume
(eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princpio determinando o tamanho do
poro para o movimento eletrofortico das macromolculas. O tubo capilar tambm exerce esse efeito.
9. Eletroendosmose
O suporte no deve interagir com as molculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a
separao. Uma interao comum que pode ocorrer, no a adsoro usual do material. Mais comumente
o efeito dos grupos carregados que esto ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como
exemplo tpico temos o suporte gar, que muito utilizado na eletroforese. O gar uma mistura de agarose
e agaropectina. A agaropectina tem um nmero relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro
tem contra-ons. Se o campo eltrico for aplicado, os contra-ons iro se mover, mas o grupo carboxil ligados
a matrix (agar) no migraro. Os contra-ons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo
significativo nesta direo, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes denominado de
endosmose.

TIPOS DE SUPORTE

Os tipo de suporte podem variar desde uma soluo de sacarose at em substncia pouco solveis como
fibras de celulose. Os suportes de meio contnuo mais comuns so: agar, agarose, poliacrilamida e amido.
A porosidade ou a mdia do tamanho do poro em alguns suportes fixo. Entretanto, em alguns suportes
podem ser controlados. Como exemplo, a mudana da concentrao do gel de agarose, agar e amido, pode
mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para
macromolculas est em torno de 5% a 10%, que separam protenas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo
de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga eltrica.

TIPOS DE ELETROFORESE.

a. Dependendo da matrix
Eletroforese livre de Tiselius
Eletroforese em acetato de celulose
Eletroforese em gel de agar
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese capilar

23

b. pH de separao
pH cido
pH neutro
pH alcalino

APLICAES DA ELETROFORESE NAS TCNICAS MOLECULARES


1. Gel de Agarose
Um dos mtodos eletroforticos mais comuns utilizados na prtica diria em biologia molecular a
de gel em agarose. Essa tcnica muito simples, rpida, prtica e apresenta boa resoluo na separao dos
fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separao por
ultracentrifugao em gradiente de densidade de sacarose.
Uma boa separao eletrofortica do DNA utilizando gel de agarose depende de vrios fatores:

1.1. Tamanho molecular do DNA.


As molculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso
molecular atravs do gel de agarose.

1.2. concentrao da agarose.


O fragmento do DNA migra em diferentes proporo atravs do gel contendo diferentes
concentrao da agarose. Existe uma relao linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentrao
do gel que baseada numa equao matemtica(Helling e cols , 1974) figura 1.
Log=logo- Kr
Onde o a mobilidade eletrofortica livre e Kr o coeficiente de retardamento, = a constante que
relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molcula em migrao.

Baseada nessa correlao podemos separar vrias molculas de DNA (de variado tamanho) nas
diferentes concentraes de agarose.

Porcentagem de agarose
0,3%
0,6%
0,7%
0,9%
1,2%
1,5%
2,0%

intervalo da efficincia da separao da molcula de


DNA em Kb
5 a 60
1 a 20
0,8 a 10
0,5 a 7
0,4 a 6
0,2 a 4
0,1 a 3

24

1.3. Conformao do DNA


A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a
mesmo peso molecular migra atravs do gel de agarose em diferentes posies (Thorne, 1966, 1967). A
mobilidade relativa das 3 formas so dependentes primariamente da concentrao do gel, mas so tambm
influenciados pela corrente aplicada, fora inica do tampo e da densidade superhelicoidal da toro na
forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condioes, a forma I do DNA migra mais
rpido que a forma III, em outras condies pode ser de ordem inversa. Um mtodo geral para identificar as
diferentes conformaes do DNA utilizar na corrida eletrofortica em agarose diferentes concentraes de
brometo de etdio(concentrao crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As tores
superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vo sendo progressivamente removida e seu ndice de
migrao diminui. Numa concentraao crtica do corante livre, onde no permanece a forma superhelicoidal,
o ndice de migrao da forma I do DNA esta no seu mnimo valor. Se ainda mais brometo de etdio for
adicionado, tores superhelicoidais positivas so gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta
rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA so diferentemente
diminuidas como consequncia da neutralizao da carga e da maior tenacidade dada ao DNA pelo
brometo de etdio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentrao critica do brometo de etdio livre de
0,1 a 0,5 g/ml

A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razo da migrao dos fragmentos de DNA linear proporcional
a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga eltrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de
DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separao do gel
de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a mxima resoluo dos fragmentos de
DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no mximo 5V/cm

Composio das bases e temperatura: O comportamento eletrofortico do DNA em gel de agarose no


significantemente afetado pela composio das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa
forma, os geis de agarose e a mobilidade eletrofortica dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos no
0

muda entre 4 C a 30 C. Em geral, os geis de agarose so submetidos a corrida em temperatura ambiente.


No entanto, em concentraes muito baixas (0,5%) os gis so pouco consistentes, sendo convenientes
trabalhar em baixas temperaturas, pois esses gis ganham mais firmeza, da mesma forma os gis de
agarose de baixo ponto de fuso(low melting agarose).

1.4. Tampes utilizados


Existem uma variedade de tampes que podem ser utilizados para separao eletrofortica de DNA.

25

TAMPES

CONCENTRAO

FORMULAO

Tris-acetato (TAE)

0,04M Tris acetato

50X 242g tris base

0,01M EDTA

57,1 ml cido actico


100ml EDTA 0,5M(pH8,0)

Tris-fosfato (TPE)

0,08M Tris-fosfato
0,002M EDTA

10X 108 g Tris Base


15,5ml de ac. fosfrico 85%
40ml EDTA 0,5M (pH8,0)

Tris-borato (TBE)

0,089M Tris borato

5X 54g Tris-base

0,089M ac. brico

27,5g c. brico

0,002M EDTA

20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)

1.5. Tipos de Agarose


Muitos tipos de agarose esto disponveis, o que se recomenda para uso dirio o tipo II, baixa
eletroendosmose. O inconveniente desta agarose que possue contaminantes de polissacrides sulfatados
que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilizao muito
difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de
reaes com essas enzimas

1.6. Colorao do DNA em gel agarose


O mtodo mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose a colorao por brometo de
etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contm um grupo planar, que intercala entre as
bases do DNA. A posio fixa do grupo e sua proximidade s bases causa uma ligao do corante com o
DNA, que se destaca com um aumento da fluorescncia comparada com o corante em soluo sob a forma
livre. A radiao UV absorvida pelo DNA a 260 nm transmitida para o corante, ou a irradiao absorvida a
300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, emitido a 590nm na regio da cor vermelho
alaranjada, do espectro visvel.
O brometo de etdio pode detectar tanto os cidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto,
a afinidade do corante pela fita simples relativamente baixa, e a fluorescncia emitida fraca.
Geralmente o brometo de etdio incorporado no tampo de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso
devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas est reduzida na presena do corante em
aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento a possibilidade de visualizar o gel durante a
separao eletrofortica, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo
a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da colorao posterior basta imergir o gel numa soluo de
brometo de etdio, no prprio tampo de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descolorao
normalmente dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA muito
reduzida, a pouca fluorescncia do brometo de etdio pode interferir na visuallizao da banda de DNA. Neste
caso recomenda-se imergir o gel em uma soluo de sulfato de magnsio a 1mM por uma hora, a
temperatura ambiente
26

1.7. Documentao:
O gel de agarose facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantnea ou
sistema automatizado de captura de imagem.
Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000.

O filme mais sensvel para essa finalidade fornecida pela

Sob a luz UV de no mnimo 2500uW/cm

e uma boa mquina ,

utilizando filtro laranja, expe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a mquina Polaroid modelo DS
34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das
bandas e do tamanho do gel. Para padronizao tente vrios tempos de exposio com vrias aberturas.

2. Gel de poliacrilamida
O gel de poliacrilamida um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separao e
caracterizao de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose.
Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerizao da acrilamida, que o monmero,
com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reao de "cross linking" ou reao cruzada, gera o suporte
de poliacrilamida. A polimerizao ocorre por ligao vinlica, sob ao de catalisadores, o perssulfato de
amnia, cuja fonte de radicais livres o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxignio um
inibidor da reao. O polmero formado so cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reao cruzada entre
elas dada pela bisacrilamida. O comprimento mdio das cadeias determinado pela concentrao relativa
da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relao entre a quantidade de acrilamida e
bisacrilamida determina as propriedades fsicas do gel, que daro subsdios para separao nesse tipo de
gel.
O gel de poliacrilamida utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados
em uma variada concentrao (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a
separao e identificao.

ACRILAMIDA (%)

INTERVALO DE SEPARAO (NUCLEOTDEOS)

3,5

10-1000

5,0

80-500

8,0

60-400

12,0

40-200

20,0

10-100

Os gis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um
ambiente isento de oxigncio para se polimerizar.
O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura at 20 a 30cm de largura por
40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utilizase 0,75 a 1,5 mm.
27

Literatura recomentada
Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J.
Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA.
Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes,
2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.

28

Aula nmero 4

REAO DE POLIMERIZAO EM CADEIA (PCR)


Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata

PRINCPIOS DA REAO DE PCR


A reao de polimerizao em cadeia (Polimerase chain reaction, PCR) a tcnica que permite a
amplificao do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reao enzimtica catalizada pela
polimerase (enzima termoestvel) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: Melting(ou
desnaturao que consiste na separao da dupla fita do DNA a ser amplificado), annealing( anelamento
ou hibridizao- ligao do iniciador ou primer ao DNA a ser amplificado) e extension(extenso ou seja a
polimerizao propriamente dita) Metodologicamente a tcnica de PCR requer trs passos (SAIKI et al.,
1.988):
1. Desnaturao - Inicialmente necessrio que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas.
A elevao da temperatura entre 90 a 95 C promove a separao da fita dupla de DNA em duas fitas
simples. Este procedimento chamado Desnaturao ou melting, e muitas vezes a temperatura de
desnaturao determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina
e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse.
2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funes, isto , anexar as bases complementares,
transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA j ligado na regio
previamente escolhida. A soluo, ento, demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse
nas duas longas fitas simples, tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se,
soluo, os primers ou iniciadores que so pequenos fragmentos sintticos de DNA de fita simples,
oligonucleotdeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que so sintetizados in vitro baseado
na sequncia do DNA a ser amplificado sendo eles complementares seqncia do segmento de DNA
de interesse. O conhecimento da seqncia procurada naturalmente pr-requisito para a sntese dos
primers. Os primers perseguem na reao as regies, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se s
seqncias complementares nas duas fitas simples (usualmente 5). Nas duas fitas surgem, assim, um
pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridizao dos primers descrito como Annealing
(do ingls), deve ser feito a uma tempertura inferior da desnaturao (45 a 60 C).
3. Extenso - Quando os primers encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNAPolimerase pode assumir sua funo. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla
(resultado do anelamento do primer), incorporando um a um os nucleotdeos correspondentes, isto , as
bases juntamente com as molculas de acar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotdeos entre si,
completando assim as fitas simples e tornando-as duplas (extenso). A DNA-Polimerase no reconhece
29

apenas o bloco de incio como tambm consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3 e 5).
Ela inicia a reao sempre pela extremidade 3 do primer, completando a fita simples da em diante,
portanto, sempre na direo do fragmento procurado.
Os fragmentos de DNA recm-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos
ciclos subseqentes, no entanto, com regio j determinada, resumindo, temos uma reao em cadeia.
Aps cada ciclo, o nmero de fragmentos se duplica: de um formando-se 2, e ento novamente 4, 8, 16, 32,
64, 128... de tal forma que pode ser definida matematicamente por:
N = No 2

N = nmero de molculas amplificadas


No = nmero de molculas iniciais
n = nmero de ciclos de amplificao

O modelo terico considera que a eficincia do processo de amplificao corresponde a 100%, o que
no observado na prtica. Experimentalmente, a eficincia da reao est abaixo da ideal e gira entorno de
78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente aps 20 ciclos tm-se cerca de um milho;
aps 30 ciclos, cerca de um bilho de cpias do fragmento de DNA de interesse.

Automao da PCR
O procedimento da PCR foi to aperfeioada desde a sua primeira descrio, que na atualidade
transcorre de forma totalmente automtica. Uma importante condio para isto foi a substituio da DNAPolimerase originalmente utilizada (extrada de E. coli) por uma DNA-Polimerase termoestvel extrada da
bactria Thermus aquaticus (Taq-polimerase). Desta forma, os vrios ciclos transcorrem, seguidamente, em
um nico tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupo para a adio de nova DNA-Polimerase ativa.
Todos os reagentes necessrios (o DNA-template, os primers, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) so
misturados com uma soluo tampo que ajusta o pH timo da reao.
Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O
operador deve apenas programar e dar incio para que transcorra a amplificao. Um ciclo dura em mdia
trs minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milho de cpias e, em menos de
duas horas, cerca de um bilho de cpias da seqncia de DNA de interesse.
6

O produto amplificado pode alcanar aproximadamente 10 cpias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2
horas.
A PCR uma ferramenta na biologia molecular to poderosa quanto a descrio das enzimas de
restrio e o Southern blot. Anunciado na Conferncia da Sociedade Americana de Gentica Humana de
1985, a tcnica de PCR

tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um nmero crescente de

publicaes por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). Tcnicamente muitas mudanas tem sido
introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilizao. No entanto, preciso salientar que
para cada situao experimental, novas modificaes tm de ser introduzidas, de tal forma que muito difcil
30

descrever um nico procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, fundamental o conhecimento
bsico das etapas envolvidas na tcnica, para um desenho experimental com sucesso.
A utilizao de PCR to ampla que podem ser editados compndios sobre a metodologia de PCR
em cada especialidade diagnstica. Na aplicao diagnstica e, particularmente, na Microbiologia a atuao
da biologia molecular muito ampla, apesar de estar ainda no cunho de afirmao e de uso restrito
pesquisa e ao ensino. Porm, muitas doenas infecciosas dependem de um diagnstico rpido e seguro, que
com certeza a nica soluo est na PCR. A liberao para uso rotineiro no laboratrio clnico ainda no
permitido para toda as possveis aplicaes, no entanto, a necessidade de meios mais sensveis e precisos
faro com que a tcnica de PCR se torne uma ferramenta impressindvel e quase obrigatria no diagnstico
precoce de vrias doenas, apesar do custo ainda estar um pouco elevado.
A tcnica de PCR to sensvel que capaz de amplificar uma simples molcula de DNA e tal a
sua especificidade, que uma simples cpia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da
sequncia genmica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Como se
pode notar, a sensibilidade e a especificidade que o mtodo pode oferecer algo singular. A PCR utilizando
DNA polimerases termoestveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n
4.683.195, em julho de 1987 e n 4.683.202.
Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicaes do
PCR para a comunidade cientfica e atualmente inesgotvel a sua aplicao prtica tanto na pesquisa
bsica como na aplicada.
Em termos prticos, podemos dizer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com a ressalva
da necessidade da optimizao para cada tipo de aplicao. Os principais problemas citados na literatura
para a padronizao pode-se assim resumir: No deteco do produto, baixo rendimento do produto
desejado, presena de bandas no especficas devido a mispriming ou misextension dos primers,
formao de dmeros dos primers que competem pela amplificao com o produto desejado, mutao ou
heterogeneicidade devido a erro de incorporao.

Primer: um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequncia j


conhecida do cido nucleico, geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automticos,
que podem ser adquiridos no comrcio para fins j definidos ou se escolhe a regio desejada do
DNA ou RNA a ser amplificada.

Sonda (probe): um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas, substratos
antigenicos, substncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta
especificidade a uma sequncia complementar do cido nucleico alvo (escolhido).

