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Universidade Federa l de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental Mestrado em Engen haria

Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental Mestrado em Engenharia Ambiental

Davi Silva Moreira

DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALITICA POR CROMATOGRAFIA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA AVALIAÇÃO DA OCORRÊNCIA DE PERTURBADORES ENDÓCRINOS EM MANANCIAIS DE ABASTECIMENTO DA REGIÃO METROPOLITANA DE BELO HORIZONTE.”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título: “Mestre em Engenharia Ambiental – Área de Concentração: Saneamento Ambiental”

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino

Ouro Preto, MG

2008

M838D

MOREIRA, DAVI SILVA. Desenvolvimento da metodologia analítica por cromatografia/ espectrometria de massas para avaliação da ocorrência de pertubadores endócrinos em mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte [manuscrito] / Davi Silva Moreira. – 2008. 123f. : il. color., graf., tabs.

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Francisco de Aquino.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisa em Recursos Hídricos Pró-Água.

1. Belo Horizonte - Abastecimento de água - Teses. 2. Mananciais hídricos - Teses. 3. Análise cromatográfica - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

iii

“Por falta de reflexão os projetos fracassam, mas se realizam quando há muitos conselheiros.”

Provérbios 15,22

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por sempre estar comigo em todos os momentos. Sem Ele não seria possível completar esta importante etapa na vida. Ao professor Sérgio por ter acreditado na minha capacidade e ter sido um grande professor nos ensinamentos de vida acadêmica e profissional. Ao professor Robson por ter apoiado o projeto e ajudado valiosamente com seus conhecimentos. Aos professores do DEQUI pela dedicação em repassar seus conhecimentos a todos nós alunos durante a graduação e mestrado. Aos colegas da UFMG: Jacson, Lucinda e, principalmente, ao Fábio e a Eliane que ajudaram no projeto sempre que necessário. Ao professor Valter por ter confiado no DEQUI-UFOP como parceiro no projeto PROSAB 5. Aos amigos do laboratório Aniel, Danusa, Fernanda e Gustavo pela grande amizade e o intercâmbio de conhecimentos que foram de grande valia para a evolução de nossos projetos. A Miriany pela grande ajuda no final do projeto com as análises complementares. Aos amigos Flaviane e Leandro que sempre estiveram comigo nos melhores e piores momentos de UFOP, que já são seis anos. Obrigado!

A

UFOP pela bolsa concedida.

A

COPASA pela colaboração na coleta das amostras.

E

finalmente, aos meus pais Luiz Henrique e Iolanda e aos meus irmãos Saulo e

Ariel que sempre apoiaram e incentivaram mostrando que todo esforço vale a pena. Muito obrigado!

SUMÁRIO

 

Página

1. INTRODUÇÃO

1

2. OBJETIVOS

4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

5

3.1. O sistema endócrino

5

3.2. Perturbadores endócrinos

7

3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos

9

3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos relatados em animais silvestres

e de laboratório

11

 

3.2.3.

Efeitos dos perturbadores endócrinos relatados em humanos

13

3.3.

Análise e monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas

Superficiais

14

3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos

15

3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais

24

3.3.3. Técnicas de remoção de perturbadores endócrinos

30

3.3.4. Considerações finais

32

4.

MATERIAIS E MÈTODOS

34

4.1.

Desenvolvimento e Otimização do Método Analítico

34

4.1.1. Amostragem, filtração e ajuste do pH

36

4.1.2. Extração e concentração dos analitos

36

4.1.3. Secagem e suspensão dos analitos

38

4.1.4. Análise Cromatográfica

38

4.2.

Validação do método analítico

42

4.2.1. Estabilidade

43

4.2.2. Seletividade

44

4.2.3. Curva analítica

44

4.2.4. Linearidade e Sensibilidade

47

4.2.5. Precisão

47

4.2.6. Ensaio de supressão

48

4.2.7. Ensaio de recuperação

48

4.2.8. Ensaio de calibração interlaboratorial

49

4.3.

Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos nos Mananciais da

Região Metropolitana de Belo Horizonte

50

5.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

58

5.1.Cromatografia Gasosa com Detecção por Ionização em Chama

58

5.2.

Cromatografia Líquida com Detecção por Espectrometria de massas -

Desenvolvimento do Método Analítico

61

5.3.

Validação do Método Analítico para LCMS

65

5.3.1. Estabilidade

65

5.3.2. Seletividade

66

5.3.3. Curva Analítica

67

5.2.4. Linearidade e Sensibilidade

69

5.2.5. Precisão

70

SUMÁRIO (continuação)

 

Página

5.3.6 Ensaio de Supressão

71

5.3.7 Ensaio de Recuperação

73

5.3.8. Ensaio de calibração interlaboratorial

74

5.4. Monitoramento dos Perturbadores Endócrinos em Mananciais da Região Metropolitana de Belo Horizonte

76

5.5 Estimativa de valores críticos de toxicidade dos PE estudados

94

6. CONCLUSÕES

97

7. PERSPECTIVAS

99

8. REFERÊNCIAS

100

LISTA DE FIGURAS

 

Página

Figura 3.1: Órgãos do sistema endócrino

5

Figura 3.2: Funcionamento do hipotálamo

6

Figura 3.3: Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais

8

Figura 3.4: Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito antagonista

11

Figura 3.5: Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores endócrinos

16

Figura 3.6: Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse

19

Figura 3.7: Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da amostra contendo estrogénios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo de detecção pretendida

22

Figura 4.1: Diagrama geral para preparação e análises dos

35

Figura 4.2: Cartucho SPE C18 500mg Unitech

37

Figura 4.3: Sistema de extração em fase sólida utilizado para extração dos analitos de interesse das amostras ambientais

38

Figura 4.4: Reação de Silanização a partir dos analitos a serem derivatizados (nonilfenol, estradiol e etinilestradiol) e o reagente de derivatização utilizado (BSTFA)

39

Figura 4.5: Diagrama esquemático de funcionamento do espectrômetro de massas íon-trap – time-of-flight

41

Figura 4.6: Fórmula Estrutural da Fenolftaleína

45

Figura 4.7: Localização dos 3 mananciais estudados na Região Metropolitana de Belo Horizonte

51

Figura 4.8: Contribuição das ETAs no abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte

51

Figura 4.9: Vista aérea ETA Rio das Velhas

53

Figura 4.10: Local de amostragem para água bruta do manancial Rio das Velhas

53

Figura 4.11: ETA Vargem das Flores

54

Figura 4.12: Vista aérea ETA Vargem das Flores

55

Figura 4.13: Vista aérea da ETA Sistema Morro Redondo

56

Figura 4.14: ETA Morro Redondo

56

Figura 5.1: Cromatogramas obtidos (5) no GC-FID com a injeção de mistura de padrões em diferentes

60

Figura 5.2 Curva de calibração obtida com a mistura dos padrões analisados

60

LISTA DE FIGURAS (continuação)

Figura 5.3: Cromatograma típico da análise dos PE em questão: 1 – Fenolftaleína, 2 – Estradiol, 3 – Etinilestradiol, 4 – ms² Etinilestradiol, 5 – ms² Estradiol, 6 – Nonilfenol , 7 – ms² nonilfenol ) Figura 5.4: Cromatogramas relativos aos íons precursores ms 1 e ms² (modos negativo) característicos de cada composto Figura 5.5: Cromatograma do metanol puro (branco). Ausência de picos para E2, EE2 (Segmento 1 - 5minutos - esquerdo) e a presença de interfente no tempo de retenção do NP (Segmento 2 - 6,8minutos - direito) Figura 5.6: Amostra Morro Redondo (água bruta) com adição de estradiol e etinilestradiol (100 μg.L -1 , quadro da esquerda) e n-nonilfenol (200 μg.L -1 , quadro da Figura 5.7: Curvas analíticas obtidas com soluções-padrão para os quatro padrões de PE Figura 5.8: Chuva acumulada mensal na RMBH durante o período de monitoramento (fev/07 a jan/08) Figura 5.9: Box-plot da concentração dos três compostos determinados nos mananciais estudados em todas as campanhas amostrais. Água Bruta Figura 5.10: Variação da concentração de nonilfenol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08 Figura 5.11: Cromatograma para Nonilfenol da Amostra Rio das Velhas – Nov. 2007 e as diferentes fragmentações (ms²) de seus isômeros (esquerda). Exemplos de estruturas químicas de 5 dos 550 Isômeros de nonilfenol existentes (direita) Figura 5.12: Boxplot da concentração de nonilfenol na água bruta nos 3 mananciais Figura 5.13: Índice de remoção de NP (água bruta – água filtrada) durante as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008 Figura 5.14: Variação da concentração de estradiol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08 Figura 5.15: Variação da concentração de etinilestradiol em água bruta nos mananciais durante o período de fev/07 a jan/08 Figura 5.16: Índice de remoção (água bruta – água filtrada) de EE2 durante as campanhas de junho 2007 a janeiro 2008 Figura 5.17: Confirmação da presença de Bisfenol A na água a partir do LCMS. Amostra: Rio das Velhas janeiro de 2008 Figura 5.18: Análise quimiométrica das amostras referentes aos meses de jun/07 a set/07 com base no PCA

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63

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70

76

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88

89

LISTA DE FIGURAS (continuação)

Figura 5.19: Variação do pH nas amostras de água bruta dos três

mananciais durante o período de monitoramento

Figura 5.20: Variação da turbidez nas amostras de água bruta dos três mananciais durante o período de monitoramento Figura 5.21: Variação da cor aparente nas amostras de água bruta durante o período de monitoramento nos 3 mananciais Figura 5.22: Variação da cor verdadeira nas amostras de água bruta durante o período de set/07 a Jan/08 nos 3 mananciais Figura 5.23: Análise da Componente principal (PCA) dos seis parâmetros utilizados para o monitoramento dos mananciais escolhidos

