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1. Introduccin
2. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
3. Consideraciones generales sobre la cromatografa de elucin
4. Anlisis qumico con mtodos cromatogrficos
5. Cromatografa de gases
6. Cromatografa de lquidos
1. INTRODUCCIN
La mayora de los mtodos de anlisis son en los casos ms favorables selectivos,
pero no especficos. Por ello, cuando se trata de muestras complejas la separacin del
analito de de las posibles interferencias es una etapa esencial. An mejor sera la
posibilidad de determinar varios analitos despus de una separacin previa.
Uno de los mejores mtodos para conseguir esa separacin, y posiblemente, el ms
utilizado es la cromatografa. Este conjunto de tcnicas permite la separacin de
componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. La cromatografa en
sus orgenes era exclusivamente una tcnica de separacin que se transform en
tcnica de anlisis cuando se acopl con un dispositivo para monitorizar las especies
qumicas que se iban separando. As, la cromatografa se ha convertido en un mtodo
analtico de primer orden para separar, identificar y cuantificar los compuestos
presentes en muestras lquidas o gaseosas (para muestras slidas se requiere una
etapa de disolucin o extraccin).
En cromatografa, los solutos se separan en base a la distinta velocidad de
desplazamiento cuando son arrastrados por una fase mvil a travs de un lecho
cromatogrfico que contiene a una fase estacionaria (slida o liquda).
La muestra se disuelve en la fase movil y se hace pasar a travs de la fase
estacionaria (inmiscible con la mvil) que se mantiene fija en una columna o sobre una
superficie plana. Las dos fases se eligen de tal modo que los componentes de la
muestra se distribuyen de modo distinto entre las dos fases. Aquellos que son
fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de
fase mvil, mientras que los que se retiene dbilmente avanzan con ms rapidez.
Las
tcnicas
cromatogrficas
pueden
clasificarse
segn
diferentes
criterios:
3.
CONSIDERACIONES
GENERALES
SOBRE
LA
CROMATOGRAFA
EN
COLUMNA
Consideremos la separacin de dos sustancias A y B en una columna por
cromatografa de elucin. La elucin implica el transporte de una especie a travs de
una columna por adicin sucesiva de fase mvil (eluyente). Sucesivas adiciones de
fase mvil hacen descender las molculas de analito por la columna en una serie de
transferencias entre la fase mvil y la fase estacionaria. Si al final de la columna se
coloca un dispositivo que responda a los cambios de composicin de la fase mvil, es
decir, a la presencia de los distintos solutos (detector) se puede registrar un
cromatograma, grfico que representa la respuesta del detector en funcin del tiempo
de elucin (o volumen de eluyente aadido).
k=
t R tm
tm
K= Cs
Cm
Donde Cs y Cm son las concentraciones del componente considerado en la fase
estacionaria y movil, respectivamente. Coeficientes de distribucin grandes favorecen
una buena separacin entre distintos componentes pero incrementan el tiempo
necesario para la elucin, lo que provoca un ensanchamiento de la banda del
componente. Se debe por lo tanto buscar una solucin de compromiso.
Desde el descubrimiento de la cromatografa se han propuesto diferentes teoras para
conseguir una explicacin del modelo cromatogrfico. Una de las ms conocidas es la
teora de platos. Aunque se trata de un modelo antiguo, hoy considerado obsoleto,
permite describir de forma sencilla las separaciones. Consiste en considerar la
separacin cromatogrfica como una serie de equilibrios sucesivos de distribucin
entre las fases mvil y estacionaria a medida que el soluto avanza por la columna.
Estos equilibrios sucesivos se basan en el concepto de plato terico, segn el cual se
puede imaginar la columna dividida de longitud L dividida en N segmentos en cada
uno de los cuales se establece un equilibrio. As aunque la cromatografa es un
proceso continuo este modelo es un enfoque esttico, que reproduce la migracin del
soluto en la columna mediante el encadenamiento de una serie de etapas estticas. El
H = A+
B + Cv
v
En gradiente:
- Transferencia
las caractersticas
de masa entre
de la elucin
las fases:seesvan
responsable
modificando
del durante
trminolaCv, ya que
separacin.
el soluto
Con ello
requiere
puedeun
conseguirse
cierto tiempo
una para
mejor
transferirse
resolucinentre
de mezclas
las fasescomplejas.
mvil y
estacionaria, cuando el caudal es demasiado rpido no puede alcanzarse el
equilibrio.