31

PROTOCOLO GERAL PARA PCR

1. A reao pode ser realizada no volume de 100l ou 50l. Escolha o volume a ser usado.
2. Para o volume de 100l, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento hermtico.
5

2.1. DNA a ser amplificado 10 a 10 molculas(target DNA ou Template)


2.2. 20 pmol de cada primer (ou iniciadores,Tm>55C preferido)
2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20C)
2.4. MgCl 2 1,5 mM
2.5. Kcl 25 mM
2.6. Tween 20 a 0,05%
2.7. 100g/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease
2.8. 50 M de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase
o

3. Pr-incubar (se for DNA genmico) 10 minutos a 94 C

4. Programar o termociclo em:


Desnaturao: 96 C (pode variar de 94 a 96C), por 15 segundos a 2 minutos
Hibridizao (Primer Annealing): 55 C (pode variar de 45 a 62C), por 30 segundos a 2
minutos
Polimerizao (Extension): 72C(pode variar de 55 a 72C) por 1,5 minutos
Extenso final do programa: de 25 a 30 ciclos, de 72C por 5 a 10 minutos
Estabilizao e parada de reao: 4C ou adio de 10 mM de EDTA.

FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR

1. Atividade enzimtica da Taq polimerase


Se os outros componentes da reao estiverem optimizados, de 1 a 2,5 U so suficientes para uma
boa amplificao em 100l de volume total.
Quando em etapa de optimizao, as quantidades da enzima a serem utilizadas coompreendem o
intervalo maior entre 0,5 a 5 U/100l. Obs: A quantidade de enzima necessria varia com as caractersticas
do template e do primer.
Se a concentrao de enzima for muito alta, ocorre o aparecimento de produtos inespecficos que
podem se acumular; e ao contrrio, se baixo, a quantidade de produto desejado ser insuficiente.
A origem comercial da Taq polimerase um importante fator, se a aquisio for de vrios
fornecedores, pode-se obter resultados diferentes, devido as diferentes formulaes, diferentes condies de
32

ensaio e pode diferir na definio da unidade.

2. Deoxinucleotdeo trifosfato:
Se a soluo de uso for preparada a partir de soluo estoque necessrio neutralizar para pH 7,0,
seguida de determinao espectrofotomtrica da concentrao. A soluo primria deve ser preparada a
10mM, distribuida em alquotas e estocada a -20C. A soluo de trabalho recomendada de 1mM de cada
dNTP. A estabilidade dos dNTPs aps os vrios ciclos de amplificao permanece em aproximadamente
50% da concentrao inicial. Na reao, a concentrao recomendada varia de 20 a 200M para um
resultado com boa especificidade e reprodutibilidade. Deve-se utilizar as mesmas concentraes de dNTP ou
valores equivalentes, isto minimiza os erros de incorporao. Quanto menor a concentrao de dNTPs
menor o risco de mispriming ou erro de incorporao de nucleotdeos. A quantidade mnima recomendada
de 20M de cada dNTP para 100l de reao, quantidade suficiente para sintetizar 2,6 g de DNA ou
10pmol de uma sequncia de 400bp. Ultimamente se estabeleceu que 2M foi capaz de dar uma alta
sensibilidade de deteco e amplificao de pontos de mutao do gene ras. De qualquer modo, para cada
experimento deve-se encontrar uma quantidade tima.

3. Concentrao de Magnsio.
A concentrao de magnsio bastante importante, pois afeta a hibridizao(annealing), a
temperatura de separao do DNA alvo (melting), o produto de PCR, a especificidade do produto, a
atividade da enzima Taq, leva formao de dimerizao de primer, prejudicando a fidelidade do
experimento. A concentrao dos ions Mg

++

deve estar entre 0,5 a 2,5 mM acima da concentrao total do

dNTPs. Sempre deve-se considerar a concentrao de EDTA na amostra que pode interferir na
++

concentrao dos ons Mg .

4. Outros componentes
O tampo recomendado para o PCR o TRIS-HCl na concentrao de 10 a 50 mM com pH entre
8,3 a 8,8 medido a 20C. Este tampo dipolar tem um pKa de 8,3 a 20C e um pKa de -0,0021/C, portanto, o
pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8,3 a 20C varia de 7,8 e 6,8 durante as condies de termociclagem.
Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reao para facilitar a hibridao dos
primer. O Cloreto de sdio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase.
O DMSO (dimetilsulfoxido) util para a reao de amplificao com Klenow fragmento de E. coli
DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%, apesar de Chamberlain e
cols. o recomendarem para amplificao de sequncias multiplas, na mesma reao.
A gelatina, a protena (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente no inico como o Tween 20(0,050,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua
utilizao.

33

5. HIbridao dos iniciadores (Primer Annealing)


A temperatura e tempo requerido para o hibridao de primer depende da composio em bases,
do comprimento e da concentrao. A temperatura bsica aplicvel seria de 5C abaixo da Tm verdadeira
dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extenso dos
primers ocorrer em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridao. O intervalo de ao da atividade
enzimtica varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85C. A temperatura de annealing no
intervalo de 55 a 72C, geralmente d melhor resultado. Numa concentrao tpica de primers(0,2M), o
annealing s requer poucos segundos.
O aumento da temperatura de annealing aumenta a discriminao contra os erros de hibridizao
dos primers mispriming, reduzindo a extenso ou polimerizao dos nucleotdeos incorretos no final 3 dos
primers. Portanto, as temperaturas de annealing mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos
poder aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade mxima, no incio dos ciclos aumentase a temperatura de annealing e adiciona-se a Taq polimerase aps a primeira etapa de desnaturao e
annealing do primer.
Baixas temperaturas de etapas de extension com altas concentraes de dNTPs favorecem os
erros de polimerizao, ou seja, os nucleotdeos so incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns
autores recomendam a utilizao de primers mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As
temperaturas so de 55 a 75C para annealing e extension e 94 a 97C para desnaturao e separao
de cadeias.

6. Extenso (ou polimerizao)


O tempo de polimerizao ou extension tambm depende de alguns fatores como a concentrao e
o comprimento do DNA a ser amplificado. A extenso dos primers tradicionalmente realizada a 72C,
porque esta temperatura prxima do timo para extenso de primers no modelo de DNA do M13. A mdia
-1

de incorporao dos nucleotdeos a 72C varia de 35 a 100 nucleotdeos por seg dependendo do tampo,
pH, concentrao salina e natureza do DNA alvo.
O tempo de 1 minuto a 72C considerado suficiente para a extenso de produtos de at 2kb. No
entanto, tempos mais prolongados podem ser teis em casos de poucos ciclos e se a concentrao do
substrato for muito baixa e tambm em ciclos prolongados quando a concentrao do produto ultrapassa a
concentrao da enzima.

7. Tempo e temperatura de desnaturao


A maioria das causas de insucesso do PCR a incompleta desnaturao do DNA a ser amplificado
ou do produto de PCR. Uma temperatura tpica de desnaturao 95C por 30 segundos, ou 97C por 15
segundos, porm, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C.
Apenas alguns segundos so necessrios para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porm, um maior
tempo necessrio para se atingir a temperatura dentro do tubo de reao. Seria desejvel a monitorao
34

da temperatura dentro do tubo de reao utilizando uma sonda trmica de medida exata. A desnaturao
incompleta reduz a possibilidade hibridizao entre o DNA alvo e os primers, diminuindo o rendimento do
produto do PCR. Por outro lado, a desnaturao por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de
atividade da Taq polimerase, que maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95
e 97,5C, respectivamente.

8. Nmero de ciclos.
O nmero de ciclos depender da quantidade de DNA inicial, quando todos os parmetros esto
optimizados. Um erro comum que se comete um excesso de nmero de ciclos. Segundo Kary Mullis Se
voc tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cpia de gene, existe alguma coisa
seriamente errada com o seu PCR. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de
produtos no especficos. Obviamente, um nmero muito baixo dar um baixo rendimento do produto
desejado.

9. Iniciadores (Primers)
A concentrao dos primers entre 0,1 a 0,5 mM so, na maioria das vezes, satisfatrios.
Concentraes maiores podem promover mispriming e acmulo de produtos no especficos e podem
aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do template denominado de primerdimer(dimerizao de primer). Produtos no especficos e dimerizao de primer so por si s substratos
para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo
rendimento do produto desejado.
Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28
nucleotdeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composio. A temperatura de
melting (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propsito, pode-se usar a regra da
prtica de 2C para o A ou T e 4C para o G ou C. Dependendo da aplicao, o Tm entre 55C e 80C so os
recomendados. Deve tambm evitar a complementaridade na poro 3 do par de "primers", pois isso pode
promover a formao de artefatos de dimerizao de primers e reduzir a produo do produto desejado.
Outra observao evitar trs ou mais C+G na poro 3 dos primers que pode promover mispriming na
sequncia rica em G+C. Deve-se evitar, quando possvel, a presena de sequncias palindrmicas dentro
dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, salutar ento tentar outro par de
primers. Uma razo menos bvia para alguns primers falharem a presena de estrutura secundria no
DNA template. Neste caso, substituir com 7-deasa-2deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers
para propsitos especiais tambm podem ser elaborados tais como a adio de stios de enzimas de
restrio, mutao in vitro, ATG start codon, e outros.

10. Efeito Plateau


O termo efeito plateau usado para descrever a atenuao exponencial da taxa de formao de
produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acmulo de 0,3 a
35

1 pmol do produto desejado. Dependendo das condies da reao e da ciclagem trmica, um ou mais
parametros podem ser afetados:
1)utilizao dos substratos (dNTP ou primers),
2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas),
3)inibio por produto formado(pirofosfato,DNA duplex),
4)competio por reagentes pelos produtos inespecficos ou dimerizao de primers,
-8

5) reannealing de produto especfico na concentrao acima de 10 (pode diminuir a eficincia da


extenso ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdiviso na migrao das cadeias e
deslocamento de primers) e
6) incompleta desnaturao dos templates ou DNAs formados ou separao do produto em alta
concentrao.
Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau a presena inicial de baixas
concentrao de produtos desejado com presena de produtos no especficos resultantes de eventos de
mispriming que podem continuar a ser amplificados preferencialmente. A optimizao do nmero de ciclos
de amplificao a melhor maneira de evitar a amplificao de produtos indesejveis.

ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR


A. Protocolo bsico para desenhar um iniciador (primer) 5para 3( sense)
Regras gerais:
Determinar a prioridade da utilizao(clonar, PCR, hibridizar, outros)
Se for para clonar: analisar a sequncia do cDNA estudando as enzimas de restrio do DNA alvo e
seguir o protocolo a seguir:
1. Copiar a sequncia e regio desejada do cDNA de interesse (no mais que 6 aminocidos
ou 18 bp)
2.Adicione no incio 6 bases aleatrias
3.Adicione a sequncia a enzima de restrio desejada (Hind III, EcoRI, etc)
4. Acrescentar a sequncia que codifica o incio da sntese de aminocido(metionina -ATG)
5. Checar a sequncia em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que no deve
ultrapassar 50%
Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridizao, PCR diagnstico etc, omita as
etapas 2, 3, 4. e acrescente mais pares de base para ajustar a relao C+G se necessrio(no > 30).

Ex 5 AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3


GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3

36

random

NdeI+iniciador

B. Protocolo bsico para desenhar um iniciador (primer) 3para 5 (anti-sense)


Regras gerais:
Determinar a prioridade da utilizao
Se for para clonagem seguir os mesmos critrios acima para o sense primer
1. Copiar a sequencia da regio desejada do cDNA de interesse( no mais que 6 aminocidos ou
18 bp)
2. Adicione a sequncia que codifica o stop codon no final da sequncia(TAG TAA)
3. Adicione a sequnicia da enzima de restrio
4. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relao C+G)
5. Faa a complementar dessa sequncia
6.Copie a sequencia complementar em direo oposta ou seja do 5 para o 3(pois o sintetizador
sempre iniciado 5)
7. Checar a sequncia em voz alta, calcular a relao C+G, no deixando ultrapassar 50%
(aceite com as base aleatrias acrescidas).
8. Se no usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada, faa a complementariedade e
copie a sequencia inversa, checando a sequencia em voz alta.

Ex. 5 CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3


5CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC
STOPSTOPHindIII bases aleatrias

3 GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5
5GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3

Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador, para avalia-los


adequadamente antes de requerer a sntese.

Literatura recomendada

Chamberlain, J.S. et al 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via
multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res, 16:11141-11156.

Ehln T. & Dubeau, L. 1989. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutationspecific,m inosine containing oligonucleotide primers. Biochem Biophy. Res. Commun. 160:441-7.
37

Mullis, K.B. & Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed reaction.
Methods Enzymol.155:335-50.

Mullis K.B. et al 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-73.

Saiki, R.K.& Gelfand, D.H. 1989. Introducing amplitaq DNA polymerase . Amplifications1:4-6.

Saiki R.K. et al 1985. Enzymatic amplification of (globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.

38

MODELO DE PROTOCOLO DE PCR

Data: ___/ ___/

REAGENTES

ORDEM DE

VOLUME

CONCENTRAO FINAL

ADIO
GUA ESTRIL

____

____

____

Tampo PCR 10X

____

____

____

____

dATP (___mM) ....

. 3

____

____

____

____

dCTP (___mM) .....

____

____

____

____

dGTP (___mM) .....

. 5

____

____

____

____

dTTP (___mM) .....

____

____

____

Primer 1 _________

____

____

____

____

Primer 2 _________

____

____

____

____

MgCl2 25 mM

____

____

____

Dimetilsulfoxido

10

____

____

____

DNA ( amostra)

11

____

____

____

DNA (controle +)

12

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

____

gua (controle - )...

.13.........

Taq DNA polimerase

12

____

____

____

____
____
____

Se necessrio fazer um mistura dos reagentes comuns evitando contaminao e erros na pipetagem.

39

Aula nmero 5

PCR NO DIAGNSTICO DE DOENAS GENTICAS


Marcos de Oliveira Machado
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

DOENAS GENTICAS
Atualmente j foram mapeados aproximadamente de 800 a 2800 locos gnicos. As doenas
genticas so causadas por alteraes, denominadas mutaes, nesses locos ou em outros a serem ainda
mapeados.. A maioria das doenas genticas so raras, mas a ocorrncia de uma doena em particular
representa um urgente problema para uma famlia afetada. As doenas determinadas geneticamente no
so apenas um grupo marginal para a medicina, mas representam juntas uma considervel proporo de
todos os processos das doenas mdicas.
At o presente, em torno de 2800 genes foram mapeados nos cromossomas autossmicos
humanos, e aproximadamente 230, no cromossoma X. Mutaes nestes genes levam a doenas genticas
monognicas. Para mais de 800 desordens clnicas a leso intragnica conhecida. Os mtodos de
mapeamento so muitos e variados, e eles complementam um ao outro. Dos vrios mtodos desenvolvidos
para isolar e identificar os genes defeituosos (Ex: loco no qual as mutaes causam uma doena), os
seguintes tem sido mais freqentemente utilizados: (1) posio do clone baseado na posio conhecida do
cromossomo, (2) estratgia do gene candidato, onde um gene previamente conhecido com um papel
funcional normal sabe-se conter mutaes, e (3) mapeamento de pequenas regies para verificar delees
ou para analisar pontos de ruptura (breakpoints) com translocaes de cromossomas.
Numerosas doenas so clinicamente similares (fentipo similar), mas tem diferentes causas
(princpio da heterogeneidade gentica). A heterogeneidade allica (devido a diferentes alelos mutados em
um loco gentico) e heterogeneidade hetero-allica (devido a mutaes em diferentes locos genticos)
podem ser diferenciadas. Na prtica, isto importante para o diagnstico e aconselhamento gentico, j que
o modo da herana e o curso da doena podem diferir.

