Examen denzymologie

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Exercice 1
Les estrases catalysent l'hydrolyse d'ester RCOOR' selon la raction :
-

RCOOR' + H 2O

RCO O + R'OH + H

On considre une estrase dont, dans un milieu de pH 7,4. Le KM est de l'ordre de 2 mM.
1) Donnez la dfinition de KM
On se propose de mesurer lactivit maximum (amax) dune prparation de cette enzyme.
2) Quel volume d'une solution de RCOOR' 100 mM introduirez-vous dans la cuve de mesure, sachant que son volume utile est
de 3 mL ?
Pour effectuer cette mesure, on peut utiliser deux enzymes auxiliaires. La premire sera une kinase (K) transformant le
carboxylate RCOO- en acylphosphate RCOOP et la deuxime une dshydrognase (DH) NADH dpendante rduisant
l'acylphosphate en aldhyde RCHO :

p
RCOOR'

RCOO-

RCOOP

H2O R'OH

ATP ADP

estrase

RCHO

NADH NAD +
DH

3) A quoi servent les enzymes auxiliaires dans cette exprience ?

On dispose d'une prparation de l'estrase contenant environ 0,5 U/ml (activit spcifique de rfrence).
4) Quel volume de cette prparation proposez-vous d'introduire la cuve pour pouvoir avoir une mesure dactivit convenable ?
5) Quelles sont les activits kinase et dshydrognase que vous proposez de mettre dans la cuve ?
6) Aprs avoir mesur lactivit dans ces conditions, la DO/min obtenue est de 0,08. Quelle sera lactivit spcifique relle de
lenzyme tudie (lestrase) ?
7) Quelle srie dexpriences devez-vous raliser pour confirmer que vos rsultats sont convenables ?
8) Quelles graphes devez tracer pour dterminer (ou confirmer) lactivit spcifique relle de cette enzyme ?
On tudie linhibition de cette enzyme par un inhibiteur rversible (InhI).
9) Quelle sont les diffrences entre une inhibition rversible et une inhibition irrversible ?
Linhibiteur InhI ici est de type non comptitif,
10) Indiquez succinctement quelles seront les expriences raliser pour dterminer la constante dinhibition ?
11) Quelles sera lallure des courbes obtenues lanalyse des rsultats ?
On observe que lenzyme perd rapidement son activit. On pense une dnaturation rapide.
12) Quelle type dexprience sera ncessaire pour dterminer lnergie dactivation de la dnaturation de lenzyme ?
13) Quelles seront les graphes tracer et que vous permettront de trouver cette nergie ?

Exercice 2
On sintresse ici une aldhyde dshydrognase fixant le NAD+ et le NADP+ avec des affinits diffrentes puis laldhyde
avec la mme affinit pour les deux complexes ENAD+ et ENADP+. Cependant, seul le complexe ENAD+ a une
activit apprciable. De plus K1 est trs infrieur K1. Le modle cintique est alors le suivant :

NAD+

Ald
ENAD+

E
K1
NADP

K2

K'1
ENADP+

ENAD+Ald

K2

E + NADH + Carb
k

+
ENADPAld

Ald
K1 <<K1
(Ald reprsente laldhyde oxyd et Carb, le carboxylate form)
14) Pour quel substrat (NAD+ ou NADP+) cette enzyme a le plus daffinit ?
15) Est ce le NADP+ ou le NAD+ le bon substrat ? Justifiez votre rponse.
16) Posez le systme dquations permettant dtablir la loi de vitesse correspondant au modle propos.
(NE PAS ETABLIR la loi de vitesse)
Lactivit de cette enzyme sexprime en fonction des concentrations de NAD+, NADP+ et Ald selon la loi suivante :

a=

k[E]T [NAD + ][Ald]

[NADP + ]
K 1 [Ald][NADP + ]
+ K 2 [NAD + ] + K1 K 2 (1 +
) + [Ald][NAD + ]
K'1
K'1

On effectue une tude en absence de NADP+.

17) Donnez les expressions des constantes (vrais) caractristiques kcat et KM,Ald.
On tudie maintenant lactivit de lenzyme en prsence de NADP+.
18) Quel est le rle du NADP+ dans ce modle ?
19) Donnez lexpression de la constante apparente kcat(NADP+)
20) Donnez lexpression de la constante apparente KM,NAD+(NADP+)
21) Quelle information vous donne la comparaison de constantes vraies vs les apparentes ?
22) Est-il possible dtudier linfluence du NADP+ sur le KM ald(NADP+) saturation de NAD+ ?
Expliquez votre rponse.