Tipos de Exames imunolgicos

A Imunolgica surgiu como um ramo da microbiologia e ganhou espao com os estudos das
doenas infecciosas e suas respectivas respostas. A nossa capacidade de coexistir com diversos
microorganismos de nosso ambiente depende de um conjunto de fatores, e um destes fatores o
Sistema Imune.
O Sistema Imune um conjunto de clulas de defesa e/ou ataque eficaz que tem a capacidade de
distinguir o que trs perigo para o organismo e proteg-lo contra estes patgenos oportunistas.
Esta distino ocorre por uma comunicao atravs de sinais mediados por citocinas e receptores.
As clulas do sistema imune esto distribudas por todo organismo, sendo encontradas alojadas
nos tecidos desempenhando o papel de sentinela e circulando por vasos sangneos e linfticos
esperando o sinal de que o organismo foi invadido.
A Imunolgica Clnica tem o papel de investigar e orientar o clnico no diagnstico das
patogenicidades atravs de resultados de exames laboratoriais. O clnico precisa conhecer as
estratgias traadas pelo Sistema Imune para controlar e/ou eliminar os diferentes patgenos,
alm de saber as estratgias de evaso utilizadas pelos patgenos para driblar a defesa e o ataque
do Sistema Imune.
Obviamente, do ponto de vista imunolgico, um determinado agente infeccioso no precisa se
restringir a uma nica estratgia patognica, de modo que a resposta imune eficiente contra o
determinado microorganismo pode incluir diversos mecanismos.
O conhecimento adquirido sobre o sistema imunolgico, principalmente sobre a produo de
anticorpos, conduziu a uma revoluo nas tcnicas usadas nas cincias biolgicas. Atualmente
uma grande parte dos mtodos bioqumicos e histolgicos lana mo desta poderosa ferramenta
chamada anticorpo para alcanar os seus objetivos. Acredito que os mtodos imunolgicos, ao
lado da biologia molecular, esto entre os maiores avanos em termos metodolgicos conseguidos
nos ltimos 10 ou 20 anos.
O mtodo laboratorial que utiliza anticorpos de valiosa importncia, por ser possvel produzir
anticorpos contra qualquer tipo de molcula e composto qumico. A produo de anticorpos
monoclonais aumentou enormemente a capacidade de gerar as tcnicas que utilizam anticorpos.

Imunoaglutinao
O fundamento bsico similar ao princpio das tcnicas de precipitao, diferindo na adsoro do
antgeno ou do anticorpo a micropartculas insolveis ou clulas e permitindo leitura visual e
rpida.
Uma desvantagem em relao imunoprecipitao, que a tcnica de aglutinao no permite
discriminar fraes dos componentes antignicos, mas permite a utilizao de antgenos
purificados e complexos fixados a micropartculas ou clulas. Tambm pode ser mais sensvel que
a imunoprecipitao e permite a deteco de pequenas quantidades de anticorpos.
A tcnica de imunoaglutinao apresenta como principal caracterstica a de que um dos
componentes (antgeno ou anticorpo) apresentado na forma insolvel em suspenso, de forma
natural em clulas, ou adsorvido artificialmente a micropartculas ou clulas. As reaes de
aglutinao promove a fixao do anticorpo na superfcie das hemcias (para posterior lise, se
necessrio) e a fixao do alrgeno na superfcie da IgE.
Com as reaes de aglutinao, formam-se agregados suficientemente grandes, de clulas
interligadas por pontes moleculares de anticorpos que se combinam simultaneamente com
determinantes antignicos iguais, porm situados em clulas diferentes.

Na reao de aglutinao ocorre o fenmeno de pr-zona, semelhante ao processo que ocorre na