Página

91

91

92

92

93

LISTA DE TABELAS

 

Página

Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos

9

Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais

12

Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al. 2000)

15

Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes

19

Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais

26-28

Tabela 3.6: Principais fontes de perturbadores endócrinos em águas superficiais

30

Tabela 3.7: Metodologias estudadas para remoção de perturbadores endócrinos

32

Tabela 4.1: Nome IUPAC, massa, fórmula molecular, pureza, marca e número CAS dos compostos determinados

35

Tabela 4.2: Descrição do procedimento de extração com cartucho Unitech C18 (500 mg) utilizado nesse trabalho para a extração simultânea dos três compostos de interesse

37

Tabela 4.3: Condições de análise dos Perturbadores endócrinos por cromatrografia gasosa

40

Tabela 4.4: Condições de análise dos PE por cromatrografia líquida acoplada à espectrometria de massas

42

Tabela 4.5: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol na ETA Rio das Velhas

54

Tabela 4.6: Campanhas realizadas para determinação de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol na ETA-Vargem das Flores

55

Tabela 4.7: Campanhas realizadas para determinação dos Perturbadores Endócrinos na Região Metropolitana de Belo Horizonte – ETA Morro Redondo

57

Tabela 5.1: Tempo de retenção, área obtida em relação à concentração e limite de detecção dos compostos analisados por cromatografia gasosa

59

Tabela 5.2: Fórmulas moleculares, tempos de retenção, íons primários (ms 1 ) e secundários (ms 2 ) característicos para cada padrão utilizado

64

Tabela 5.3: Variação da concentração dos compostos em relação ao tempo de preparo das amostras

66

LISTA DE TABELAS (continuação)

 

Página

Tabela 5.4: Faixa de trabalho, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) dos quatro compostos determinados por LCMS-IT-TOF

68

Tabela 5.5: Coeficiente de correlação (r) obtido para os 4 padrões determinados por LCMS-IT-TOF ao longo do monitoramento

69

Tabela 5.6: Repetibilidade dos resultados obtidos para soluções-padrão dos três PE expressa por meio do coeficiente de variação (CV)

71

Tabela 5.7: Resultados dos testes de supressão realizados com amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo (fev. 2008)

72

Tabela 5.8: Variação da supressão nas amostras de água bruta no mês de janeiro 2008

73

Tabela 5.9: Valores obtidos pelos ensaios de recuperação de E2, EE2 e NP em função da fortificação das amostras coletadas na entrada da ETA Morro Redondo

74

Tabela 5.10: Resultados obtidos pela calibração interlaboratorial UFOP- CIRRA

70

Tabela 5.11: Concentração de nonilfenol (ng.L -1 ) encontrada durante as campanhas de amostragem

79

Tabela 5.12: Concentração de 17β-estradiol (ng .L -1 ) encontrada durante as campanhas de amostragem

84

Tabela 5.13: Concentração de 17α-etinilestradiol (ng.L -1 ) encontrada durante as campanhas de amostragem

86

Tabela 5.14: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Rio das Velhas (água bruta)

89

Tabela 5.15: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Vargem das Flores (água bruta)

90

Tabela 5.16: Dados de pH, Turbidez, Cor Aparente e Real durante o período de fevereiro 2007 a janeiro 2008. Local: Morro Redondo (água bruta) Tabela 5.17: Exemplos de pertubação endócrina observada em animais do sexo masculino expostos aos estradióis e nonilfenol durante o período pré-natal. (adaptado Damstra et al.,

90

2002)

94

LISTA DE NOTAÇÕES

APEO

Alquilfenóis Polietoxilados

BPA

Bisfenol A

BSTFA

N-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida

CAS

Chemical Abstract Service

CETESB

Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

CG

Cromatografia Gasosa

CG-FID

Cromatrografia Gasosa com detecção por Ionização em Chama

CGMS

Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas

CSTEE

Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment

DAD

Detector de Arranjo de Diodo (para cromatografia líquida)

DDE

Diclorodifeniltricloroetileno

DDT

Dicloro-difenil-tricloro-etano

DES

Dietilestilbestrol

DIC

Detector de Ionização em Chama (para cromatografia Gasosa)

E1

Estrona

E2

Estradiol

E3

Estriol

EDC

Endocrine Disrupting Chemicals

EE2

Etinilestradiol

EM

Espectrometria de Massas

ESI

Eletronspray ionization

ETA

Estação de tratamento de água

ETE

Estação de tratamento de esgoto

FE

Fase estacionária

FM

Fase móvel

H 2 SO 4 HCl HPLC IEH IPCS IUPAC LC LCMS

Ácido Sulfúrico Ácido Clorídrico Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Institute for Ecological Health Programa Internacional de Segurança Química International Union of Pure and Applied Chemistry Cromatografia Líquida Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas

LCMS-IT-

Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas. Detecção por

TOF

Ion Trap e Time of Flight

MSTFA

N-metil-n-trifluoroacetamida

MTBSTFA N-metil-n-(tert-butildimetilsilil)trifluoroacetamida

4NP

4-nonilfenol

LISTA DE NOTAÇÕES (continuação)

NP

Nonilfenol ou n-nonilfenol

NPEO

Nonilfenol Polietoxilado

OCDE

Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico

OMS

Organização Mundial da Saúde

PCA

Análise de componente principal

PE

Perturbadores Endócrinos

POP

Poluentes Orgânicos Persistentes

RMBH

Região Metropolitana de Belo Horizonte

SPE

Extração por fase sólida

SPME

Microextração em fase sólida

STP

Substâncias Tóxicas Persistentes

UE

União Européia

UKEA

Agência de Proteção Ambiental do Reino Unido

USEPA

Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos

UV/VIS

Detector ultravioleta na região do visível

VTG

Vitelogenina

RESUMO

Alguns compostos orgânicos classificados como Perturbadores Endócrinos (PE) são encontrados em águas superficiais e têm atraído a atenção da comunidade científica devido à alteração que eles causam no sistema endócrino da fauna aquática e ao potencial risco à saúde humana. Nessa classe de compostos, destacam-se os hormônios (17β-estradiol, 17α-etinilestradiol) e subprodutos da degradação de surfactantes não- iônicos (n-nonilfenol). Devido a atualidade do tema, há poucos trabalhos nacionais publicados abordando o monitoramento e a remoção de PE de águas naturais, não havendo ainda uma legislação que regulamente a emissão de hormônios e nonilfenóis no ambiente ou que estabeleça padrões de potabilidade para tais compostos. Sendo assim, essa dissertação teve como objetivo desenvolver metodologia analítica para quantificação de 17β-estradiol (E2), 17α-etinilestradiol (EE2) e n-nonilfenol (NP) em amostras de água superficial, de forma a permitir o monitoramento de tais PE em três mananciais de abastecimento da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH). A quantificação dos PE nas amostras ambientais foi feita em equipamento de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LCMS) após extração e concentração em cartuchos tipo C18. A recuperação dos PE pelo processo de extração em fase sólida variou de 90 a 96¨% ao passo que os limites de detecção do método foram de 1,4; 0,9 e 4,9 ng.L -1 para o E2, EE2 e NP, respectivamente. Após validação do método analítico, foi feito o monitoramento do afluente e da água filtrada (em filtro de areia) de três estações de tratamento de água (Morro Redondo, Vargem das Flores e Rio das Velhas) da região Metropolitana de Belo Horizonte. Todos os três compostos monitorados foram encontrados em pelo menos uma amostra, sendo que o n-nonilfenol esteve presente em todas amostras de água bruta, na faixa de concentração de 44 a 1.918 ng.L -1 . Os compostos 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol foram determinados em apenas 15% das amostras, na faixa de concentração de 2 a 54 ng.L -1 . As análises das amostras coletadas nas ETAs após o filtro de areia mostraram que as etapas de pré-cloração, coagulação, sedimentação e filtração não foram capazes de remover, em sua totalidade, os PE monitorados.

Palavras-chave: Perturbadores endócrinos; microcontaminantes orgânicos; qualidade da água; tratamento de água; espectrometria de massas.

ABSTRACT

Some organic molecules classified as endocrine disrupters compounds (EDC) have been found in surface waters and attracted attention from the scientific community due to their hability to tamper with the endocrine system of aquatic fauna, hence due to the potential risk they pose to human health. Among the compunds with endocrine properties, the hormones (17β-estradiol 17α- ethinylestradiol) and a by-product of the degradation of non-ionic surfactants (n-nonylphenol) are of particular importance. There are a handful of papers on the monitoring of EDC in Brazilian waters and there is no Brazilian legislation regulating estradiol and nonylphenol in surface or drinking water. Therefore, this work aimed at developing analytical techniques to quantify 17 β- estradiol (E2), 17 α-ethynilestradiol (EE2) and n-nonylphenol (NP) in samples of surface water from three manancials located in the Belo Horizonte Metropolitan Area, Minas Gerais, Brazil. The quantification of such EDC was performed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LCMS) after the samples being extracted and concentrated with C18 cartridges. The recovery of EDC by solid phase extraction varied from 90 to 96% and the limit of detection of the whole analytical procedure was determined as 1.4; 0.9 and 4.9 ng.L -1 for E2, EE2 and NP, respectively. After the method validation it was carried out a one year monitoring of raw and filtered water (sand filtration) of three water treatment plants (Morro Redondo, Vargem das Flores and Rio das Velhas) that supply Belo Horizonte Metropolitan Area. The results showed that the three compounds were found in at least one sample, and that the n- nonylphenol was present in all water samples analysed, in a concentration range of 44 to 1,918 ng.L -1 . The estrogens 17β-estradiol and 17 α-ethinylestradiol were detected in only 15% of the samples, in a concentration range of 2 to 54 ng/L. The analyses of samples collected in the WTPs after the sand filter indicates that the pre-chlorination, coagulation, sedimentation and sand filtration steps were not capable of completely removing the EDC present in the raw water.