POLIMORFISMOS E MUTAES
A sequncia de nucleotdeos do DNA determina uma correspondente sequncia de aminocidos
atravs da transcrio e traduo. Se a sequncia de DNA sofre mutaes, a sequncia de aminocidos
pode estar alterada no stio correspoondente (mutao nvel protico). Assim, toda mutao tem uma
posio definida. O cdigo do DNA e seu correspondente polipeptdeo so colineares. Uma mutao na
sequncia de bases do DNA produz um cdon dferente. A posio onde resultou a mudana da sequncia
de aminocidos corresponde a posio da mutao.
40

Basicamente, h trs diferentes tipos de mutao envolvendo um s nucleotdeo (mutao


pontual): substituio (troca), deleo (perda), e insero (adio). Na substituio o codon alterado e
pode codoficar para um diferente aminocido. Dois tipos de substituio podem ocorrer: transio (troca de
uma purina por outra purina ou uma pirimidina por outra) e transverso (mudana de uma purina por uma
pirimidina ou vise versa). Uma substituio pode alterar um cdon de modo que um aminocido diferente
estar presente neste stio, mas isto no tem efeito na fase de leitura, caracterizando a mutao de
sequencia trocada (missense mutation), enquanto que uma deleo ou insero causam uma mudana na
fase de leitura (mutao de sequencia descolada ou frameshift mutaion). Na mutao de sequencia
deslocada, as sequncias seguintes no codificam para um produto gentico funcional (mutao de
sequencia interrompida ou nonsense mutation). As mutaes podem ocorrer em vrios stios do DNA, mas
existem determinados stios em que ela ocorre com maior frequncia - os chamados pontos quentes
(hotspots).
A maioria dos pares de base incorretamente formados durante o processo de polimerizao no se
torna permanentemente incorporados ao DNA. As DNA-polimerases possuem uma atividade exonuclesica
3 5 que garante uma remoo de praticamente todo nucleotdeo erroneamente pareado. Alm disso,
cerca de um em cada dez nucleotdeos corretamente pareados removido pela atividade de exonuclesica
3 5da DNA- polimerase III, que exerce funo de revisar a polimerizao.
Todos os seres vivos sofrem um certo nmero de mutaes como resultado de funes celulares
normais ou interaes aleatrias com o ambiente, denominadas de mutaes espontneas. Alguns agentes
podem aumentar o grau de mutaes, os agentes mutagnicos, e as modificaes que eles causam so
denominadas mutaes induzidas. Estes agentes podem ser qumicos (ex: cido nitroso) ou fsicos (ex:
raios U.V.). Os agentes qumicos possuem estruturas suficientemente similares s bases normais para
serem metabolizadas e incorporadas ao DNA durante a replicao. Contudo, elas so suficientemente
diferentes para aumentar a frequncia de pareamento errado e, portanto, de mutao. As radiaes
aumentam a excitabilidade dos tomos presentes no DNA, e isto a base dos efeitos mutagnicos da luz
ultravioleta e da radiao ionizante.
Na natureza, os organismos das mesmas espcies usualmente diferem em alguns aspectos quanto
a sua aparncia. As diferenas so geneticamente determinadas e so denominadas de polimorfismo. Em
muitos locos gnicos, dois ou mais alelos podem ocorrer, constituindo o polimorfismo gentico. O
polimorfismo gentico definido como a ocorrncia em uma populao de dois ou mais fentipos
alternativos determinados geneticamente devido a diferentes alelos, pelo qual o menos frequnte alelo no
pode ser mantido somente por repetidas mutaes. Um loco gentico definido como polimrfico se o (s)
alelo (s) raro (os) tem uma frequncia de pelo menos 0,01 (1%), e como um resultado, heterozigotos para
tais alelos ocorrerem com uma frequncia de pelo menos 2%. O polimorfismo pode ser observado nvel do
indivduo como um todo (fentipo), em formas variantes de protenas e substncias de grupos sanguneos
(polimorfismo bioqumico), caractersticas morfolgicas dos cromossomos (polimorfismo cromossomal), ou
nvel de diferenas na sequncia de nucleotdeos do DNA (polimorfismo de DNA ou gentico).

41

Geralmente, o polimorfismo no perceptvel pelo fentipo. Os mtodos laboratoriais so o meio


pelo qual ele detectvel. Diferenas individuais nas sequncias das bases dos nucleotdeos do DNA podem
ser determinadas. Se a diferena na sequncia levar a uma mudana no cdon, um diferente aminocido
ser incorporado no stiocorrespondente, Isto pode ser demonstrado pela anlise do produto do gene.
O polimorfismo de uma protena (produto do gene) pode ser demonstrado por eletroforese em gel
quando a forma variante difere de outras pela presena de um aminocido com carga eltrica diferente.
Neste caso, o alelo forma um produto gnico que pode ser distinguido devido sua diferente velocidade de
migrao em um campo eltrico (eletroforese). O polimorfismo que no leva a uma mudana na carga
eltrica no pode ser identificado dessa maneira.
nvel molecular, o polimorfismo pode ser identificado pelo uso de enzimas de restrio que
reconhecem no DNA determinadas sequncias de bases nucleotdicas (stios), especficas para a sua
atividade de clivagem. Cada enzima (obtidas de uma ampla variedade de bactrias) tem em particular um
alvo na dupla fita de DNA, geralmente uma sequncia especfica de 4 a 6 bp. A mudana em uma das bases
da sequncia determinar a atividade ou no da enzima naquele stio especfico. Dessa forma, pode-se
identificar este tipo de polimorfismo, aps a atividade dessas enzimas, por eletroforese em gel.

ANLISE DO POLIMORFISMO DE DNA POR PCR


O surgimento de novas tcnicas em Biologia Molecular tem alterado significativamente as formas de
abordagem dos problemas bsicos e aplicados nessa rea. O desenvolvimento da tcnica de amplificao
de segmentos de DNA utilizando a reao de polimerizao em cadeia (PCR) abriu enormes perspectivas
para a anlise de genes, diagnstico de doenas genticas, deteco de agentes infecciosos, entre outros
exemplos.
A anlise do polimorfismo de DNA por PCR realizada a partir de iniciadores adjacentes a uma
determinada regio polimrfica do DNA, tornando possvel amplificar-se um segmento de DNA que pode ser
ento, analisado de diferentes formas, como por exemplo, por sequnciamento direto do DNA, por clivagem
com endonucleases de restrio (RFLP), ou por hibridizao com sondas genticas. A anlise do produto de
PCR por determinao da sequncia de nucleotdeos a mais informativa em relao aos polimorfismos.
Quando j se tem informao sobre a presena de polimorfismo em um determinado loco, em nvel
da sequncia de nucleotdeos, mtodos rpidos e simples podem ser utilizados para deteco dos produtos
de PCR por tcnicas de hibridizao com sondas genticas especficas, usando-se condies em que a
diferena de uma nica base pode ser detectada. Esse mtodo tem sido aplicado na deteco de mutaes
em doenas genticas, como a anemia falciforme, talassemias e fibrose cstica, bem como na tipagem de
HLA. O polimorfismo de DNA tambm pode ser detectado diretamente na reao de PCR. Nesse caso,
iniciadores contendo a regio 3correspondente sequncia polimrfica so utilizados e somente ocorre a
amplificao quando h o pareamento correto das bases na regio 3.

42

A tcnica de PCR foi utilizada, pela primeira vez, na amplificao de DNA genmico para a deteco
de anemia falciforme. Desde ento, vrias outra doenas, como a - Talassemias, distrofia muscular de
Duchenne, sndrome de Lesch-Nyham, fenilcetonria, fibrose cstica, doena de Tay-Sachs e doena de
Gaucher, tem sido diagnosticada por PCR.
Para algumas doenas em que a predisposio gentica bastante alta, tais como doenas
cardiovasculares e doenas auto-imunes, o uso da PCR tem sido de grande utilidade. Mutaes no gene do
receptor da lipoprotena de baixa densidade (LDL) e polimorfismos nos genes da apolipoprotena B e E (Apo
B e Apo E) tm sido detectados por PCR e relacionados com o risco de doenas cardiovasculares. Doenas
auto-imunes, como a diabete melito insulina-dependente, esclerose mltipla e artrite reumatide, esto
associadas aos alelos especficos dos locos HLA classe II.

POLIMORFISMO DE APOLIPOPROTENAS
Apolipoprotena B
A apo B ocorre no plasma em duas formas primrias designadas apo B-100 e apoB-48, que
possuem massa molecular relativa (Mr) de 513 Kda e 246 kDa, respectivamente. A apo B-100 uma das
maiores protenas j conhecidas, contendo 4536 resduos de amino cidos e 8-10% de carboidratos.
Defeitos genticos da apo B tm sido descritos, como a hiperapoliproteinemia B (hiperapo-B) e a apo
B defeituosa familiar, que podem resultar em diminuio da remoo plasmtica dos remanescente de VLDL
e das LDL. A hiperapo-B consiste em uma alterao do gene da apo B-100, resultado da substituio da
arginina, da posio 4019 na sequncia primria da molcula de protena, pelo triptofano. A hiperapo-B
caracterizada pelo aumento de partculas de LDL pequenas e densas, devido a uma superproduo de LDL,
secundria ao aumento da sntese de apo B-100 e na remoo plasmtica da LDL. Essas alteraes
metablicas esto fortemente associadas com a doena coronariana prematura, embora alguns pacientes
com hiperapo-B apresentem nveis normais de colesterol e triacilgliceris no plasma.
A apo B Defeituosa Familiar ocorre por substituio do amino cido arginina (Arg) pela glutamina
(Gln) no resduo 3500. Essa mutao altera a corformao do domnio de ligao da apo B-100 aos
receptores da LDL, prejudicando a interao da LDL com esses receptores. Com isso h uma reduo na
remoo plasmtica da lipoprotenas, que se acumula no plasma, levando a hipercolesterolemia moderada
ou severa que importante fator de risco para o desenvolvimento de doenas aterosclerticas.
Recentemente, a clonagem e o sequnciamento do gene da apo B, localizado no brao curto do
cromossoma 2 (2p 23-24), tem permitido estudar a variao do gene nvel de DNA.
As endonucleases (enzimas de restrio) reconhecem sitios especficos na sequncia de
nucleotdeos do DNA (stios de restrio), onde se ligam e cortam, produzindo diversos fragmentos de
acordo com o nmero de stios para aquela enzima. O polimorfismo ocorre quando as mutaes na
sequncia de DNA criam ou abolem um stio de restrio. Analisando estes fragmentos de restrio
polimrficos, pode-se identificar alelos de um loco gentico em particular que esto associados com um
43

fentipo clnico, caracterizando o polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrio (RFLP). A


associao do polimorfismo gentico com uma dada doena ou com um fator de risco pode existir por
algumas das seguintes razes: o polimorfismo por s s pode constituir uma mutao funcional; pode no ter
um efeito direto, mas estar acoplado a um desequilbrio atravs da mutao funcional; ou a associao pode
ser devido a outros fatores.
Alguns desses RFLP podem estar associados com variaes nos nveis plasmticos de lipdeos e
aterosclerose. Diversos RFLP da apo B foram descritos. A mais consistente associao entre os RFLP e os
lipdeos plasmticos envolve o polimorfismo XbaI, localizado na terceira base do cdon 2488 do gene da apo
B. Uma nica mudana na terceira base deste cdon, sem alterao na sequncia de aminocidos da apo B,
suficiente para determinar dois tipos de alelos para este tipo de polimorfismo, os quais podem ser
detectados pela enzima XbaI: o alelo X+ (presena do stio de restrio) e o alelo X- (ausncia do stio de
restrio); formando assim trs gentipos: X-X-; X-X+ e X+X+. Muitos estudos foram feitos relacionando os
alelos e/ou gentipos do polimorfismo XbaI com os nveis plasmticos de colesterol total, colesterol da LDL,
apo B e triglicerdeos. Alguns dados revelam que a LDL de indivduos com o gentipo X-X- possuem maior
afinidade pelo receptor da LDL quando comparada com a LDL de indivduos com o gentipo X+X+.
Outros RFLP do gene da apo B, tais como o polimorfismo EcoRI, MspI e Ins/Del, tambm vem sendo
pesquisados com relao a eventuais influncias no mecanismo das doenas coronarianas aterosclerticas
e no seus fatores de risco ambientais, como a dieta.

Apolipoprotena E
A apo E o principal constituinte protico das VLDL e possui um papel importante no metabolismo
das lipoprotenas. Ela tambm est presente nos quilomcrons e seus remanescentes, e nas IDL. A sua
principal funo est na contribuio para a interao das lipoprotenas com os receptores celulares
responsveis pela captao destas lipoprotenas.
A funo da apo E no desenvolvimento da aterosclerose no est totalmente esclarecida e
especialmente o mecanismo de regulao dos nveis de colesterol atravs desta apolipoprotena ainda
obscuro. Por outro lado, tem se observado que o polimorfismo da apo E influncia na concentrao de
colesterol da LDL em diferentes popula!es.
A estrutura e conformao da apo E em soluo, e especialmente sua topografia na superfcie das
partculas lipoproticas, provavelmente influnciam no metabolismo dessas lipoprotenas sob condies
normais e patolgicas. O catabolismo de partculas ricas em triglicerdeos, atravs de receptores pelos quais
a apo E serve como ligante, podem desta maneira ser modulados pela conformao da apo E, a qual pode
influnciar na afinidade pelo receptor ligante. A apo E o nico ligante para o receptor da VLDL em algumas
lipoprotenas tais como os quilomcrons e seus remanescentes. Em outras lipoprotenas, incluindo a VLDL e
a LDL, a apo E divide a propriedade de ligante-receptor com a apo B-100.
Em humanos o gene da apo E est localizado no cromossoma 19 cercado nas proximidades pelos
genes da apo C-I e C-II e bastante distante do gene do receptor da LDL. Dois tipos de polimorfismos da apo
E tem sido detectados, um nvel de gene e outro nvel de ps-traduo; o primeiro polimorfismo da apo E
44

devido a presena de trs alelos comuns (2, 3 e 4) presentes em um nico loco. A determinao desses
alelos pode gerar seis diferentes gentipos, sendo trs heterozigticos (E3/2, E4/2 e E4/3) e trs
homozigticos (E2/2), E3/3 e E4/4). O gentipo E3/E3 o mais comum e est presente em 60% da
populao.
No primeiro tipo de polimorfismo da apo E, o gentipo E2/2 (associado ao fentipo E2) difere do E3/3
(E3) pela substituio da arginina pela cistena na posio 158 da sequncia de amino cidos da apo E,
enquanto que o gentipo E4/4 (E4) difere do E3/3 por substituio da cistena-112 pela arginina. Essas
diferenas na estrutura primria influenciam na capacidade de ligao da apo E pelo receptor da LDL (B,E),
sendo que o fentipo E2 possui afinidade aproximadamente 100 vezes menor por esse receptor, que o E3.
Os indivduos que apresentam o fentipo E2 tm nveis plasmticos das VLDL e de seus remanescentes
aumentados, que esto associados com a disbetalipoproteinemia familiar (Hiperlipoproteinemia tipo III) e
representam riscos em potencial para o desenvolvimento da aterosclerose. No fentipo E4 a capacidade de
ligao do receptor da LDL, normal, porm os nveis plasmticos de colesterol e de LDL esto
aumentados. Esse polimorfismo da apo E tambm pode ser analisado pela tcnica da PCR seguido do uso
de enzimas de restrio, especficas para estas regies polimrficas.

POLIMORFISMO DO RECEPTOR DA LDL


Alm das apolipoprotenas os receptores celulares das lipoprotenas tambm esto relacionados
com as variaes nos nveis sricos lipdicos e lipoproticos. Os receptores so estruturas glicoproticas
que esto agrupados em regies definidas da membrana celular, onde a lipoprotena se liga por intermdio
da apolipoprotena. Eles fazem parte do mecanismo de remoo das lipoprotenas do plasma e fornecimento
do colesterol e triacilglicerdeos para as clulas. Por isso so responsveis pela manuteno da homeostase
dos lipdeos e das lipoprotenas no plasma e nos tecidos e, ao mesmo tempo, protegem as clulas do
acmulo desses lipdeos, principalmente do colesterol.
Uma variedade de clulas humanas contm receptores de alta afinidade para a LDL, tambm
denominados receptores B,E. A LDL liga-se a estes receptores por intermdio da apo B-100 presente nas
partculas. O receptor da LDL humano constitudo de 839 resduos de amino cidos e apresenta cinco
domneos.
Mutaes no gene do receptor da LDL causa uma doena hereditria do metabolismo lipdico
chamada de Hipercolesterolemia Familiar (FH). A deficincia funcional no receptor da LDL na FH resulta no
acmulo de LDL no sangue. O resultado deste alto nvel de LDL induz enfim a uma aterosclerose prematura
e ao infarto do miocrdio. Alguns anos atrs um grupo de pesquisadores sugeriu que os genes normais do
loco do receptor da LDL poderiam contribuir para variao populacional nos nveis sricos de colesterol. Nos
meados de 1980, com o advento da tecnologia do DNA, surgiram novas possibilidades para examinar este
problema.