- Difusin
turbulenta.
Est
relacionado
con el perfil de caudal de la fase mvil a
4. ANLISIS
QUMICO
CON
MTODOS
CROMATOGRFICOS
travs dees
la actualmente
fase estacionaria.
El tamao
de las
partculas
su de
La cromatografa
el principal
mtodo
utilizado
paradelarelleno,
separacin
distribucin
por tamaos
y su regularidad
son el origen
deSe
la puede
formacin de
mezclas de
especies qumicas
estrechamente
relacionadas
entre si.
caminos
preferentes.
Por tanto,y el
soluto puedecuantitativa
recorrer mltiples
trayectorias
emplear para
identificacin
cualitativa
determinacin
de las especies
de distinta longitud aleatoriamente. Este trmino (A) es independiente de la
separadas.
velocidad deellaparmetro
fase mvil.
Anlisis cualitativo:
que puede usarse con fines cualitativos en
As
la eficacia es
mxima
de separacin
se obtiene
cuando la altura
de plato
cromatografa
el tiempo
de retencin.
Este es caracterstico
de equivalente
cada componente
terico
es mnima.
Para velocidades
que de
la ptima
la difusinpobre
longitudinal
en cada(H)
sistema
cromatogrfico.
Se trata menores
sin embargo
una informacin
si se
causa un con
ensanchamiento
banda y con ello
incremento de H.nicamente
Para
compara
otras tcnicasdedelaidentificacin
(ej: un
espectroscpicas).
con el
velocidades
mayoresresulta
que la difcil
ptimaasegurar
la dificultad
para alcanzar
el equilibrio en
entre
tiempo
de retencin
la presencia
de un componente
unalas
fases
hace
que lasibanda
se extienda.
un tipoLa
dado
de fase estacionaria
cuanto el
mezcla,
aunque
se puede
afirmar laPara
ausencia.
identificacin
requiere siempre
menor
el tamao
demismas
partculacondiciones
mejor es lacromatogrficas.
eficacia de la separacin, ya que el soluto
uso de es
patrones
en las
debe recorrer
menoressedistancias
alcanzar eldel
equilibrio.
El problema
es que
Anlisis
cuantitativo:
basa en lapara
comparacin
area o altura
de pico del
cuanto menores
son lascon
partculas
de rellenode
mayor
resistenciadeseconcentracin
opone al flujo de
componente
de inters
la de estndares
esta sustancia
fase
mviladmitiendo
por lo que hay
trabajar
con altalineal
presin.
conocida,
que que
existe
una relacin
entre el area o altura de pico y la
concentracin en un determinado intervalo de concentraciones. En los anlisis
La resolucin
cromatogrfica
constituye
medidade
cuantitativa
de sufra
la capacidad de
basados
en altura
de pico se requiere
queuna
la anchura
los picos no
una columna para
separar
dos analitos.
Lapara
resolucin
calcula
a partir delde la
modificacin
durante
el tiempo
necesario
obtenerselos
cromatogramas
cromatograma
como: para obtener resultados exactos. Por ello suele usarse
muestra y los estndares
mucho ms el anlisis basado en rea de pico, parmetro independiente de los
2 [(t R )B (t R )A ]
=
wA 2 + wB 2 wA + wB
w A + wB
El mtodo ms sencillo de la calibracin consiste en el uso de patrones externos. Se
Z
2Z
efectos
Rs = de ensanchamiento.
=
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5. CROMATOGRAFA DE GASES
1. Introduccin
2. Componentes bsicos de un cromatgrafo de gases.
3. Anlisis cuantitativo empleando cromatografa de gases
4. Preparacin de muestras ambientales para cromatografa de gases
5. Aplicaciones ms relevantes en medio ambiente
5.1. Introduccin
En cromatografa de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de la
columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil gaseosa.
