Programa de Estudios de Posgrado

Estudio sobre el órgano genital del camarón blanco del
Pacífico Litopenaeus vannamei (Boone), con énfasis en la
glándula androgénica

TESIS
Que para obtener el grado de

Doctor en Ciencias
Uso, Manejo y Preservación de los Recursos Naturales
( Orientación Acuicultura )

Presenta

RODOLFO GARZA TORRES

La Paz, Baja California Sur, Noviembre de 2011

CONFORMACIÓN DE COMITÉS

Co-directores:

COMITÉ TUTORIAL

Dr. Rafael Campos Ramos (CIBNOR, S.C.).

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martínez (CIBNOR, S.C.).
Tutores:

Dra. Norma Yolanda Hernández Saavedra (CIBNOR, S.C.).
Dr. Gopal Murugan (CIBNOR, S.C.).

Dr. Gabino Adrián Rodríguez Almaraz (UANL).

Dr. Rafael Campos Ramos.

COMITÉ REVISOR DE TESIS

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martínez.

Dra. Norma Yolanda Hernández Saavedra.
Dr. Gopal Murugan.

Dr. Gabino Adrián Rodríguez Almaraz.

Dr. Rafael Campos Ramos.

JURADO DE EXAMEN DE GRADO

Dr. Alejandro Manuel Maeda Martínez.

Dra. Norma Yolanda Hernández Saavedra.
Dr. Gopal Murugan.

Dr. Gabino Adrián Rodríguez Almaraz.

Dra. Danitzia Adriana Guerrero Tortolero (Suplente).
Dr. Claudio Humberto Mejía Ruíz (Suplente).

PREFACIO

El presente trabajo de tesis doctoral comprende los siguientes artículos
publicados:

I.

Garza-Torres, R., R. Campos-Ramos, y

A. M. Maeda-Martıínez. (2009).

Organogenesis and subsequent development of the genital organs in female
and male Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture

296: 136-142.
II.

Garza-Torres, R., A. M. Maeda-Martıínez, D. A. Guerrero-Tortolero, H. ObregónBarboza y R. Campos-Ramos. (2011). Description of meiosis in female and male

Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Decapoda: Penaeidae). Journal of

Crustacean Biology 31 (1): 75:81.

.

se realizaron 4 investigaciones concernientes al estudio de la GA en machos de camarón blanco. anfípodos y decápodos). conectados a un tubo colector que se extiende dorsalmente hacia la región posterior en forma de U invertida. además de un análisis molecular de su expresión. Se describe organogénesis y el desarrollo subsecuente del órgano genital a partir de postlarvas (PL) de L. Este se observa como un lóbulo bilateral en la parte anterior al hepatopáncreas. el crecimiento de las especies es la característica más importante para la rentabilidad de la industria. el control endocrino proveniente de la glándula sinusal que se encuentra en el tallo ocular y el efecto que tiene al ser ablacionado. función y control de esta glándula son prácticamente nulos en especies comerciales de peneidos. y es cuando se forma la GA en los vasos deferentes rodeado de un tejido conectivo el cual lo conecta al 8º lóbulo testicular. incluyendo el desarrollo de esta durante la organogénesis del aparato genital. de este tubo se proyectan bilateralmente 8 lóbulos. su función en el mantenimiento de la espermatogénesis en relación con el ciclo de muda. Con este conocimiento se tendrían las bases para emprender ensayos de reversión sexual en el camarón blanco y finalmente integrar una biotecnología como cultivo monosexual de hembras a la industria. y un lóbulo posterior en hembras. en donde fue posible distinguir entre ovario y . Alrededor de PL50. vannamei. En peneidos existe dimorfismo sexual en donde las hembras tienen un mayor crecimiento en comparación con los machos. el órgano responsable de determinar la masculinidad es la glándula androgénica (GA). En Malacostraca (isópodos. el conocimiento sobre el desarrollo. un oviducto. y 7 lóbulos en el macho además de los vasos deferentes. se evidencia la diferenciación sexual externa con la formación del télico en hembras y los gonoporos en machos. La diferenciación de la gónada ocurrió a partir de PL68. La reversión sexual del camarón blanco Pacífico Litopenaeus vannamei podría contribuir a una mayor producción en la camaronicultura a través del cultivo monosexual de hembras. El órgano genital de cada sexo se reconoció por completo a través de la disección en el día PL16.i RESUMEN En la acuicultura. Sin embargo. En el presente estudio.

Maeda Martínez Co-director de tesis . La secuencia de este producto fue similar a las publicadas en peneidos y su traducción peptídica tiene la misma estructura del tipo-insulina que muestran los demás decápodos para la hormona de la GA. Palabras clave: L. Los conteos espermáticos se incrementaron significativamente en el grupo bilateral (̴6X106) respecto al unilateral y control (̴2X106). Por último. se analizaron las etapas de la profase meiótica I en cada uno de los estadios de ecdisis en ambos sexos. Con el objeto de establecer una relación entre la gametogénesis y el ciclo de muda. diferenciación sexual Dr. La ablación en ambos grupos mostró un efecto significativo en el peso total del órgano genital con respecto al grupo control.. lo cual denota una hiperplasia producida una semana después de la ablación. Alejandro M.ii testículo. se diseñaron oligos a partir de las secuencias nucleotídicas de la GA en decápodos reportadas en GenBank. pre-muda y post-muda temprana y tardía. Se obtuvieron amplificaciones de ADNc por RT-PCR en tejido del vaso deferente medio y ámpula terminal. Se observaron células meióticas en etapa de cigoteno. glándula androgénica. Rafael Campos Ramos Co-director de tesis Dr. En cortes histológicos se logró observar en ambos grupos ablacionados. Se realizó un bioensayo para analizar el efecto de la ablación unilateral y bilateral de los tallos oculares sobre el órgano genital y la GA. paquiteno (denotado por la completa sinapsis de sus bivalentes) y diploteno en los estadios de inter-muda. un incremento en el número de células en la GA del vaso deferente medio y el ámpula terminal. lo cual sugiere que no existe una relación entre esos 2 procesos. El conocimiento general que se obtuvo en este trabajo sobre la GA ayudará a próximos estudios enfocados a la producción de cultivos monosexuales en el camarón blanco. vannamei.

In the present work. The meiotic prophase I stages were analyzed in both genders on each molt stadium to establish if the gametogenesis and the molt cycle are related. including its development during the organogenesis of the genital organ. an oviduct. 4 AG investigations were carried out. However. Sex reversal of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei could contribute to the mayor production of the shrimp farming trough an all-female culture. where females grow larger than males. its function in the maintenance of the spermatogenesis related to the molt cycle. knowledge in the development. growth is the most important characteristic for the profitability of the industry. pre-molt. surrounded by connective tissue that attaches it to the eighth testicular lobe. pachytene. the androgenic gland (AG) is the responsible for their maleness.iii ABSTRACT In aquaculture. In Malacostraca (isopods. and a posterior lobe in females and 7 lobes including the vas deferens in males. are connected bilaterally along the collector tube. plus a molecular analysis of its expression. where external gender differentiation is recognized as the thelycum in females and the gonopores in males. 8 lobes. Peneid shrimp have a gender dimorphism. and the effect if ablated. vannamei is here described. (recognized by the complete synapsis of the bivalents) and diplotene stages were observed at inter-molt. Around PL50. Timing of the organogenesis and subsequent development of the genital organ of females and males of L. where it was possible to differentiate the female ovary from the male testes. Gonad differentiation occurred from PL68. The genital organ was fully recognized from postlarve day-16 (PL16) as a bilateral lobe located in the anterior region of the midgut gland that connects to an anterior collector tube that extends dorsally towards the posterior region and forms an inverted U-shape collector. function and control of the AG are practically null in commercially reared peneids. its endocrine control from the sinus gland in the eyestalk. the AG appears along the vas deferens. amphipods and decapods). Meiotic cells at zygotene. and early and late post- . This knowledge can create the foundations to undertake sex reverse essays on the white shrimp and finally integrate a biotechnology that could produce a monosexual culture in shrimp.

which denotes that eyestalk ablation caused hypertrophy of the gland. The AG knowledge here achieved. which suggests that there is no relationship between molting and the meiotic prophase. Amplifications of cDNA by RT-PCR were amplified on vas deferens and terminal ampule tissues of L. and its peptide translation has the same insulin-like structure that other AG hormones in decapods have.iv molt stages in all individuals. vannamei. Spermatic counts also had a significant increase in the bilateral group (̴6X106) over the unilateral and control (̴2X106). Finally. A bioassay to analyze the effect of the unilateral and bilateral eyestalk ablation over the genital organ and the AG was conducted. will contribute to future studies focused on the production of all-female cultures in the white shrimp. sexual differentiation . Key words: L. androgenic gland. An increase in the AG cell number in the vas deferens in both ablated groups was observed trough histology. vannamei. primers were designed based on the published AG nucleotide sequences of decapods. The sequence of these products was similar to those published in peneids. Ablation in both groups caused a significant effect over the total weight of the genital organ over the control group.

v A La Paz .

Gopal Murugan y el Dr. la Dra. Maeda Martínez. Hortencia Barboza. Hernández Saavedra. Gracias al CIBNOR y al personal de Posgrado. Gracias a la Dra. gracias a Sandra de la Paz. incluida Arlett. 166576). Quiero dar gracias a todos por haberme ayudado a llegar hasta aquí. Eulalia Meza. Carlos Ceseña. . Norma Y. Gracias a mi comité tutorial. Delia Rojas y Miguel Correa. gracias al CONACyT por la beca otorgada (No. Gracias a toda mi familia. Carmen Rodríguez.vi AGRADECIMIENTOS Agradezco a mis directores de tesis. Gracias a todos mis amigos y compañeros. Alejandro M. Elva Cortés. a la Dra. el Dr. Rodríguez Almaraz. Gabino A. el Dr. Danitzia Guerrero y a la Dra. Rafael Campos Ramos y el Dr.

..................................................... 45 ABLACIÓN DEL TALLO OCULAR E HIPERTRÓFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA ....................................................................................................................... 27 CICLO DE MUDA Y MEIOSIS .........................................................................8 Relación entre la gametogénesis y el ciclo de muda en decápodos ....... 35 ORGANOGÉNESIS ...........................................................1 ANTECEDENTES ..........................................................................................................................CONTENIDO INTRODUCCIÓN ..................5 Aparato genital en hembras y machos de Litopenaeus vannamei .................... 28 ABLACIÓN DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA ...................................... 40 Desarrollo del epitelio germinal y diferenciación sexual de la gónada (PL52 a PL72) 40 Desarrollo subsecuente de los vasos deferentes y de la glándula androgénica..... 35 Organogénesis de la gónada (PL12 a PL16) ................................................................................................................. 30 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 36 Desarrollo temprano de la gónada (PL12 a PL28) ..................................................... 38 Diferenciación sexual externa subsecuente (PL44 a PL48) ................................................................... 50 ANÁLISIS MOLECULAR ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 60 ................................. 31 ANÁLISIS MOLECULAR ................................................................................................................................. 27 ORGANOGÉNESIS .................................................................................................... 35 Línea de tiempo de eventos durante la diferenciación sexual interna y externa ............................................................................................................................ 37 Histología del oviducto y del vaso deferente ....... 15 Control neuroendocrino de la glándula androgénica ...................................... 31 RESULTADOS................................................................................... 39 Organogénesis de la GA y del tejido adiposo blanco (PL48 a PL50) ...................................................................... 56 DISCUSIÓN..................................................................................................................................................................... 37 Diferenciación sexual externa temprana (PL32 a PL44) ........................................ 35 Morfología del órgano genital ...........................................................................5 Organogénesis del aparato genital ............................................................... 26 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 41 CICLO DE MUDA Y MEIOSIS .............................................................. 25 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................................ 25 HIPÓTESIS .........................................................................................................8 Descubrimiento e investigaciones de la glándula androgénica en malacostráceos .......................... 19 OBJETIVO GENERAL ...............

.... 71 RECOMENDACIONES ............ 64 ABLACION DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA ..................................................................................... 72 LITERATURA CITADA ................... 67 ANÁLISIS MOLECULAR ...........................................ORGANOGÉNESIS ..................................................... 69 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 73 ANEXO .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................. 60 CICLO DE MUDA Y MEIOSIS ............................................................................................................................................................................................................................................................... 86 ...........................................................

.......... Órgano genital de L.............................................. Cromosomas en diploteno de L...... Vaso deferente medio de L........................... 11 Figura 7.............................................. 13 Figura 9..................................... 46 Figura 27............. Cromosomas en diploteno avanzado y en mitosis de L........................................................................................................................................................ 43 Figura 25....... Modelo linear de la pro-proteína (A) y en 3D de la proteína madura (B) Pm-IAG ...................................... 13 Figura 8........................ Esquema del control endócrino de la reproducción .................... Localización de la expresión del gen ..................................................... 20 Figura 14........................................................................... 30 Figura 17.......... Diámetro de los núcleos ..... Órgano genital de macho de L..................... 48 Figura 29...................................................... Comparación del peso del órgano genital e índice genital-soático entre camarones ablacionados ........................... vannamei . 14 Figura 10. Vaso deferente de L........................................... 39 Figura 21.... Órgano genital de L....................................... Tallo ocular de un peneido .......................... vannamei ..................................................... 10 Figura 6.................... Complejo sinaptonémico ....................................................... Vaso deferente de Litopenaeus vannamei............................................................................. Gónada de L................................................ vannamei.............................. Efectos de ablación del tallo ocular ...........................................................................................5 Figura 2..................................................................... 44 Figura 26..................................... Modelos linear de la pro-proteína (A) y en 3D de la proteína madura (B) del gen Cq-IAG................................ 22 Figura 16...................................................... vannamei ....... Vaso deferente de Cherax destructor ... vannamei...................................... vannamei ............................................................................ vannamei ........................................................................................................ Aparato reproductor masculino ................................................................7 Figura 4............................. 36 Figura 19... 47 Figura 28.......... vannamei ....................................................15 Figura 11..................................................................................Télico abierto en hembras Litopenaeus vannamei (A)........................................ Aparato reproductor femenino de peneidos..... Aparato reproductor masculino de peneidos ................................. 40 Figura 22............ vannamei....................................................................6 Figura 3.......................... y télico cerrado .................... Modelo linear de la pro-proteína de Mj-IAG... 49 Figura 30........................... Cambios morfológicos en urópodos de L...................................... 17 Figura 12................. 21 Figura 15...................................................... Cromosomas en cigoteno y paquiteno de L............. Órgano genital de la hembra de L................................ 35 Figura 18. 10 Figura 5... Vaso deferente de L...............................................LISTA DE FIGURAS Figura 1........................................... vannamei ............................. 41 Figura 23....... 18 Figura 13.............................. vannamei ......... Línea de eventos de la diferenciación sexual externa e interna .. .......................................................................................................................... 51 ...................................... Corte longitudinal de vaso deferente distal...................................... 37 Figura 20..... 42 Figura 24...... vannamei ..........