reao de precipitao onde alguns anticorpos no conseguem precipitar o antgeno quando esto
em maiores quantidades. Para evitar este fenmeno, se faz necessrio utilizar soros diludos para
se observar aglutinao.
Alguns anticorpos, ditos incompletos ou bloqueadores, so incapazes de aglutinar as hemcias. A
explicao est na dificuldade de acessar o antgeno na superfcie da hemcia, porque o
determinante antignico deste antgeno est localizado na regio intramembranar, e/ou as cargas
eltricas presentes na membrana da hemcia dificultam o acesso do anticorpo. Um tratamento
enzimtico da hemcia com tripsina, papana ou bromelina melhor expem estes antgenos e
altera as cargas eltricas da membrana da hemcia favorecendo a reao com o anticorpo.
Tcnica: Adiciona-se em um tubo o soro teste e o antgeno particulado (hemcia ou bactria).
Incuba-se at a formao de aglutinao. Quando ocorrer aglutinao as partculas sedimentam
formando um "tapete" no fundo do tubo.
Princpio: Quando um antgeno particulado (bactrias; hemcias ou ltex adsorvidos com
antgenos) incubado com anticorpos especficos ocorre uma reao de aglutinao das partculas
antignicas.
Interpretao: A aglutinao das partculas indica a presena de anticorpos especficos para o
antgeno. A reao de aglutinao mais sensvel que a reao de precipitao. Portanto, para
aumentar a sensibilidade de deteco de antgenos solveis, pode-se ligar estes a hemcias ou
ltex.
Reao de aglutinao:
- Lmina, tubo ou placa de microtitulao
- Reao com partculas insolveis
- Fatores interferentes: classe de Ac, pH (6,0-8,0), tempo, temperatura, presena de
macromolculas (albumina, PEG)
Teste de aglutinao Direta:
- Ag faz parte naturalmente da clula
- Leitura visual e rpida
- Um dos componentes insolvel
- Uso de hemcias (grupo sangneo dos sistemas ABO e Rh)
- Uso de clulas bacterianas: pesquisa de Ac (leptospirose, brucelose e salmonelose)
- Determinao do ttulo

Teste de aglutinao indireta:

- Adsoro de Ag ou Ac a partculas inertes (ltex, sepharose, gelatina), hemcias de aves ou de
mamferos fixadas
Teste de aglutinao de partculas de ltex
- Protena C reativa (PCR), fator reumatide, anti-estreptolisina O (ASO)

Imunoprecipitao:
- Quantifica precipitados, Ag e Ac so inicialmente solveis
- Meio gelificado (gel de agar ou agarose) ou meio lquido (nefelometria, turbidimetria)
- Ag multivalente, Ac preferencialmente policlonal

Curva de Precipitao

Pr-zona

Ps-zona

Imunodifuso:
- Meio gelificado (gel de agar ou agarose)
- Precipitao mxima na regio de equivalncia
Classificao: simples e dupla, linear e radial
O teste de imunodifuso radial simples permite determinar a concentrao de uma amostra de
antgeno. O soro especfico incorporado a agarose que recobre uma lmina de vidro. Em orifcios
feitos na agarose, so adicionadas diferentes concentraes do antgeno. A lmina incubada por
24/48 horas. Observa-se o halo de precipitao em volta dos orifcios.
O Princpio:
Durante a incubao ocorre a difuso do antgeno na agarose, com a formao de complexos
antgeno-anticorpo. Os complexos precipitam e formam um halo ao redor do orifcio.
Interpretao:
Existe uma relao linear entre o quadrado do dimetro do halo e a concentrao do antgeno.
Com o uso de antgeno de concentraes conhecidas pode-se fazer uma curva padro, permitindo
determinar a concentrao em amostras desconhecidas. possvel inverter o teste, incorporando
antgeno na agarose e colocando-se soro nos orifcios.
Pesquisa de imunoglobulinas
- Suspeita de infeco
- Diagnstico de infeces intra-uterinas (toxoplasmose, rubola, citomegalia)

- Imunodeficincias: nvel de Igs e idade

- Gamopatias: mieloma mltiplo, macroglobulinemia de Waldestrm
- Diagnstico de alergia
Imunodifuso Dupla e Outcherlony Ambos Ag e Ac migram no gel, formao de banda na regio
de equivalncia.
Imunodifuso:
- Vantagens Mtodo de fcil execuo, tempo curto de realizao, baixo custo, no necessita de
aparato sofisticado
- Desvantagens Baixa sensibilidade, especificidade, difcil preservao do gel, no aplicvel a
alguns isotipos de imunoglobulinas.
- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnstico. Empregado como controle
em produo de policlonais.

Hemaglutinao:
Os testes sorolgicos so utilizados como um dos critrios para confirmao de suspeita clnica da
Doena de Chagas e triagem em bancos de sangue. Entretanto, alguns cuidados so necessrios na
escolha do mtodo e sua interpretao. O Machado Guerreiro (Fixao de complemento) era o
exame de escolha no passado, mas por apresentar baixa sensibilidade (60%), baixa especificidade
e complexidade na sua execuo, no mais deve ser utilizado. Os mtodos Hemaglutinao,
imunofluorescncia e imunoensaio apresentam sensibilidade prximo a 100%. Tendo em vista a
possibilidade de falso-positivos (leishmania, malria, sfilis, toxoplasmose, hansenase, doenas do
colgeno, hepatites) recomendado que o soro seja testado em pelo menos dois mtodos
diferentes antes de aceito, pelo clnico assistente, a positividade da sorologia. A hemoaglutinao
utilizada para triagem devido sua praticidade e boa sensibilidade. Entretanto, tem especificidade
inferior a imunofluorescncia e ao imunoensaio enzimtico. A imunofluorescncia indireta IgG
exame sensvel no diagnostico da Doena de Chagas. A imunofluorescncia indireta IgM til
para caracterizar fase aguda. Ambos apresentam menor reprodutibilidade que o
imunoensaio enzimtico (ELISA). O imunoensaio enzimtico utiliza antgenos altamente
purificados com maior sensibilidade (98 a 100%), maior especificidade (93 a 100%) e leitura mais
objetiva.
O imunoensaio de partculas em gel apresenta sensibilidade de 96,8% e especificidade de 94,6%.
Ressalta-se que a Organizao Mundial de Sade preconiza o uso de pelo menos dois testes de
diferentes metodologias para o diagnstico laboratorial da doena de Chagas.