45

O gene do receptor humano para a LDL foi clonado e mapeado no cromossoma 19p 13-2. Um amplo
espectro de mutaes localizadas na parte estrutural do gene do receptor-LDL tem sido analisadas. Vrios
RFLP foram encontrados no gene do receptor da LDL. Estudando tais polimorfismos detectou-se correlao
com os nveis de colesterol total e LDL alterados. O alelo P- (ausncia do stio de restrio PvuII), do
polimorfismo PvuII do gene do repector da LDL, foi associado ao aumento dos nveis sricos de colesterol
total e da LDL em vrias populaes europias. Outros mostraram que a frequncia do alelo N- do
polimorfismo NcoI) foi significantemente maior em pacientes com FH do que nos indivduos do grupo
controle. Tambm, uma alta frequncia do alelo A- do polimrfismo AvaII foi encontrada em pacientes brancos
Africanos com FH. A ligao entre o polimorfismo do loco do receptor da LDL e um perfil lipoprotico
aterognico sugere que uma mutao no gene do receptor da LDL deve ser responsvel por este fentipo.
Diante de todos estes dados podemos concluir que o polimorfismo gentico das apolipoprotenas B e
E, e do receptor da LDL contribuem de alguma forma para a elucidao dos casos em que ocorrem
respostas individual e populacional diferentes frente a determinados fatores de risco, como a dieta, para as
doenas cardiovasculares.

Literatura recomendada
HALLMAN, D.M., VISVIKINS, S., STEINMETZ, J., BOERWINKLE, E. The effect of variation in the
apolipoprotein B gene on plasma lipid and apolipoprotein B levels: A likelihood-based approach to cladistic
analysis. Ann. Hum. Genet., v. 58, p 35-84, 1994.
PASSAGLIA, L.M.P. Mutao, mecanismos de reparo do DNA e recombinao. In: ZAHA, A. coord. Biologia
molecular bsica. Porto Alegre. Mercado Aberto ed. cap. 6, p. 116-155, 1996.
PASSAGLIA, L.M.P., ZAHA, A. Tcnicas de DNA recombinante. In: ZAHA, A. coord. Biologia molecular
bsica. Porto Alegre. Mercado Aberto ed., cap. 15, p. 307-331, 1996.
PASSARGE E. Color atlas of genetics/Eberhard Passarge, Thieme ed. p. 46,156-158. 1995
WATSON, J.D., HOPKINS, N.H., ROBERTS, J.W., STEITZ, J.A. & WEINER, A.M. Molecular Biology of the
Gene. 4rd ed. Menlo Park: The Benjamin/Cummings Publishing, Inc., 1987

46

Aula nmero 6

APLICAO DO PCR NO DIAGNSTICO DE DOENAS INFECTO-CONTAGIOSAS


Prof.Assoc. Mario Hiroyuki Hirata

Moseley e colaboradores, em 1980, foram os pioneiros da aplicao de tecnologia de DNA em


doenas infecciosas. Eles mostraram no primeiro estudo que a bactria E. coli poderia ser detectada por
Hibridizao de DNA-DNA em amostras impregnadas em papel de filtro e incubadas uma noite em placa de
agar MacConkey, mostrando sensibilidade e especificidade quando comparados com os mtodos de cultura
at ento conhecidos. Na dcada

seguinte probes de DNA capazes de identificar varias bactrias

patognicas j eram disponveis no mercado. A seguir surgiram probes dirigidos para DNA de virus, fungos,
parasitas e helmintos patognicos. Ultimamente, a utilizao de tcnicas em biologica molecular tornou-se
importante em muitos laboratrios inclusive para diagnstico em cortes histolgicos. Com o aparecimento
dos sintetizadores automticos de oligonucleotdeos houve um grande avano na tecnologia de probes
sintticos baseados nas sequncias publicadas e disponveis nos bancos dos genes.

Tcnicas disponveis de PCR de importncia epidemiolgica


PCR para pesquisa de bactrias patognicas
Neisseria menigitidis
Mycobacterium tuberculosis
Richettsia rickettsii
Borrelia burgdorferi
Yersinia pestis
Treponema pallidum
Chlamydia trachomatis
Mycoplasma pneumoniae
Legionella pneumophila
Genes de toxinas de Vibrium cholerae 01
Genes de toxinas de termosensvel e
termolbil de Shiga-like em E. coli
Espcies de Shigella enteroevasiva e de E. coli
Helicobacter pylori

PCR para pesquisas de Virus


HIV I
Hepatite B
RNA de Hepatite C
Herpes simplex
Epstein-Barr
Cytomegalovirus
Varicella-Zoster
Parvosvirus B19
Rotavrus
Adenoviroses
Rubeola
Enteroviroses
Papilomavrus
Papilomavrus tipo 16 e 18
mRNA E6 e E7 por 3S

PCR para deteco de locus de resistncia a


antibiticos
Rifampicina em Micobacterium tuberculosis e M. leprae
Eritromicin e methicilina para Staphylococcus aureus
Penicilinase em N. gonorrhoeae
Aminoglycoside modifying enzyme
Beta lactamases de espectros estendidos.

PCR para pesquisa de parasitas


Trypanosoma cruzi
Leishmania sp
Plasmodium sp
Entamoeba histolytica
Babesia microti
Giardia lamblia
Microsporidium
Toxoplasma gondii

47

PCR NO DIAGNSTICO DAS MENINGITES BACTERIANAS


Professora Dra. Elza Masae Mamizuka
Jane Atobe

A meningite um conjunto de sndromes cujo denominador comum a inflamao menngea


(Gomes, 1991). O perodo de incubao varia de acordo com o agente etiolgico (bactrias, vrus, fungos,
protozorios, helmintos ou espiroquetdeos), sendo as bactrias causadoras mais frequentes de meningite.
As meningites bacterianas constituem um srio problema de sade pblica em todo o mundo. Elas
representam um captulo de importncia pelos altos ndices de morbi-mortalidade, principalmente em
crianas. A meningite bacteriana a mais notvel e comum infeco que ataca o Sistema Nervoso Central
(SNC). Dados da literatura relatam que 70% das ocorrncias se do em menores de 5 anos de idade e a
taxa de mortalidade chega a 28% (Kilpe et al., 1993). As sequelas variam desde os problemas de
comportamento at danos cerebrais irreversveis.
O risco de morte muito alto, especialmente quando no se realiza um tratamento adequado. Assim
sendo, fundamental que o diagnstico e tratamento apropriados realizem-se especifica e prontamente
(Radstrom et al., 1994). No Brasil, o problema se agrava devido ao baixo nvel scio-econmico da
populao, e seus determinantes: pobreza, falta de higiene e baixa nutrio que contribuem para a
disseminao e implantao da meningite, alm do precrio sistema de Sade Pblica que dificulta o
diagnstico precoce e o tratamento adequado. Na Grande So Paulo, o coeficiente de incidncia das
meningites meningoccicas, no ano de 1995, foi de 7,95 casos/100 mil habitantes, com uma letalidade de
20,42% (Dados provisrios do Centro de Vigilncia Epidemiolgica - CVE).
O diagnstico da meningite meningoccica inicia-se com a suspeita clnica, porm a confirmao
feita pelo isolamento e identificao da Neisseria meningitidis em amostras biolgicas como tecido, sangue e
lquor, ou pela deteco de diplococos Gram - negativos. A cultura de sangue apresenta-se positiva em,
aproximadamente, 50% dos pacientes.
A mortalidade dos indivduos com doena meningoccica reduzida quando os antibiticos so
administrados em casos suspeitos, antes da admisso em hospital. Entretanto, na vigncia da
antibiticoterapia, a taxa de isolamento do meningococo no sangue ou no lquor reduzida de 50% para
menos de 5% (NI et al., 1992).
Atualmente, o mtodo de Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido empregado para
amplificar e detectar DNA microbiano em amostras clnicas. Alm da alta sensibilidade, a vantagem deste
mtodo a deteco de bactrias mortas ou inibidas pelo antibitico. Como a meningite bacteriana deve ser
tratada de imediato, h necessidade de rpida deteco de microrganismos para o diagnstico clnico. As
desvantagens da microscopia direta e dos testes imunolgicos para deteco de antgenos, so bem
conhecidos no que diz respeito sensibilidade e especificidade (Gray & Fedorko, 1992). O mtodo mais
especfico para diagnosticar a meningite bacteriana atravs do isolamento do patgeno em cultura, seguida
de identificao (necessidade de 12 a 24 horas de incubao).
48

Para o diagnstico da meningite meningoccica, emprega-se, atualmente, trs estratgias de PCR. A


primeira emprega o PCR para detectar o DNA de um nico patgeno na amostra biolgica. Essa estratgia
tem sido utilizada para detectar DNA de Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes (Kilpi et al., 1993) e
de Haemophilus influenzae (Ketil et al., 1990). O DNA do meningococo pode ser especificamente detectado
pela amplificao do gene da hidropteroato sintetase (dhps) . Esse gene foi clonado a partir do DNA isolado
de cepas de Neisseria meningitidis sulfonamida sensvel e resistente pertencentes aos sorogrupos A, B e C.
O sequenciamento desse gene permitiu construir dois iniciadores para a amplificao do gene dhpa por
PCR, denominados NM1 e NM2. O produto de amplificao tem 950 bp de tamanho.. Outro gene que pode
ser utilizado para deteco de Neisseria meningitidis por PCR o 1S1106, descrito por Ni, H. et al. (1992).
Nesse caso so utilizados iniciadores adjacentes extremidade 5 do gene na posio 850 e na extremidade
3 na posio 1445 do gene, produzindo um fragmento de 596 bp.
A segunda estratgia utilizar duas etapas de amplificao que permitem a deteco de amplo
espectro de patgenos (Radstrom et al., 1994). A primeira etapa de amplificao utiliza um par de
iniciadores, denominados marcadores universais de eubactrias, correspondente a um gene de uma regio
conservada no genoma como o gene da subunidade 16S do rRNA. A finalidade desta etapa de detectar
qualquer agente bacteriano na amostra biolgica. Na segunda etapa, os produtos da primeira etapa so
amplificados utilizando iniciadores especficaos para Neisseria meningitidis,, atravs da tcnica de PCR
"semi-nested" ou so hibridizados com sondas de DNA espcie-especficas. Dados da literatura mostram
que o mtodo de PCR como teste de triagem permite uma rpida deteco do DNA bacteriano de vrias
espcies que causam meningite (Greiser et al., 1994).
A terceira estratgia a amplificao por PCR multiplex, empregando-se iniciadores universais para
amplificar o gene de qualquer tipo de bactria gram-negativa (ex. sonda universal COR28), e iniciadores
especficos para N. meningitidis (ex., sonda RDR 47D1). Na PCR multiplex , as duas sequncias (universais
e espcie-especficas), de 370 bp (universal) e 279 bp (N. meningitidis) so amplificadas em uma nica etapa
de PCR, o que reduz consideravelmente o tempo utilizado na deteco do meningococo.
Devido sua alta sensisibilidade e especificidade, a prova da PCR em lquor um teste rpido,
extremamente til para a confirmao precoce do diagnstico da meningite meningoccica e em situaes
onde a cultura dificultada devido prvia terapia antimicrobiana muitas vezes necessria ou imprescindvel.
Estudos demonstram que cerca de 23% dos casos com diagnstico clnico de meningite aguda no
apresentam confirmao em exames microscpicos ou em culturas (Grey & Fedorko, 1992).
Pela gravidade da enfermidade, justificada tanto pela letalidade como pelo grau de sequelas
neurolgicas, de suma importncia que o diagnstico etiolgico seja determinado o mais rpido possvel,
orientando, desta maneira, a conduta clnica e teraputica.
Literatura recomendada
Gomes, M. C. O. - Como diagnosticar e tratar meningite. Rev. Bras. Med. 48: 9-27, 1991.
Greisen, K.; Loftelholz, M.; Purohit, A.; Leong, D. - PCR primers and probes for 16S rRNA gene of most
species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. CLin. Microbiol. 32: 335351, 1994.
49

Ketel Van, R. J.; Wever, B.; Alphen Van, L. - Detection of Haemophilus influenzae in cerebrospinal fluids by
polymerase chain reaction DNA amplification. J. Med. Microbiol. 33: 271-276, 1990.
Kilpi, T.; Antiba, M.; Markku, J. T.; Pitold, M. - Length of prediagnostic history related to the course and
sequele of childhood bacterial meningitis. Pediat. Infec. Dis. 12: 184-188, 1993.
Kristiansen, B. E.; Ask, E.; Jenkins, A.; Fermer, C. ; Radstrem, P.; Skold, O. - Rapid diagnosis of
meningococcal meningitis by polymerase chain reaction. Lancet. 337: 1568-1569, 1991.
Gray, L. D.; Fedorko, D. P. - Laboratory diagnosis of bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 5: 130-145,
1992.
Ni, H.; Knight, A. I.; Cartwright, K.; Palmer, W. H.; MacFadden, J. - Polymerase Chain Reaction for diagnosis
of meningococcal meningitis. Lancet. 340: 1432-1434, 1991.
Rasdtrom, P.; Backman A.; Qian, N.; Kragsbjerg, P.; Pahlson, C.; Olcen, P. - Detection of bacterial DNA in
cerebrospinal fluid by an assay for simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae and Streptococci using a seminested PCR strategy. J. Clin. Microbiol. 32: 2738-2744, 1994.

50

PCR NO DIAGNSTICO DA TUBERCULOSE


Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Profa. Dra. Elza Masae Mamizuka

INTRODUO
A infeco por micobactrias, acomete pacientes de qualquer idade, sexo ou grupo tnico e no

sendo tratada oportunamente poder ser fatal ou trazer consigo um alto risco de seqelas graves,
principalmente nos casos em que a terapia seja retardada ou inadequada (VIAMONT, 1.992). Atualmente,
com a Sndrome da Imunodeficincia Adquirida (AIDS), o ressurgimento de micobactrias no tuberculosas,
tem aumentado dramaticamente, sendo as de maior interesse em sade pblica as pertencentes aos
complexos M. avium e M. fortuitum que apresentam distinto significado clnico, tanto no tratamento como no
prognstico dos pacientes acometidos, e principalmente com implicaes epidemiolgicas diferentes,
(KIEHN & EDWARDS, 1.987, GUTHERTZ et al., 1.989).
A tuberculose como doena continua a figurar entre as principais enfermidades que afetam a
humanidade (BOOM et al., 1.990, BRISSON-NOEL et al., 1.991). Estima-se que aproximadamente 1/3 da
populao mundial esteja infectada por M. tuberculosis, com incidncia anual de 8 milhes de casos novos
da doena (KOCHI et al., 1.992). Simultaneamente ao aumento da incidncia da tuberculose, tambm
surgiram cepas de M. tuberculosis multi-resistentes s drogas como a rifampicina e isoniazida. Os dados
sobre resistncia primria ou secundria no Brasil variam de regio para regio, sendo de 16,5% no estado
de So Paulo e de 19,1 % no Rio de Janeiro (CVE/SP, 1995). Sem dvida, os principais problemas que se
enfrentam na tuberculose so: o problema scio-econmico, diagnstico clnico-laboratorial adequado e
rpido, tratamento e controle profiltico da doena (WHITE

& GOLD, 1.992; WILLIANS et al., 1.994;

WHELEN et al., 1.995; COOKSEY, et al 1.996).


Os recentes avanos da biotecnologia vem sendo conhecidos nos pases subdesenvolvidos no
entanto, ainda so

escassos os recursos econmicos e a falta de apoio aos centros de pesquisa

tecnolgica, especialmente aos pesquisadores que atuam na rea de sade. Entretanto, a tcnica de
amplificao do DNA pela Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido aplicada nos vrios centros de
pesquisa em diagnstico e indica ser um procedimento simples e rpido, onde os reagentes so estveis e
os equipamentos de baixo custo (CLARRIGDE 1994). Estudos iniciais tm demonstrado que o custo de
insumos e recursos humanos para a realizao da tcnica da PCR e da cultura so semelhantes.
Em razo disso, a tcnica da PCR deve ser proposta tambm como tecnologia apropriada at para
laboratrios de sade pblica do terceiro mundo. Com o aprimoramento de sondas genticas no radioativas
especficas para deteco de micobatrias com emprego de tcnicas eletroforticas e de hibridizao, a PCR
provavelmente, representa um instrumento alternativo interessante para o controle da infeco
especialmente na deteco precoce da tuberculose e da identificao de cepas bacterianas resistentes aos
quimioterpicos (KIRSCHNER et al., 1.993; KOX et al., 1.994; 1.995).