............. 32 Tabla II................. 55 Figura 34................................................................................................................................................................................................. Análisis de alineamiento de secuencias de aminoácidos de la HGA . 57 Figura 36........................................................... Comparación del peso del espermatóforo y conteo espermático entre camarones ablacionados ......... Conteos espermáticos .................... Comparación del peso del testículo e índice gonadosomático entre camarones ablacionados ........................................................................................................... 49 ................................................................. 59 LISTA DE TABLAS Tabla I............................................ 54 Figura 33......................... vannamei usando como templado ARN total de diferentes tejidos del vaso deferente....... Oligonucleótidos diseñados ........ Dendrograma consenso de similitud ..................................................................................................... Efecto de la ablación en L.......................... RT-PCR de L...... Comparación del peso del vaso deferente e índice vaso deferente entre camarones ablacionados ..... 58 Figura 37............................ 33 Tabla III...... 53 Figura 32................................................................................................................................................... vannamei ........................................... .................... Componentes para la reacción de PCR......................................................................................... 56 Figura 35..........Figura 31................

. en donde las hembras crecen más rápido que los machos. Li y Xiang. 1991) y se vuelve significativo aproximadamente a los 17 g (Pérez-Rostro et al.. 2003a). la fisiología reproductiva.. De acuerdo a las investigaciones realizadas en el CIBNOR (Campos-Ramos et al. dichas estructuras se utilizan en la identificación taxonómica de estas especies (Pérez-Farfante. los estudios en camaronicultura enfatizan el dimorfismo sexual en el crecimiento de las especies y las posibles ventajas que ello representa para mejorar la producción a través del monocultivo de hembras. 1999). 2008). 1994). la especie hindú Penaeus indicus (H. 2003b).. Penaeus monodon (Fabricius) (Lumare et al. Los peneidos presentan fertilización externa y sexos separados (gonocóricos). La producción de camarón por cultivo ha alcanzado una gran importancia a nivel mundial. se presenta también dimorfismo sexual en talla y peso durante su desarrollo. Milne- Edwards) (Mohan y Siddeek. 1992. 1995) y Fenneropenaeus chinensis (Kishinouye) (Yin et al. Li et al. y es por esto que se necesitan avances científicos y tecnológicos que ayuden a incrementar el sistema productivo (Martínez-Córdova. 2002). 1988).. . 1998. Hansford y Hewitt. Li et al. el crecimiento de las especies es la característica más importante para la rentabilidad de la industria. la nutrición y la genética de la especie propuesta (Lutz. 1999. 1997. Garza-Torres. Tal es el caso del camarón blanco del Pacífico. Anónimo. en donde el dimorfismo sexual comienza alrededor de los 10 g de peso (Chow y Sandifer. Adicionalmente. la resistencia a enfermedades. 2006. 1990). como posible ventaja en el cultivo de camarones a través del monocultivo de hembras.INTRODUCCIÓN En la acuicultura.. Litopenaeus vannamei (Boone).. 2002. incluyen también a especies asiáticas como Penaeus (Marsupenaeus) japonicus (Bate) (Nakamura et al.. Los estudios sobre el dimorfismo sexual. 2006). 1986. Su dimorfismo sexual se caracteriza principalmente por la presencia del petasma en machos y el télico en hembras (Dall et al. Es por ello que es necesario tener un mejor conocimiento de la zootecnia.

el conocimiento sobre el desarrollo de la GA durante la organogénesis del aparato genital.. es prácticamente nulo en especies comerciales de peneidos. 2007) y Procambarus clarkii (Taketomi y Nishikawa. 1954. el primer estudio se enfocó al conocimiento sobre la anatomía del mismo. su función en el mantenimiento de la espermatogénesis (incluyendo el control endocrino proveniente de la glándula sinusal). Sagi y Cohen. Cherax quadricarinatus (von Martens) (Khalaila et al. en la industria de la camaronicultura. Sagi et al. En langostinos como Macrobrachium rosenbergii (Nagamine et al. Manor et al. es el órgano responsable de la diferenciación testicular. documentando la organogénesis a partir de postlarva y determinando el momento en que aparece la GA y sucede la diferenciación de la gónada en ovario o testículo. se realizaron cuatro investigaciones concernientes al estudio de la GA en machos de camarón blanco. 1996). Dado que no se encontró información reciente sobre las hembras. tanto la determinación como la diferenciación sexual son procesos particularmente interesantes. 1980a. Sin embargo. 2001. ya que la glándula androgénica (GA).2 En los Malacostraca (isópodos. Dado que la GA forma parte del órgano genital en el macho. anfípodos y decápodos). 2003.b. En la presente tesis. se tendrían las bases para emprender ensayos de reversión sexual en el camarón blanco y sería factible integrar una biotecnología.. 1999).. 1990. 1990) y acociles como Cherax destructor (Fowler y Leonard.. la andrectomía (remoción de los vasos deferentes del macho) y la implantación de la GA en hembras han dado resultados parciales y totales de reversión sexual de la gónada y del individuo en cuanto a su estructuras sexuales externas. Se encontró que después de 63 años de la primera descripción del órgano genital en peneidos realizada por . Con estos conocimientos. 1960). Barki et al. el desarrollo de las características sexuales secundarias y forma parte del eje endocrino reproductivo que regula la espermatogénesis. además de la caracterización molecular y el análisis de expresión. La morfología y función de esta glándula fue descrita por primera vez en el anfípodo Orchestia gammarella (Pallas) (Charniaux-Cotton.. 1953. éstas también se incluyeron en el estudio. como el cultivo monosexual de hembras. que se localiza en los conductos deferentes de los machos.

. un aumento significativo en la producción de esperma. por lo tanto. la anatomía del órgano genital en hembras estaba mal descrita. y no como habían propuesto Yano (1998) y Qiu (1986) para otras especies. la meiosis en hembras comienza una vez que la gónada en el juvenil se ha diferenciado en ovario y se detiene en metafase I. (2009). Como cuarto y último tema de investigación. El tercer tema de investigación.. 2004. Asi mismo. en este trabajo se corroboró que al menos en camarón blanco. Cabe resaltar . 1988. adicionalmente. se aclara en esta especie una controversia en la literatura. (1990). Sroyraya et al.3 King (1948) y muchas otras descripciones subsecuentes revisadas por Dall et al. Como segundo tema de investigación. es dependiente del ciclo de muda. De hecho. (2011). en donde para cada estadio de muda corresponde una etapa de la profase I.. o si se trata de un desarrollo meiótico ordenado. Okumura y Hara. en donde se planteaba que la gametogénesis en peneidos (hembras y machos) está regulada por el ciclo de muda. se logró obtener la secuencia nucleotídica del precursor de la hormona que produce la GA en camarón blanco. así como su expresión en los diferentes tejidos del órgano genital. se obtuvieron y analizaron cromosomas meióticos en cada uno de los estadios del ciclo de muda de camarón blanco que. con la hipertrofia observada en la GA se logró determinar que esta glándula continúa hasta la parte distal del ámpula terminal. no estaban descritos en la literatura. De esta manera. 1991. Poljaroen et al.. toda esta información se puede consultar en Garza-Torres et al. 2002. por ende. tal como ocurre en decápodos de agua dulce (Sagi et al. en donde la meiosis comienza y antecede al desove y. Para ello. se investigó si la espermatogénesis (y por ende la meiosis) es un proceso continuo a lo largo de los estadios del ciclo de muda. lo cual se descartó en vista de los resultados que se obtuvieron en esta investigacion. corroborando que al igual que otros decápodos (Khalaila et al. 2010) la ablación (unilateral y bilateral) produce hipertrofia de la GA y. en prensa). toda esta información se puede consultar en Garza-Torres et al. se relacionó con el control endocrino que ejerce la glándula sinusal (localizada en el pedúnculo ocular) sobre la GA.

2010).4 que durante el transcurso de este estudio doctoral en el CIBNOR. En el 2010. se dio a conocer la secuencia nucleotídica del precursor de la hormona de la GA del cangrejo Portunus pelagicos (Rathbun) que es una especie de importancia económica en las pesquerías (Sroyraya et al. se dio a conocer la secuencia de nucleotidos del precursor de M.. resultando ser muy similar a la de P. monodon. vannamei por investigadores del CIBNOR. la secuencia de nucleotidos del precursor de este cangrejo es similar a la del langostino Cherax. Por último. en el 2009 se dio a conocer la secuencia nucleotídica del precursor de la hormona que produce la GA en P.. en marzo del 2011. se hizo más que relevante y en esta tesis doctoral. De manera interesante. japonicus por investigadores japoneses (Banzai et al..1) y en mayo del 2011 los datos se publicaron formalmente por investigadores australianos e israelitas (Mareddy et al. cuando se hubiera esperado que estuviera mas relacionada con las de los peneidos por tratarse de un organismo de ambiente marino y no de agua dulce. monodon en GenBank (GU208677. 2011). . la obtención de la secuencia del precursor de la hormona de la GA en L. Finalmente se sugieren recomendaciones para continuar con estas investigaciones. 2011). se presenta dicha información. Con lo anterior.

cada uno con lóbulos laterales cortos que se extienden desde la región cardiaca. hasta el telson. Aparato reproductor femenino de peneidos: lóbulos anteriores (LA). oviducto (O) (tomado y modificado de Dall et al.).e.. De igual manera. lóbulos laterales (LL). en este trabajo se describe al ovario como una estructura bilateral parcialmente fusionada con lóbulos proyectados. i. La revisión de Dall et al. de seis a ocho lóbulos laterales. el lóbulo anterior. Consiste en un par de testículos. lóbulos posteriores (LP). (1990) sobre peneidos hembras describe al ovario como dos estructuras bilaterales independientes con lóbulos proyectantes. Figura 1.. 1990). se acepta que dicho aparato consiste en un par de ovarios parcialmente fusionados (más el oviducto). En la actualidad.5 ANTECEDENTES Aparato genital en hembras y machos de Litopenaeus vannamei En Litopenaeus setiferus (L. y un lóbulo posterior largo. con la excepción de que no presenta los lóbulos posteriores. cada uno con siete u ocho lóbulos laterales. dorsalmente al hepatopáncreas. la anatomía básica del aparato genital de una hembra adulta fue descrita por King (1948). sobre la base de la descripción original de King (1948). en peneidos la forma general del aparato reproductor masculino es similar al femenino. algunos . además del oviducto en el sexto lóbulo lateral (Figura 1).

Dall et al. y Chow et al. Figura 2. vasos deferentes (VD). Los vasos deferentes se prolongan dorsalmente desde el extremo de cada uno de los dos lóbulos testiculares y continúan lateralmente en una dirección dorso-ventral hasta llegar a las aberturas ventrales en el exterior (King. japonicus. posteriormente Chim (1983). ámpula terminal (AT) (tomado y modificado de King. (1991) el de machos de L. Laubier et al. 1948). vasos deferentes proximales (VDP). 1948. 1988. Aparato reproductor masculino de peneidos: testículos (T). coincidiendo todos que el testículo presenta ocho lóbulos testiculares . vasos deferentes medios (VDM). 1990). Treece y Yates.. vasos deferentes distales (VDD). vannamei (Figura 3). dorsalmente al hepatopáncreas (Figura 2). localizados en la región cardiaca. setiferus y L.6 fusionados. Sin embargo. (1983) y Charniaux-Cotton y Payen (1985) describieron el aparato reproductor del macho de M.

“ala” del espermatóforo en Litopenaeus setiferus (WD). el cual llega hasta el ámpula terminal. tubo colector (CT). en vez de varios túbulos como se había propuesto en los primeros estudios. La parte distal de cada uno de los vasos deferentes medios descendentes. vasos deferentes posteriores proximales (PPV). 1991). vasos deferentes anteriores proximales (APV).. . vasos deferentes medios ascendentes (AMV). gonoporo (GP) (tomado de Chow et al. denominado vaso deferente distal. En estos trabajos se establece que cada lóbulo testicular está compuesto de un solo tubo seminífero enrollado. vasos deferentes medios descendentes (DMV). cerca de la comisura posterior del cefalotórax. línea hialina en los vasos deferentes medios (HL). El vaso deferente medio se pliega a la mitad de su longitud formando un doblez. Aparato reproductor masculino: lóbulos testiculares (TL).7 bilaterales que desembocan independientemente a un vaso colector en forma de herradura o de “U” invertida. El vaso colector bilateral continúa. ducto del ámpula terminal (WI). con una porción corta y estrecha que asciende y se ensancha hacia la parte dorsal (vaso deferente medio ascendente). Figura 3. vasos deferentes distales (DV). ausente en Litopenaeus vannamei (ámpula izquierda). ahora como vaso deferente medio proximal. en donde continúa de forma descendente hacia la parte ventral (vaso deferente medio descendente) formando una estructura tipo herradura. ámpula terminal (TA). se angosta formando el vaso medio deferente distal que continua como un tubo delgado.