Fixao do complemento:
Testes sorolgicos baseados na inativao do complemento pelo complexo antgenoanticorpo (estgio 1). A ligao do complemento livre pode ser visualizada pela adio de um
segundo sistema antgeno-anticorpo, tal como o de clulas vermelhas e anticorpos apropriados
contra clulas vermelhas (hemolisina) que requerem complemento para seu trmino (estgio 2). A
ausncia de lise das clulas vermelhas indica que uma reao antgeno-anticorpo especfica
ocorreu no estgio 1. Se ocorre lise das clulasvermelhas, o complemento livre est presente,
indicando que no ocorreu a reao antgeno-anticorpo no estgio 1.
- Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinao, rpida execuo, baixo custo;
- Desvantagens: Devido a problemas na preservao do Complemento, e na sua estabilidade,
problemas de falso negativos podem ocorrer.

Imunofluorescncia:
Os ensaios de imunofluorescncia so de grande importncia na imunologia clnica e necessitam
de consideraes especiais.
A primeira tcnica utilizada foi a imunofluorescncia direta, onde se pesquisou um antgeno em
uma reao com anticorpo preparado com o fluorocromo. Para este tipo de reao so utilizados
anticorpos purificados especficos para um determinado antgeno ou grupo de antgenos
conjugados com um fluorocromo. Esta tcnica tambm chamada de tcnica de camada simples.
A reao da imunofluorescncia indireta, ou tcnica de dupla camada, realizada por antgenos
fixados em uma lmina, onde se aplica primeiro um anticorpo especfico no fluorescente. E por
ltimo coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinantes
antignicos do primeiro anticorpo utilizado para reagir com o antgeno. Esta tcnica apresenta
como vantagem possibilidade de se ter uma fluorescncia mais evidente, pelo fato do anticorpo
fluorescente se ligar apenas aos anticorpos primrios. Outra vantagem que por esta tcnica
pode-se trabalhar com vrios anticorpos primrios especficos para diferentes tipos de antgenos e
pode-se identificar qual a classe que o anticorpo pertence.
A tcnica de imunofluorescncia por sanduche recebe este nome porque o antgeno fica entre
dois anticorpos. Esta tcnica aplicada para estudar tecidos linfides e descobrir que tipo de
anticorpos est sendo produzido.
- Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de deteco de protenas
intracelulares e de sua localizao, bem como do trfico intracelular.
- Desvantagens: variao individual na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscpio de
fluorescncia; tcnicas especiais de fixao e incluso de tecidos para Imunohistoqumica nem
sempre disponveis.
Imuno Enzimtica
Elisa/EIA
A ELISA (do ingls, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) se baseia na identificao de anticorpos
e ou antgenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre
um substrato e a reao faz com que o cromgeno mude de cor (Figura 17). O produto da reao,
alm de colorido, insolvel para no difundir do local da formao.
Reao enzimtica ELISA
A reao desenvolvida, freqentemente, em micro placas contendo vrios poos onde so
depositados os reagentes. H vrias maneiras (mtodos) de se processar o ensaio
imunoenzimtico.
O mtodo competitivo mais usado para identificao de antgenos, mas pode tambm ser
empregado para a deteco de anticorpos. Neste mtodo primeiro se adsorve o anticorpo no poo
da microplaca. Aps a adsoro do anticorpo, uma soluo que possivelmente contm o antgeno
adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O prximo passo adicionar o antgeno marcado
com uma enzima. Os poos que no possuem o antgeno primrio (da soluo problema)
aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poos que possuem antgenos aderidos
aos anticorpos no mudam de cor.
O mtodo indireto utilizado para deteco de anticorpos. Neste caso o antgeno fica aderido aos
poos da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado
com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A
presena de cor nos poos indica a presena do anticorpo, e os poos que no mudarem de cor
indica a ausncia do anticorpo em questo.