Keywords: Endocrine Disruptors Compounds; organic microcontaminants; Water Quality; Water Treatment; mass spectrometry

1. INTRODUÇÃO

A água é hoje reconhecida como um dos bens naturais mais importantes do

planeta. Seus múltiplos usos são indispensáveis a um amplo espectro das atividades

humanas. Devido a crescente degradação dos corpos d’água, as preocupações com o uso e destino têm mobilizado pessoas de diversas áreas acadêmicas a pesquisas científicas com o intuito de preservar e recuperar esse recurso natural.

A partir da década de 70, o interesse da comunidade acadêmica e a criação de

órgãos de proteção ambiental, como a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA), promoveram um crescimento de pesquisas envolvendo monitoramento de microcontaminantes orgânicos em diversos setores ambientais. Com isso, o interesse dos setores público e privado por assuntos ambientais resultou em várias organizações governamentais e não-governamentais que hoje debatem, estabelecem normas e discutem práticas de minimização e remediação de substâncias químicas potencialmente poluentes. Dentre as substâncias químicas potencialmente poluentes, nos últimos anos, destacaram-se alguns compostos denominados perturbadores endócrinos (PE), que são substâncias que podem provocar alterações no sistema endócrino de animais e de humanos. Os PE constituem uma classe de substâncias não definidas pela sua natureza química, mas pelo seu efeito biológico, que pode causar distúrbios no sistema endócrino mesmo em baixas concentrações. Muitos dos perturbadores endócrinos listados por algumas organizações como a USEPA e a Agência Ambiental do Reino Unido (UKEA), também estão classificados numa série de grupos de compostos orgânicos potencialmente tóxicos, tais como as substâncias tóxicas persistentes (STP), poluentes orgânicos persistentes (POP), poluentes emergentes, dentre outros. A União Européia também elaborou um relatório contendo uma vasta lista de 118 compostos suspeitos de interferir no sistema endócrino, tanto de seres humanos como de diferentes espécies animais (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002). O interesse no estudo de compostos classificados como PE foi motivado a partir de observações sobre a ocorrência de anormalidades no sistema endócrino e reprodutivo de animais. Os sintomas observados têm sido atribuídos à presença de uma grande variedade de substâncias químicas, mesmo em concentrações-traço, principalmente em sistemas aquáticos naturais (Auger et al. 1995; Routledge et al. 1998). Uma evidência dos possíveis efeitos dos PE em seres humanos foi obtida a partir da experiência

envolvendo mulheres grávidas que tomaram o estrogênio sintético dietilestilbestrol (DES), prescrito para evitar o aborto espontâneo e promover o crescimento do feto, no período entre 1948 a 1971. Muitas das filhas dessas mulheres são hoje estéreis e, uma minoria, tem desenvolvido um tipo raro de câncer vaginal (Damstra et al., 2002). Homens adultos que foram expostos a estradiol mostram maior incidência de anormalidades em seus órgãos sexuais, apresentam contagem média de espermatozóides diminuída e podem sofrer um risco maior de desenvolver câncer de testículos (Colucci et al. 2001; Guillette et al. 1996; Legler et al. 2002). Dentre a vasta quantidade de PE que já foram avaliados pela comunidade científica, destacam-se três compostos que são comumente avaliados em diversos trabalhos, que pode ser justificado pelos seguintes fatores:

i) n-nonilfenol ou nonilfenol: é um subproduto da degradação dos alquillfenóis polietoxilados (APEO), que são agentes surfactantes de amplo uso tanto em processos industriais como em produtos de uso doméstico, por exemplo, detergentes (USEPA 2001);

ii) 17β-estradiol ou estradiol: é um hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante, sendo por isso naturalmente e diariamente excretado na urina humana e, assim, descartado no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2003);

iii) 17α-etinilestradiol ou etinilestradiol: é um dos estrogênios sintéticos mais usados como contraceptivos orais, na reposição terapêutica na menopausa ou na prevenção do aborto (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli e Jardim 2007).

De acordo com trabalhos nacionais e internacionais, compostos classificados como PE têm sido detectados em amostras de águas superficiais, principalmente em função da atividade antrópica (Alda e Barceló 2001). Pesquisas também têm mostrado que substâncias estrogênicas são encontradas em rios receptores de esgotos domésticos, tratados ou in natura. Potencialmente danosos à saúde, os PE têm se mostrado resistentes aos processos de tratamento convencionais utilizados nas estações de tratamento de esgotos (ETE) e de águas (ETA), sendo a intensidade de remoção dos PE dependente das condições operacionais impostas no sistema de tratamento. Os poucos trabalhos existentes sobre o tema indicam que os tratamentos convencionais não

conseguem remover completamente tais micropoluentes, havendo relato da presença de diversos fármacos e de estrogênios naturais e sintéticos no esgoto doméstico e efluentes de ETEs (Jeannot et al. 2002; Körner et al. 2000). Em relação aos corpos d’água, outro fator importante é que pouco se sabe sobre

o real impacto desses compostos sobre o ambiente aquático e, principalmente, sobre a saúde humana. No caso do Brasil, a ausência de ETEs em grande parte dos municípios brasileiros agrava ainda mais o quadro de possível contaminação das águas superficiais por PE.

Tendo em vista a crescente preocupação ambiental dedicada aos “perturbadores endócrinos”, principalmente no Brasil, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia analítica que permita a detecção e quantificação de três PE (NP, E2 e EE2) em amostras de água superficiais a partir da técnica de LCMS. Serão também discutidos, brevemente, resultados sobre análises dos três compostos a partir da cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (CG-FID). Após o desenvolvimento da técnica de análise, será feito o monitoramento de três mananciais de abastecimento da RMBH: Rio das Velhas e Morro Redondo e Vargem das Flores. Dessa forma, o primeiro capítulo de resultados apresentará o procedimento para validação da metodologia analítica empregada e discutirá os parâmetros mais relevantes para análise. O segundo capítulo de resultados apresentará os dados do monitoramento

de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em três pontos de captação de água da região metropolitana de Belo Horizonte (RMBH) e discutirá os resultados obtidos. Finalmente,

o capítulo de conclusões consubstanciará as informações mais relevantes e destacará a contribuição da dissertação para o tema pesquisado.

2. OBJETIVOS

O objetivo geral do trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a detecção e quantificação dos perturbadores endócrinos nonilfenol (NP), estradiol (E2) e etinilestradiol (EE2) em amostras de água usando cromatografia acoplada a espectrometria de massas (LCMS).

Objetivos específicos:

Monitorar, pelo período de um ano, a água de três mananciais da região metropolitana de Belo Horizonte para avaliar a presença de NP, E2 e EE2;

Avaliar, de forma geral, a eficiência das etapas de pré-cloração, coagulação, sedimentação e filtração, empregadas nas estações de tratamento de água (ETA) monitoradas, na remoção de NP, E2 e EE2.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. O sistema endócrino

Dá-se o nome de sistema endócrino ao conjunto de órgãos que apresentam como atividade característica a produção de secreções denominadas hormônios, que são lançados na corrente sangüínea e irão atuar em outra parte do organismo, controlando ou auxiliando o controle de sua função. Os órgãos que têm sua função controlada e/ou regulada pelos hormônios são denominados órgãos-alvo (Guyton 1988). Os hormônios influenciam praticamente todas as funções dos demais sistemas corporais. Freqüentemente o sistema endócrino interage com o sistema nervoso, formando mecanismos reguladores bastante precisos. O sistema nervoso pode fornecer ao endócrino a informação sobre o meio externo, ao passo que o sistema endócrino regula a resposta interna do organismo a esta informação. Dessa forma, o sistema endócrino, juntamente com o sistema nervoso, atua na coordenação e regulação das funções corporais (Guyton 1988). A Figura 3.1 apresenta os órgãos do sistema endócrino. As propriedas dos órgãos do sistema endócrino serão discutidas a seguir.

órgãos do sist ema endócrino serão discutidas a seguir. Figura 3.1 - Órgãos do sistema endócrino

Figura 3.1 - Órgãos do sistema endócrino (Fonte: AFH, 2007).

Hipófise ou pituitária: os hormônios produzidos pela hipófise são denominados tróficos por atuarem sobre outras glândulas endócrinas. São responsáveis por ativar a secreção de outros hormônios como os da glândula tireóide, glândula adrenal, gônadas e do crescimento.

Hipotálamo: responsável pelo controle da hipófise através de conexões neurais e substâncias semelhantes a hormônios chamados fatores desencadeadores (ou de liberação), o meio pelo qual o sistema nervoso controla o comportamento sexual via sistema endócrino. Em mulheres, a glândula-alvo do hormônio gonadotrófico é o ovário; no homem, são os testículos. O hipotálamo é responsável pelo controle de inibição ou liberação destes hormônios. Como a hipófise secreta hormônios que controlam outras glândulas e está subordinada, por sua vez, ao sistema nervoso, pode-se dizer que o sistema endócrino é subordinado ao nervoso e que o hipotálamo é o mediador entre esses dois sistemas A Figura 3.2 apresenta um diagrama de funcionamento do hipotálamo.