.. no existiendo antecedente sobre la organogénesis del oviducto y la diferenciación de la gónada en ovario. incluyendo la morfología de la GA y el proceso de diferenciación sexual han sido estudiados en machos de P. En ninguna otra especie de peneido se han estudiado a fondo el desarrollo del aparato reproductivo en machos. Okuno et al. 1983). . el cangrejo Callinectes sapidus (Rathbun). 1999). Katakura y colaboradores investigaron al isópodo Armadillidium vulgare (Latreille) en Japón (Katakura. Sus trabajos consistieron en la purificación y caracterización parcial de la hormona de la glándula androgénica (HGA) y. lo cual fue posteriormente confirmado en esta especie por Legrand (1955) y Suzuki y Yamasaki (1997). durante el segundo mes como postlarva. por primera. Estos estudios coinciden en que la organogénesis de la GA ocurre antes o en el momento de la espermatogénesis. se obtuvo la secuencia nucleotídica del precursor de la HAG en esta especie (Martin et al. Laubier et al. Descubrimiento e investigaciones de la glándula androgénica en malacostráceos En 1947 Cronin observó por primera vez la GA en un crustáceo decápodo. (1983). Nagasawa et al. Katakura et al. Charniaux-Cotton y Payen (1985) y Nakamura et al. (1992). dentro de las dos primeras semanas del desarrollo postlarval. 1975.. vez realizaron experimentos de masculinización de hembras mediante la inyección directa de extractos de la GA (Hasegawa et al.. mucho tiempo después de que se diferenció el sexo del individuo con la formación de la gónada indiferenciada y los vasos deferentes que identifican al macho. 1961. 1991. En Francia.8 Organogénesis del aparato genital La organogénesis del aparato reproductivo. 1995). japonicus por Chim (1983). y las hembras han sido consistentemente excluidas de estos análisis.. Posteriormente. gammarrella. Katakura y Hasegawa. Durante las siguientes décadas. 1999. Charniaux-Cotton (1954) sugirió que la GA estaba involucrada en la regulación de la diferenciación sexual y la espermatogénesis en el anfípodo O.

9

En California Nagamine et al. (1980 a, b), trabajaron con el decápodo M.

rosenbergii, revirtiendo hembras genotípicas a machos fenotípicos (neomachos) a

través de la implantación de GAs en las hembras juveniles. De igual forma, se
revirtieron machos genotípicos a hembras fenotípicas (neohembras) mediante la

andrectomización de los vasos deferentes. En machos de M. japonicus, Chim
(1983), Laubier et al. (1983), Charniaux-Cotton y Payen (1985) y Nakamura et al.

(1992), localizaron la GA en los vasos deferentes distales. Cabe mencionar que
Charniaux-Cotton y Payen (1985), también identificaron la GA en Penaeus

keraturus (Forsskål). En M. japonicus, se observa que la fase indiferenciada del

aparato genital se extiende hasta el día onceavo como postlarva (Charniaux-Cotton
y Payen, 1985), la diferenciación interna ocurre con la formación de los conductos
deferentes del macho y la aparición de la GA es tardía, ya que se observa a partir
del día 55 como postlarva (Nakamura et al., 1992). Externamente, la fase

indiferenciada se prolonga en toda la vida larval, hasta que la postlarva muestra

una característica muy peculiar: en la cara interna del protopodito del primer par
de pleópodos se forma una depresión en forma de mueca, lo cual es una

característica exclusiva de los machos. Posteriormente, aparece el apéndice
masculino, que se desarrolla en el segundo par de pleópodos, además, el

endopodito del primer par de pleópodos se diferencia en el petasma, continuando
con la aparición de gonoporos en la coxa del quinto pereiópodo.

Nagamine y Knight (1987) estudiando al acocil P. clarkii, lograron observar

características sexuales secundarias de macho en hembras implantadas con GAs.

Alfaro (1994) en L. vannamei y Litopenaeus stylirostris (Stimpson) y
posteriormente Campos-Ramos et al. (2006) en L. vannamei, documentaron la

localización de la GA en los vasos deferentes distales (Figura 4), y la histología de la

GA en L. vannamei (Figura 5), la cual corresponde con la reportada en la literatura
para otros malacostracos, como C. destructor (Fowler y Leonard, 1999) (Figura 6).

10

Figura 4. Vaso deferente de Litopenaeus vannamei por microscopía de barrido.
Glándula androgénica (GA); vaso deferente medio (VDM); vaso deferente distal
(VDD); ámpula terminal (AT) (tomado de Campos-Ramos et al., 2006).

Figura 5. Corte longitudinal de vaso deferente distal de Litopenaeus vannamei (a).
Magnificación de GA en (b). Glándula androgénica (AG); capa muscular (ML); capa
epitelial (EL); tejido conjuntivo (CT) (tomado de Campos-Ramos et al., 2006).

11

Figura 6. Vaso deferente de Cherax destructor por microscopía de barrido (1).
Sección del vaso deferente de C. destructor por histología (2). Vaso deferente (VD);
glándula androgénica (AG); músculo (M); epitelio (E); masa espermática (S),
(tomado y modificado de Fowler y Leonard, 1999).
En L. vannamei, Campos-Ramos et al. (2006) describieron que durante el

segundo mes como postlarva, después de que alcanza un peso mínimo de 150 mg

(y un tamaño de 20 mm) comienzan a aparecer las estructuras externas que
distinguen a las hembras de los machos, lo cual concuerda con las pocas especies

de peneidos estudiadas como M. japonicus (Charniaux-Cotton y Payen, 1985;
Nakamura et al., 1992), y F. chinensis (Yin et al., 1986; Li y Xiang, 2002).

Dependiendo de qué tan favorable o desfavorable puede ser una condición
ambiental (como temperatura, densidad y alimento) para los camarones, la

diferenciación sexual externa ocurrirá alrededor del segundo mes. En L. vannamei,
Campos-Ramos et al. (2006) documentaron la estructura de la GA como una

estructura celular compacta, en paralelo al vaso deferente distal (Figuras 4 y 5),
conectada a una capa muscular a través de un recubrimiento epitelial (Figura 5A).

Su longitud es de ≈2.5 mm, es tubular, con un diámetro de ≈100 µm en la parte
media. La masa celular está compuesta por células ovales largas, con citoplasma
vacuolado y cada célula presenta un núcleo prominente (Figura 5b). Mediante

microscopía de barrido, la GA se observa como un cordón pegado en la parte distal

del vaso deferente medio, o bien en la parte distal del tubo eyaculador. De cada

lo que indica que el gen está regulado negativamente por la GA. En los machos a los que se les removió la GA. Barki et al. (2002) clonaron el ADNc de la vitelogenina de C. Este gen específico del sexo. (2003) lograron inhibir tanto la segunda vitelogénesis como el desarrollo de los ovarios. Esta proteína consta de un péptido señal. Mediante la implantación de GAs en hembras de C. lo que confirma el papel de esta glándula en la plasticidad sexual de la especie. fue denominado como Cq-IAG (C. y produce una proteína similar a los miembros de la familia “tipo-insulina” (por ello su nombre) específica para los crustáceos decápodos machos (Figura 8). . estos investigadores observaron en hembras implantadas con GAs que el proceso de vitelogénesis disminuye drásticamente (Khalaila et al. (2007) construyeron la primera librería substractiva de ADNc de la GA de C. 2001). (1999) monitorearon el comienzo de la vitelogénesis utilizando pruebas de ELISA. Mediante experimentos de hibridación in situ estos autores observaron que el gen solo se expresa en machos. como hacia el vaso deferente distal delgado (Figura 4). quadricarinatus Sagi et al. Abdu et al. estos resultados confirmaron la localización exclusiva de la expresión del gen en la GA (Figura 7). quadricarinatus. quadricarinatus. Manor et al. mediante una prueba inmunohistoquímica que detecta lipoproteínas vitelogenina-específicas. se observaron transcritos del gen que codifica la vitelogenina..12 extremo de la glándula se extienden cordones más delgados que se dirigen tanto hacia el bulbo eyaculador. dos cadenas (A y B) además de un péptido C. Este estudio proveyó una herramienta exacta para investigar la influencia de la GA en la expresión de una proteína vitelogénica-específica en las hembras. En C. que se dobla y une a las dos cadenas mediante puentes di-sulfuro en los residuos de cisteína de las cadenas. quadricarinatus insuline-like androgenic gland factor). además ellos también observaron en ellas la aparición de características secundarias de macho. Posteriormente. quadricarinatus y mostraron que el gen de la vitelogenina estaba presente en el hepatopáncreas de hembras durante la vitelogénesis secundaria.

(A) tinción con hematoxilina y eosina. 2007). ..13 Figura 7. 2007).. Modelos linear de la pro-proteína (A) y en 3D de la proteína madura (B) del gen Cq-IAG. que presenta la estructura clásica de las insulinas (tomado de Manor et al. (B) sonda con detección (C) sonda testigo (tomado de Manor et al. Localización de la expresión del gen Cq-IAG en secciones del ducto espermático (SD) y de la glándula androgénica (AG) de Cherax quadricarinatus. Figura 8.

monodon (Pm- IAG). basándose en una secuencia de 531 pb de P. que resulta ser muy similar a la de M. japonicus (Mj-IAG). en donde encontraron el gen especifico de la GA (Mr- IAG). (2009) crearon una librería de ADNc de GA de M. Sroyraya et al. además de provocar hipertrofia e hiperplasia de la GA. 2011) (Figura 9). lo cual previno temporalmente le regeneración de características secundarias sexuales. además del retraso en la muda y la reducción del crecimiento. (2011) publicaron la secuencia de la GA de P. (2011) publicaron la secuencia de la GA de M. Para silenciar este gen. encontrando una similitud del 68%. inyectaron in vivo dsRNA. japonicus. La ablación también detuvo la espermatogénesis y el desarrollo del espermatóforo del ámpula terminal.14 Ventura et al. de acuerdo con los parámetros para esta especie. Modelo linear de la pro-proteína de Mj-IAG (tomado de Banzai et al. (2010) publicaron la secuencia nucleotídica de la GA del cangrejo nadador P. la cual se muestra en la Figura 10. . Figura 9. Banzai et al. (2011). observando entre ellas una similitud del 83%. como el apéndice masculino.. monodon (Mareddy et al. basándose en la secuencia de Cq-IAG. Mareddy et al. rosenbergii ablacionado del tallo ocular. pelagicus.

Macrobrachium lar (AB579012. Marsupenaeus japonicus (AB598415.1). Hasta el momento existen nueve secuencias de la GA en decápodos. Macrobrachium rosenbergii (FJ409645). la cual sostiene la estructura clásica de las insulinas (tomado de Mareddy et al.. Relación entre la gametogénesis y el ciclo de muda en decápodos En camarones machos. en donde la espermatogénesis continúa a través de los bulbos eyaculadores. 2011).1).1). Portunus pelagicus (HM459854. Palaemon paucidens (AB588013) y Palaemon pacificus (AB588014. Cherax destructor (EU718788. Modelo linear de la pro-proteína (A) y en 3D de la proteína madura (B) Pm-IAG.1).1).1). Cherax quadricarinatus (DQ851163. los testículos producen espermátidas que son transportadas y acumuladas en los vasos deferentes.15 Figura 10. y la masa de .1). publicadas en la base de datos del GenBank: Penaeus monodon (GU208677.

2004). comienza la maduración del ovocito (vitelogénesis) hasta alcanzar la maduración final y el desove. la espermatogénesis pudiera estarlo también. De hecho. 1990). los niveles de la hormona de la GA se mantienen constantes. Dall et al. que el ciclo de renovación del espermatóforo está regulado por el ciclo de la muda y. Por otro lado. 1995. El proceso de ciclo de muda y gametogénesis está ampliamente documentado en decápodos hembras.. en donde finalmente se empaqueta por secreciones glandulares formando los espermatóforos (King.. Se conoce que en decápodos la actividad espermatogénica está regulada por la circulación de la hormona de la GA (Charniaux-Cotton y Payen. sin la regulación de un estadio específico de muda (Okumura y Hara. en los decápodos de agua dulce. Yano. en prensa). en peneidos de télico abierto como L. y a partir de ahí.. esto indica una sincronía entre la meiosis y el ciclo de muda (Sagi et al. 1988.16 espermatocitos es guardada en el ámpula terminal. 1991. monodon y M. ya que el desarrollo ovárico (vitelogénesis). et al. y en langostinos y acociles. en M. 2004. la maduración final y la ovulación (desove) están controlados por órganos endocrinos y neurosecretores.. 1993). los machos maduros colocan la masa espermática en el télico de la hembra recién mudada (télico suave). 1986. sin relación alguna con el ciclo de muda (Heitzmann et al. vannamei y L. los machos adhieren el espermatóforo en el télico de la . Parnes et al. Por lo tanto. 1948). (2006) observaron que cada vez que el macho muda el espermatóforo “viejo” es reemplazado en el ámpula terminal por uno recién formado. Adicionalmente.. A este respecto. de acuerdo a los ciclos de muda (Qiu. el comportamiento reproductivo de inseminación en camarones dependerá ciclo de la muda. en especies de télico cerrado. es decir. Por otra parte. 1990). por ende. 1988. Un estudio histológico mostró que la espermatogénesis en L. 1995. Dall et al. 1988. cada estadio de muda corresponde a una etapa de la profase I. rosenbergii se ha observado que durante el ciclo de muda. el apareamiento y la transferencia de esperma se dan antes de la vitelogénesis (Yano. En peneidos de télico cerrado como P. Okumura y Hara. stylirostris (Figura 11A). 1988). Poljaroen. vannamei es un proceso continuo. japonicus (Figura 11B).

asociado con la maduración final. previo al desove. 1990. Figura 11. y por ende. en donde la ovulación y la meiosis I caracterizan la etapa de maduración de los ovocitos (Yano. 1995). algunos reportes indican que comienza en el desove. 1998). en etapa de inter-muda (télico duro).Télico abierto en hembras Litopenaeus vannamei (A). el arresto de la meiosis en el ovocito se ha . Es por eso que en especies de télico abierto. 1988) y el camarón rojo Acetes chinensis (Hansen) en los que la meiosis I inicia en el momento del desove (Qiu. etapa en la que el comportamiento de apareo es un requisito indispensable para la transferencia del espermatóforo y una fertilización exitosa. 1986). En la metafase I. monodon (B) (tomado de Pérez-Farfante. y télico cerrado en hembras P.. Existe una discrepancia en cuándo comienza la meiosis I en los decápodos hembras. japonicus. del desove y del ciclo de muda. Como ejemplos se pueden mencionar M. después de la vitelogénesis (Dall et al. y reinicia en hembras maduras. Sin embargo. el apareamiento ocurre alrededor de dos horas antes de la maduración final del ovocito y el desove. el comienzo de la meiosis I es independiente de la maduración final. al ciclo de muda. otros reportes indican que la meiosis I está detenida o arrestada en metafase I. Yano. En este caso.17 hembra con una maduración de la gónada avanzada.