51

Um fator bastante relevante na identificao de micobactrias a demora no crescimento


bacteriano na cultura, alm da dificuldade da realizao dos testes de sensibilidade s drogas pelos
mtodos tradicionais. Outro problema que os mtodos tradicionais apresentam baixa sensibilidade e
especificidade, alm de ter baixa reprodutibilidade. No entanto, o abandono do tratamento propicia o
aumento de transmisso da doena e tambm contribui para o aparecimento de cepas resistentes por
seleo de mutantes na populao das micobactrias.
Considerando as dificuldades encontradas com esses mtodos e a gravidade atual da situao da
tuberculose a nvel mundial, seria muito importante estabelecermos uma metodologia que gere diagnstico
mais rpido com garantia de alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. A introduo de tal tcnica
na rotina diagnstica ser de grande utilidade no somente pela abreviao do tempo mas tambm, pela
facilidade de treinamento tcnico para a formao de recursos humanos nesta rea (HERNANDEZ, 1996).

DIAGNSTICO LABORATORIAL DA TUBERCULOSE

Microscopia Direta
A microscopia ou baciloscopia um mtodo rpido para pesquisar micobactrias, mas requer
4

aproximadamente 10 bactrias/mL de amostra para ser detectado com segurana na maioria das espcies.
A especificidade das baciloscopias positivas alta (84 - 100 %) (DANIEL, 1.990), mas esta porcentagem
pode ser

consideravelmente reduzida em zonas endmicas de infeces pelas bactrias do Complexo

Mycobacterium avium (MAC).


A colorao fluorescente tem melhorado a sensibilidade da microscopia direta,

sem superar de forma

considervel obtida com a colorao de Ziehl-Neelsen, que apesar de apresentar especificidade de 99 %,


tem uma sensibilidade baixa, aproximadamente de 30 % a 40 % por necessitar de uma concentrao
aumentada de bacilos na amostra a ser estudada. Exames mltiplos das amostras, aumentam a
sensibilidade, melhorando o diagnstico (KENNEDY & FALLON, 1.979)

Cultura

A cultura um mtodo mais sensvel e especfico do que a microscopia, mas requer de 3 at 8 semanas
para o crescimento. A optimizao de meios seletivos acoplados a mtodos radiomtricos (BATEC) de
deteco de crescimento precoce de micobactrias, pode diminuir, consideravelmente, o tempo do
diagnstico, especialmente se o inculo inicial alto e adequado. Entretanto, o alto custo do equipamento e
a necessidade do

14

C, torna-o inacessvel para a maioria dos laboratrios de mdio e pequeno porte. A

sensibilidade da cultura varia entre 20 e 90 %, dependendo da quantidade da amostra submetida cultura e


da infraestrutura do laboratrio (KENNEDY & FALLON, 1.979; MOLAVI & LEFROCK, 1.985). De todas as
desvantagens apresentadas pelos mtodos anteriormente mencionados, a biologia molecular pode ser
considerada uma excelente alternativa no diagnstico deste gnero bacteriano.

52

PESQUISA DE MICOBACTRIAS POR TCNICAS MOLECULARES


Os recentes avanos da engenharia gentica e da biotecnologia trazem interesse queles que esto

familiarizados em inovao e desenvolvimento. E, com o aprimoramento de sondas genticas (DNA-Probe)


no radioativas e iniciadores mais especficos para deteco com eletroforese, a PCR provavelmente,
representar um instrumento alternativo para o controle da tuberculose nos pases em desenvolvimento.
Dentre as principais tcnicas de biologia molecular, utilizadas no diagnstico de micobactrias conforme
segue (CLARRIDGE et al., 1.991; 1.993):

Hibridizao de cidos Nuclicos


Esta tcnica est baseada nas propriedades de complementaridade e estabilidade das fitas do DNA.

A estrutura nativa do DNA mantida por pontes de hidrognio entre as bases complementares das duas fitas
opostas. Entretanto, em temperaturas prximas a 100C, ou em pH alcalino, as pontes de hidrognio
desestabilizam-se e as fitas separam-se. J as ligaes covalentes entre os nucleotdeos da mesma fita
permanecem estveis. Nesta forma, o DNA dito desnaturado. A desnaturao no irreversvel, pois com
a diminuio da temperatura da soluo para 50 C as duas fitas pareiam-se novamente, seguindo o
princpio da complementariedade das bases (MUSIAL et al., 1.988). Durante a renaturao as fitas tanto
podem ligar-se entre si como ligadas previamente, ou podem parear-se a qualquer outra seqncia de
nucleotdeos, mesmo que seja RNA, desde que haja complementariedade de bases (TENOVER, 1.991).
Uma aplicao comum da hibridizao de cidos nuclicos a identificao de um determinado
segmento gnico em uma amostra. Procede-se desnaturao do DNA da amostra seguida da incubao
com uma sonda gentica complementar ao segmento gnico de interesse. A sonda gentica pode consistir
de oligonucleotdeos sintticos ou fragmentos de cDNA (DNA complementar). Em ambos os casos, alguns
dos nucleotdeos da sonda sero marcados com elementos radioativos como

32

P. Caso exista na amostra o

segmento gnico procurado, a sonda ir hibridizar especificamente e ser detectada em auto-radiografia. H


uma tendncia recente ao emprego de nucleotdeos marcados com enzimas ou compostos luminescentes,
como a digoxigenina marcada, que no teriam os incovenientes inerentes ao uso de radioistopos (ROBERT
et al., 1.991; SHANWAR et al., 1.993).
A hibridizao com sondas marcadas , freqentemente, empregada na identificao dos
fragmentos de DNA e de molculas de RNA separadas e imobilizadas pelas tcnicas de Southern e Northern
blot, respectivamente. Dispondo de sondas apropriadas possvel investigar um determinado gene ou
molcula de DNA ou RNA quanto presena do agente etiolgico na amostra. Como a hibridizao
quantitativa, pode ser inferida a quantidade do mRNA em questo pela comparao da intensidade do sinal
obtido na auto-radiografia utilizando densitometria (SOUTHERN, 1.975; FRIES et al., 1.991).
Os cidos nuclicos podem ser hibridizados com sondas genticas, ainda que mantenha intacta a
estrutura morfolgica dos tecidos, mediante a tcnica denominada hibridizao in situ. um mtodo
extremamente sensvel, que permite a deteco de quantidades mnimas de cido nuclico no acessveis
por outros mtodos. A hibridizao in situ evidencia a distribuio de um determinado gene ou RNA entre as
53

vrias clulas de um mesmo tecido, o que no possvel por Southern ou Northern blot. H sondas
comerciais disponveis para deteco de genoma de diversos microrganismos (COATES, 1.987).
Tambm os mtodos de hibridizao de cidos nucleicos podem utilizar sondas genticas de DNA
que so capazes de hibridizar com seqncias complementares de RNA (35) ribossomal 16S, podendo
estas apresentar uma alta especificidade e sensibilidade para detectar bactrias deste gnero (ROBERTS
et al., 1.987; STOCKMAN et al., 1.993). As sondas genticas de DNA com capacidade de hibridizar com as
seqncias de RNA ribossomal 16S para as espcies mais comuns do gnero Mycobacterium (M.
tuberculosis, M. avium, e M. intracellulare), so comerciais

e podem ser marcadas com elementos

radioativos ou no, diminuindo, consideravelmente, o tempo de deteco e quando associados aos mtodos
de cultura radiomtrica podem reduzir o tempo em at 2 semanas (ELLENER

et al., 1.988; KEMP et al.,

1.990). No entanto, a tcnica de hibridizao de cidos nucleicos limitada por sua baixa sensibilidade. Este
4

mtodo requer (aproximadamente 10 bactrias para a deteco) quantidade similar a que necessita a
baciloscopia, isto no to satifatrio para a identificao de micobactrias a partir de amostras clnicas, j
que muito difcil encontrar tal quantidade de microrganismos na maioria destas amostras. O tempo gasto
para o diagnstico pelo mtodo de hibridizao torna-se sempre dependente da cultura bacteriana e do
inculo inicial (WILSON et al., 1.993), exceto por esses inconvenientes, a tcnica de hibridizao pode
apresentar uma alta especificidade e sensibilidade (GONZALES & HANNA, 1.987) .

Endonucleases de Restrio e RFLP


A tecnologia atual da Biologia Molecular tornou-se possvel graas identificao e purificao de

enzimas nucleares. Merecem destaque, as endonucleases de restrio, pela ampla variedade de seus
membros e pelas aplicaes prticas. So enzimas bacterianas com a propriedade de clivar molculas de
DNA estranho, que porventura, penetram a clula. Representam, portanto, uma defesa primitiva de
organismos procariontes. A clivagem da dupla hlice de DNA ocorre em pontos conhecidos como stios de
restrio, que so seqncias de 4 a 8 nucleotdeos especficos para cada enzima.
H uma grande variedade de enzimas de restrio que reconhecem uma ampla gama de stios de
restrio. A distribuio dos stios de restrio num determinado gene especfica para a endonuclease, em
funo da seqncia de nucleotdeos do gene. Este o princpio em que se baseia a tcnica de RFLP, que
a sigla inglesa relativa a polimorfismo do tamanho de fragmentos gerados por endonucleases de restrio.
Quando um segmento de DNA monomrfico, ou seja, no exibe variao individual na sua
seqncia de nucleotdeos, o padro de fragmentos gerados por uma determinada endonuclease de
restrio sempre o mesmo. Caso haja variao na seqncia de nucleotdeos, poder mudar alguns stios
de restrio e conseqente h variao no nmero de fragmentos gerados pela respectiva endonuclease de
restrio. Delees ou inseres fora dos stios de restrio podero tambm ser identificados por
ocasionarem alteraes no tamanho de alguns dos fragmentos de restrio gerados (PLIKAYTIS

et al.,

1.992; VAN ECHOUTTE et al., 1.993).


O estudo do RFLP envolve tcnicas de digesto de DNA, separao eletrofortica, Southern blot e
hibridizao de cidos nuclicos. A amostra de DNA a ser estudada inicialmente digerida por uma ou mais
54

endonucleases de restrio e separada eletroforeticamente. Aps a transferncia para membranas de


nitrocelulose ou nylon (Southern blot) e fixadas, sob luz UV ou calor, posteriormente esta incubada com a
sonda gentica (marcada) complementar a segmentos do gene de interesse. A hibridizao da sonda
identifica os fragmentos de restrio em um gene, o tamanho e nmero dos fragmentos gerados obedecer
s variaes na seqncias de nucleotdeos. Esta variao pode ser normal no caso de regies polimrficas
do genoma ou pode traduzir uma mutao especfica no caso de genes monomrficos. Boa parte dos
estudos utilizando RFLP no analisa diretamente o gene de interesse, e sim regies polimrficas vizinhas,
para as quais existem mapas de restrio definidos (TELENTI et al., 1.993).

Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)


As limitaes dos mtodos de diagnstico utilizando cidos nuclicos, podem ser superadas com a

amplificao de fragmentos especficos destes cidos, mediante a Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
(SAIKI et al., 1.988). Introduzida em 1.986 por MULLIS & FALOONA (1.987). A PCR uma tcnica que
permite a amplificao in vitro de um fragmento de DNA, milhes de vezes em poucas horas, pois com a sua
utilizao possvel marcar todo e qualquer segmento de informao gentica entre, bilhes de unidades e
reproduzi-lo milhes de vezes. O princpio da reao em cadeia da polimerase simples e baseia-se no
mecanismo natural de duplicao do material gentico que ocorre sempre que uma clula se divide para
formar duas novas. Portanto, na PCR, reproduz-se o processo de replicao natural do DNA com as
vantagens de extrema rapidez e de ser possvel determinar, precisamente, o trecho do DNA a ser
amplificado, ao passo que na replicao normal todo o genoma amplificado lentamente. Assim, a PCR
deve satisfazer as condies bsicas do processo de replicao do DNA, realizado pelas DNA polimerases,
enzimas que agem, exclusivamente, sobre fitas pareadas de DNA.
Recentemente, vrios trabalhos tm descrito esta tcnica como uma boa alternativa para a
identificao de micobactrias, discutindo-se melhorias na tcnica da PCR para a pesquisa dessas bactrias
em material biolgico. Apesar do sucesso realizado nos laboratrios de pesquisa mediante a utilizao da
PCR, esta tcnica enfrenta alguns problemas, como: a contaminao do produto amplificado (BOOM et al.,
1.991), presena de inibidores da Taq - polimerase quando se preparam amostras de escarro para a
obteno de uma boa purificao do DNA para a aplicao pela PCR (AMICOSANTE, et al., 1.995)

Deteco e Identificao de Micobactrias por Amplificao do DNA.


A deteco da presena ou ausncia de micobactrias pode ser feita por hibridizao de cidos

nuclicos (DRAKE

et al., 1.987), sendo

a quantidade do DNA presente na amostra, muitas vezes

insuficiente para ser detectada. Tm sido feitas pesquisas de novos mtodos que permitem a amplificao
de seqncias de DNA especficas. Uma vez que o processo de amplificao detecta a presena de
micobactrias no viveis, ou seja no haja necessidade de crescimento in-vitro, a sensibilidade desta
tcnica pode superar a cultura. A amplificao da seqncia do DNA micobacteriano tem permitido a
deteco e identificao rpida destas bactrias em amostras clnicas. O trabalho publicado por
ALTAMIRANO et al. (1.992) para o diagnstico de tuberculose pulmonar, mostra uma sensibilidade e
55

especificidade aumentadas sendo prximas a 100%. SHANKAR et al. (1.991), identificou M. tuberculosis em
diferentes tipos de amostras de pacientes com diagnstico clnico presuntivo de tuberculose. KANEKO et al.
(1.990) utilizando a PCR detectou M. tuberculosis no LCR em 84% do pacientes com diagnstico clnico de
meningite tuberculosa.
Para a identificao de micobactrias foram elaborados alguns tipos de primers para detectar
gnero ou espcies de micobactrias (HANCE et al., 1989; TAKEWAKI

et al., 1.993). Tudo depende do

nvel ou stio em que vo se ligar os primers e os genes que se procura, existindo tcnicas baseadas na
amplificao de seqncias especficas de DNA ou RNA que esto presentes em todas ou em algumas
a

espcies de micobactrias (BDDINGHANS et al., 1.990 )


Existem primers que so utilizados para amplificar genes que codificam protenas conservativas
nas diferentes espcies de micobactrias, como as protenas heat shock. Exemplificamos, os genes groEL
e phoS, que codificam as protenas 65 e 38 KDa respectivamente (HANCE

et al., 1.989) ou seqncias

repetitivas de insero como as IS6110, IS6116 ou IS986, onde existem seqncias repetitivas de 1 a 20
vezes no cromossomo de membros do Complexo M. tuberculosis (EISENACH et al., 1.990; HERMANS
al., 1.990

a,b

et

; THIERRY et al., 1.990; SOINI et al., 1.992).

Tambm esto sendo utilizadas

seqncias de oligonucleotdeos da

subunidade menor do

ribosomas 16S (rRNA) para amplificar fragmentos de DNA capazes de hibridizar com sondas genticas
gnero e espcie especficas. Estas zonas so empregadas devido capacidade de serem altamente
conservativas nos diferentes grupos bacterianos (CHEN

et al., 1.989). Esta alternativa est sendo utilizada

para a identificao a partir de amostras clnicas das diferentes espcies de micobactrias (WOESE et al.,
b

1.987; EDWARDS et al., 1.989; BDDINGHANS et al., 1.990 ; ROGALL

et al., 1.990; BTTGER

et al.,

a,b

1.992; KIRSCHNER et al., 1.993 ; VUORINEN et al., 1.995).


