USP - Universidade de So Paulo

Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto

Departamento de Fsica e Qumica

Prof. Dr. Eliane Candiani Arantes
Braga

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Noturno
Nomes:

Ribeiro Preto
2011

1. Objetivo
Verificar o comportamento eletrofortico de protenas com diferentes PIs, em
eletroforese para protenas bsicas.

2. Introduo

2.1 Eletroforese em gel

uma tcnica de separao de molculas onde as partculas que so carregadas
negativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de sdio),
com exceo do DNA que j possui um carter de ction, migram em um determinado gel
durante a aplicao de uma diferena de potencial em direo a um eletrodo positivo, sendo
que este criado por uma corrente eltrica, e posteriormente so aplicadas sobre o gel.
Para a separao das molculas nesta tcnica, temos que levar em considerao o
tamanho da molcula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as
de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos o formato da
molcula tambm influencia, pois dependendo do formato as mesmas tero mais facilidade
de migrar pelo gel. importante ressaltar que a eletroforese utilizada normalmente para a
separao de protenas e molculas de DNA e RNA.
2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida
A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e bisacrilamida. Para
preparar este gel, basta adicionar os dois polmeros nas concentraes desejadas em um
suporte de vidro e na presena de um catalisador.
Esta tcnica utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar
fragmentos muito pequenos de DNA e protenas que apresentam uma mnima diferena de
massa, alm disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra.
Apesar das vantagens, o gel de agarose mais utilizado pois a poliacrilamida
muito txica e difcil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida feita em cubas verticais,
e o carante utilizado o mesmo da eletroforese em gel de agarose.
O tamanho do poro do gel pode ser controlado pela concentrao total de
acrilamida (T), e pelo grau de bis-acrilamida (C).
a=massa de acrilamida, b=massa de bis-acrilamida e V=volume

a b 100
V

e C

b 100
a b

Existem dois tipos de gel de poliacrilamida:

Desnaturante: separa e purifica fitas simples de DNA, e convenciona desnaturante

pois polimerizado pela uria.

No desnaturante: separa e purifica fitas duplas de DNA.

2.3 Aplicaes de tcnicas Eletroforticas

Anlise da pureza de protenas

Determinao do peso molecular

Verificao da concentrao de protenas

Deteco de protelise

Identificao de protenas imunoprecipitadas

Primeiro estgio de imunoblotting

Separao e concentrao de antgenos de protenas para produo de anticorpos

Separao de protenas radioativamente marcadas

2.4 Fatores que afetam a eletroforese:

Campo Eltrico: Voltagem, resistncia e corrente;
Amostra: Carga, tamanho e forma;
O tampo: Composio, concentrao e Ph;
O meio de suporte: Absoro, eletroendosmose e peneira molecular.

2.5 Classificao das eletroforeses :

2.5.1 Eletroforese em soluo livre:

Eletroforese de fronteira mvel

Eletroforese de fluxo livre

Eletroforese capilar

Cromatografia eletrocintica capilar (misto)

2.5.2 Eletroforese em meio de suporte:

Eletroforese em papel

Eletroforese em camada delgada (slica ou alumina)

Eletroforese em membrana de acetato de celulose

Eletroforese em gel: agarose, poliacrilamida ou amido

3 Materiais e mtodos
3.1 Gel a 9 % em acrilamida, para eletroforese sem SDS:

O espao retangular formado entre duas placas de vidro, distanciadas entre si por
espaadores de 0,7 mm, preenchido com a soluo que dar origem ao gel.

Terminada a polimerizao, retira-se a borracha da parte inferior da placa e monta-se

o sistema na cuba de eletroforese.

Realizar uma pr-corrida de 30 minutos, a 100V, antes da aplicao das amostras.