3.2 apresenta um diagrama de funcionamento do hipotálamo. Figura 3.2 - Funcionamento do hipotálamo (Fonte: AFH,

Figura 3.2 - Funcionamento do hipotálamo (Fonte: AFH, 2007).

Tireóide: responsável pela produção de hormônios como triiodotironina (T3) e tiroxina (T4), que aumentam a velocidade dos processos de oxidação e de liberação de energia nas células do corpo, elevando a taxa metabólica e a geração de calor. A calcitonina, outro hormônio secretado pela tireóide, participa do controle da concentração sangüínea de cálcio, inibindo a remoção do cálcio dos ossos e a saída dele para o plasma sangüíneo, estimulando sua incorporação pelos ossos.

Paratireóides: glândulas responsáveis pela secreção do paratormônio, hormônio que estimula a remoção de cálcio da matriz óssea (o qual passa para o plasma sangüíneo), a absorção de cálcio dos alimentos pelo intestino e a reabsorção de cálcio pelos túbulos renais, aumentando a concentração de cálcio no sangue.

Adrenais ou supra-renais: são duas glândulas localizadas sobre os rins, divididas em duas partes independentes, medula e córtex.

Pâncreas: é uma glândula mista, ou seja, apresenta determinadas regiões endócrinas e exócrinas ao mesmo tempo. As funções endócrinas do pâncreas são responsáveis por células que secretam dois hormônios: insulina e glucagon.

3.2. Perturbadores endócrinos

O termo “Pertubador Endócrino” é utilizado nesse texto como sinônimo de

disruptores endócrinos, interferentes endócrinos e agentes hormonalmente ativos, que na literatura internacional corresponde aos “endocrine disrupting compounds or chemicals” (EDC). Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e disruptores endócrinos. Muitas definições têm sido propostas para tal classe de compostos, entretanto, para todas elas existe um ponto em comum: trata-se de uma substância química que pode interferir no funcionamento natural do sistema endócrino de espécies animais, incluindo os seres humanos. Alguns pesquisadores definem um interferente endócrino com base nos seus efeitos, ou seja, trata-se de uma substância química que, mesmo presente em concentração extremamente baixa, é capaz de interferir no funcionamento natural do sistema endócrino, podendo causar câncer, prejudicar os sistemas reprodutivos e causar outros efeitos adversos (Mozaz et al. 2007; Yang et al. 2006). Em maio de 1997, a agência de proteção ambiental dos Estados Unidos (Environmental Protection Agency - USEPA), definiu um interferente endócrino como “agente exógeno que interfere com

síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo, que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento dos organismos”.

O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS), em conjunto com o

Japão, os EUA, o Canadá, a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) e a União Européia, adotou a seguinte definição para os perturbadores endócrinos: “Um perturbador endócrino é uma substância ou um composto exógeno que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem, conseqüentemente, efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua descendência, ou (sub) populações” (CEC 1999). Os PE podem ser produtos naturais, como os fitoestrógenos produzidos por plantas, e por isso bastante comuns em alimentos de origem vegetal; ou produtos sintéticos, como no caso de solventes clorados, aditivos alimentares, constituintes de

produtos de limpeza, agrotóxicos, e cosméticos; pílulas anticoncepcionais e outros

fármacos. Desta forma, a exposição aos perturbadores endócrinos pode ocorrer a partir

de uma variedade de fontes, de forma voluntária ou não, inclusive por meio da dieta

diária e do consumo de água potável (Damstra et al. 2002; Solé et al. 2003; Veras

2006). A Figura 3.3 mostra exemplos de perturbadores endócrinos comumente

presentes no ambiente (Laganà et al. 2004).

comumente presentes no ambiente (Laganà et al . 2004). Figura 3.3 – Estruturas químicas de alguns

Figura 3.3 – Estruturas químicas de alguns perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais (Laganà et al. 2004).

Embora desde o início do século XX já existissem hipóteses prevendo alterações

no funcionamento do sistema endócrino de algumas espécies animais expostas a

determinadas substâncias químicas tóxicas, apenas recentemente esta importante

questão tem recebido a devida atenção por parte da comunidade científica. Isso pode ser

constatado pelo número crescente de publicações que relatam o aumento da incidência

de disfunções no sistema endócrino de seres humanos (incluindo a infertilidade

masculina), e mais significativamente, efeitos fisiológicos adversos observados em

espécies animais para as quais a relação causa/efeito é mais evidente (Damstra et al.

2002).

De fato, as evidências observadas em estudos envolvendo moluscos, crustáceos,

peixes, répteis, pássaros e alguns mamíferos têm sugerido que possíveis alterações de

saúde humana envolvendo o sistema reprodutivo, tais como o câncer de mama e de

testículo, podem estar relacionadas à exposição aos Perturbadores Endócrinos

(Lintelmann et al. 2003). Para esclarecer, desenvolver estratégias e solucionar o

problema dos perturbadores endócrinos, várias organizações governamentais e não

governamentais, como, União Européia (UE), US-EPA, Damstra et al. 2002, IPCS e a

Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), investigaram

o tema “perturbadores endócrinos”, conforme mostra a Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os Perturbadores Endócrinos (Bila e Dezotti 2007).

Ano

Organização

Objetivos do Estudo

1995

Agência Ambiental Federal Alemã

Discussão sobre evidência e impactos dos PE e riscos potenciais que podem causar em humanos e animais

1995

Agência Proteção Ambiental Americana (USEPA)

Seminários para avaliar os riscos à saúde e efeitos ambientais dos PE

1995

Ministério do Meio Ambiente e Energia da Dinamarca

Avaliação dos efeitos de substâncias estrogênicas no desenvolvimento e nas funções do sistema reprodutivo masculino

1996

USEPA

Seminário para desenvolvimento de estratégia para avaliar o risco dos PE no ambiente

1996

USEPA

Desenvolvimento de programa de testes e análises (screening) para avaliar a ação dos PE

1997

USEPA

Relatório sobre os PE presentes no meio ambiente

1998

USEPA

Revisão e discussão das informações científicas disponíveis sobre PE

1998

Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE)

Desenvolvimento de métodos de ensaio para os PE

1999

Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment (CSTEE)

Revisão da literatura existente e opinião científica nas evidências dos PE, em particular, avaliação dos riscos ecológicos e diretrizes de ensaios toxicológicos

1999

Comissão das Comunidades Européias

Identificação do problema dos PE, suas causas, conseqüências e definição das medidas adequadas para dar uma resposta ao problema

2001

Comissão das Comunidades Européias

Primeiro relatório sobre o progresso dos trabalhos da comunidade européia sobre os PE

2002

Comissão das Comunidades Européias

Programa COMPREHEND: Avaliação das evidências dos PE no ambiente aquático na Europa

2002

OCDE

Avaliação dos métodos de ensaios para as substâncias estrogênicas

2002

Organização Mundial da Saúde (OMS)

Avaliação global do estado da arte da ciência dos PE

2003

Instituto de Saúde Ecológica (IHE)

Relatório de avaliação do progresso internacional da pesquisa dos PE

2004

Comissão das Comunidades Européias

Segundo relatório sobre o progresso dos trabalhos sobre os PE.

3.2.1. Mecanismos de Ação dos Perturbadores Endócrinos

A ação de um determinado hormônio inicia-se através da sua ligação a um

receptor específico, no interior de uma célula. O complexo resultante liga-se a regiões

específicas do DNA presente no núcleo da célula, o que determina a ação dos genes. Certos compostos químicos podem também se ligar ao receptor hormonal e, conseqüentemente, mimetizar ou bloquear a ação do próprio hormônio (Ghiselli e Jardim 2007; Damstra et al. 2002; Soto et al. 1991). Esta mudança de atividade é transmitida por várias vias metabólicas, através da membrana plasmática, dependendo do tipo de hormônio. Os diferentes processos fisiológicos (em cascata e independentes) obtidos são controlados por mecanismos complexos, que são ativados ou desativados de acordo com os níveis dos hormônios encontrados no organismo. Embora muitas destas vias metabólicas possam ser influenciadas por estimulações externas ao organismo, a grande maioria das disfunções endócrinas observadas é atribuída ao funcionamento das gônadas, responsáveis pelas características sexuais secundárias e pelo desenvolvimento e funcionamento dos órgãos sexuais (Ghiselli e Jardim 2007; OMS 2002). Um receptor hormonal possui elevada sensibilidade e afinidade por um hormônio específico produzido no organismo. Por isso, concentrações extremamente baixas de um determinado hormônio geram um efeito, produzindo uma resposta natural (Figura 3.4a). Entretanto, estes receptores hormonais também podem se ligar a outros compostos químicos, e isso explica o porquê de determinados perturbadores endócrinos presentes no organismo, mesmo em baixíssimas concentrações, serem capazes de gerar um efeito, provocando conseqüentemente uma resposta (Damstra et al., 2002). A alteração no sistema endócrino ocorre quando o PE interage com os receptores hormonais modificando a sua resposta natural, e para isso dois processos distintos podem ser desencadeados. O PE pode se ligar ao receptor hormonal e produzir uma resposta, atuando então como um mimetizador, ou seja, imitando a ação de um determinado hormônio, processo este denominado de efeito agonista (Figura 3.4b). Se o PE se ligar ao receptor, mas nenhuma resposta for produzida, ele estará agindo como um bloqueador, ou seja, estará impedindo a interação entre um hormônio natural e o seu respectivo receptor. Este processo é denominado de efeito antagonista (Figura 3.4c) (Ghiselli 2006). Um exemplo de perturbação endócrina é o caso do estradiol. Muitos PE competem com o estradiol, pelos receptores de estrogênio. Outros competem com a dihidrotestosterona (hormônio sexual masculino produzido naturalmente pelo organismo), pelos receptores de androgênio. Portanto, estes compostos exercem efeitos de feminização ou masculinização sobre o sistema endócrino. Compostos que produzem

efeitos de feminização são conhecidos como estrogênicos, enquanto que os que

produzem efeitos de masculinização são conhecidos como androgênicos. Assim, se um

determinado composto é considerado anti-androgênico como a flutamida (fármaco

utilizado no tratamento de câncer de próstata) ele certamente inibirá a ação biológica

dos androgênios, ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de

androgênios presentes nos tecidos-alvo. Já um composto anti-estrogênico como o

tamoxifeno (fármaco utilizado no tratamento de câncer de mama) inibe a ação biológica

dos estrogênios ligando-se e, conseqüentemente, inativando os receptores de estrogênios

presentes nos tecidos-alvo (Joon Kang et al. 2002; Panter et al. 2000).