La fase mvil en cromatografa de gases es un gas inerte, es decir, no interacciona
con las molculas de analito, slo las transporta a travs de la fase estacionaria.
1.
Los gases ms usados son helio, argon, nitrgeno e hidrgeno. El gas suele venir
determinado por el tipo de detector que se va a emplear. Con ele suministro de gas
portados van asociados reguladores de presin, manmetros y medidores de flujo.
2.
10
Existe una gran variedad de fases estacionarias lquidas. La seleccin de una u otra
suele hacerse empricamente. Debe buscarse que la fase estacionaria disuelva los
componentes de la mezcla separar de forma diferente, que no queden muy retenido ni
tampoco demasiado poco. En general suele seguirse el principio de que lo semejante
disuelve a lo semejante. As, se utilizan fases estacionarias polares para separar
compuestos polares, dichas fases suelen tener grupos tipo CN, -CO, -NH. Las fases
estacionarias apolares se emplean para separar compuestos apolares.
Adems del empleo de lquidos no voltiles como fases estacionarias, es cada vez
ms frecuente el uso de fases enlazadas. Se trata de molculas unidas
covalentemente al soporte slido para minimizar la prdida de fase lquida de la
columna.
La columna cromatogrfica se encuentra en el interior de un horno termostatizado, ya
que la temperatura es una variable crucial en las separaciones por cromatografa de
gases. La temperatura afecta al equilibrio de distribucin de los analitos entre la fase
mvil y estacionaria. Cuando se aumenta la temperatura de la columna se acelera la
elucin. La temperatura ptima reflejar un equilibrio entre la consecucin de la
resolucin necesaria y la velocidad de la separacin. Puede trabajarse a temperatura
constante (isotrmicamente) o con programacin de temperaturas (en gradiente o
rampa de temperatura). Esta ltima modalidad permite separar grupos de compuestos
con volatilidad muy variada en periodos de tiempo ms breves.
4.
adecuada sensibilidad
a)
11
cuya conductividad trmica sea diferente de la del gas portador. Este trmino se
refiere a la capacidad de una sustancia de transportar calor de una regin caliente a
una fria. El funcionamiento se basa en la disminucin de la conductividad del gas
portador cuando un soluto sale de la columna. Se suele usar he generalmente por su
elevada conductividad termica. Se emplea un filamento calentado elctricamente cuya
resistencia depende del calor disipado. Se necesita una referencia, un gas que no
pasa por la columna. Este dtector sensible que el anterior y suele emplearse para
aquellas especies que no producen respuesta en el FID, puesto que responde a
cualquier compuesto cuya conductividad trmica sea diferente a la del gas portador.
Es un detector no destructivo, por lo que puede emplearse en serie con otros y as
mejorar la cantidad de informacin obtenida.
c)
modificacin del FID. La presencia de iones alcalinos en una llama disminuyen las
ionizaciones de los grupos C-H y aumentan la de grupos que contienen atomos de N y
P, generando una respuesta muy selectiva para molculas que contienen estos
atomos.
d)
12
lquido lquido con un disolvente inmiscible con agua y compatible con la fase
estacionaria. Luego debe secarse este disolvente. La muestras solidas se tratan con
disoventes apropiados para extraer selectivamente los analitos.
-
traves de una columna que contiene un material adsorbente. Los analitos quedan
retenidos selectivamente y luego son eluidos con un pequeo volumen de disolvente
orgnico.
13
volatiles de una muestra lquida, generalmente acuosa usando un gas inerte de purga.
Generalmente depus los compuesto son retenidos en un adsorbente que luego se
somete a calentamiento para liberalos en introducirlos en el cromatografo.
Anlisis de compuestos orgnicos en general, para los que se emplea el detector FID.