Outros autores classificam as reaes de amplificao existentes para micobactrias em geraes.
As de primeira gerao incluem, principalmente, as reaes diretas, como a utilizao de genes que
codifican protenas como a IS6110. As de segunda gerao incluem metodologias mais complicadas que
geralmente constam de duas ou mais tcnicas: NASBA (nucleic acid sequence based amplification), TMA
(transcription - mediated RNA amplification), SDA (Strand, displacent amplification) e em ambos casos
podem ser utilizadas seqncias que codificam IS6110 e 16S rRNA, OLA (oligonucleotide ligation assay)
(VAN SOOLINGEN et al., 1.991; MENDIOLA et al., 1.992; VANDER ULIET et al., 1.993; KENT et al., 1.995;
KLATSER, 1.995).
Os parmetros de sensibilidade da tcnica do PCR para identificar Mycobacterium spp. podem ser
afetados diretamente pelos mtodos de extrao do DNA, j que se utilizam mtodos de extrao em
condies extremas (exemplo: pH). Pela natureza qumica da bactria muitas vezes perde-se uma
considervel quantidade de DNA, e isto agravado quando se processam amostras com um alto ndice de
contaminao, onde existe a necessidade de se descontamin-los e concentr-los (exemplo: escarros,
aspirado ganglionar).

Teoricamente,

sabe-se

que

para

detectar

micobactrias

precisa-se

de

aproximadamente um fentograma de DNA bacteriano (o que equivalente a 1/5 do microrganismo) (PATEL

56

et al., 1.993), embora em amostras clnicas como escarro seja necessrio de 100 a 1.000 organismos
b

(HANCE et al., 1989; HERMANS et al., 1.990 ).


A sensibilidade pode ser recuperada se utilizarmos mtodos de extrao com digesto enzimtica,
extrao com fenol clorofrmio e precipitao do DNA com etanol. Este procedimento mais recomendvel
quando se processam amostras clnicas. J que as extraes com detergentes inicos resultam em uma
queda da sensibilidade (SHANWAR et al., 1.993).
A sensibilidade tambm pode ser afetada pelo tempo de deteco do produto ps-PCR. O
procedimento mais comum a visualizao do produto em gel de agarose corado com brometo de etdio sob
luz ultravioleta, tendo sempre um marcador de peso molecular como referncia para caracterizar as bandas
de DNA observadas. Outro mtodo comumente utilizado a hibridizao com sondas genticas
complementares as regies internas dos produtos amplificados.
Geralmente os sistemas de hibridizao so variados, mas em geral, os produtos ps-PCR podemse ligar a uma matriz ou membrana de nylon ou nitrocelulose (dot-blot ou slot-blot), onde se adicionam as
sondas genticas marcadas com radioistopos como o
alcalina, digoxigenina, biotina - avidina (SHANWAR

32

P, conjugados enzimticos ligados a fosfatase

et al., 1.993; WILSON

et al., 1.993) ou mtodos

quimioluminescentes (BRISSON et al., 1.989, 1.991; KUSUNOKI et al., 1.991) e dependendo do sistema de
revelao utilizado pode-se melhorar a sensibilidade em relao ao mtodo de colorao com brometo de
etdio.
Por combinao da hibridizao e PCR ou digesto do produto amplificado utilizando enzimas de
restrio (RFLP) as micobactrias podem ser identificadas prontamente, seja a nvel de gnero ou espcie
(PLIKAYTIS et al., 1.992; HAAS et al., 1.993; TAKEWAKI et al., 1.993).
Estas aplicaes dependem das condies de

cada laboratrio e de acordo com o tipo de

identificao necessrio. A sensibilidade pode ainda ser melhorada submetendo-se os produtos ps-PCR a
outra amplificao utilizando primers que sejam capazes de amplificar um fragmento interno do produto
ps-PCR. A este novo processo denomina-se Nested-PCR ou segunda amplificao (SHANWAR

et al.,

1.993; WILSON et al., 1.993).


Para uma melhor ilustrao dos mtodos que esto sendo aplicados na identificao de
micobactrias a partir de amostras clnicas, utilizando PCR, seja direto ou ligado a outros sistemas. A tabela
3 apresenta alguns resultados referentes ao tipo de primer utilizado (PAO et al., 1.988, 1.990; BRISSON et
al., 1989, 1.991; EISENACH et al., 1.990; 1.991; COUISINS et al.,1.992; SHANWAR et al.,1.993; WILSON
et al.,1.993; VUORINEN et al., 1.995), onde a sensibilidade varia de 55 a 100 %, mas a especificidade alta,
variando de 95 a 100 %.

57

Tabela 3: Deteco de M. tuberculosis diretamente de amostras clnicas


Referncia

Nmero de
Amostras

Primers

Sensibilidade

Especificidade

PAO et al., 1.990

248

65 k prot

100 %

63 %

BRISSON, et al., 1.991

514

65 k prot IS6110

80 - 97 %

EISENACH et al.,1.991

162

IS6110

100 %

95 %

COUSINS et al., 1.992

177

MPB70 prot

97 %

76 %

WILSON et al., 1.993

171

IS6110

75 - 92 %

99 - 100 %

SHANWAR et al., 1.993

389

IS6110

55 - 74 %

95 - 98 %

VUORINEN, et al., 1.995

243

rRNA 16S +
Hibridizao

86.2 %

100%

* No avaliado pelo excesso de culturas negativas das amostras PCR-positivas

Como

podemos

verificar

existe

uma

grande

variedade

de

mtodos

diagnsticos

para

micobacterioses, e muitos deles apresentam alguns problemas na correlao da sensibilidade e


especificidade (BOOM et al., 1.991, MANJUNATH et al.,1.991; BUCK et al., 1.992; WILSON et al., 1.993).
Para superar os diferentes

inconvenientes apresentados pelas tcnicas descritas na literatura,deve-se

procurar optimizar as tcnicas tornando-as viveis para aplicao em laboratrios de rotina.


A eleio dos primers baseada nos trabalhos de ANDREAS et al.(1.991), BTTGER (1989, 1.992);
a,b

KIRSCHNER et al. (1.993) ; INDERLIED, et al., 1.993; CARPENTIER et al., 1.995; VUORINEN et al. (1.995)
os quais identificam, seqncias especficas de oligonucleotdeos da subunidade menor do ribossoma 16S
(rRNA). Os dois primeiros primers que sero utilizados (MB1 - MB2) permitem identificar o gnero
Mycobacterium. A partir deste produto ps-PCR, poderemos identificar espcies, submetendo este produto a
uma segunda amplificao (Nested-PCR) utilizando primers para os Complexos: M. tuberculosis e M.
avium (esquema 1).
Assim, poderemos contar com um mtodo rpido e relevante para a identificao atravs da
amplificao gnica por PCR e Nested-PCR, utilizando fragmentos de nucleotdeos altamente especficos
para o gnero Mycobacterium e espcies de micobactrias de importncia na medicina humana.

Literatura recomendada
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BRASIL, Ministro da Sade. MS/FNS/CRPHF/PNCT. Reunio de avaliao operacional e
epidemiolgica do PNCT, na decda de 80 - 90. Braslia, p.15-27, 1992.
58

BRISSON-NOEL, A., AZNAR, C., CHUREAU, C., NGUYEN, S., PIERRE, C., BARTOLI, M., BONETE, R.,
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Characterization of Streptomycin Resistance Mechanisms among Mycobacterium tuberculosis Isolates
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59

PCR NO DIAGNSTICO DA INFECO PELO VRUS DA HEPATITE C (HCV)


Rozangela Verlengia, Msi
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
A infeco pelo vrus da hepatite C uma doena infecciosa, usualmente crnica e comumente
assintomtica por muitos anos, estando relacionada com o desenvolvimento de cirrose e carcinoma
hepatocelular.
O conceito e a importncia da hepatite no-A, no-B surgiram da observao que cerca de 2 20%
dos pacientes transfundidos desenvolviam hepatite, dos quais 90% no apresentavam evidncia de infeco
aguda pelo vrus da hepatite A (VHA), vrus da hepatite B (VHB), citomegalovrus (CMV) e vrus Epstein-Barr.
Estas hepatites passaram a ter a denominao de hepatite no-A, no-B ps-transfusional (HNANB-PT).
Doena idntica foi tambm verificada em pacientes expostos a derivados do sangue (especialmente nos
receptores de fatores de coagulao, como o caso dos hemoflicos) e entre os usurios de droga
endovenosas. Paralelamente, observou-se que alguns pacientes sem antecedentes de transfuso, com uso
de drogas injetveis ou de outra forma de exposio parenteral tambm podiam apresentar clnica,
laboratorial e histologicamente

a doena identica hepatite transfusional. Tais casos passaram a ser

denominados de "forma espordica". Atualmente, aps a identificao do agente etiolgico dessas hepatites
e constatao de tratar-se de um agente nico, essas hepatites passaram a receber a denominao de
hepatite C.
A descoberta do vrus da hepatite C tem sido descrita como um evento totalmente dependente das
tcnicas da Biologia Molecular. No final da dcada de 70, estudos baseados na transmisso da hepatite C
chimpanzs, atravs do plasma de pacientes portadores de hepatite C, j haviam sugerido que o agente
etiolgico dessa doena era um vrus.

Porm, dificuldades relacionadas principalmente com a baixa

concentrao do antgeno obtida, impediam de se obter resultados conclusivos nos ensaios imunolgicos
empregados. Choo et al. (1989), utilizando tcnicas de Biologia Molecular, construiram uma biblioteca de
cDNA a partir do cido nucleco proveniente do plasma de chimpanz infectado com hepatite C, obtida
atravs do isolamento por ultracentrifugao e clonagem em bacterifago gt 11. A triagem dos fagos
recombinantes gt 11 permitiram a identificao de dois clones positivos, denominados 5-1-1 e c100-3. Os
quais, foram juntamente com outros antgenos clonados, utilizados no desenvolvimento de ensaios
imunolgicos (ELISA e RIBA) para a deteco de anticorpos anti-HCV.
Anlise da sequncia de DNA do HCV revelou que a organizao genmica e o perfil hidrofbico
eram similares aos dos vrus pertencentes famlia do Flaviviridae. Consequentemente, o HCV foi
classificado como um gnero separado dentro desta famlia.
O genoma do HCV uma molcula de RNA fita simples, sense positiva de aproximadamente 9.400
nucleotdeos. O genoma do HCV contm uma nica e longa fase de leitura aberta (Open Reading frame,
ORF), a qual codifica para uma poliprotena de 3.010 3.033 aminocidos. Esta poliprotena clivada em
protenas funcionais atravs de proteases virais e do hospedeiro. A regio N-terminal codifica para as
60

protenas estruturais do ncleo (core) e do envelope (E1 e E2/ NS1). A regio C terminal codifica para as
protenas no estruturais (NS) as quais esto envolvidas no ciclo de replicao.
Uma das caractersticas dos vrus RNA a alta frequncia de mutaes devido a perda da atividade
na correo de leitura proof reading da polimerase dependente de RNA. Como resultado, os vrus RNA in
vivo forma populaes diversas, chamadas de quasispecies

que contm uma ou mais sequncias

principais e um largo espectro de variantes completamente relacionadas. Dentro deste contexto, estudos
recentes indicam que o genoma do HCV heterogneo tanto entre indviduos quanto no mesmo indviduo. A
diversidade na sequncia de nucleotdeos do genoma viral, possibilitou classificar o HCV em 9 grandes
grupos e 28 subtipos.
A fase aguda da hepatite C usualmente subclnica ou moderada e clinicamente indistinguvel de
outras forma de hepatites virais. Pacientes apresentando sinais clnicos de doena heptica, tais como
ictercia, so raros. Sintomas semelhantes a fadiga e sensibilidade heptica so eventualmente observados,
porm a maioria dos casos so assintomticos por um perodo significativamente prolongado, at que se
desenvolva disfuno heptica crnica.
Apesar da manifestao clnica discreta, as infeces com HCV apresentam tendncia significativa
em cronificar-se, cujo processo bastante lento. Alm do desenvolvimento de cirrose heptica, tem-se
observado tambm a presena do carcinoma hepatocelular (HCC), associado a infeco crnica com o vrus
C.
A hepatite C transmitida principalmente via produtos do sangue, destacando a transfuso de
sangue e seus derivados. O uso de drogas injetveis, tem-se apresentado

como um fator de risco

importante para a infeco com o vrus da hepatite C. A transmisso por outros fludos biolgicos, tais como,
saliva, lgrima, urina, smem e secreo vaginal ocorre com menor freqncia, provalvelmente devido ao
2

baixo ttulo do vrus C no sangue e no fludo biolgico dos portadores de HVC (10 a 10 cpias/ml).
Recentemente foi mostrado que a transmisso do HCV a partir de mes infectadas para s crianas, estava
relacionada ao ttulo do RNA do HCV na me. Neste estudo, as mes que apresentaram anticorpos antiHCV e que foram RNA negativas no transmitiram HCV para seus bebs. Mes RNA-HCV positivas, cujas
crianas tornaram-se infectadas, mostraram uma tendncia a ter um ttulo 100 vezes maior do que mes
RNA-HCV positiva, cujas crianas no adquiriram o HCV. Vale a pena salientar, que a exposio a uma
quantidade relativamente pequena de sangue ou de outros fludos biolgicos pode tornar-se um fator
significante de risco para HCV nos casos em que os nveis de vrus circulantes so elevados. O fato de ser
uma doena transmissvel, somado alta taxa de cronificao com o desenvolvimento de cirrose e
carcinoma hepatocelular, torna a hepatite C uma doena de importncia tanto social quanto mdica.
A presena de anticorpos anti-HCV em pacientes infectados com o vrus C e a clonagem de vrios
segmentos do genoma viral, por exemplo 5-1-1, c100-3, c-33c, c-22-3 e c-200, levaram ao desenvolvimento
de ensaios imunolgicos, correntemente aprovados para a triagem do sangue dos doadores, possibilitando
um grande avano na descoberta do controle da infeco por HCV, evitando uma disseminao desenfreada
da doena.