(Joon Kang et al . 2002; Panter et al . 2000). Figura 3.4 - Disfunções endócrinas:

Figura 3.4 - Disfunções endócrinas: (a) resposta natural; (b) efeito agonista; (c) efeito antagonista (Ghiselli, 2006).

3.2.2. Efeitos dos Perturbadores Endócrinos em animais silvestres e de laboratório

Vários estudos relacionam a poluição ambiental das águas naturais com

anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de diferentes espécies de

animais. A exposição aos perturbadores endócrinos pode ser responsável por alterações

fisiológicas e histológicas em animais silvestres e de laboratório, incluindo alterações

nos níveis de vitelogenina (VTG) no plasma sangüíneo, feminização de peixes machos,

indução ao hermafroditismo, inibição no desenvolvimento das gônadas e declínio na

reprodução. Essas e outras anomalias relatadas em várias espécies de animais são

apresentadas na Tabela 3.2.

Tabela 3.2: Efeitos e anomalias atribuídos aos perturbadores endócrinos em animais (Bila e Dezotti 2007)

Espécie

Contaminante

Efeitos

Referência

   

Feminização de Peixes

(Allen et al. 1999)

Efluente de

Declínio da Reprodução

(Robinson et al. 2003)

ETE

Indução da síntese de VTG

(Allen et al. 1999; Solé et al. 2000; Solé et al. 2003)

Peixe

 

Feminização de Peixes

(Körner et al. 2000)

Alteração nas gônadas

(Panter et al. 2000)

Hermafroditismo

(Hartley et al. 1998)

17β-Estradiol

Incidência de Testículo-Ovulos nas gônadas

(Joon Kang et al. 2002)

Declínio da Reprodução

(Shioda e Wakabayashi 2000)

 

Mortalidade elevada dos descendentes

(Knorr e Braunbeck 2002)

Indução da síntese de VTG

(Routledge et al. 1998)

17α-

Indução da síntese de VTG

(Folmar et al. 2000)

etinilestradiol

Mortalidade da espécie

(Schmid et al. 2002)

Declínio da Reprodução

(Robinson et al. 2003)

Estrona

Indução da síntese de VTG

(Routledge et al. 1998)

Octilfenol

Declínio da Reprodução Indução da síntese de VTG

(Jobling e Sumpter 1993; Routledge et al. 1998)

Nonilfenol

Mortalidade elevada dos descendentes Feminização de Peixes

 

Butilfenol

(Knorr e Braunbeck 2002)

Bisfenol A

Declínio da Reprodução

(Shioda e Wakabayashi 2000)

Mamífero

Bisfenol A

Anomalia no sistema reprodutivo de ratos

(Markey et al. 2002)

PCB

Alta mortalidade de golfinhos

(Aguilar e Borrell 1994)

 

DDE e DDT

Concentrações anormais de hormônios sexuais no plasma e anomalias morfológicas nas gônadas

(Guillette et al. 1996; Guillette et al. 1999; Milnes et al. 2002)

Réptil

17β-Estradiol

Indução da síntese de VTG no sangue e alterações na produção de ovos de tartaruga

(Irwin et al. 2001)

 

DDT

Feminização de Gaivotas machos

(Fry e Toone 1981)

Aves

Anomalia no sistema reprodutivo

(Bitman et al. 1968)

DDE

Nascimento prematuro de aves

(Damstra et al. 2002)

 

Efluente de

Indução à síntese de VTG no sangue e hermafroditismo

 

Anfíbio

ETE

(Bogi et al. 2003)

Vários estudos mostram que organismos aquáticos respondem com indução da

síntese de VTG à exposição a determinadas concentrações de estrogênios (Panter et al.

2000; Robinson et al. 2003). No estudo de Routledge et al. 1998, duas espécies de

12

peixes, Oncorhynchus mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a concentrações de E2 e estrona (E1) ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L -1 ). Os resultados mostraram que as espécies do sexo masculino são sensíveis para E2 e E1 nas concentrações utilizadas, pois ocorreu aumento na concentração de VTG no plasma sanguíneo durante o período de exposição. Entre as fêmeas da espécie Rutilus rutilus ocorreu diminuição do tamanho do ovo. De acordo com esses e outros pesquisadores, os resultados confirmaram que os estrogênios identificados em efluentes domésticos estão presentes em quantidades suficientes para induzir o surgimento de órgãos masculinos em peixes fêmeas, conhecido como “imposex”, ou imposição sexual (Ghiselli 2006). Este fenômeno é irreversível e provoca a esterilização das espécies, podendo causar declínio considerável nas populações de espécies mais sensíveis. Segundo o estudo de Fernandez et al (2002), os PE encontrados nas águas estudadas (organoestânicos) interferiram na síntese da testosterona (hormônio masculino), ocorrendo aumento na produção deste pelas fêmeas. Consequentemente, a alteração hormonal faz surgir estruturas sexuais masculinas não funcionais, mantendo-se, porém, a anatomia interna do organismo (Fernandez et al. 2002; Damstra et al. 2002). Foram observadas anomalias em embriões machos e fêmeas de trutas, como por exemplo, a feminização dos machos (Körner et al. 2000; Damstra et al. 2002). Várias espécies de peixes são usadas como modelo para detectar os efeitos de perturbadores endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo. O estudo de Legler et al (2002) mostrou que as substâncias com atividade estrogênica não só são importantes na fase aquosa, mas também podem acumular-se em sedimentos marinhos e expor os organismos em ambientes aquáticos a substâncias com atividade estrogênica.

3.2.3. Efeitos dos perturbadores endócrinos em humanos

Uma variedade de substâncias químicas é suspeita de causar efeitos adversos na saúde humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no sistema reprodutivo feminino e masculino. Os efeitos dos PE em humanos foram revisados em alguns estudos como o relatório “Global Assessment of the State-of-the- Science of Endocrine Disrupters” do estudo feito pela International Pannel on Chemical Safety (IPCS) encomendado pela Organização Mundial da Saúde (Damstra et al. 2002). Uma das conclusões do estudo foi a possível relação entre alguns PE e

alterações na saúde humana, como o câncer de testículo, mama e próstata. A conseqüência da exposição aos PE foi relacionada ao declínio das taxas de espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos e disfunção da tireóide. Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece estar relacionado à presença de estradióis nas águas (Damstra et al., 2002). De 1973 a 1994, analisaram a qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis, levando em conta o volume do fluido seminal, a concentração de esperma e a mobilidade e morfologia dos espermatozóides. Os autores observaram um declínio na concentração e mobilidade dos espermas nos homens por um período de 20 anos, e esse decréscimo da qualidade do sêmen coincide com o aumento na incidência de anomalias no sistema reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular (Auger et al. 1995). O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do balanço e das concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos). Portanto, uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais como, irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade e ovários policísticos. No entanto, devido à capacidade dos PE em modular ou alterar a intensidade dos hormônios, resta saber se essas substâncias podem realmente afetar as funções do sistema reprodutivo feminino. Alguns fatos demonstram que isso pode realmente ocorrer, como o uso de dietilestilbestrol (DES) em mulheres grávidas na década de 70. Uma das conseqüências foram anomalias do sistema reprodutivo feminino (câncer vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) de crianças nascidas a partir de mães que fizeram uso desse medicamento. Este fato é, sem dúvida, uma evidência dos efeitos à exposição aos perturbadores endócrinos (Damstra et al. 2002). Apesar de alguns pesquisadores não sugerirem uma correlação entre a exposição aos perturbadores endócrinos e efeitos danosos em humanos, revisões como a da OMS (Damstra et al. 2002) indicam que há claras evidências experimentais e epidemiológicas dessas substâncias na disfunção no sistema reprodutivo humano (Ghiselli 2006).

3.3. Análise e Monitoramento de Perturbadores Endócrinos em Águas Superficiais

Uma importante fonte de contaminação de águas superficiais com perturbadores endócrinos (PE) é o lançamento de esgotos domésticos tratados ou in natura. Vários estudos mostram que as águas receptoras de efluentes de estações de tratamento de

esgoto doméstico (ETEs) foram estrogênicas para peixes, e que a proporção da

intersexualidade nos peixes estava correlacionada com a quantidade dos efluentes

lançados nas águas dos rios estudados (Folmar et al. 2000; Solé et al. 2003; Van den

Belt et al. 2004). Além das emissões pontuais de efluentes doméstico e industrial,

emissões difusas, associadas à chuva e ao escoamento que dela resulta, chegam aos

corpos de água e podem contribuir para o aporte de PE. A poluição difusa pode ocorrer

devido às deposições atmosféricas (poluição industrial e veicular), à lixiviação de solo

contaminado (Ex. drenagem de lixões) e ao escoamento de águas pluviais em ambientes

rurais (Ex. pesticidas) e urbanos (Ex. óleos, lixo). A Tabela 3.3 mostra as classes de

alguns perturbadores endócrinos e a Figura 3.3 mostra a estrutura química de alguns

perturbadores endócrinos comumente encontrados em águas superficiais.