La larga y compleja primera profase meiótica consiste de las etapas de leptoteno. Fawcett. 2005). 1994). von Wettstein et al. 1993. Figura 12. .18 documentado en L. paquiteno. 1980) como en el langostino M.. Carpenter. 1994) e involucra tres procesos importantes: (1) El apareamiento de los cromosomas homólogos (sinapsis). 2002). El complejo sinaptonémico (CS) (Figura 12) es un complejo protéico que se forma durante la primera fase meiótica. Loidl. diploteno y diaquinesis (Strickberger. 1979.. cigoteno. y por histología tanto en Farfantepenaeus aztecus (Ives) (Clark et al. Bernhard. Loidl. 2000). Complejo sinaptonémico (tomado de Alberts et al. rosenbergii (Okumura y Aida. y (3) la segregación de los cromosomas homólogos. vannamei utilizando sondas fluorescentes para ADN y tubulina con un microscopio confocal (Hertzler. 1990. 1976. en donde ocurren la sinapsis y la recombinacíon genética entre cromosomas homólogos durante las fases de cigoteno y paquiteno.. Schmekel et al. 1984. (2) la recombinación genética.. 1956. no existen estudios extensos sobre la meiosis en crustáceos. respectivamente (Moses. Actualmente. 1956.

Campos-Ramos. (1987) reportaron . también llamada la hormona juvenil del crustáceo. Otras neurohormonas se encuentran en el tallo ocular donde se almacenan y se liberan de la glándula sinusal. en las granjas productoras de postlarvas de camarón utilizan la técnica de la ablación del tallo ocular para inducir a la maduración a las hembras. En el cangrejo araña Libinia emarginata (L. El conteo de los bivalentes altamente condensados ha llevado a establecer el número haploide de las especies.. donde los cromosomas son pequeños y con una longitud descendente progresiva. vannamei y en otras especies de peneidos comerciales los cromosomas mitóticos han sido estudiados ampliamente (CamposRamos.. Este complejo.19 En el camarón blanco L. existe solo un reporte en ovario en la hembra de F. incluyendo la hormona inhibidora de la muda (HIM) y la hormona inhibitoria del órgano mandibular (HIOM) (Chang y Kaufman. 1989). 2008). tiene una función estimulante en la reproducción en ambos géneros. chinensis (Xie et al. 1990). Se han obtenido núcleos en diploteno de cromosomas meióticos de testículo de M. esta hormona se sintetiza en la glándula del órgano mandibular (OM). Farfantepenaeus duorarum (Burkenroad) y L. La glándula sinusal. 2006). aztecus. F. 2005). 1997. sirve como reservorio y liberador de hormonas producidas por el órgano-X. La mayoría de las especies tienen un número diploide de 88 cromosomas. japonicus (Hayashi y Fujiwara. chinensis (Jixun et al. F. chinensis (Jixun et al. 1990. 1989). Por otro lado. Control neuroendocrino de la glándula androgénica Hoy en día. que se encuentra en el tallo ocular (Figuras 13 y 14). y es la razón por la que la ablación crea un desbalance hormonal y provoca (en corto tiempo) la maduración de la hembra. vannamei (Chow et al.. el CS ha sido analizado en triploides y diploides de F. setiferus (Chow et al. produce la hormona inhibidora de la vitelogénesis (HIV)...) Laufer et al. lo cual hace difícil estudiar su cariotipo. y L.. también llamada de la gónada. Otras hormonas como el metilfarnesoato (MF). Alcivar-Warren et al. 1997). confirmándolo con el número diploide anteriormente obtenido. 1988). órgano-X/glándula sinusal.

glándula sinusal (GS). estimulan la vitelogénesis de algunos insectos. el tracto órgano-X . Natantia) mostrando ganglio del órgano-X (GOX). .481).168. mejor conocidas como las hormonas de la muda.20 un incremento en la producción de MF en el OM en hembras en proceso de ovogénesis. la ablación continua utilizándose comúnmente para la maduración gonádica ya que las hembras responden positivamente a ella. sobre la base de la analogía existente entre los sistemas endocrinólogos entre insectos y crustáceos. 1970). poro sensitivo del órgano-X (PS).glándula sinusal (TGOXGS) y el tracto del poro sensitivo del órgano-X (TPSGX) (modificado de Adiyodi y Adiyodi. Figura 13. no se ha encontrado relación entre el ecdisisteroide y la vitelogénesis. Sin embargo. 5. rosenbergii con estas hormonas. sin embargo. ya que los niveles de esta hormona en la hemolinfa no cambiaron entre los ciclos de muda en hembras en reproducción respecto a hembras normales (control). Tallo ocular de un peneido (Decápoda. Existe una patente para el uso de la MF en la reproducción de camarón. Las ecdisisteroides. sugiriendo que estas hormonas no están relacionadas con la vitelogénesis. Okumura y Hara (2004) trabajaron en M. sin la necesidad de la ablación unilateral (Patente no.

2004).21 Figura 14. En langostinos... el crecimiento (Hopkins. 2002.. 2006. Hopkins. Subramoniam. 1984). quadricarinatus (Khalaila et al. 2004) y C. Parnes et al. japonicus en los que inyecciones de progesterona inducen la maduración ovárica y estimulan la secreción de vitelogenina (Yano. 2004). 1988.. 1984) y la regeneración de miembros (Holland y Skinner. la ablación del tallo ocular .. como lo son la reproducción (Charniaux-Cotton y Payen. como M. ya que Takayanagi et al. 2002). En el ámbito científico un tema interesante a discusión ha sido la presencia de feromonas en camarones. 1985) así como inyecciones de serotonina en decápodos (Sarojini et al. Khalaila et al. 1995. rosenbergii (Okumura y Hara. metilfarnesoato (MF) (modificado de Okumura. Sagi et al. (1986) observaron que las hembras de Paratya compressa (Kemp) retrasan su desarrollo ovárico a menos de que un macho este presente o cuando se agrega un extracto de testículo al agua. Alfaro et al. 2000. Hormona inhibidora del órgano mandibular (HIOM). 2000). También se han realizado estudios en M. Esquema del control endócrino de la reproducción del macho en camarón. En decápodos existen varias funciones fisiológicas reportadas en el complejo órgano X/glándula sinusal (dentro del tallo ocular de machos y hembras).. 1991. 1976. hormona de la glándula androgénica (HA). Huberman.

se encontró una ocurrencia en GA pero no en testículo. ducto espermático (SD) (tomado y modificado de Khalaila et al. debido a que se observa un incremento significativo en el peso del espermatóforo. se incrementa la producción de gametos del macho. y observaron un crecimiento de tres veces su tamaño normal de la GA ocho días después de la ablación. después de un tiempo. pelagicus. 2002). P. en una disminución en el peso de la gónada y en la ocurrencia de espermatocitos primarios en los lóbulos testiculares (Figura 15). Glándula androgénica (AG). lo que estimula la espermeación y genera espermatóforos maduros. la espermeación inicial elevada deriva.22 causa hipertrofia e hiperactividad de la GA. Sroyraya et al. El mejoramiento del esperma ocurre cuando los machos . Existe evidencia indirecta que indica que al incrementar la tasa de renovación del espermatóforo de forma manual. (A) GA de langostino intacto (B) GA de langostino ablacionado (C) gráfica representando el índice del peso gonadal en langostinos intactos y ablacionados a través del tiempo.. quadricarinatus con ablación bilateral. En una inhibición in vitro de la síntesis de polipéptidos de la glándula sinusal. En machos de C. lo que incluye una mejor calidad y cantidad del esperma en camarones marinos. (2010) ablacionaron bilateralmente al cangrejo nadador. sugiriendo de esta forma un eje tallo ocular-GA–testículo (Khalaila et al. Figura 15. 2002).. Efectos de ablación del tallo ocular.

2006). . Alfaro y Lozano. 1993. en peneidos se desconoce hasta qué punto la glándula androgénica está implicada en el eje neuroendocrino inhibitorio órgano X/glándula sinusalglándula androgénica-testículo. Ceballos-Vázquez et al. 1993)..1985. 1987. este mejoramiento pudiera ocurrir por la estimulación de la GA a falta de un control de la glándula sinusal. cuando son eyaculados manualmente (Alfaro y Lozano. la cual mantiene y regula el incremento o decremento en la actividad espermatogénica. Sin embargo. Aunque no existen estudios realizados en camarones.. 2003). por lo que la edad del macho puede ser un factor que determina también la actividad de la GA sobre la espermatogénesis.23 adoptan un comportamiento sexual (Parnes et al.. De igual forma. sobre la cantidad y calidad espermática L. no existen reportes científicos que analicen el papel de la glándula androgénica en la calidad y/o producción espermática (cantidad). En investigaciones posteriores. vannamei. se encontró que la edad óptima para el uso de machos como reproductores es cuando alcanzan los 12 meses de edad (Ceballos-Vázquez et al. 2004) y cuando son ablacionados unilateralmente del tallo ocular (Leung-Trujillo y Lawrence.

para estar en la posibilidad de ofrecer. por lo que avances similares a los obtenidos en decápodos de agua dulce se generarán en la próxima década. tanto México como Latinoamérica deben de estar a la vanguardia en este tipo de investigaciones. estrategias de cultivo y biotecnologías en las que a través del cultivo monosexual de hembras se incremente el rendimiento por hectárea de este crustáceo. ya que en peneidos el papel fisiológico de la GA debe de estar bien estudiado y comprendido. Por lo anterior. en el corto plazo. en este sentido. En peneidos. En decápodos de agua dulce. vannamei ocupa un lugar importante en la acuicultura mundial y. la investigación que se ha realizado es muy extensa y. en México representa la especie más importante de cultivo por lo que se requiere realizar más investigación científica acerca de esta especie. la fisiología reproductiva de camarones marinos (específicamente la del macho) requiere de mayor atención por la comunidad científica. no fue sino hasta años recientes que algo de información a nivel molecular ha emergido en la literatura científica. .24 JUSTIFICACIÓN El camarón blanco L. Este estudio contribuye al conocimiento de la biología y la fisiología de la reproducción en decápodos además de abordar el estudio de su diferenciación sexual.

una semana después de la ablación unilateral y bilateral del tallo ocular. Describir la anatomía de la GA. 8. 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Obtener la secuencia nucleotídica del precursor de la hormona que produce la GA y su expresión en los diferentes tejidos del órgano genital. su función en la espermatogénesis y su análisis molecular en el camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei. testículo y vaso deferente. 4. 5. 7. con respecto a la externa. Analizar el efecto de la ablación sobre los diferentes tejidos del órgano genital. 2. y a la edad en número de días como postlarva. 6.25 OBJETIVO GENERAL Realizar estudios encaminados a analizar el desarrollo de la glándula androgénica (GA) durante la organogénesis del órgano genital. Documentar el período de indiferenciación sexual y la anatomía del órgano genital en ambos sexos. Realizar conteos espermáticos en espermatóforos en las diferentes etapas de muda. Documentar la diferenciación sexual interna. . Analizar cromosomas meióticos en los diferentes estadios de muda. Documentar el momento de aparición de la GA en los vasos deferentes del macho y el momento en que se diferencia la gónada en testículo.

vannamei. . sin tener relación con la muda. y por ende. ni una hipertrofia en dicha glándula. si la meiosis se lleva a cabo previo al desove. al igual que en todos los malacostracos estudiados hasta ahora. entonces no se observarán etapas meióticas en hembras inmaduras. Como hipótesis nula. se plantea que los tiempos en la organogénesis del camarón blanco no corresponden al del camarón kuruma. ni tampoco un incremento en la producción espermática. vinculada con la muda. Alternativamente. Alternativamente. Como hipótesis nula. seguida de la diferenciación testicular se llevan a cabo durante el segundo mes del desarrollo. dicha hormona en camarón blanco presenta una estructura molecular diferente. III. si la espermatogénesis en los machos está vinculada con la muda. existe un eje endocrino entre dichos órganos y por ende se observará una hipertrofia y como consecuencia se incrementará la producción espermática. Alternativamente. Como hipótesis nula. entonces este proceso debe de ser similar en L. japonicus se lleva a cabo dentro de las primeras dos semanas de desarrollo postlarval y la glándula androgénica. se plantea que en camarón blanco no existe un eje endocrino: complejo órgano X/ glándula sinusal-GA-testículo y por ende no ocurre. se plantea que si la organogénesis de la gónada y vasos deferentes de machos de M. II. IV.26 HIPÓTESIS I. se plantea que en L. entonces cada etapa meiótica de la profase I deberá corresponder a un estadio del ciclo de muda. Como hipótesis nula. se plantea que la meiosis es continua en ambos sexos. con una ovogénesis avanzada. la hormona de la glándula androgénica es del tipo-insulina. En el caso de las hembras. Alternativamente. vannamei.