61

O primeiro teste imunolgico a ser utilizado, foi um imunoensaio enzimtico de primeira gerao
(EIA) contendo um antgeno recombinante, C 100-3, proveniente da regio no estrutural do vrus. A alta
freqncia de resultados falso-positivo e falso-negativo (ambos acima de 20%), particularmente quando
usado para triar populaes de baixo risco, tais como, doadores de sangue, levou a necessidade de se
desenvolver novos ensaios.
Atualmente, os imunoensaios consistem da deteco de anticorpos contra vrios antgenos
recombinantes HCV-especficos fixados sob uma fase slida, denominados testes de ELISA de segunda e
terceira gerao. Nos testes de segunda gerao, os antgenos utilizados so: C100-3; NS4; C33c (NS3) e
C22-3 (core). J os de terceira gerao utilizam os antgenos: NS3; NS4; NS5/5N1S (core). Esses antgenos
tem sido tambm empregados em ensaios denominados de RIBA (Radio imunoblot assay - Ortho Diagnosis,
Raritan, N.J., USA) para confirmao da triagem de resultados anti-HCV. O RIBA consiste de uma fita de
nitrocelulose contendo protenas recombinantes indviduais associadas com a protena Superoxido
Dismutase (SOD), com as quais os anticorpos anti-HCV presentes no soro podem reagir. Nesse ensaio,
introduzido um controle com a protena SOD sozinha, para detectar auto-anticorpos anti-SOD, que poderiam
resultar em teste falso-positivo.
Usando esses ensaios atuais de ELISA, a sensibilidade para a deteco dos anticorpos anti-HCV
de cerca de 94% 100% e a especificidade maior que 97%. Entre as possveis causas de resultados falsonegativos com os ensaios correntes a heterogeneidade viral. Os testes so produzidos a partir de
sequncias de gentipos predominantes de HCV (tipo 1a), cujos antgenos no reagem com anticorpos de
pacientes infectados com gentipos menos comuns. J condies associadas com resultados sorolgicos
falso-positivo incluem hipergamaglobulenemia e desordens do tecido conjutivo.
Outras limitaes constadadas com uso dos ensaios imunolgicos so as relacionadas com o perfil
de soroconverso. Normalmente a soro-converso do anti-HCV tardia, ou seja, ocorre aps o incio dos
sintomas clnicos da doena ou a elevao das transaminases (ALT e AST), podendo ento o anticorpo antiHCV ser detectado entre a oitava e dcima semana aps o contato com o vrus. J no caso dos pacientes
imunossuprimidos, este perodo torna-se mais significativamente prolongado, uma vez que, o tempo de soroconverso e a evoluo da resposta imune so manifestados tardiamente. Outro aspecto, o fato de que os
ensaios de anticorpos podem promover evidncias de exposio ao HCV porm, so incapazes de
diferenciar entre uma infeco presente ou passada. Pacientes na fase inicial da soro-converso apresentam
resultados inconclusivos pelos ensaios imunolgicos. Claramente, pacientes infectados recentemente
apresentam soro com reao fraca (indeterminada) que, ocasionalmente, torna-se positivo, com o passar do
tempo se obtidas outras amostras em coletas posteriores. Comumente, a soro converso para o anti-HCV
completamente tardia aps o incio da ictricia ou elevao dos nveis das transaminases e o anticorpo pode
no ser detectado at 8 a 12 semanas aps a infeco. Neste estgio, a reao EIA fraca e deve ser
confirmada atravs do RIBA ou Western blot.
As falhas metodolgicas observadas nos ensaios imunolgicos para o diagnstico da hepatite C,
definiu a necessidade de novos ensaios diagnsticos que proporcionem maior confiabilidade quanto: (i)

62

especificidade e sensibilidade (ii) definio de infeco passada ou recente e (iii) avaliao da atividade viral,
em relao a doena heptica, seu prognstico e a convenincia a terapia antiviral.
Considerando as limitaes observadas no uso dos ensaios imunolgicos e a ausncia de um
sistema de cultura in vitro para o HCV, os mtodos de deteco do genoma viral devem ser mais indicados
para solucionar estes problemas, aprofundando o conhecimento dos mecanismos das infeces por HCV e,
teoricamente, oferecendo um parmetro mais adequado para diferenciar os pacientes virmicos dos
pacientes sem virmia. Nesse campo de pesquisa, destaca-se a reao em cadeia da polimerase (PCR),
onde ocorre a amplificao do genoma viral, para detectar o RNA-HCV no soro.
A deteco do vrus da hepatite C processa-se atravs da transcrio reversa e subsequente
amplificao do genoma viral atravs da PCR (RT-PCR), que possibilita o diagnstico da infeco pelo vrus
C antes de qualquer outro mtodo tradicional. Por essa tcnica, o RNA-HCV pode ser detectado no soro
uma a duas semanas aps a transfuso sangunea, antes do incio clnico da infeco ps-transfusional pelo
HCV. A PCR, tambm, tem significativa aplicao nos casos onde o imunoensaio RIBA fornece resultados
indeterminados ou no-reativos.
Um ponto crucial na deteco do RNA-HCV a escolha dos iniciadores para o uso diagnstico, os
quais devem corresponder as sequncias genmicas bem conservadas nas diferentes variantes do HCV, de
modo a garantir uma boa sensibilidade. No caso do HCV, pesquisa-se a regio 5' no transcrita, que a
mais conservada dentro do genoma viral. Todos os protocolos dependem da reao de transcrio reversa,
que faz a cpia de DNA complementar (cDNA), a partir do RNA viral extrado. O cDNA pode ser, ento,
amplificado pela PCR cujo produto pode ser analisado por eletroforese ou por um sistema de hibridizao.
Alguns pesquisadores tem utilizado, alm da amplificao convencional, um ciclo adicional de amplificao
com a utilizao de iniciadores internos (Nested PCR).

Essa tcnica aumenta significativamente a

especificiade e a sensibilidade da tcnica de PCR original.


Cada vez mais, tem-se demonstrado a importncia da PCR na investigao da infeco pelo vrus da
hepatite C, seja no reconhecimento do tipo de vrus infectante e posterior classificao ou na avaliao da
carga viral. Estudos recentes tem sugerido que o gentipo do HCV e o nvel de viremia esto associados
com o desenvolvimento clnico da doena.

Com relao ao gentipo, o HCV tipo 1b parece estar

particularmente associado com doena crnica do fgado mais severa, cirrose e carcinoma hepatocelular,
com ou sem o passo intermedirio da cirrose. A quantidade de partculas virais no sangue tambm parece
ser dependente do gentipo viral, uma vez que, pacientes infectados com HCV tipo 2 mostra um nvel
significantemente menor de RNA-HCV circulante.
Outra importante aplicao da PCR para o HCV o acompanhamento da resposta terapia antiviral
em pacientes com hepatite C crnica, em particular ao interferon (IFN). O IFN promove o rpido
decrscimo dos nveis sricos de alanina aminotransferase (ALT), a erradicao do genoma do HCV do soro
7

e a melhora do estado de inflamao e necrose do fgado. Alta viremia do HCV (superior a 10 cpias/ml de
soro) prognstico negativo para uma completa e adequada resposta ao tratamento com o IFN . Portanto,
a avaliao da eficcia teraputica ao IFN mais adequadamente realizada pela quantificao do RNAHCV, que somente possvel por tcnicas moleculares.
63

A quantificao do RNA viral, tem sido realizada por vrios mtodos de amplificao do RNA-HCV, o
mais usualmente empregado a PCR competitiva (Roche Monitor Kit). Nessa tcnica, a amostra diluida
seriadamente e cada diluio submetida reao de amplificao juntamente com um controle interno,
com o qual compete, revelando diferentes sinais. Outro ensaio tambm disponvel o branched DNA
(Quantiplex, Chiron Corp), um mtodo de amplificao de sinal de fase-slida. Neste mtodo, o soro
adicionado sob um suporte slido, onde ocorre a lise do vrus, a captura e a hibridizao do cido nucleco a
ser detectado e a amplificao do sinal. Embora essas tcnicas sejam muito sensveis, os resultados obtidos
tem mostrado variao do nvel de viremia dos pacientes infectados. No caso do branched DNA, este
demonstrou ser significativamente menos sensvel (deteco limite 350.000 cpias/ml) do que o PCR
competitivo (deteco limite aproximadamente 2000 cpias/ml). Um estudo recente de comparao entre 31
laboratrios mostrou uma substancial variao de sensibilidade e especificidade desses mtodos.
Portanto, verifica-se a necessidade de aprimoramento metodolgico e aplicao das tcnicas
moleculares de forma mais rotineira na busca do diagnstico precoce e do acompanhamento teraputico
adequado.

Literatura recomendada
CHOO, et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.
Science, 244: 359-62, 1989.
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acute infection. J. Med. Virol. 42: 103-108, 1987.

64

PCR NO DIAGNSTICO DA INFECO PELO VRUS HIV


Claudio Mortensen

1. Deteco e Quantificao do Vrus HIV Por PCR:


1.1. Introduo:
O vrus HIV membro da famlia dos retrovrus sendo que, seus vrions (partculas individuais),
possuem uma forma aproximadamente esfrica com algo em torno de 110nm de dimetro. um vrus
contendo um envelope com nucleocapsdeo em forma de cone. O genoma viral composto por 2 molculas
de RNA simples-fita, de 9,2kb, com polaridade positiva em relao a traduo (Fields).
O genoma HIV j foi totalmente seqenciado e analisado, sendo que seu genes receberam a
seguinte nomenclatura (6): gag, pol, vif, vpr, tat, rev, vpu, env, nef. As protenas sintetizadas a partir do gene
gag compem o ncleo (core) que envolve o genoma viral. O gene gag traduzido na forma de uma
protena precursora Pr55

gag

, que posteriormente clivada para compor as protenas p17 (protena de matriz),

p24 (protena estrutural do capsdio), p9 (protena do ncleocapsdio que se liga fortemente ao RNA viral) e
p7. O gene pol tambm traduzido na forma de um precursor, Pr160

gag-pol

e codifica para as enzimas virais:

Protease (p10), Transcriptase Reversa e RNase-H (p51/66) e Integrase (p32). O gene vif (protena p23),
parece atuar como um fator de infectividade, mas sua funo ainda no foi totalmente elucidada. A funo do
gene vpr (protena p15) ainda no conhecida. A protena p14, codificada pelo gene tat, atua como
transativador transcripcional, interagindo com fatores de transcrio celulares e a seqncia TAR viral,
promovendo a iniciao e elongao dos transcritos virais. O gene rev (protena p19), indispensvel
replicao viral, age como transativador ps-transcripcional, ligando-se seqncia RRE viral e fatores
celulares, promovendo "splicing" e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (protena p16) influencia a
+

liberao das partculas virais e aumenta o turnover do antgeno CD4 . O gene env codifica a glicoprotena
precursora gp160, que posteriormente clivada para formar a gp41, transmembranar, e a gp120,
glicoprotena de face externa, responsveis pela ligao do vrus ao receptor celular. Por fim, o gene nef
(protena p27) potencializa a infectividade viral (18).

Genoma do HIV
rev
vpr
LTR

tat

pol
gag

vif

vpu

nef
env

LTR

65

Em seu processo de replicao (produo de novas partculas virais), o HIV necessita da formao
de uma molcula intermediria de DNA, a qual integra-se ao genoma celular, permanecendo como parte
integrante deste, durante todo o perodo de vida da clula em questo. A informao gentica para a sntese
dos componentes do vrus, inclusive do genoma RNA, proveniente deste DNA (denominado DNA pr-viral)
integrado. Esta molcula intermediria de DNA sintetizada a partir do "molde" de RNA viral, pela enzima
Transcriptase Reversa, codificada pelo vrus e transportada no interior da partcula viral. A seguir, atravs de
mecanismos ainda no muito bem definidos, a molcula de DNA recm sintetizada, transportada para o
ncleo celular onde ser integrada ao genoma por ao de outra enzima viral, tambm presente no vrion, a
Integrase. Tanto a Transcriptase Reversa quanto a Integrase, so produtos do gene pol.

1.2. Deteco do Genoma Viral por PCR:


O mecanismo, bastante peculiar, de replicao dos retrovrus, possibilita dois caminhos para a
deteco da presena do vrus HIV no organismo humano: a demonstrao da presena do DNA pr-viral
integrado ao genoma celular e a deteco do RNA viral presente nas partculas livres circulantes.
A este ponto, importante esclarecer determinados aspectos da histria natural da infeco pelo
vrus HIV. At pouco tempo atrs, havia um certo consenso entre os cientistas e os clnicos de que muito
poucas clulas estariam infectadas ou expressando o genoma viral e que existiria muito pouco vrus
circulante, livre no plasma, durante a maior parte do curso clnico da doena. Sendo assim, foram
desenvolvidos modelos para a doena AIDS, os quais consideravam um perodo de latncia virolgica
durante a fase assintomtica da mesma. Entretanto, mais recentemente, trabalhos publicados por Ho, D. e
Wei, X., demostraram que o vrus HIV replica-se muito mais rapidamente e muito mais precocemente do que
era imaginado. Estes trabalhos provaram que o perodo de latncia na verdade clnico, pois o vrus replicase numa velocidade bastante alta, j imediatamente aps infectar a primeira clula e, um equilbrio entre esta
+

produo de vrus e a reposio de clulas CD4 acaba por estabelecer-se e, at que se esgote a
capacidade do organismo em manter este dispendioso equilbrio, o paciente poder no apresentar
sintomas.
Em vista disso fica claro que em qualquer momento ps-infeco, podero ser encontradas
partculas virais circulantes, contudo, necessrio que haja uma quantidade mnima de partculas virais para
que a tcnica de PCR seja capaz de detect-las. Sob condies ideais, ou seja, tendo-se um protocolo muito
bem otimizado para a reao de PCR, seu limite de sensibilidade ser de 200 cpias do genoma por ml de
plasma. muito importante que se tenha conscincia destes dados, pois haver um perodo de tempo pscontaminao, embora muito menor do que para os testes imunolgicos, em que no ser possvel detectarse a presena do vrus. Este perodo de tempo foi estimado em aproximadamente 9 dias ps-contaminao.
Outro ponto que deve ser observado, com relao ao PCR aplicada AIDS, diz respeito ao diagnstico de
crianas nascidas de mes portadoras do HIV. O risco de um recm nascido, de me portadora do HIV, ter
sido infectado por via placentria (transmisso vertical) foi calculado em um valor aproximado de 30%,
66

portanto bastante importante que se possa diagnosticar o quanto antes o nvel de infeo da criana.
Entretanto, os mtodos imunolgicos ficam sujeitos a resultados falso-positivos devido ao fato da criana, at
3-6 meses aps o nascimento, estar portanto anticorpos provenientes da me, herdados durante a gestao.
Sendo assim, o mtodo mais seguro de detectar-se a presena do vrus, comprovar o genoma prviral
integrado no genoma celular. A pesquisa de partculas livres no plasma da criana tambm poderia levar a
resultados falsos, pois uma grande parte dos vrions produzidos pelas clulas, so inativos (no infectantes)
e, sendo assim, a criana poderia portar partculas virais inativas em sua circulao, que no teriam
estabelecido uma infeco produtiva, mas que estariam sendo detectadas pela alta resoluo da tcnica de
PCR.
Assim sendo, apresentamos aqui um mtodo de PCR para o diagnstico de infeco pelo vrus HIV
que utiliza a tcnica de Nested PCR na deteco do DNA pr-viral integrado ao genoma celular. O
protocolo descrito a seguir utiliza um conjunto de primers, desenvolvidos por este laboratrio,
complementares a regies altamente conservadas, presentes na seqncia do gene gag, gerando um
produto de amplificao de 495pb.
O DNA isolado das clulas mononucleares do sangue perifrico utilizando-se o mesmo protocolo j
O

descrito nesta apostila. Este DNA, normalmente estoca em geladeira ou freezer, aquecido a 58 C durante
20 min. antes de ser adicionado reao.
Ao adicionar-se os componetes de reao aos tubos, importante seguir uma determinada ordem.
Portanto, aps descongelar todos os componentes, o primeiro a ser adicionado a gua, a seguir o Tampo
O

de Reao, dNTP, Primers e, s ento, o DNA, que pode ser mantido no banho-maria a 58 C at o momento
de ser adicionado aos tubos. Cuidados especiais devem ser tomados a este ponto, pois o DNA genmico
humano uma molcula bastante grande, tornando a soluo em que est contida, muito viscosa.
Recomenda-se utilizar ponteiras especiais de ponta larga ou, na falta destas, cortar as pontas para torna-las
mais largas em sua abertura.
Aps a adio do DNA aos tubos de reao, estes so transferidos ao aparelho de PCR para a
O

primeira etapa de reao, o HOT START, ou pr-aquecimento da amostra a 98 C durante 10min. O


objetivo desta prtica desfazer possveis estruturas secundrias da molcula de DNA, as quais poderiam
afetar sensivelmente a assessibilidade dos primers aos seus stios correspondentes. Quando terminados os
10min., aciona-se a funo PAUSA do aparelho, retira-se os tubos colocando-os em gelo imediatamente. No
interior do fluxo laminar, adiciona-se a Taq DNA polimerase, retornando os tubos ao aparelho e liberando-se
a funo pausa. A reao prosseguir por 35 ciclos.
Finalizado o primeiro PCR, sero retirados 10l desta reao e adicionados em outra contendo o
segundo conjunto de primers (nested), sempre respeitando a ordem de adio dos componentes. A diferena
desta reao com a primeira, a inexitncia de HOT START, pois aqui as molculas alvo j possuem um
tamanho milhares de vezes menor do que as da amostra inicial.