Tabela 3.3: Classificação de alguns perturbadores endócrinos (adaptado de Mol et al.

2000)

Tipo de composto

Uso

Pesticidas

Agricultura (ex: DDT)

Hormônios naturais e sintéticos

Contraceptivos, agentes de crescimento (ex:

estradiol e etinilestradiol)

Alquilfenóis

polietoxilados

(APEOs)

Detergentes, cosméticos, agroquímicos

Alquilfenóis

Produtos de degradação dos APEOs (ex:

nonilfenol, octilfenol), anti-oxidantes

PCBs / dioxinas

Fluidos para refrigeração / subprodutos da combustão

Ésteres ftalatos

Plastificantes

Fitoestrogênios

Ocorrência natural em plantas

Bisfenol A

Produção de polímeros, degradação de plásticos (policarbonatos)

3.3.1. Metodologias para análise de perturbadores endócrinos

Diferentes métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a determinação de

perturbadores endócrinos em amostras ambientais (Mol et al. 2000). A metodologia de

análise ideal deve ser rápida, exata, precisa, de fácil adaptação e consumir a menor

quantidade de insumos possíveis (Mozaz et al. 2007). As metodologias utilizadas para a

análise de perturbadores endócrinos são, em sua maioria, técnicas cromatográficas que

podem utilizar equipamentos de cromatografia líquida (Hu et al. 2005; Komori et al.

2004) ou de cromatografia gasosa (Wang et al. 2005; Yang et al. 2006). Em ambos os

casos, a quantificação dos perturbadores endócrinos nas concentrações ambientais é

normalmente feita com espectrômetros de massa, dada à sua elevada especificidade.

Outro método de análise baseado em técnicas enzimáticas ou bioensaios também têm

sido estudados, todavia, seu maior custo operacional e a pouca especificidade do

método tem favorecido o uso das técnicas cromatográficas na análise de perturbadores

endócrinos (Farré et al. 2007)

Basicamente, a determinação dos PE em amostras aquosas envolve três etapas:

amostragem, pré-concentração e análise. Para a determinação de perturbadores

endócrinos é necessário usar critérios analíticos rigorosos para que as várias etapas,

como amostragem, transporte, estocagem e análise, tenham o menor erro possível, tendo

em vista a baixa quantidade dos PE (µg.L -1 a ng.L -1 ) nas amostras ambientais (Liu et al.

2004b). A Figura 3.5 mostra um diagrama simplificado do protocolo de análise dos PE.

um diagrama simp lificado do protocolo de análise dos PE. Figura 3.5 - Diagrama esquemático para

Figura 3.5 - Diagrama esquemático para preparação e análise dos perturbadores endócrinos

Amostragem, filtração e ajuste de pH

A primeira etapa da análise é a amostragem, e a qualidade do processo de

amostragem e preparação das análises é um fator determinante para um resultado

correto (Mozaz et al. 2007). Como os PE em amostras de água podem sofrer degradação

biológica durante o transporte e estocagem, é comum adicionar alguns biocidas, como o

formaldeído ou metanol, bem como manter as amostras em baixa temperatura (4 ºC) até

o procedimento de extração e concentração. O tempo máximo recomendado entre a coleta e a extração é de 48 horas (Fountoulakis et al. 2005; Wang et al. 2005), sendo a coleta feita em frascos de cor escura uma vez que alguns estrogênios, como estradiol, podem ser foto-degradados (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). A quantidade de água coletada pode variar de acordo com as propriedades intrínsecas da água analisada, tipo de composto, método de extração e aparelho utilizado para quantificação. Aparelhos com grande sensibilidade, águas com nível alto de poluição e alguns métodos de extração como a microextração por fase sólida (SPME) geralmente necessitam de pouca quantidade de amostra (Yang et al 2006). Contudo, para a maioria dos casos é necessária uma quantidade maior de água, que normalmente varia de 250 a 1000 mL (Jeannot et al. 2002; Wang et al. 2005). Como exemplo, Lagana et al (2004) fizeram análise de perturbadores endócrinos em diferentes matrizes, e o volume de amostra variou de 110 mL para esgoto bruto a 1000 mL para água de rio. Após coletada a amostra, a primeira etapa de preparação consiste na sua filtração. A filtração tem a finalidade de retirar os sólidos presentes na água, evitando assim o comprometimento (entupimento e queda na taxa de filtração) da etapa posterior de concentração em cartuchos de extração em fase sólida. Embora a maioria das membranas utilizadas e citadas na literatura seja de acetato de celulose, recomenda-se a utilização de membranas de materiais mais inertes (teflon, fibra de vidro, nylon) para evitar a adsorção de perturbadores durante a etapa de filtração. As membranas mais utilizadas na filtração são de 0,45µm feitas de acetato de celulose. Etapas preliminares de filtração, como a utilização de filtros de 8µm, podem ser necessárias dependendo da quantidade de sólidos presentes na água. Isso é particularmente importante durante a amostragem de água de mananciais superficiais durante períodos chuvosos. Em seguida é feito o ajuste do pH da amostra, que tem como finalidade aumentar a afinidade dos perturbadores endócrinos, principalmente aqueles de caráter ácido como nonilfenol, bisfenol e estrona, pela fase estacionária do cartucho de extração, aumentando assim sua extração da fase aquosa (Raimundo 2007). De fato, Liu et al (2004b) fizeram um trabalho para avaliar a influência do pH inicial da amostra na eficiência de extração, e os resultados obtidos mostraram que a melhor recuperação obtida foi àquela feita em meio mais ácido. À medida que o pH era diminuído, o índice de recuperação aumentava, chegando a 100% para alguns compostos no pH igual a 3. O pH escolhido para as amostras pode variar de acordo com a capacidade máxima que o cartucho de extração suporta, mas a maioria dos trabalhos de fato utilizam o pH

variando entre 2 e 3, sendo 3 o valor de pH mais utilizado (Gibson et al. 2007; Wang et al. 2005). Os ácidos mais utilizados para a correção do pH são o clorídrico (HCl) ou o sulfúrico (H 2 SO 4 ).

Concentração e eluição dos compostos de interesse

Os PE são, em sua maioria, compostos orgânicos hidrofóbicos encontrados em baixas quantidades no ambiente, e como a maioria dos equipamentos não consegue detectá-los nas concentrações usualmente encontradas, uma etapa de concentração é usualmente necessária (Ghiselli e Jardim 2007). Atualmente existe um considerável interesse no desenvolvimento de novos métodos seletivos para extração e isolamento dos componentes de matrizes ambientais complexas (Kasprzyk-Hordern et al. 2007). A seletividade da fase estacionária é um importante parâmetro, uma vez que um dos principais objetivos seria remover os interferentes e facilitar as análises posteriores feitas nos equipamentos de LC-MS e CG-MS (Mozaz et al. 2007). A alternativa mais utilizada para contornar esses problemas tem sido a extração em fase sólida (Solid Phase Extration - SPE). A SPE é uma técnica de separação líquido-sólido que, do ponto de vista prático, pode ser descrita como uma cromatografia líquida, onde se usa uma pequena coluna aberta, denominada cartucho de extração, que contém a fase sólida (o correspondente à fase estacionária em cromatografia). No procedimento de extração a amostra contendo o analito de interesse é colocada no topo do cartucho e aspirada através dele pela aplicação de um pequeno vácuo. Ao passar a amostra pelo cartucho o analito fica retido (adsorvido) na fase sólida, de forma a ser posteriormente eluído com um pequeno volume de solvente, e essa etapa de eluição permite a determinação do grau de concentração necessário para a análise uma vez escolhido o volume inicial de amostragem e o volume final de solvente eluído. Se houver contaminantes que possam interferir na análise, uma lavagem e/ou clean-up precede a eluição, com a utilização de um solvente que tenha afinidade pelo contaminante e não pelos compostos de interesse. Em muitos casos, onde a amostra não precisa ser filtrada, a própria etapa de extração em fase sólida funciona como clean-up (Lanças 2004a). A Figura 3.6 exemplifica as etapas envolvidas na extração em fase sólida.

Figura 3.6 - Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse

Figura 3.6 - Etapas da extração por fase sólida para isolamento de compostos de interesse (Lanças 2004a)

Atualmente um grande número de cartuchos de SPE está disponível de modo

que possa ser utilizado por uma grande faixa de aplicações. Um adsorvente genérico é

capaz de adsorver uma grande variedade de PE, mas alguns compostos específicos

exigem cartuchos mais seletivos. O mecanismo mais utilizado é a interação hidrofóbica

e as fases sólidas mais reportadas nos trabalhos são as compostas de octadecil (C18) e

sílica. A Tabela 3.4 mostra os cartuchos mais utilizados na extração por fase sólida para

os perturbadores endócrinos nonilfenol e estradióis.