O mtodo de sanduche, ou captura, indicado para identificao de antgenos, e este antgeno

fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primrio especfico ao antgeno adsorvido no
poo da microplaca. Em seguida o antgeno na soluo problema adicionado. Depois o segundo
anticorpo especfico ao antgeno marcado com uma enzima adicionado. Esta enzima que reage
com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de cor nos poos indica a
presena do antgeno, e os poos que no mudarem de cor indica a ausncia do antgeno em
questo.
Radioimunoensaio/RIA
Esta tcnica de grande importncia dentro da imunologia clnica, pois pequenas quantidades de
anticorpos ou antgenos podem ser detectadas depois de marcadas com istopos radioativos.
Desta forma, h um grande aumento na sensibilidade das reaes imunolgicas. E no h perda
das caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas das molculas marcadas com os compostos
radioativos.
A radioimunodifuso o mtodo que aplica os princpios da imunodifuso simples, radial, para
identificao de anticorpos, por exemplo, IgE humana (que est em presente em pequenas
quantidades no soro).
Citometria de Fluxo
A citometria de fluxo tem como particularidade anlise rpida, quantitativa e multiparamtrica
de uma clula individual (viva ou morta), entre diversas clulas de uma populao. Ou seja, esta
tcnica possibilita que um determinado tipo celular seja rapidamente identificado, caracterizado,
quantificado e selecionado.
A anlise quantitativa e a separao de clulas so as duas aplicaes gerais deste mtodo.
Freqentemente empregado para investigar a expresso de certas molculas intracelulares ou
molculas de membrana.
Western blotting
Western blotting (WB) tambm conhecido como protein blotting ou immunoblotting, um
poderoso e importante mtodo em biologia molecular utilizado para imunodeteco de protenas
aps a separao destas por eletroforese em gel e transferncia para membrana adsorvente. Esta
tcnica permite detectar, caracterizar e quantificar mltiplas protenas, principalmente aquelas
que esto em baixas quantidades em determinada amostra.
A tcnica de WB oferece as seguintes vantagens: membranas midas so maleveis e de fcil
manuseio; as protenas imobilizadas na membrana so rapidamente e uniformemente acessveis a
diferentes ligantes; somente uma pequena quantidade de reagentes so necessrios para a
anlise de transferncia; possvel fazer mltiplas rplicas do gel; o armazenamento da amostra
transferida pode ser prolongado, antes de ser usada e a mesma protena transferida pode ser
usada para mltiplas anlises sucessivas. Alm disso, em estudos relacionados deteco de
anticorpos e protenas de agentes infecciosos, este mtodo considerado altamente sensvel e
especfico.

Tcnicas envolvendo disperso da luz

I - Nefelometria:
Passagem de luz em meio com partculas disperso da luz em todas as direes (efeito Tyndall)
Reaes de precipitao Ag-Ac em solues diludas reflexo da luz
Medida feita na regio de excesso de Ac (relao linear entre concentrao e densidade tica
Desvantagens: custo elevado do equipamento e anti-soro
Aplicaes: Ig, fator reumatide, protenas do complemento, hormnios
II- Turbidimetria
Mede a quantidade de luz transmitida (pode usar espectofotmetros)
Aplicaes: mesmas da nefelometria
CONCLUSAO
Os mtodos imunolgicos esto distribudo amplamente tanto na pesquisa como na
anlise bioqumica e da imonologia clnica. Dentre as diversas vantagens destas tcnicas, duas
parecem ser as mais importantes para o grande sucesso destes mtodos: A grande especificidade
facilmente conseguida com os anticorpos e a grande sensibilidade destes mtodos alm da imensa
diversidade e maleabilidade destas tcnicas, uma vez que praticamente todos os componentes
usados nestes mtodos podem ser interligados, basta utilizar as pontes adequadas.
Estas caractersticas fizeram dos mtodos imunolgicos de grande utilidade em vrias
reas das cincias biolgicas, biomdicas e mdicas, sendo o seu conhecimento fundamental em
toda a rea da sade humana.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
www.ufrgs.br
WWW.wikipedia.org.br
WWW.hermespardini.com/laboratoriosconveniados
WWW.roche.com.br
WWW.portaleducacao.com.br
Alberts, B, Dennis, B., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D., Molecular Biology of the Cell,
3rd Ed. Garland Publ. New York. (1995).

UNIOESTE - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARAN

ACADMICO: EDUARDO MARTINS BOZA

IMUNOLOGIA:
EXAMES IMUNOLGICOS
PROF: CLEBER SERAFIAN

CURSO: FARMCIA

CASCAVEL, OUTUBRO DE 2014.