67

Literatura recomendada
Amato Neto, V.; Medeiros, E.A.S.; Kalls; E.G.; Levi, G.C.; Baldy, J.L.S.; Medeiros, R.S.S. (1996). AIDS na
Prtica Mdica. Sarvier, So Paulo.
Cohen, P.T.; Sande, M.A.; Volberding, P.A. (1994) The AIDS Knoledge Base. Second Edition, Little, Brown
and Company, Boston.
DeVita, V.T.; Hellman, S.; Rosemberg, S.A. (1991) AIDS: Etiology, Diagnosis, Treatment, and Prevention.
Third Edition. J.B. Lippincott Company. Philadelphia.
Fields, B.N.; Knipe, D.M.; Howley, P.M. (1996). Fields Virology, Third Edition. Lippincott-Raven, Philadelphia.
Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., Chen, W., Leonard, J.M., Markowitz, M. (1995). Rapid turnover of
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plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature, 373: 123.
Kwok, S.; Mack, D.H.; Mullis, K.B. (1987). J. Virol., 61: 1690.
Phair, I.P., Wolinsky S. (1989). Diagnosis of infection with the human immunodeficiency virus. J. Infect. Dis.,
159: 320.
Varmus, H.E., Swastrom, R. (1985). Replication of retrovirus. in Weiss, R., Teich, N., Varmus, H.E., et al.
(eds.): RNA Tumor Virus, ed. 2. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, pp 74.
Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., Johnson, V.A., et al. (1995). Viral dynamics in human immunodeficiency
virus type 1 infection. Nature, 373: 117.
White, D.O.; Fenner, F.J. (1994). Medical Virology, Fourth Edition. Academic Press, San Diego.

68

Aula nmero 7

PCR E RFLP NA IDENTIFICAO DE INDIVDUOS


Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Adriana Ozaki
Erik Martins Ueda

Introduo

A necessidade de confirmar disputas de paternidade ou relacionamento familiar sempre existiram. O


progresso no desenvolvimento de um meio seguro para a determinao de relacionamento tem ocorrido
muito lentamente. A descoberta de Landsteiner do grupo sanguneo ABO em 1900, estabeleceu o que se
tornou a base para os estudos de parentescos dos dias modernos, porm a aplicao da descoberta para a
determinao de paternidade, s foi demostrado em 1910 por von Dungern e Hirszfeld, conhecida como
herana Mendeliana do grupo sanguneo. O prximo evento significante ocorreu em 1927 quando o sistema
MN foi descrito por Landsteiner e Levine. Este foi seguido pela descoberta, em 1939-1940, do sistema Rh-Hr
por Levine, Stetsun, Landsteiner e Wiener. A aplicao do conhecimento desses sistemas fornece uma
mdia de excluso da paternidade de aproximadamente 55% dos homens supostamente acusados.
A combinao dos sistemas ABO, Rh e MN, tornou possvel excluir 70% dos homens caucasianos
supostamente acusados da paternidade, e os testes de parentesco foram reconhecidos pelo seu valor de
excluso, mesmo que estes tivessem alcance limitado. Apesar dessas deficincias, esses testes foram
utilizados at fins de 1960 e meados de 1970, quando a utilidade do sistema de antgenos leucocitrios
humanos (HLA) foi reconhecido legalmente e cientficamente como um mtodo para avaliao nos testes de
paternidade. Os testes, usando mltiplos sistemas, incluindo o HLA, ento forneceram um meio prtico para
a excluso de pelo menos 95% dos supostos pais, no entanto, ainda no totalmente adequada para esse fim.
Recentemente, tcnicas baseadas no estudo de sequncias polimrficas do DNA tem dado de forma muito
segura a definio adequada para a identificao de indivduos.
A anlise de sequncias polimrficas no DNA , atualmente, a ferramenta mais poderosa para
distinguir geneticamente os indivduos ou determinar nveis de relacionamento familiar. Os testes com DNA
superam os resultados obtidos pelos mtodos tradicionais, e podem solucionar de forma segura os
resultados tidos como inconclusivos pelos mtodos considerados tradicionais. Por essas razes, foram
realizadas uma srie de estudos de marcadores genticos para determinar a real definio de um vnculo
familiar. A crescente demanda de testes de identificao, estimulou a comunidade cientfica a desenvolver
metodologias com maior grau de discriminao que permite com segurana incluir ou excluir a paternidade
ou relao familiar.
Esses marcadores genticos so caractersticas herdadas que diferenciam os indivduos uns dos
outros e so controlados por genes localizados em um par de cromossomos, denominados alelos. Apenas
dois alelos esto envolvidos na formao de uma caracterstica especfica, um do pai outro da me. Quando
o par de genes for idntico, chamado de homozigoto; quando o par de genes for diferente, de heterozigoto.
69

necessrio tambm uma escolha adequada dos alelos para um estudo detalhado da ocorrncia, a fim de
aumentar a preciso e exatido no resultado final.

Repeties Sucessivas de Nmero Varivel (VNTR) e Repeties Sucessivas


Pequenas (STR)
Vrios locos de DNA so amplamente utilizados em anlises forenses, os mais utilizados so

aqueles contendo as denominadas Repeties Sucessivas de Nmero Varivel ((Variable Number


Tandem Repeat). Estas sequncias no codificam um gene especfico, podendo assim serem utilizadas para
anlises forenses sem nenhuma consequncia ao indivduo. Isto uma vantagem pois as VNTR so menos
suscetveis a seleo natural, que poderia levar a diferentes frequncias de alelos em populaes diferentes.
As VNTR tem sido tambm denominadas de minisatlites.
Uma regio tpica de VNTR consiste de 500 a 10,000 bp, compreendendo vrias unidades de
repeties sucessivas, cada uma com 15 a 35 bp em comprimento. O nmero exato de repeties assim
como o comprimento da regio de VNTR, varia de um alelo para outro, e diferentes alelos podem ser
identificados pelo seu comprimento. Os locos VNTR so particularmente convenientes como marcadores
para identificao, pois eles possuem um grande nmero de alelos diferentes, geralmente 100 ou mais,
embora apenas 15 a 25 possam ser distinguidas (A palavra alelo tradicionalmente aplicada como forma
alternativa de um gene; entretanto, pode-se extrapolar o significado para regies no gnicas do DNA, como
as VNTR).
As VNTR tem uma alta taxa de mutao, levando as mudanas no comprimento. Uma mutao
individual usualmente muda o comprimento por apenas uma ou poucas unidades de repetio. O resultado
um grande nmero de alelos na populao com diferentes sequncias. O nmero de possveis gentipos em
um loco muito maior que o nmero de alelos, e quando diversos locos so combinados, o nmero total de
gentipos muito grande.
Famlias de microsatlites de DNA compreendem arranjos de repeties consecutivas de pequeno
tamanho (Short Tanden Repeat, STR), que apresentam sequncias simples (1-4 bp) e esto localizados ao
longo do genoma. Normalmente repeties dos mononucleotdeos A e T, so comuns e juntos so
responsveis por cerca de 10 Mb ou 0,3% do genoma nuclear. Em contraste, sequncias de G e C so bem
mais raras. No caso de repeties de dinucleotdeos, arranjos de repeties CA (repeties de TG na fita
complementar) so comuns, compreendendo 0,5% e so altamente polimrficos. Repeties CT/TG so
tambm comuns, ocorrendo em cada 50 kb, em mdia, e sendo responsvel por cerca de 0,2% do genoma.
Por outro lado, sequncias de CG/GC so raras. Isso se deve ao fato de que resduos de C ligados em sua
extremidade 3 por um resduo G (CpG) so suscetveis metilao e desaminao, resultando em TpG (ou
CpA na fita complementar). Repeties consecutivas de trinucleotdeos e tetranucleotdeos so rarssimas,
porm altamente polimrficas, sendo candidatas a marcadores genticos do polimorfismo entre indivduos.

RFLP na Identificao de Indivduos


70

A maioria do DNA no genoma humano no parece codificar genes especficos, mas parece ter um
papel na integridade estrutural do cromossomo ou em sua replicao. Como vimos, o DNA no codificante
contm vrias sequncias repetitivas, sendo possvel a anlise de DNA para identificao de indivduos. A
garantia de que o DNA apresenta repetio nica para cada indivduo, ou polimorfismo, o torna singular pelo
nmero caracterstico dessas repeties. Neste contexto, essa caracterctica muito singular pode servir
como parmetro muito importante na caracterizao de um indivduo, porque diferentes tamanhos de
fragmentos de DNA so encontrados, aps digesto do DNA com enzimas de restrio, e hibridizao com
sondas alelo-especficas. Considerando a frequncia desses fragmentos polimrficos na populao e
possveis variaes tnicas, o teste de DNA tem a capacidade de fornecer as probabilidades mais exatas de
incluso ou excluso de indivduos num contexto forense ou de vnculo familiar. Consequentemente muita
ateno tem sido dada para a padronizao desses novos mtodos em laboratrios forenses. Tcnicas
similares tem sido usadas para teste de paternidade em casos legais.
Uma aplicao potencial a anlise da sequncia dos nucleotdeos nos gens HLA para definir
identidade imunolgica. Essa aplicao fornece uma oportunidade para se encontrar os melhores doadores.
Uma outra aplicao seria estabelecer suscetibilidade a patologias autoimunes em indivduos com alteraes
especficas nos genes HLA.
Os locos de VNTR consistem em numerosas cpias de sequncias simples de DNA, em um
intervalo de comprimento que varia de 9 a 14 pares de base (bp), alinhados de forma contnua. Estudos
sobre populaes humanas tem revelado que o nmero de repeties sucessivas presentes em um
determinado loco pode exibir uma grande variao de um indivduo para outro, dessa forma se estabelecem
como marcadores genticos que so altamente informativos de acordo com o espcime biolgico. O uso de
vrios locos VNTR independentes e hipervariveis fornecem informao muito importante condiderando
uma fonte de espcime biolgico a ser identificado.
A anlise por RFLP de locos de VNTR envolve a purificao do DNA de fludos corporais ou
esfregaos de bipsias, seguida da digesto do DNA com a enzima de restrio (p. ex. Hae III). Os
fragmentos de DNA resultantes so separados por eletroforese, utilizando gel de agarose; Os fragmentos
separados so ento desnaturados e transferidos para uma membrana de nylon (Southern Blot). A
membrana ento hibridizada com sondas marcadas isotopicamente ou por mtodos no-isotpicos (p. ex.,
enzimtico) especficas para o locos de VNTR de interesse. Os mtodos no-isotpicos so preferidos, pois
no necessitam dos cuidados na manipulao que a conduta de segurana exige para os materiais
radioativos. A enzima fosfatase alcalina muito utilizada na revelao, onde so utilizados substratos
coloridos ou quimioluminescentes. O mtodo luminescente tem seus incovenientes, pois requer um sistema
com produo contnua de luz para que o sinal possa ser coletado com o decorrer do tempo (para aumentar
a sensibilidade) e se for necessrio, a exposio mltipla do filme. Os sistemas quimioluminescentes mais
sensveis so aqueles que emitem luz continuamente e a reao enzimtica envolve a clivagem de
substratos 1,2-dioxitanos estabilizados. Esses sistemas tem sido amplamente aplicados em pesquisas

71

genticas. O sistema de deteco quimioluminescente pode substituir as sondas marcadas com

32

P usadas

nos sistemas de quantificaes de DNA e tipagem por RFLPs.

Tipos de Sondas utilizadas no RFLP


Para anlise de regies hipervariveis (VNTR) so utilizadas sondas moleculares complementares a
estas sequncias repetitivas, o que possibilita observar as caractersticas de cada indivduo e suas relaes
com os pais. No mtodo de RFLP, h sondas multilocais que hibridizam com vrios locos ao mesmo tempo,
sendo analisadas vrias bandas de DNA, que correspondem aos alelos respectivos. Os testes com sondas
unilocais utilizam a mesma metodologia, entretanto, identifica-se um loco polimrfico do DNA de cada vez,
permitindo com simplicidade observar um alelo de origem materna e outro de origem paterna. O limite de
deteco das sondas multilocais de 500 ng de DNA, as sondas unilocais apresentam limites muito menores
onde quantidades em torno de 30 ng podem ser visualizadas, que permitem espcimes de at 1 L de
sangue ou smem para anlise. Essa sensibilidade significa que embora as sondas multilocais fornecerem
melhor distino individual as sondas unilocais so as mais utilizadas no contexto forense. Outra vantagem
a possibilidade do uso das sondas unilocais em amostras misturadas.

PCR na identificao de indivduos


Uma alternativa que vem dominando as tcnicas moleculares para fins de identificao baseada na
tcnica de amplificao do gene utilizando a reao em cadeia da polimerase (PCR). Esse procedimento
baseia-se na amplificao especfica de VNTR, presentes em determinados alelos humanos, atravs da
hibridizao de oligonucleotdeos (iniciadores ou primers) flanqueando a regio que contm a VNTR. Essa
tcnica tem sido denominada Polimorfismo de Tamanho de Fragmento amplificado (AMP-FLP).
Atualmente, estes locos altamente polimrficos demonstrados por PCR so os marcadores genticos mais
informativos para a caracterizao do indivduo.
A PCR permite um aumento da sensibilidade de um procedimento subanaltico para nveis analticos
em um perodo de tempo relativamente curto. A tcnica permite o aumento da quantidade de DNA de tal
forma que uma simples sequncia pode ser analisada, aps a PCR, em um simples procedimento sem a
utilizao de material radioativo ou qualquer outro procedimento mais complexo. As vantagens em relao
aos outros mtodos esto no aumento da sensibilidade, especificidade e a reduo no tempo de ensaio.
Outra vantagem na utilizao da PCR que ela pode ser realizada com muito pouca quantidade de amostra
(a tcnica de PCR pode detectar at 1 fentograma de DNA alvo) e em material fixado com formaldedo,
parafinados e em peas de necrpsia ou manchas de sangue secas.
Dentre os genes polimrficos utilizados para a caracterizao de indivduos, podemos citar a
amplificao de minisatlites nos locos: Apo B (apolipoprotena B), D1S80, D17S30 e microsatlites SE33,
D12S67, Y-27H39, vWF (von Willerbrand). Esses alelos podem ser amplificados de amostras contendo
pouca quantidade de DNA, o que facilita a utilizao tanto para fins de identificao criminal como para testes

72

de identificao de paternidade. Porm, nem todos os locos de minisatlites e microsatlites existentes


podem ser utilizados na investigao de paternidade, sendo os mais adequados os que apresentam maior
polimorfismo e maior grau de heterozigose. A anlise dos polimorfismos genticos tem sido utilizada como
parmetro importante na rea mdica e tambm em anlises forenses.

Clculo da Frequncia dos Alelos


A frequncia dos alelos baseada na ocorrncia de todos os alelos para um dalo loco estudado
dentro de mais ou menos 3% do tamanho do banco de dados, que se construiu. Em adio, pode-se
escolher alelos com frequncia mnima de 2%.

Clculo estatstico
1. Probabilidade de Excluso
A Probabilidade de Excluso (PE) definida como a probabilidade de excluir ao acaso, indivduos da
populao dados os alelos da criana e da me. A informao gentica do suposto pai no considerada
dentro da determinao da Probabilidade de Excluso. A Probabilidade de Excluso igual a frequncia de
todos os homens da populao que no contm os alelos compartilhado obrigatoriamente do alelo do pai e
da criana.
A equao utilizada para determinar esta probabilidade :
PE = (1-a)

Onde, a = frequncia do alelo da criana herdado do seu pai biolgico


(obrigatoriamente o alelo paterno).

2. ndice de Paternidade
O ndice de Paternidade (PI) a razo de verossimilhana nas quais os testes apresentam duas
probabilidades condicionais. A probabilidade do teste de paternidade supor que o suspeito pai o pai
biolgico, comparado com a probabilidade de que ele no seja o pai biolgico. Se ambos os pais so
heterozigotos, ento:
PI = (0,5)x(0,5)/(0,5)x(fPa) ou
PI = (0,5)/(fPa)
Onde (fPa) a frequncia do alelo paterno.
Padro de banda simples do suposto pai so tratadas como heterozigotos para o clculo de PI.

3. Probabilidade de Paternidade
A Probabilidade de Paternidade (W) baseada sobre o Teorema de Bayes nas quais proporciona a
determinao de posterior probabilidade para paternidade baseados nos resultados genticos dos testes da
me, da criana e do suposto pai. Em ordem de determinao da Probabilidade de Paternidade, a suposio
73

deve ser marcada (antes do teste) como uma prvia probabilidade de que o suposto pai seja o verdadeiro pai
biolgico. A equao usada para o clculo da posterior probabilidade (W) da prvia probabilidade de 0,5 :
W=

_PI_
PI + 1

PI = ndice de Paternidade.

Literatura recomendada
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