1988. 1990). juveniles. México..9%. Tokio. camarones de talla más grandes (>PL20) se alimentaron tres veces al día con artemia viva y congelada. Para registrar peso (mg y g) y longitud (mm. Las imágenes fueron documentadas mediante fotografía digital y analizadas con el software Image Pro Plus 4. las laminillas se analizaron con un microscopio de luz compuesto (Olympus. Dall et al. Se criaron camarones desde postlarva 4 (PL4) en seis tanques de 1000 L manteniéndose con agua marina (salinidad: 36 – 38 ppm) filtrada y aireada. pre-adultos y adultos fueron cultivados en el laboratorio de crustáceos del CIBNOR. Japón). Los camarones utilizados para el análisis histológico.27 MATERIALES Y MÉTODOS ORGANOGÉNESIS Las postlarvas de camarón se obtuvieron en el laboratorio de producción Acuacultura Mahr en La Paz. 1988). Kong y William.0 (Media Cybernetics). se tomaron aleatoreamente diez camarones de cada uno de los seis tanques. Los órganos genitales internos se tiñeron con azul de metileno comercial (Acuario Lomas) en una solución de NaCl al 0. 1988. se fijaron en solución Davidson por 24 h y después en etanol al 70% hasta su procesamiento mediante la técnica histológica de hematoxilina-eosina (Bell y Lightner. BCS. a una temperatura de 27 ± 1°C con calentadores de 300 W a una densidad de 200 camarones por tanque. Se analizaron las estructuras sexuales externas (Pérez-Farfante. rostrum-telson). . Japón). 2006) y los órganos internos (King. Las postlarvas. cada cuarto día. hojuelas de artemia y pellets triturados. Campos-Ramos et al. Se realizaron recambios de agua del 50% tres veces por semana.. 1948. la examinación interna y externa se llevó a cabo con un microscopio estereoscópico de disección (Olympus. Tokio. a partir de PL4 hasta PL80. Las postlarvas PL4 hasta PL20 se alimentaron tres veces al día con nauplios de artemia y microencapsulado comercial (250 – 500 µm).

la cual consiste en cortar el tejido de la gónada con un pequeña tijera en 1 ml de solución Triton X-100 (Triton X-100 0. de acuerdo a Campos-Ramos (1997). premuda temprana (Etapa D1). pH 8.2 M). pH 8. se lavaron dos veces en agua destilada. Posteriormente. La primera técnica fue la de secado al aire.5 ajustado con tetraborato de sodio 0.6- diamidino-2-fenilindol). disuelto en NaOH 1 N. Cada grupo de camarones consistió de seis hembras (ovarios) y seis machos (testículos) en cada uno de los siguientes estadios de muda: post-muda tardía (Etapa B). se transfirieron 500 µL de sobrenadante a otro tubo con 500 µL de paraformaldehído (paraformaldehido 4%. Los lóbulos de las gónadas fueron disectados y posteriormente procesados bajo dos técnicas y tres protocolos de tinción. se mezcló suavemente y se incubó por 10 minutos a temperatura . dejando caer y reabsorbiendo inmediatamente el líquido sobre la laminilla previamente calentada a 30°C. que consiste en un shock hipotónico en agua destilada durante una hora con tres cambios posteriores de 15 minutos cada uno en solución fijadora Carnoy (3:1.28 CICLO DE MUDA Y MEIOSIS En camarón blanco. 2001). Los órganos genitales de un grupo control (sin tratamiento) de camarones adultos (25-27 g de peso corporal) fueron disecados después de identificarse los estadios de muda. y la identificación de las etapas meióticas se basó en las descripciones de von Wettstein et al.01 M). (2006) (Figura 16). (1) Las laminillas se tiñeron en orceína (orceína 2% en ácido acético al 45%) por 5 minutos. los estadios de muda se identificaron sobre la base de la descripción de de-Oliveira-Cesar et al. y pre-muda tardía (Etapa D3).5 mL a 4°C. seguido de la disociación de tejido en ácido acético al 50%. (1984) y Loidl (1994). (2) Las laminillas se tiñeron con DAPI (diclorhidrato de 4'. Se prepararon tres laminillas por gónada.2%. Otro grupo se inyectó con colchicina (5 µg/gr de peso corporal) después identificar los estadios de muda. La segunda técnica consistió en una pequeña modificación (adaptada a tejido gonádico de camarón) de la técnica para obtención de CS en tilapia (Campos-Ramos et al. disectándose 8 h después de la inyección.. una en etanol y después se dejaron secar al aire. . metanol:ácido acético) recién preparada y fría. inter-muda (Etapa C). La suspensión celular resultante se dejó reposar por una hora en un tubo de 1.5 ajustado con tetrarborato de sodio 0.

y se dejaron secar al aire dentro en una campana de extracción de humos. (3) Las laminillas se tiñeron con nitrato de plata al 50% (Howell y Black. El promedio de los conteos se determinó a partir de los dos vasos deferentes y los dos espermatóforos de cada camarón. Horsham. Japón). 1980). . ++++ (núcleos abundantes). Sobre tres laminillas se pipetearon 100 µL de la suspensión celular ya fijada. en cada uno de los estadios de muda se obtuvo información cuantitativa de los vasos deferentes y espermatóforos de seis machos. + (núcleos raramente presentes).1 mm de fondo. Tokio. se cortaron en pedazos pequeños y se homogenizaron manualmente en 1 mL de agua de mar filtrada estéril y los conteos de esperma se realizaron con un hemacitómetro (0. dejándolos secar al aire. PA).html). agua destilada y por último con etanol.gov/ij/index. mientras que la determinación del diámetro de los CS se realizó en seis núcleos de cada etapa meiótica (software Image J. En cada estadio de muda se registró la abundancia relativa de núcleos meióticos de la siguiente manera: Ø (sin núcleos presentes).29 ambiente. Las células meióticas se fotografiaron con un microscopio compuesto equipado con fluorescencia y una cámara digital (Olympus. http://rsb. Para contrastar la información cualitativa obtenida de las células meióticas. ++ (pocos núcleos presentes). Los órganos se disectaron.nih. Las laminillas secas se lavaron con agua corriente.info. +++ (núcleos comúnmente presentes). HausserScientific.

30 Figura 16. la flecha señala el vacío de las setas.. se aplicó un trozo de papel absorbente con pegamento instantáneo (Ceys) sobre la herida. para evitar hemorragia. Cada semana se muestrearon aleatoriamente 6 camarones de cada grupo. la flecha señala el lumen de las setas llenas de matriz. etapa D3 (premuda tardía). la flecha señala la formación de nuevas setas. 2006). etapa C (intermuda). Cambios morfológicos en urópodos de L. Tres días después. Imágenes de urópodos a 40X. etapa D1 (premuda temprana). Etapa A (postmuda temprana). Posteriormente. vannamei durante el ciclo de muda. ABLACIÓN DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA Mediante un corte con tijera sobre el pedúnculo ocular se ablacionaron unilateralmente cien camarones machos adultos. se conformaron dos grupos experimentales. la flecha señala la retracción de la matriz del lumen y el comienzo de la formación de conos internos. uno con 50 camarones ablacionados unilateralmente y otro con 50 organismos con ablación bilateral. más un último grupo de 50 camarones no ablacionados (control). a los cuales se les determinó la longitud (cm. a cada . De esta manera. Después del corte. etapa B (postmuda tardía). Los organismos se mantuvieron en estanques cuadrados de concreto en el área de estanques del laboratorio de crustáceos del CIBNOR. la flecha señala la separación entre la cutícula y la epidermis. todos ellos fueron utilizados en este estudio. se realizó la ablación del segundo pedúnculo ocular a cincuenta de estos camarones. en animales de tres meses de edad (tomado de deOliveira-Cesar et al. rostrum-telson) y el peso (g).

1988). PA). Chicago. HausserScientific. la homogeneidad de varianzas. mediante la prueba de Levene con el programa Statistica 8. Adicionalmente. (2011). se fijaron en solución Davidson (Howard y Smith. rosenbergii (FJ409645) y P. 1988) por 24 h y posteriormente en etanol (70%) para ser procesarse por la técnica hematoxilina-eosina (Bell y Lightner.1).1 mm de fondo. se corroboró mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y. se utilizaron los oligos publicados por Banzai et al. el índice genital-somático (peso total del órgano genital/peso corporal) X 100.1). 3) vasos deferentes con las ámpulas terminales. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS La normalidad de los datos del diámetro de los CS.31 camarón se le disectó el órgano genital y se pesaron las siguientes estructuras sexuales: 1) órgano genital. Las diferencias significativas entre los tratamientos se analizaron por medio de la prueba de Tukey. los conteos espermáticos (en cada estadio de muda y en el experimento de ablación) y los pesos registrados del órgano genital. Horsham. el índice del vaso deferente-somático (peso del vaso deferente/peso corporal) X 100. ANÁLISIS MOLECULAR Se diseñaron una serie de oligonucleótidos (Tabla I) con el software Primer3 (http://frodo. El experimento duró seis semanas. monodon (GU208677. Los vasos deferentes con la GA de los camarones analizados en la primera semana. Los datos de cada experimento fueron analizados mediante un ANOVA. Por otra parte.mit. IL). con un nivel de significancia de P < 0. con los cuales amplificaron regiones . utilizando el programa SPSS ver. se registró el peso de los espermatóforos y se realizó un conteo espermático de los mismos mediante un hemacitómetro (0. 2) lóbulos testiculares y.0 (SPSS. Bell y Lightner.edu/primer3/) a partir de las secuencias de la GA de decápodos disponibles en el GenBank: C.05. Se calculó el índice gonadosomático (peso del testículo/peso corporal) X 100. 16. quadricarinatus (DQ851163.wi. 1983. M.

Posteriormente. japonicus basándose en la secuencias reportadas de P. monodon: Jap(F)-CTTCGACTG-CGGTGACATCG y Jap(R)-ACACGTCCGCTGGCTCACGT. se obtuvo ARN total utilizando el método de extracción de tiocianato de guanidina acido-fenol cloroformo (Chomczynski y Sacchi. Tabla I. 1987). a partir de los siguientes tejidos: 1) la parte distal del ámpula terminal (dAT). Inicialmente. 3) vaso deferente distal (VDD).5 µg del ARN total utilizando la transcriptasa reversa cloned AMV (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. 4) la parte distal del vaso deferente medio (dVDM) y testículo (T). 2) la parte proximal del ámpula terminal (pAT). El ADNc se usó como templado para la amplificación mediante PCR con . Oligonucleótidos diseñados a partir de secuencias reportadas de la GA en decápodos.32 específicas de M. se sintetizó la primera hebra de ADNc usando 2.

y un paso de extensión final de 3 min a 72°C. en donde se agregaron 100 ml de Fast Blast DNA Stain 1X (Bio-Rad). 1:1 y 1:0. con los siguientes componentes mostrados en la Tabla II. Después. la secuenciación de los amplicones puros se realizó mediante el metodo dideoxy por el servicio GeneWiz (USA). 35 ciclos de: 30 s a 94°C (desnaturalización). 30 s a 55°C (alineamiento). los geles se observaron y documentaron mediante fotografía digital en un fotodocumentador MiniBIS Pro (DNR). preparadas con Agua Sigma. a 100 V por 30 min. Se prepararon mezclas de 15 µl por reacción para la amplificación. Tabla II. Las secuencias obtenidas se analizaron con el programa Chromas Pro. los geles se trasladaron a bolsas plásticas resellables (Zip-lock).33 los oligonucleótidos diseñados (Tabla 1). La electroforesis de los amplicones se realizó en geles de agarosa-TAE (1. La amplificación del ADNc se llevó a cabo en un termociclador MJ Mini (Bio-Rad). 1:3. respectivamente). Componentes para la reacción de PCR. 1 min a 72°C (extensión). El programa utilizado para las amplificaciones de PCR consistió de un ciclo de 3 min por 30s (desnaturalización inicial). para . se realizó un lavado con agua corriente tibia durante 10 min.5%-1%. Posteriormente. Los productos de PCR se purificaron con el kit Geneclean Turbo (MP). 1:2. en diluciones 1:4. Finalmente. tiñiendose con agitación suave por 5 min a temperatura ambiente.

. para el análisis de alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos deducidas se usó el software Clustal X ver.. 2011). Posteriormente.34 determinar la calidad de los electroferográmas y corroborar ambigüedades en las bases secuenciadas.0 (Tamura et al. Para la elaboración de dendogramas de similitud se utilizó el algoritmo Neighborg-Joining (NJ) implementado en el programa Mega 5.8. usando parámetros estándar. 1.

El órgano genital de cada género se reconoció por completo a través de la disección en PL16. Durante este periodo. Sin embargo. Figura 17. Organogénesis de la gónada (PL12 a PL16) La observación de las laminillas histológicas reveló la ausencia de gónada en PL4 y PL8.35 RESULTADOS ORGANOGÉNESIS Línea de tiempo de eventos durante la diferenciación sexual interna y externa En la Figura 17 se muestra una línea de tiempo con los eventos que conforman el proceso de diferenciación sexual interna y externa en hembras y machos de camarón blanco. Línea de eventos de la diferenciación sexual externa e interna de L. vannamei. en la que se liga cada evento a una figura. a partir de PL12 la gónada se observó como una estructura bilateral localizada dorsalmente en la región anterior del hepatopáncreas. . el peso corporal del camarón osciló entre los 80 – 130 mg con una longitud de 15 – 18 mm (Figura 17).