Solues utilizadas para a montagem do gel de poliacrilamida:

3.2 Amostras:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Nenhuma amostra
Tripsina
Soroalbumina
Soro de cavalo
Veneno de T.serrulatus
Frao XIII
Veneno de C. durissus terrificus
Crotoxina
Crotamina
Fucsina

3.3 Procedimento para montagem da placa

-

Limpar com etanol 70% ou acetona as placas de vidro, espaadores e pentes

Preparar as solues, de resoluo e de concentrao, sem adicionar o TEMED, de

acordo com as quantidades indicadas. Adicionar soluo do gel de resoluo o
agente polimerizante TEMED. Agitar vigorosamente e colocar imediatamente a
soluo, com o auxlio de uma micropipeta, entre as placas de vidro, com o cuidado
de evitar a formao de bolhas de ar. A soluo colocada at marca traada
previamente.

Adicionar TEMED soluo do gel concentrador e colocar o pente logo em seguida,

antes do gel comear a polimerizar. Encaixe o pente com o tamanho de poo
desejado entre as placas. Deixar em repouso at o gel concentrador polimerizar
(aproximadamente 30 minutos). Aps o gel ter polimerizado retirar o pente
posicionando de forma que no danifique os poos do gel concentrador. Com o
auxlio de uma micropipeta, lavar os poos com tampo de eletroforese e tentar
arrumar os poos que tenham ficado deformados durante a remoo do pente.

Coloque as amostras e os padres moleculares nos poos do gel de concentrao, a

soluo tampo e encaixe a tampa. Remover com o auxlio de uma seringa as
bolhas de ar que se formaram entre as placas de vidro, no limite inferior do gel. (Por
conveno, o preto o plo negativo e o vermelho o plo positivo - as protenas
vo migrar para o plo positivo).

4 Discusso e Resultados
Na eletroforese em gel de poliacrilamida as protenas migram atravs dos poros do
gel. O tamanho desses poros diminuem para concentraes crescentes de acrilamida.
A migrao atravs do gel se d por causa do tamanho dos poros do gel e do peso
molecular das protenas. Considerando um determinado tamanho de poro, tem-se que
quanto menor for o peso molecular da protena mais facilmente ela migrar em relao s
protenas de alto peso molecular.
A direo da eletroforese de cima para baixo. As protenas pequenas movem-se
rapidamente no gel, enquanto as grandes ficam em cima, perto do ponto de aplicao da
mistura.
Atravs da visualizao dos resultados possvel analisar tambm se as protenas
tem carter bsico ou cido em relao as outras. Como no processo realizado em aula
tinha a pretenso de detectar protenas bsicas, as que se possussem um menor
deslocamento ao longo do gel tinha essas caractersticas.

Pode visualizar as protenas no gel corando-as com um corante (Coomassie Blue).

10

4.1 Provveis causas de erros:

Formao de bolhas no gel e nas solues;

Preparo de solues;

Montagem da placa;

Manuseio do gel;

Tempo de corrida;

Preparo do Tampo e deixa-lo extravasar na placa.

5 Concluso

A eletroforese em gel de poliacrilamida usada em menor escala. A tcnica

simples, rpida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que no podem ser
separados por outros mtodos, tais como centrifugao com densidade de gradiente ou por
velocidade de sedimentao. A localizao do DNA no gel pode ser determinada
diretamente. As bandas do gel so coloridas por corante, que colore por intercalar-se na
dupla fita de DNA.
A partir dos resultados obtidos, pudemos observar que as protenas comportam-se
aleatoriamente nos diferentes PIs , devido s distintas concentraes das substncias em
questo.
Presena de bolhas, no preparao adequada do gel bem como os erros relacionados
anteriormente, pode causar flutuao nos resultados levando a um experimento inadequado.

Referencias Bibliogrficas:

SILVA JNIOR, J. G. Eletroforese de protenas: guia terico e prtico. Rio de Janeiro:

Intercincia, 2001.
STRYER, Lubert. Bioquimica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988.
www.w3.ufsm.br/piquini/biomol09/eletroforese.doc