Tabela 3.4: Cartuchos de SPE mais utilizados e seus principais fabricantes

Cartuchos

Descrição

Fabricante

Oasis HLB

Poli(divinilbenzeno-co-N-vinilpirrolidona)

Waters

C18

Polimericamente ligado, octadecil (18% C)

Vários

C18/ENV +

C18 hidroxilado poliestireno-divinilbenzeno

IST

Liu et al (2004b) fizeram um estudo a respeito da eficiência de recuperação dos

PE em relação ao tipo de cartucho SPE. A conclusão obtida foi que o melhor cartucho

para adsorção de alquilfenóis e estrogênios é o conhecido como Oasis HLB 500mg. O

maior inconveniente na utilização deste tipo de cartucho é o preço, cerca de cinco vezes

superior aos cartuchos de eficiência de recuperação semelhante, como o DSC-18. Dessa

forma, fases estacionárias compostas de octadecil (C18) possuem melhor relação custo-

benefício.

Uma das grandes desvantagens obtidas na extração em fase sólida é a quantidade

de amostra a ser coletada para análise. Para uma concentração de 1000 vezes, por

exemplo, necessita-se, em média, de 1 litro da amostra, e o tempo de extração pode ser

bastante demorado, podendo chegar a até 3 horas (Wang et al. 2005). Kuch e

Ballschmiter (2001) e Snyder et al (1999) alcançaram baixos limites de detecção de

estradiol natural, etinilestradiol e nonilfenol devido ao grande volume de amostra utilizado, que chegou a 5 litros com uma pré concentração de 5000 vezes. Uma das soluções apresentadas seria a microextração por fase sólida (SPME), a qual possui as mesmas funcionalidades da SPE e reduz consideravelmente a quantidade de amostra e tempo de extração para análise. Yang et al (2006) compararam as metodologias SPME e SPE e os resultados obtidos mostraram que a SPME é bastante promissora para a análise de estrogênios, anabolizantes e alquilfenóis, sendo possível utilizar apenas 3mL de amostra para obter fatores de concentração de 100 vezes. Recentemente, Wang et al (2008) criaram um método alternativo de extração utilizando filtros de cigarro como cartuchos de SPE. Uma vez que os filtros de cigarro são utilizados para a retenção de parte dos poluentes orgânicos gerados pela fumaça, avaliou-se a capacidade destes em reter alguns PE como o estradiol. Uma das grandes vantagens seriam o baixo custo e a facilidade de aplicação. Os resultados obtidos chegaram a 100% de recuperação do estradiol para amostras do rio monitorado.

A eluição do cartucho, ou seja, a dessorção dos compostos de interesse vai

depender do tipo de composto a ser analisado. Trabalhos publicados utilizam geralmente metanol, acetato de etila e acetona, puros ou misturados, como agentes de eluição (Alda e Barceló 2001; Gibson et al. 2007; Laganà et al. 2004; Wang et al. 2005). É importante destacar que a eluição é normalmente feita com um volume maior

de solvente (5 a 15 ml) para assegurar a completa dessorção dos analitos de interesse. Desta forma, para se obter um elevado grau de concentração é preciso secar o extrato orgânico e re-solubilizar o analito em volume adequado de solvente. Além de obter o grau de concentração adequado, a secagem permite ainda adequar o solvente ao método de análise tendo em vista que o solvente utilizado na eluição pode ser incompatível com o equipamento cromatográfico. Um exemplo é o diclorometano, que não é recomendado para análises em cromatografia líquida devido a sua alta volatilidade, mas que foi utilizado (junto com o metanol em solução 1:1) por Laganà et al (2004) para a eluição de fitoestrogênios, micoestrogênios, estrogênios e alquilfenóis.

A secagem dos extratos orgânicos é normalmente feita em banho-maria à

temperatura pouco maior que a ambiente. Além disso, é comum utilizar fluxo de nitrogênio sobre os extratos orgânicos para acelerar o processo de secagem. Conforme dito anteriormente, a reconstituição do extrato seco é feita com o solvente mais apropriado para análise cromatográfica. Para a cromatografia líquida geralmente utiliza-

se acetonitrila e metanol como solventes de reconstituição, ao passo que para cromatografia gasosa é comum o uso de solventes mais voláteis como acetona e acetato de etila (Jeannot et al. 2002). Outros métodos analíticos, como a utilização de kits enzimáticos, exigem a reconstituição em soluções tampão de fosfato (Farré et al. 2007).

Análise Instrumental

Do ponto de vista analítico, os métodos mais adequados para monitoramento dos PE em amostras ambientais incluem, genericamente, métodos biológicos e métodos de separação (Farré et al. 2007). Dentre os métodos biológicos destacam-se, principalmente, os imunoensaios, cujos princípios são a produção de anticorpos e/ou receptores que se ligam especificamente a substâncias que apresentam atividade estrogênica. A Figura 3.7 exemplifica os dois passos genericamente associados aos imunoensaios. Inicialmente ocorre a imobilização do receptor específico a um suporte, seguido de adição da amostra contendo estrogênios e anticorpos, ocorrendo então um período de incubação, que varia de 1 a 4 horas. Em seguida, por adição de uma solução adequada ao tipo de detecção pretendida, procede-se à quantificação por medidas de fluorescência ou isotópicas (Ex. ELRA: "Enzyme Linked Receptor Assay"; ELISA:

"Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"; RIA: "Radio Immuno Assay") (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003). Com o intuito de análise vestigial em amostras ambientais, têm-se desenvolvido inúmeros anticorpos e receptores específicos para os mais diversos tipos de poluentes químicos, permitindo a tais métodos elevada rapidez de screening (Nogueira 2003). As vantagens dos métodos biológicos são: rapidez, seletividade, especificidade e sensibilidade. Por apresentarem limites de detecção na ordem de ng/L não necessitam, em alguns casos, de pré-concentração da amostra. Algumas desvantagens incluem a necessidade de se fazer análises individualizadas dos PEs e problemas causados por alguns interferentes da matriz, podendo levar a resultados superestimados. Farré et al (2007) observaram que seria necessário um clean-up da amostra para que não ocorresse este efeito e concluíram também que, para análise de estrogênios como o estradiol, poderia haver interferência de outros contaminantes como estrona e nonilfenol. Para contornar esta limitação recorre-se, usualmente, a métodos cromatográficos de separação, que têm se mostrado bastante eficazes e versáteis no monitoramento de um grande grupo de PE.

Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericame nte associados aos imunoensaios: A) Imobilização do

Figura 3.7 - Exemplo dos dois passos genericamente associados aos imunoensaios: A) Imobilização do receptor específico ao suporte, seguido de incubação após a adição da amostra contendo estrogênios e de anticorpos; B) Adição da solução adequada ao tipo de detecção pretendida (Mozaz et al. 2007; Nogueira 2003).

Os métodos cromatográficos implicam em interações fisico-químicas entre os compostos presentes na amostra e a coluna cromatográfica, e sua aplicação permite a análise qualitativa ou quantitativa de vários microcontaminantes de interesse ambiental. A cromatografia permite separar constituintes de uma mistura através de sua distribuição em duas fases: uma estacionária (fixa na coluna cromatográfica) e outra móvel. A cromatografia acoplada à espectrometria de massas, seja líquida ou gasosa, apresenta-se como a técnica analítica mais robusta, abrangente, reprodutível e sensível, para o monitoramento de amostras ambientais. A instrumentação disponível combina baixos limites de detecção e reprodutibilidade analítica através do monitoramento de íons pré-selecionados. A cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CGMS) tem sido uma técnica comumente empregada, apesar de a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LCMS) ter ganhado popularidade. O pré-requisito necessário para análise em cromatografia gasosa é que o analito de interesse seja volatilizável e termicamente estável, muito embora a derivatização possa ser usada em alguns casos para superar esta limitação. Tradicionalmente, a cromatografia gasosa necessita do emprego de derivatização para determinar compostos estrogênicos, e os compostos mais utilizados com tal finalidade são o MSTFA (n-metil-n-trifluoroacetamida), BSTFA (n- bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida) e MTBSTFA (n-metil-n-(tert- butildimetilsilil)trifluoroacetamida). A diferença entre eles se baseia no tipo de reação que ocorre com o grupo hidroxila dos compostos. Quintana et al (2004) fizeram um

estudo comparando os três compostos e mostrando que o MTBSTFA é mais seletivo e o MSTFA o mais reativo. Apesar da derivatização ser mais comum quando se usa cromatografia gasosa, Matsumoto et al (2002) utilizaram o anidrido de pentafluorpropionil (CDPP) em cromatografia líquida, reduzindo assim os limites de detecção para os estradióis analisados. As desvantagens do procedimento de derivatização estão relacionadas ao maior trabalho laboratorial para preparo das amostras, ao maior tempo de análise, e à possibilidade de perdas de analito, uma vez que a baixa eficiência da hidrólise dos conjugados a estrogênios livres, via derivatização, pode compor erros nos estágios de recuperação, extração e quantificação. Tais desvantagens têm dado mais popularidade à cromatografia líquida para a determinação de estrogênios (Reis Filho et al. 2006) e outros contaminantes ambientais pouco voláteis.

A cromatografia líquida tem várias vantagens para análise de compostos

orgânicos em água, e uma delas refere-se ao fato de os compostos voláteis serem apenas uma pequena fração de poluentes usualmente presentes em água e esgotos. De fato, a

maior parte dos perturbadores endócrinos não é volátil, tornando a cromatografia líquida a técnica mais adequada para sua análise. Isto é especialmente verdade para esgotos, os quais contêm muito material húmico e compostos orgânicos polares, tais como os carboidratos. Vários detectores podem ser acoplados à cromatografia líquida, tais como ultravioleta-visível, arranjo de diodos, fluorescência e espectrômetro de massas (Alda e Barceló 2001; Mao et al. 2004; Matsumoto et al. 2002; Raimundo 2007; Solé et al. 2000; Wang et al. 2008).