Morfología del órgano genital Tanto en la hembra como en el macho. PL24. se encuentran ocho lóbulos laterales en hembras. estos lóbulos se encuentran extendidos sobre la superficie del hepatopáncreas por debajo del pericardio. numerados del II hasta el IX. Tubo colector en forma de herradura (hmc). el primer par de lóbulos anteriores está conectado a un tubo colector que se encuentra perpendicular al eje del cuerpo. A lo largo.36 Figura 18. siete lóbulos laterales en los machos. la morfología final de la gónada de la hembra comprende un lóbulo bilateral anterior. vannamei. dejando un espacio evidente entre el tercer y quinto lóbulo. representando la anatomía básica de la gónada. sin dejar rastro de lóbulos rudimentarios (Figura 19 A). En la hembra. numerados del II al VIII. oviducto (ov) y vasos deferentes (vd). el lóbulo bilateral X emerge de la región distal del tubo colector y se desarrolla dorsalmente junto con el intestino a través de los cinco segmentos abdominales durante los siguientes ocho días. Órgano genital de L. en PL28 el cuarto lóbulo no se desarrolló y tuvo una regresión hasta que aparentemente fue absorbido. que se extiende dorsalmente hacia la región posterior del hepatopáncreas formando un tubo en forma de herradura. lóbulos gonádicos (números romanos). y perpendicularmente conectados a este colector. Por lo tanto. siete lóbulos . Adicionalmente. localizado en la región cefalotorácica. Vista ventral de la hembra (A) y de macho (B). además del oviducto bilateral (Figura 18 A). además de los vasos deferentes (Figura 18 B).

Esta estructura se localiza entre los lóbulos VI y VII y continúa lateralmente sobre el hepatopáncreas. además del oviducto (ov) y el tubo colector en forma de herradura (hmc). además del oviducto bilateral (Figura 19 B). las flechas muestran un espacio interlobular que corresponde al cuarto lóbulo. tiene una forma de media luna. el vaso deferente proximal surge de la parte distal del tubo colector “herradura”. Órgano genital de la hembra de L. extendiéndose ventralmente hacia el musculo torácico-abdominal. visto transversalmente. (B) Hembra adulta (28 g) mostrando un lóbulo anterior y siete laterales (números romanos). numerados del II al VIII. En el macho. al nivel del tercer periópodo. lo que le permite distinguirse de los demás lóbulos gonádicos (Figura 20 C). Figura 19. (A) Vista ventral del órgano en una hembra juvenil PL80 (3 g). detrás . Desarrollo temprano de la gónada (PL12 a PL28) La morfología inicial del lóbulo anterior indiferenciado está compuesto por células ordenadas en forma irregular (Figura 20 A). vannamei. y del IX lóbulo bilateral distal abdominal. las que para PL28 se forman en grupos de células en todos los lóbulos gonádicos (Figura 20 B). Histología del oviducto y del vaso deferente El oviducto bilateral es un tubo colapsado que.37 laterales bilaterales.

mientras que en machos esta articulación presenta una muesca en su región distal. descendiendo posteriormente en paralelo con la aorta. Se extiende hacia arriba y hacia los lados. formando tres o cuatro setas proximales en su borde. el protopodito del primer par de pleópodos tiene una articulación rectangular. sin notarse aún ningún bulbo eyaculador medio. . rodeado por un tejido conectivo suelto indiferenciado (Figura 20 D). 2) En hembras. En machos. y están compuestos de células epiteliales columnares con un lumen. y el endopodito se mantiene como un apéndice tubular. el endopodito de la hembra se amplía en la parte externa proximal-media. cuando la región anterior se observó más amplia. En el transcurso de los días. que posteriormente forma el petasma. El desarrollo temprano de los vasos deferentes se observó después de PL36. Cada vaso deferente se extiende hacia el empalme de los músculos torácico-abdominal y el flexor oblicuo abdominal. diferenciándose en un vaso deferente medio que funciona como bulbo eyaculador. Se observaron dos características externas importantes: 1) el endopodito que surge como una pequeña protuberancia con una o dos setas apicales. Diferenciación sexual externa temprana (PL32 a PL44) La diferenciación sexual externa temprana comienza alrededor de PL32. el peso corporal oscila entre 180-280 mg y la longitud entre 25-35 mm. Los vasos deferentes son filiformes. que corre hacia abajo en el lado izquierdo del cuerpo entre el musculo torácico-abdominal y el intestino. formando una estructura columnar y un septum longitudinal que divide al tubo en una gran cámara lineada por epitelio y con otra cámara pequeña incompleta (Figura 21). descendiendo lateral y directamente como vaso deferente distal que alcanza ventralmente la región interna de la base del quinto periópodo como una ámpula terminal primordia.38 del hepatopáncreas. manteniendo las apicales. en el endopodito se forman una o dos setas proximales y apicales que se pierden durante las siguientes mudas.

39 Figura 20. . con un peso corporal entre los 0.6 g y una longitud entre los 45-50 mm. Aorta (a). semi-arreglos de células mesodérmicas (sgc). En hembras. intestino (i).5-0. hepatopáncreas (mg). en el télico se comienzan a formar un par de crestas afiladas y oblicuas. paquetes de células mesodérmicas (cgc). Corte longitudinal del lóbulo gonádico anterior en PL18 (A) y PL28 (B). Corte longitudinal de la región cefalotorácica posterior y abdominal anterior de machos PL32 (D). vannamei. oviducto (vd) y vaso deferente proximal (vdp). en el segundo par de pleópodos. Diferenciación sexual externa subsecuente (PL44 a PL48) La diferenciación sexual externa continua en PL44. en la coxa de quinto periópodo y los apéndices masculinos. Órgano genital de L. lo que es característico de la especie. músculo torácicoabdominal (tam). Corte transversal del oviducto localizado en la parte postero-lateral del hepatopáncreas en hembras PL40 (C). mientras que en machos comienzan a desarrollarse los gonoporos. músculo flexor-abdominal oblicuo (ofam).

Desarrollo del epitelio germinal y diferenciación sexual de la gónada (PL52 a PL72) Los grupos de células que se formaron en la gónada se diferencian en epitelio germinal a partir de PL52. las células primordias de la GA se forman a partir de PL45. aparentemente sujetas por un tejido conectivo fibroso fino en la pared externa-posterior de cada vaso deferente. el tejido conectivo suelto se diferencia en un tejido adiposo blanco. unidas en línea. y forman una estructura tubular ovalada donde las . pared posterior externa (pew) y vaso deferente (vd). células de la glándula androgénica (agc). vannamei.40 Organogénesis de la GA y del tejido adiposo blanco (PL48 a PL50) En los machos. Vaso deferente de L. el musculo torácico-abdominal. Figura 21. el lado que encara al músculo abdominal oblicuo (Figura 21 A). Las células germinales son más grandes y más redondas que las células originales. llenando la cavidad que se encuentra entre la región posterior del hepatopáncreas. tejido adiposo blanco (wat). Corte longitudinal de los vasos deferentes en macho PL44 (A) y en PL52 (B). el intestino y el área que rodea la aorta en el lado izquierdo del cuerpo. en hembras y machos. Poco después (PL52) las células ovaladas se acumulan en esta área formando el tejido de la GA (Figura 21 B). Durante este tiempo. Los núcleos de estas células se desplazan hacia la periferia por el alto contenido graso en el citoplasma (Figura 21). Células androgénicas primordias (pagc).

La flecha muestra en (A) ovocitos en forma triangular o de pera (ooc). Por otro lado. los espermatocitos primarios del macho. lo que la caracteriza como una gónada femenina (Figura 22 A) a diferencia de una gónada masculina (Figura 22 B). los cuales comienzan un crecimiento previtelogénico primario a partir de PL72. producen las espermátidas que se transfieren hacia el lumen del lóbulo testicular. Desarrollo subsecuente de los vasos deferentes y de la glándula androgénica En camarones juveniles la apariencia externa de la GA fue difícil de observar debido a que en organismos en este estadio la glándula es minúscula y transparente. Gónada de L.2 g y una longitud de 70-74 mm. vannamei. durante esta etapa la disección de cualquier lóbulo testicular mostró solo un túbulo seminífero largo. En las hembras. los ovocitos alcanzan un mayor tamaño y toman una forma triangular o de pera. Corte longitudinal de la gónada de la hembra (A) y del macho (B) en PL72. la gónada se encuentra aún sin diferenciarse. Sin embargo. Sin embargo. Figura 22. La diferenciación de la gónada ocurre cuando ambos sexos alcanzan un peso entre 1. y en (B) la espermatogonia (sper) alrededor del lumen (L).41 células gonádicas se encuentran en la periferia rodeando al lumen.8-2. Las células secundarias gonádicas se transforman en ovocitos primarios. son redondos y se encuentran estrechamente acomodados. llenando y expandiendo los lóbulos que caracterizan al ovario. el desarrollo de tejido conectivo fue evidente en la .

0. un adulto de 26 g (B). lóbulos testiculares (tl). bulbo eyaculador anterior (aeb).42 región media de los vasos deferentes. 1988). Durante el crecimiento del macho. Cada uno de los vasos deferentes medios incluyen un bulbo eyaculador anterior y posterior (Figura 23 B y C). grande y doblado. vannamei.5 g (A). Detalle de los vasos deferentes de B (C). Tubo colector herradura (hmc). En camarones .octavo lóbulo testicular (etl). Figura 23. tomando forma de herradura o de una “U” invertida (llamado de “doble fijado” por Treece y Yates. Órgano genital de macho de L. vaso deferente distal (dvd) y ámpula terminal (ta). vaso deferente proximal (pvd). El tejido conectivo del vaso deferente se encuentra también sujeto al octavo lóbulo testicular. Vista ventral del órgano genital del macho en PL48. en paralelo (Figura 23 A). bulbo eyaculador posterior (peb). vaso deferente medio (mvd). la parte media del vaso deferente continua su desarrollo hasta convertirse en un vaso deferente medio. lo que indica la localización de la supuesta GA. lo que permite que el vaso y el testículo se encuentren juntos.

del vaso deferente distal. Anatomía externa del vaso deferente medio en macho adulto mostrando la interconexión a través de un tejido conectivo (ct) entre la región distal del bulbo eyaculador posterior (peb). conectando la parte distal del bulbo eyaculador posterior con el octavo lóbulo testicular (Figura 24 A y B). Figura 24. la cual expandió su localización a lo largo. En el experimento de ablación del pedúnculo ocular que se detalla más adelante. la GA se observa como una masa delgada y compacta con células ovaladas con un núcleo prominente. Vaso deferente medio de L. la GA se muestra como un cordón inmerso en el tejido conectivo. se observó hipertrofia de la GA.43 pre-adultos y adultos. rodeando el ámpula terminal y ensanchándose en su parte distal (Figura 25). Levantamiento del bulbo eyaculador posterior (A) y disección junto con el octavo lóbulo testicular (B). vannamei. la glándula androgénica (ag) y el octavo lóbulo testicular (etl). Posterior a la disección del vaso deferente. y por la parte interna. . bajo examinación histológica.

vannamei. Barra = 500µm. Vaso deferente de L. .44 Figura 25. Histología del vaso deferente distal (VDD) y ámpula terminal (AT). Las flechas indican el cordón de la glándula androgénica (GA).

Las etapas de cigoteno (Figura 26 A y B). en donde se observaron completamente unidos (sinapsis). caracterizada por los bivalentes en completa sinapsis. en contraste con los bivalentes en la etapa de paquiteno. La etapa de cigoteno se diferenció de la de paquiteno ya que los cromosomas homólogos aún no se encontraban en completa sinapsis. los bivalentes. diploteno temprano (+) y diploteno-diaquinesis (++). Ambos sexos del camarón mostraron todas las etapas de la meiosis I. mostraron núcleos en cigoteno (++). paquiteno (++++). Las ovogonias (++) y espermatogonias (+++) se observaron en todos los estadios de muda. paquiteno (Figura 26 C y D). En ambos sexos. previamente habiendo fijado los tejidos con paraformaldehído. Sin embargo. en ambos sexos en todos los camarones analizados. en el grupo tratado fue más fácil de encontrar la etapa de diploteno. . exceptuando la etapa de leptoteno (Ø). En el camarón. y solo los machos presentaron algunas núcleos mitóticos conteniendo 88 cromosomas (Figura 28 C y D). revelando una alta densidad de cromatina y un arreglo complejo.45 CICLO DE MUDA Y MEIOSIS La mejor técnica para la observación de los complejos sinaptonémicos (CS) fue la de secado al aire. la mayoría de las células meióticas se identificaron en la etapa de paquiteno. diploteno temprano (Figura 27 A–D) y diploteno-diaquinesis (Figura 28 A y B) se observaron en los estadios de post-muda. inter-muda y pre-muda. con tinción de orceína. Tanto el grupo control como el tratado con colchicina. Los CS no se observaron con la tinción de DAPI ni con la de nitrato de plata. Durante cigoteno. la naturaleza de los CS observados muestra a los cromosomas homólogos en sinapsis. un tanto desorganizado dentro del núcleo. La etapa de diploteno se observó más nítida bajo las técnicas de tinción de orceína y DAPI que con la de nitrato de plata. se observaron más delgados y más largos que en paquiteno por su poca condensación de cromatina.

Sinapsis completa en paquiteno (flechas dobles). vannamei. Se observan los elementos laterales. Cromosomas en cigoteno y paquiteno de L. y en etapa de paquiteno en hembra (C) y macho (D). Técnica de tinción: orceína. aparentemente de un extremo a otro (flechas grandes). La sinapsis ocurre a manera de un “cierre” en una sola dirección. . en donde los cromosomas homólogos aún no han hecho sinapsis (flechas pequeñas). Complejos sinaptonémicos “enredados” en etapa de cigoteno de hembras (A) y machos (B).46 Figura 26. Barra = 10 µm.

DAPI. orceína. Técnica de tinción: A.47 Figura 27. vannamei. . B y D. C. mostrando 44 bivalentes. Barra = 10 µm. Cromosomas en diploteno de L. Hembra (A y B) y macho (C y D) en etapa temprana de diploteno.

ocurre una reducción en el diámetro de los núcleos. orceína. Conforme la primera profase meiótica avanza hacia la etapa de diploteno. Cromosomas mitóticos (C y D). vannamei. Barra = 10 µm.48 Figura 28. Cromosomas en diploteno avanzado y en mitosis de L. En esta etapa fue posible determinar el número haploide de 44 cromosomas. dejando a los cromosomas homólogos unidos solo por los quiasmata (puntos de recombinación). C y D. Los núcleos de diploteno (en ambos sexos) presentaron 44 bivalentes. No se observaron diferencias significativas en el diámetro de los núcleos entre ambos sexos: cigoteno . DAPI. ya que el núcleo se encontraba con el grado de condensación más alto de bivalentes. Técnica de tinción: A. de los que ~40 presentaron forma de anillo y el resto una forma de “v”. B. Hembra (A) y macho (B) en etapa avanzada de diploteno. mostrando 44 bivalentes.