14
6.1 Introduccin
Entre las tcnicas cromatogrficas cuya fase mvil es un lquido la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC) es la ms utilizada. Esta tcnica deriva de una
evolucin de la cromatografa preparativa en columna, en la que la cromatografa se
realizaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500
cm. Para que el flujo de fase mvil fuese razonablemente rpido las partculas de fase
estacionaria deban ser de gran dimetro (150-200 m), lo que se traduca en una
separacin poco eficaz y, a pesar de todo, lenta. Para aumentar la eficacia de la
separacin y as incrementar la resolucin era necesario emplear fases estacionarias
con tamao de partcula mucho menor (entre 2 y 5 m), ya que la difusin de los
solutos entre las fases mvil y estacionaria se hace ms rpida. Pero ello implica la
necesidad de impulsar la fase mvil con un sistema de alta presin, nace as la
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
15
c) Columna cromatogrfica
16
Las columnas de HPLC son tubos rectos de acero que miden entre 3 y 30 cm de
longitud. Su dimetro entre 2 y 5 mm. La fase estacionaria se mantiene entre dos
discos porosos situados en los extremos de la columna.
En HPLC se emplean dos tipos de relleno para las columnas:
- Relleno pelicular: se utilizan bolitas de vidrio o polmero no porosas esfricas de
dimetro entre 30-40 m. Sobre su superficie se deposita una capa delgada de
partculas muy pequeas (2-5 m) gel de slice, almina o un cambiador inico que
actan como fase estacionaria. Si la fase estacionaria es lquida se coloca una fina
pelcula de lquido sobre las esferas no porosas.
- Partculas porosas: se trata de micropartculas porosas con tamaos entre 3-10 m
de slice, almina o cambiadores inicos, que actan como fases estacionarias.
Tambin pueden recubrirse con pelculas orgnicas lquidas retenidas por adsorcin.
Son mas fciles de empaquetar pero menos eficaces que las segundas
Adems pueden emplearse fases enlazadas, que son generalmente partculas de gel
de slice modificadas qumicamente. Estas resultan mucho ms estables que los
lquidos retenidos fsicamente.
Muchas veces para alargar la vida de la columna analtica se atizan precolumnas con
objeto de retener impurezas de la muestra que podran perjudicar la columna
croamatografica. El relleno de la precolumna es similar al de la columna analtica pero
con mayor tamao de partcula.
d) Detector
Un detector ideal en HPLC debe ser sensible a pequeas concentraciones de analito,
dar una respuesta lineal amplia, tener poco ruido de fondo y ser estable en el tiempo
que dura el cromatograma. Adems, en caso de que se utilice gradiente debe ser
insensible a los cambios de composicin de la fase mvil. Es tambin importante que
la celda de flujo del detector tenga un volumen mnimo para no provocar
ensanchamiento de las bandas. La mayora de los detectores empleados responden a
alguna propiedad caracterstica de los compuestos a analizar aunque existen tambin
detectores que responden a la variacin de una propiedad de la fase mvil debido a la
presencia de solutos.
Algunos de los detectores ms usados son:
17
coulombimetra,
voltamperometra.
Detectan
compuestos
18
Una vez fijada la fase estacionaria las caractersticas de la fase mvil son el factor
clave de la separacin cromatogrfica. Las fases mviles se caracterizan por los su
capacidad de desplazamiento y selectividad. En fase normal los disolventes polares
eluyen ms rpidamente (tienen mayor capacidad de desplazamiento) mientras que en
fase inversa es al revs. La selectividad se basa en las interacciones especficas entre
el soluto y la fase mvil. Puede emplearse elucin isocrtica o en gradiente.
19
Cambiador de cationes
Cambiador de aniones
Los rellenos de cambio inico empleados como fases estacionarias suelen ser
polmeros
generalmente cidos o bsicos. Son frecuentes por ejemplo los cambiadores con
grupos -SO3-, -COO-, -NR4+.
20
La fase mvil en cromatografa de cambio inico suele ser una disolucin acuosa (con
cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgnico miscible con agua) que
contiene especies inicas en forma, generalmente, de disolucin reguladora del pH
(variable clave en la elucin). Los iones de la fase mvil compiten con los analitos por
los sitios activos de la fase estacionaria. Por ello, la fuerza eluyente y la selectividad
de la fase mvil dependen del tipo y concentracin de iones aadidos.
que
contenga
alguna
especie
absorbente
detectndose
los
solutos
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22