Os detectores de arranjo de diodos e fluorescência são menos utilizados como

alternativas devido a sua especificidade, mas são poderosas ferramentas adicionais para análise ou confirmação de alguns grupos específicos de PE (Mozaz et al. 2007). Conforme mencionado anteriormente, a detecção de perturbadores endócrinos por espectrometria de massas (MS) tem sido a técnica preferida pela comunidade científica

devido à sua elevada sensibilidade, reprodutibilidade, abrangência e robustez. A instrumentação atualmente disponível combina a diminuição dos limites de detecção e excelente reprodutibilidade analítica e elevada seletividade seja no modo de varredura (modo Full-SCAN), seja através do monitoramento de íons selecionado (modo SIM) (Hu et al. 2005; Liu et al. 2004b). Segundo Nogueira (2003), a tendência para um eficiente monitoramento dos PE em amostras ambientais parece ser a combinação entre métodos biológicos, através de

ensaios de imunoextração que consistem no isolamento seletivo de classes restritas de PE de amostras ambientais com a utilização de "immunosorbents", que seria uma SPE contendo anticorpos muito específicos na constituição da fase estacionária. Os compostos de interesses que ficariam retidos na fase estacionária seriam analisados por cromatografia. Atualmente pouco se desenvolveu neste tipo de técnica, mas a expectativa para a criação ainda existe, pois o desenvolvimento de uma metodologia de alta especifidade onde baseia-se em reações enzimáticas é possível. A principal vantagem deste método estaria na minimização de interferentes durante a análise cromatográfica.

3.3.2. Monitoramento de perturbadores endócrinos em águas superficiais

A Tabela 3.5 resume resultados disponíveis na literatura do monitoramento de três perturbadores endócrinos encontrados em águas superficiais: um estrogênio natural (17β-estradiol ou E2), um estrogênio artificial (17α-etinilestradiol ou EE2) e um produto da degradação dos surfactantes alquilfenóis etoxilados (nonilfenol ou NP), que foram escolhidos pelo potencial de risco aos seres vivos e pela freqüência com que foram reportados em trabalhos nacionais e internacionais. O 17β-estradiol (conhecido também como estradiol ou pela sigla E2) é um hormônio natural que nas mulheres é responsável pela síntese de estrogênio circulante. Esses estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e, assim, descartados no esgoto doméstico (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). O 17α- etinilestradiol ou etinilestradiol é um dos estrogênios sintéticos mais usados como contraceptivos orais (Bila e Dezotti 2007; Ghiselli 2006). Os alquilfenóis, por sua vez, apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes industriais e domésticos, lubrificantes, emulsificantes, formulações de pesticidas, de tintas, bem como produtos de higiene pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos para cabelo e banho). Nas ETEs e mananciais, os alquilfenóis polietoxilatos (APEOs) são inicialmente biodegradados, derivando em metabólitos persistentes e altamente lipofílicos que incluem os alquilfenóis etoxilatos e, finalmente, os alquilfenóis, tais como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP). Os trabalhos apresentados na Tabela 3.5 mostram que a técnica de preparo de amostra usada predominantemente na análise dos estradióis e do nonilfenol utiliza a extração em fase sólida, sendo o cartucho Oasis HLB e o octadecilsilano (C18) os mais

comuns para tal finalidade. Os resultados compilados mostram ainda que as técnicas de cromatografia (tanto gasosa como líquida) acopladas à espectrometria de massas são as mais utilizadas, sendo usada ainda, em menor freqüência, cromatografia acoplada a detector de arranjo de diodos ou a detector de fluorescência. Quando a cromatografia

gasosa é utilizada percebe-se que a derivatização por reações de silanização é preferida

e que os reagentes mais utilizados para tanto são o MTBSTFA, o MSTFA e o BSTFA.

As técnicas preferidas pelos pesquisadores resultam em limites de detecção na ordem de 0,15 a 2,0 ng.L -1 para os PE investigados. Valores baixos de limite de detecção dependerão do tipo de equipamento utilizado e volume de amostragem, e todas as técnicas de análise listadas na Tabela 3.5 resultam em limites de detecção semelhantes. A Tabela 3.5 mostra que para amostras de rios e mananciais o estradiol (E2) e o nonilfenol (NP) são os compostos frequentemente presentes, sendo o etinilestradiol (EE2) sempre presente em menor quantidade. Em esgotos domésticos in natura, os compostos E2 e EE2 foram encontrados com mais freqüência que o NP. Um dos

possíveis fatores é a maior degradação/adsorção dos alquilfenóis ao longo da rede de coleta. A Tabela 2.5 mostra ainda que apenas o trabalho de Beck et al (2005) investigou

a presença de PE em água marinha. As amostras foram coletadas em um estuário

próximas da ETE municipal de uma cidade alemã com 90.000 habitantes. Os valores médios encontrados para EE2 e NP foram de 17,9 e 6,3 ng.L -1 , respectivamente. De acordo com a Tabela 3.5, também pode ser observado que as maiores concentrações de PE foram reportadas em trabalhos feitos no continente americano e asiático, onde se verificou valores médios acima de 100 ng.L -1 para NP e E2. Apesar da grande quantidade de trabalhos europeus relacionados, não foram encontradas grandes quantidades de estrogênios em águas superficiais, e os valores máximos de estradiol e de etinilestradiol reportados foram de 13,9 ng.L -1 e 17,9 ng.L -1 , respectivamente. Dos trabalhos feitos na Europa salta aos olhos o monitoramento feito por Azevedo et al (2001) em Portugal, onde se verificou a presença de nonilfenol em concentrações de até

10 mg.L -1 . Como grande parte dos trabalhos feitos com águas superficiais de cidades européias não detectou nenhum dos três PE destacados (NP, E2 e EE2) é provável que estes se encontravam abaixo do limite de detecção analítico (Jeannot et al, 2004; Matsumoto et al, 2002). Tais resultados indicam que os PE podem estar presentes no ambiente em valores na ordem de pg/L, tornando-se necessário pesquisar novos métodos para análise e extração bem como técnicas que permitam avaliar a estrogenicidade de tais compostos em baixas concentrações.

Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais.

   

Fonte de

Tipo de

Tipo de

Reagente de

Concentração detectada (ng.L -1 )

Referência

Localização

Origem

extração

detecção

Derivatização

Nonilfenol (NP)

Estradiol (E2)

Etinilestradiol (EE2)

 

Portugal

Rio

           

(Azevedo et al. 2001)

Vários locais

Oasis HLB

CG-MS

- (0,01 a 10)x10 6

NA 1

NA

 

Mar Báltico

Água

SPE

         

(Beck et al. 2005)

(Parte Alemã)

Marinha

(Oasis HLB)

LC-MS/MS

- 3,1 a 6,3

<

4,0

2,1 a 17,9

 

França

Efluente

           

(Bruchet et al. 2004)

Doméstico

SPE C18

CG-MS

PFPA

<0,1x10 3

10,0

2,5

 

Espanha

 

SPE C18 e

LC-MS/MS

       

(Farré et al. 2007)

Rio

NH2

Kit ELISA

-

NA

0,5 a 1,1

<1,0

 

Campinas

 

SPE

         

(Ghiselli 2006)

(Brasil)

Rio

(Oasis HLB)

CG-MS

MTBSTFA

(1,1 a 1,8)x10 3

(1,8 a 6,0)x10 3

(1,3 a 3,5)x10 3

(Gibson et al.) 2008

Cidade do

             

México

Nascente

SPE C18 ou (Oasis HLB)

CG-MS/MS

BSTFA +

1,8 a 8

0,01 a 0,02

0,04 a 0,08

 

(México)

Piridina

 

Pequim

             

(Hu et al. 2005)

(China)

Rio

SPE C18

LC-MS/MS

NA

< 0,1

< 0,1

(Jeannot et al. 2002)

França e

Efluente

SPE C18 ou (Oasis HLB)

CG-MS/MS

       

Canadá

doméstico

LC-MS/MS

BSTFA (para CG- MS)

< 2,0

< 2,0

< 5,0

 

Estados

Efluente

Líquido -

 

TMS (para

     

(Kolpin et al. 2002)

Unidos

Doméstico

Líquido

CG-MS

hormônios)

(0,8 a 40)x10³

9,0 a 93,0

73 a 831

 

ETE’s

Efluente

SPE

         

(Komori et al. 2004)

(Japão)

doméstico

(Oasis HLB)

LC-MS/MS

-

NA

27 a 220

N.D 2

     

SPE

 

Cloreto de pentafluorbenzoila (para alquilfenóis)

     

(Kuch e Ballschmiter

Alemanha

(LiChrolut

2001)

Rio

EN)

CG-MS

6,7 a 134

0,15 a 3,6

0,10 a 5,1

 

Roma

 

SPE

         

(Laganà et al. 2004)

(Itália)

Rio

(Oasis HLB)

LC-MS/MS

-

(1,3 a 1,5)x10 3

2,0 a 6,0

N.D

1 NA – não analisado, 2 ND – não detectado

26

Tabela 3.5: Compilação de trabalhos publicados sobre o monitoramento de nonilfenol, estradiol e etinilestradiol em águas superficiais (continuação

)

   

Fonte de

Tipo de

Tipo de

Reagente de

 

Concentração detectada (ng.L -1 )

 

Referência

Localização

Origem

extração

detecção

Derivatização

Nonilfenol (NP)

Estradiol (E2)

Etinilestradiol (EE2)

 

East Sussex

Sedimento

Microondas e