Las espermátidas (++++) y el esperma inmaduro (++++). Conteos espermáticos (Media±ES) en los vasos deferentes y en espermatóforos durante el ciclo de muda de L. paquiteno (66 ± 9 µm en hembras.49 (p=0.26). paquiteno (p=0. 60 ± 8 µm en machos) y diploteno (42 ± 10 µm en hembras. 88 ± 15 µm en machos). vannamei. llegando a decrecer el diámetro de los núcleos (a lo largo de las etapas) alrededor del 50% (Figura 29). .19) y diploteno (p=0.39). así como ovocitos previtelogénicos (+++) fueron observados comúnmente durante todo el ciclo de muda. Figura 29. 38 ± 8 µm en machos).34) y espermatóforos (p=0.25) no fueron significativamente diferentes durante los estadios de muda (Tabla III). Diámetro de los núcleos (Media ± DS) en etapas de cigoteno. paquiteno y diploteno en hembras y machos de L. Tabla III. La media en diámetro de los núcleos disminuyó gradualmente a partir de cigoteno (95 ± 16 µm en hembras. vannamei. Los conteos espermáticos en los vasos deferentes (p=0.

3ª: p=0.01) semanas (Figura 30 B).04).01) y cuarta (p=0. con respecto a los camarones ablacionados unilateralmente (referenciado como unilateral) y los organismos control.04) semanas se incrementó significativamente el grupo bilateral. se incrementó significativamente en los machos ablacionados bilateralmente (referenciado como bilateral) en la primera (p=0. 4ª: p=0.50 ABLACIÓN DEL TALLO OCULAR E HIPERTRÓFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA Los resultados del bioensayo de ablación del pedúnculo ocular mostraron que el peso total del órgano genital. En la tercera semana no se observaron diferencias significativas (p=0.01.36) (Figura 30 A).03). . mientras que en la sexta semana ambos grupos fueron similares (p=0.04) semanas de cultivo. mientras que el peso promedio del órgano genital de los organismos con ablación bilateral fue significativamente mayor (p=0. En la quinta semana de cultivo se observó un incremento significativo del órgano genital en el grupo unilateral con respecto a los controles (p=0. que solo en la primera (p=0.42) entre los tres grupos. Los resultados del índice genital-somático ajustan el peso del órgano genital respecto al peso corporal.04) que el control en la tercera semana del cultivo (Figura 31 A). respecto a los grupos unilateral y control.04) que el de los controles (Figura 30 A). Respecto a los resultados del peso de los testículos. respecto al grupo unilateral y control. Sin embargo.04) y quinta (p=0.04. se observó que en el grupo bilateral se incrementó significativamente en la segunda (p=0. sin embargo. en la cuarta semana los grupos bilateral y unilateral fueron similares (p=0.02). mientras que el unilateral lo fue únicamente en la primera (p=0. Cabe señalar que el grupo de camarones bilateral tuvo una alta mortalidad y más allá de la cuarta semana de experimentación ningún organismo sobrevivió. el grupo bilateral fue significativamente mayor (respecto a los controles) en cada una de las cuatro semanas (1ª: p=0.01. y se observó. mientras que en la tercera semana. en ambos grupos ablacionados. 2ª: p=0. El grupo unilateral fue significativamente mayor (p=0.03) y segunda (p=0.01) semanas.01) y cuarta (p=0. el peso de los testículos fue significativamente mayor que el de los del grupo control (p=0.35).

.51 Figura 30. bilateralmente y controles. Semana (S). Letras minúsculas diferentes denotan una diferencia significativa. Comparación del peso del órgano genital e índice genital-soático entre camarones ablacionados unilateralmente.

Al ajustar el peso del vaso deferente con respecto al peso corporal.01). el índice del vaso deferente- somático mostró un patrón muy similar al anterior (Figura 32 B).93) en los tres grupos (Figura 33 A).01) y cuarta (p=0. disminuyendo a valores similares en la sexta semana (Figura 32 A).52 Al ajustar el peso del testículo con respecto al peso corporal. Cabe señalar que tanto en el peso testicular así como en el índice gonadosomático del grupo control mostró una oscilación bien marcada: de forma descendente durante las primeras dos semanas.01) y que se mantuvieron de esta forma una semana posterior en el grupo unilateral. El peso del espermatóforo mostró una tendencia ligera de incremento hacia la cuarta semana de cultivo. Los resultados del peso del vaso deferente mostraron que no es sino hasta la cuarta semana que existió un incremento similar entre los grupos ablacionados. seguida de una ligera disminución hacia la sexta semana. los datos no mostraron una diferencia significativa (p=0. Sin embargo. mientras que en la tercera semana no existió una diferencia significativa entre los tres grupos (p=0. el grupo bilateral aumento significativamente (p=0. respecto a los grupos unilateral y control. El conteo de esperma mostró que solamente en la cuarta semana. los cuales se mantuvieron en ~2 x 106 cel/espermatóforo durante las seis semanas de cultivo (Figura 33 B).5 x 106 cel/espermatóforo al día cero hasta ~6 x 106 cel/espermatóforo con respecto al grupo unilateral y control. segunda (p=0.66) (Figura 31 B). el índice gonadosomático del grupo bilateral mostró un incremento significativo en la primera (p=0.01) de 1. y descendente durante la quinta y sexta semanas (Figura 31 A y B).01) semanas de cultivo. ascendente durante la tercera y cuarta. los cuales fueron significativamente más altos que el control (p=0. .

. Comparación del peso del testículo e índice gonadosomático entre camarones ablacionados unilateralmente. Letras minúsculas diferentes denotan una diferencia significativa.53 Figura 31. Semana (S). bilateralmente y controles.

Semana (S). Letras minúsculas diferentes denotan una diferencia significativa. bilateralmente y controles.54 Figura 32. Comparación del peso del vaso deferente e índice vaso deferente entre camarones ablacionados unilateralmente. .

55 Figura 33. bilateralmente y controles. . Comparación del peso del espermatóforo y conteo espermático entre camarones ablacionados unilateralmente. Semana (S). Letras minúsculas diferentes denotan una diferencia significativa.

Cortes histológicos del vaso deferente y GA en el camarón una semana después de la ablación. como templado para la amplificación (Figura 35). la GA incrementó el número de células en la parte distal del vaso deferente medio y en el ámpula terminal. se obtuvo cuando se usó ADNc de tejido de la ámpula terminal (AT) y de la parte distal del vaso deferente medio (dVDM) del camarón macho. Efecto de la ablación en L. Barra = 100 µm. lo cual denotó una hiperplasia producida por la ablación (Figura 34). tanto en el grupo de ablación unilateral como en el grupo bilateral. En los cortes histológicos se logró observar que después de una semana. ANÁLISIS MOLECULAR Mediante RT-PCR/secuenciación se obtuvo un fragmento de la secuencia de nucleótidos de la hormona de la GA de L.56 Figura 34. . vannamei (Lv-IAG) utilizando los oligonucleótidos mono3F-mono3R (Tabla I). vannamei. Este fragmento de aproximadamente 360 pb (~120 aa).

destructor (EU718788.1). rosenbergii (FJ409645). carril 4) y testículo (T). japonicus. 39% con P. pacificus (AB588014. lar (AB579012. Escalera (E). Gel de agarosa-TBE 1.1). 55% con M. paucidens (AB588013) y 39% con P. RT-PCR de L.5% teñido con Fast Blast DNA Stain (Bio-Rad). monodon (GU208677. ámpula terminal proximal (ATP). japonicus (AB598415.1).1) se encontró una identidad del 80%. 33% con C. 76% con M. vaso deferente distal (VDD). . vannamei usando como templado ARN total de diferentes tejidos del vaso deferente.57 Figura 35. monodon y un 80% con la de M.1). parte distal del vaso deferente medio (dVDM.1). El análisis de alineamiento de la secuencia nucleotídica de L. A partir de la secuencia de nucleótidos Lv-IAG se dedujo la secuencia de aminoácidos que mediante análisis de alineamiento (Figura 36) con las secuencias de decápodos reportadas se obtuvo que: con P. mostró que existe un 87% de identidad con aquella reportada para P. vannamei realizado con el programa Mega 5. 37% con M. 38% con C. quadricarinatus (DQ851163. 30% con P.1).0. pelagicus (HM459854. ámpula terminal distal (AT).

en cajas se señalan los residuos de cisteína conservados.58 Figura 36. Las flechas indican el término del péptido señal. 1. Análisis de alineamiento de secuencias de aminoácidos de la HGA reportadas en decápodos. y en líneas los puentes de disulfuro predichos (sitios de unión de las cadenas A y B). con parámetros estándar.8. . Análisis realizado con ClustalX ver.

.000 réplicas de remuestreo (bootstrap). basado en las secuencias de aminoácidos de la HGA de L.0 (Tamura et al. . sin raíz. Dendrograma consenso de similitud. Algoritmo Neighborg-Joining (NJ) y método p-distance del programa Mega 5. 2011). vannamei y otros crustáceos decápodos.59 Figura 37. Soporte estadístico calculado mediante 10.

En ambos sexos. En cambio. sin embargo. Chow et al.. (1990) no concuerdan con nuestras observaciones. 1991). Aparentemente.60 DISCUSIÓN ORGANOGÉNESIS La anatomía del órgano genital en machos de L. Chow et al. la notoria separación entre el tercer y cuarto lóbulo (ver Figura 19 A en hembras y Figura 18 B en machos) pudiera sugerir que el cuarto lóbulo bilateral se forma junto con las primeras capas de células mesodérmicas que dan la estructura a cada lóbulo gonádico. esta anatomía no ha sido estudiada en otras especies. Campos-Ramos et al. este lóbulo sufre una regresión.. La regresión de este lóbulo no es clara. el órgano genital de las hembras de L. si el cuarto lóbulo se desarrollara. (1991). con los pocos estudios acerca de la morfología externa e interna. japonicus de Chim (1983) y con las de L. Se sugiere que tanto para M. sería más largo y externo que los otros lóbulos.. el tiempo en que la postlarva se mantiene indiferenciada es muy corto después de la . vannamei concuerda con las descripciones de M. de los peneidos descritos por King (1948) y Dall et al. dada la dificultad del análisis de todo el órgano genital durante estas primeras etapas de desarrollo. Laubier et al. 1983. vannamei y. Charniaux- Cotton y Payen. vannamei. no hay diferencia en el desarrollo de los lóbulos gonádicos. setiferus de Chow et al. 2006). posiblemente por la morfología y desarrollo del hepatopáncreas. Ambos sexos tienen una anatomía básica de lóbulos bilaterales anteriores y lóbulos laterales independientes. 1983. y de la diferenciación sexual en peneidos (Chim. 1983. concuerda en lo general. la posición física del cuarto lóbulo coincide con el eje más ancho y alto del hepatopáncreas anterior. Sin embargo. 1991. 1992. esta estructura es única para especies de peneidos (Laubier et al. una vez que se desarrolla la gónada en cada sexo. en general. 1985. Nakamura et al. vannamei y L.. La descripción de la organogénesis genital aquí detallada. japonicus como para L... acomodados simétricamente a cada lado de un tubo colector en forma de herradura. por lo tanto. Desde un punto de vista anatómico.

En contraste. los grupos de células que se acumulan en los lóbulos gonadales son células mesodérmicas. Las células de la GA pudieran originarse a partir de las células mesodérmicas que forman el tejido conectivo. 1992). las células primordias de la GA se diferencian independientemente del tejido conectivo suelto. indicando el tiempo de diferenciación de la gónada. 1994. además de la aparición interna de la GA. el cual mantiene a los lóbulos testiculares debajo del pericardio. De acuerdo con Charniaux-Cotton y Payen (1985). Sin embargo. en sincronía por el desarrollo externo del télico de la hembra y de los gonoporos del macho. La GA está inmersa dentro de un tejido conectivo que interconecta a los vasos deferentes y el octavo lóbulo testicular. las primeras estructuras gonádicas que se observaron fueron los lóbulos bilaterales anteriores. mientras que los oviductos y vasos deferentes crecen a partir del tejido del órgano genital que se diferencia a epitelio columnar. hasta cierto punto. japonicus (Nakamura et al. Aparentemente. el que a su vez se diferencia en ambos sexos en tejido adiposo-blanco alrededor del intestino y del hepatopáncreas.5 g y una longitud de 45 mm.5 g y 45 mm). 1992). Para PL52 (0. nuestra primera identificación del oviducto y de los vasos deferentes ocurre hasta PL16. la diferenciación sexual externa se lleva a cabo hasta que el camarón alcanza un peso de 0. aproximadamente en PL50. japonicus (Nakamura et al. La organogénesis de la GA en L. vannamei. estos grupos de células forman estructuras tubulares ovaladas donde las gonias se reúnen alrededor de un lumen. lo que indica una zona germinal. En L. como se observa en M. De acuerdo a Laubier et al. japonicus (Charniaux-Cotton y Payen. De PL68 a PL72 (≈ 2 g y ≈72 mm). estos autores encontraron el órgano genital completo del macho en PL11.61 metamorfosis larval. ocho días más tarde de lo que se reporta en M. lo cual coincide con el desarrollo de M... 1985) o en L. 2006). .. vannamei (Alfaro. Esta etapa está representada y. (1983). Campos-Ramos et al. vannamei comienza en la región lateral- posterior de cada vaso deferente y el ámpula terminal. detalle no observado previamente en M. japonicus por Nakamura et al. a partir de PL12. los camarones muestran ovocitos primarios en desarrollo. (1992). en PL8 la gónada aparece primeramente como dos masas de células germinales asociadas con células somáticas.

existe evidencia que en dos especies de peneidos esta glándula no está involucrada en la diferenciación y determinación sexual. Sin embargo. también se encontró que la diferenciación externa ocurre durante el mismo tiempo bajo dos condiciones de temperatura diferentes (27° y 32°C). envuelta y almacenada en el ámpula terminal. Por lo tanto. L. vannamei posee un sistema de determinación sexual genético estable no influenciado por condiciones medioambientales. Es necesario identificar las estructuras sexuales internas y externas.62 Como lo describe King (1948). donde la espermatogénesis continua. los machos también tiene un ciclo de muda reproductivo. en donde las células sustentaculares (soporte epitelial) juegan el papel de expandir y contraer el lumen comenzando un nuevo ciclo de producción de espermatocitos primarios por la espermatogonia. Aunque la GA es única para malacostracos. llamada fase cuerda. si es que no existiera un comportamiento reproductivo. el tamaño no debe tomarse como factor para la determinación sexual. el ciclo de producción de gametos. ya que el . independiente en cada túbulo seminífero. De acuerdo con Campos-Ramos et al. De acuerdo con Chow et al. es donde la espermatogénesis esta soportada por las células sustentaculares multifuncionales y generan las espermátidas tardías. (1991). en la segunda es la fase lumen. en machos las espermatogonias se reúnen en la periferia del lóbulo testicular. es en la que las células sustentaculares se retractan y se alinean para formar una cavidad donde las espermátidas tardías se transfieren al vaso deferente posterior. mientras que en el lumen se acumulan espermatocitos secundarios y espermátidas. la primera fase. La masa espermátida-espermatozoide se transporta a lo largo del vaso deferente. y que también la diferenciación en condiciones de temperaturas menores (18°C) y condiciones biológicas y ambientales desfavorables pudieran retrasarla. formando el espermatóforo que será expulsado a través de los gonoporos y renovado cada ciclo de muda. De acuerdo a Parnes et al. Inicialmente. El tamaño de los camarones sirvió de guía para el seguimiento al desarrollo sexual bajo las condiciones de crianza de ese estudio. donde el tamaño del camarón fue variable. (2006). posteriormente. (2006). las cuales se resumen en la figura 17. consta de dos fases características.

o algún otro proceso regulatorio de inhibición del ovario. trabajos previos y el que aquí se presenta deberán tomarse en cuenta. En contraste. 2006). 1990. rosembergii. como se reporta para C. poco después de la transformación larval.. 1980a. quadricarinatus (Khalaila et al. Li y Xiang (1997) trataron de revertir el sexo en F.63 sexo se diferencia antes de que esta se desarrolle. ciertamente.. la aparición de características secundarias sexuales y la inhibición de la vitelogénesis. 2002). Sagi et al. ya que la gametogénesis comienza después de que la GA se forma. mientras que en machos juveniles la andrectomía induce a la feminización (vitelogénesis). en el camarón blanco cuando se observa la diferenciación externa. rosembergii. cualquier procedimiento quirúrgico de los vasos deferentes o la implantación de GA a las hembras. en ambos sexos de L. la GA está involucrada con el eje endocrino tallo ocular–GA– testículo. Aún se desconoce si la implantación y andrectomización de la GA en camarones tenga éxito para promover la reversión sexual. En este trabajo se concluye que. En teoría. Como se muestra en este estudio. Aflalo et al. Probablemente. En langostinos en hembras implantadas con GA se ha observado una inducción de la masculinización. Este experimento fallido puede relacionarse con la falta de conocimientos adecuados del proceso de diferenciación sexual en peneidos comparados con los de langostinos.. la diferenciación externa se desarrolla alrededor de 15-20 días antes de la diferenciación de la gónada. ya hay evidencia de que en peneidos. la interconexión entre los vasos deferentes y el testículo está relacionada con la espermatogénesis y la maduración del testículo. . Esta estrategia de inducción de la reversión sexual para producir cultivos monosexuales en langostinos como en M. comprometerá el camino de la diferenciación de la gónada. que es básicamente el mismo principio biotecnológico de reversión sexual utilizado en M. vannamei. está bien documentada en la literatura (Nagamine et al. chinensis sin obtener resultados.. b.

64

CICLO DE MUDA Y MEIOSIS
En el camarón blanco, las células meióticas en la gónada mostraron las

características generales de la primera profase observadas en eucariontes. Los CS
de las células gonádicas se obtuvieron bajo la técnica de secado al aire, usando
Carnoy como fijador y orceína como tinción, gracias a la alta densidad de

cromatina de los bivalentes. Esta técnica fue más fácil de procesar en comparación

con la de fijación con paraformaldehído y plata como tinción, lo que es
comúnmente utilizado para el estudio de varias especies. En términos de esparcir
los núcleos, las técnicas utilizadas fueron útiles para separar los bivalentes. La gran
cantidad de bivalentes con un arreglo enredado en el núcleo, no permitió la

medición y reconocimiento de cada bivalente, y mucho menos, de un bivalente
relacionado con el sexo, si es que existiera. Por este arreglo desordenado de los CS

y la baja resolución de las técnicas, no se pudieron observar otras estructuras de
los bivalentes, como cinetocoros y placas de anclaje. En ambos sexos, la mayoría de

las células meióticas se observaron en paquiteno, reconocida por la completa
sinapsis de los bivalentes, lo cual soporta las observaciones histológicas de
Heitzmann et al. (1993) en machos de L. vannamei. Xie et al. (2008), al analizar

mediante microscopia electrónica de barrido los CS de F. chinensis diploides y

triploides, observaron el mismo arreglo enredado de bivalentes sin revelar más

características. Los autores acentuaron lo extremadamente difícil que es localizar
un núcleo bien disperso para analizar. Dado lo anterior, se requiere de una mejora

a la técnica en gónada de camarones, específicamente, un método para dispersar
los bivalentes.

En este estudio se encontró que en hembras de L. vannamei el comienzo de

la meiosis I es continuo, por lo tanto, ocurre de manera independiente de la

vitelogénesis, la maduración final y el desove, y por consiguiente del ciclo de muda.

Hertzler (2005) ha documentado hembras en desove la fase de arresto de los
ovocitos en metafase I. De acuerdo con los resultados obtenidos en los estudios de

organogénesis, el crecimiento primario previtelogénicos en la hembra del camarón
blanco ocurre alrededor de PL70, lo cual distingue la diferenciación gonádica de la

hembra. Es por eso que se sugiere que la meiosis I ocurre después de la

65

diferenciación ovárica en juveniles y que el ovario continúa almacenando ovocitos
arrestados en el crecimiento previtelogénico. En edad adulta, y bajo condiciones

reproductivas, ocurre la maduración del ovocito secundario (vitelogenina) y en el
momento del desove, el ovocito continua con la meiosis. La separación del primer

cuerpo polar meiótico es evidente alrededor de los siete minutos después de la
ovulación en el camarón blanco (Dumas y Campos-Ramos, 1999). De acuerdo con

Bernhard (1990), en la mayoría de los invertebrados existe un arresto de ovocitos

en metafase I, incluyendo artrópodos, anélidos y algunos moluscos y tunicados.
Algunos reportes indican que en decápodos hembras, la meiosis I en los ovocitos
comienza en el momento del desove (Qiu, 1986; Yano, 1988); esto todavía se
encuentra en controversia y requiere de confirmación.

El presente estudio, también confirma que en machos la meiosis

(espermatogénesis) de L. vannamei es continua, y no se relaciona con las etapas de

muda, lo cual concuerda con las observaciones de Heitzmann et al. (1993). Por lo

tanto, la producción de gametos por la meiosis (no relacionado con la muda) y la
liberación del esperma caduco (relacionado con la muda) son dos procesos
fisiológicos diferentes (Heitzmann et al., 1993; Parnes et al., 2006). En otros

decápodos, como en el langostino M. rosenbergii de morfotipo tenaza roja, la

síntesis de ADN en testículo en la etapa de pre-muda es al menos tres veces mayor

cuando se compara con la etapa de inter-muda del morfotipo tenaza azul (Sagi et

al., 1988, 1991). También en esta especie, las etapas de la profase I coinciden con

los estadios de la muda (Poljaroen et al., en prensa). Por lo tanto, no existe ninguna
regla general que indique que la espermatogénesis es continua en todas las
especies de decápodos.

El genoma diploide en el camarón blanco está compuesto por 88

cromosomas (Campos-Ramos, 1997), y su número haploide consta de 44
bivalentes (Chow et al., 1990; Campos-Ramos, 1997; Alcivar-Warren et al., 2006).

De acuerdo a Campos-Ramos (1997), el cariotipo tentativo es 4m + 10sm + 56st +

18t. La mayoría de estos cromosomas son subtelocéntricos y telocéntricos (37
pares), los cuales aparentemente tienen una configuración de anillo durante la fase
temprana de diploteno lo que representa dos intercambios o “crossovers” por

66

bivalente por meiosis. Los otros siete pares de cromosomas que presentan una
configuración tipo “v” y donde ocurre un solo intercambio, pudieran ser

metacéntricos o submetacéntricos. Estas observaciones sugieren que en ambos

sexos existe recombinación en la mayoría de los bivalentes, lo que es un escenario
común en animales gonocóricos, ya que la meiosis aquiasmatica raramente se
presenta. Marcadores ligados al sexo mapeados en el genoma materno de M.

japonicus (Li et al., 2003b) y de L. vannamei (Zhang et al., 2007) sugieren que existe
un bivalente involucrado a la determinación sexual, lo que implica que la hembra
es el sexo heterogamético en estas especies.

La determinación sexual en crustáceos gonocóricos es principalmente a

través de cromosomas sexuales (Charniaux-Cotton, 1960; Ginsburger-Vogel y

Charniaux-Cotton, 1982). Se ha encontrado evidencia de genes ligados al sexo
mediante el fenotipo ojo-blanco de la Artemia franciscana (Kellogg) bisexual, el

cual está ligado al sexo de la hembra en el cromosoma W (Bowen, 1963; 1965;
Bowen et al., 1966). Entre los cromosomas, la recombinación obligada es durante

la profase I (paquiteno), mientras que la restauración del cigoto diploide WZ toma

lugar durante la segunda división meiótica en Artemia parthenogenetica (Bowen y
Sterling, 1978; Campos-Ramos et al., 2006b). Al parecer, en langostinos y
camarones peneidos, también es común la determinación sexual de tipo WZ.

En camarones marinos, como F. chinensis (Li et al., 2003a) y M. japonicus

(Coman et al., 2008) se ha logrado exitosamente la inducción a la triploidía. Li et

al. (2003a) observaron un sesgo hacia hembras en proporción 4:1 en camarones

triploides. Coman et al. (2008) observaron una población triploide de puras

hembras y plantearon que no era posible explicar el mecanismo de determinación
sexual, como se describe en peces. Ellos propusieron un cromosoma W
sobredominate y un genotipo letal ZZZ. Esta explicación pareciera controversial ya

que el camarón macho triploide si existe, como se encontró en F. chinensis con

citometría de flujo (Li et al., 2003a) y con el análisis de CS (Xie et al., 2008). Una
alternativa a la hipótesis de los genotipos dominantes y letales, es la
recombinación entre cromosomas sexuales, ya que explica mejor el sesgo en la

proporción hacia hembras, como se muestra en especies de peces que tiene un

Estas observaciones están de acuerdo con Khalaila et al.. El incremento en el peso de los vasos deferentes se atribuyó a que las espermátidas producidas en los lóbulos testiculares. De esta manera. los camarones bilaterales ya habían muerto por lo que no fue posible continuar con el seguimiento experimental. los resultados mostraron un incremento del peso del órgano genital muy acentuado. la proporción de sexos en triploides sugiere la existencia de un cromosoma sexual en peneidos. lo que sugiere que la estimulación temprana de la GA es temporal y. 1987. Entonces. por la estimulación de espermatogonias.. quadricarinatus después de la primera semana de ablación bilateral. las espermatogonias entran en actividad mitótica para la producción de más espermatogonias y espermatocitos primarios. el peso del testículo fue similar al de los controles. Este resultado. Posteriormente. en comparación con langostinos controles. el peso de la GA disminuyo sustantivamente al término de la tercera semana. la espermatogénesis disminuye o bien se deteriora.. En cualquier caso. para la cuarta semana de cultivo. 1991). en donde el peso del testículo se incrementó significativamente en los grupos unilateral y bilateral. conjuntamente con la hipertrofia de la GA. ABLACION DEL TALLO OCULAR E HIPERTROFIA DE LA GLÁNDULA ANDROGÉNICA Derivados de los experimentos de ablación. e. El grupo unilateral tuvo una mejor supervivencia y mostró que para la quinta y sexta semanas. que fue desinhibida de la acción regulatoria de la glándula sinusal. Cabe . requiriendo futuras investigaciones de determinación sexual. Sin embargo. en este proceso. subsecuentemente. (2002) quienes documentaron un incremento en el tamaño de la GA de C. continuaron su desarrollo en los vasos deferentes. principalmente durante las dos primeras semanas de cultivo. g. el incremento en peso del testículo se debió a un incremento en células germinales y meióticas. la tilapia azul Oreochromis aureus (Steindachner) (Penman et al.67 sistema WZ/ZZ. Mair et al. los que continuaron con la espermatogénesis. lo que demuestra un eje endocrino glándula sinusal-GA-testículo. conlleva a sugerir que las espermatogonias fueron estimuladas por una hiperactividad de la GA.

El incremento del peso de los vasos deferentes coincidió con el incremento de esperma en el espermatóforo del grupo bilateral. posiblemente con el proceso de renovación de espermatóforo a través de la muda. Los resultados del grupo control mostraron una oscilación en la espermatogénesis en el contexto de que la producción de gametos disminuyó en la primera y segunda semanas en los lóbulos testiculares. por consiguiente la calidad espermática depende de las . 1985). (2004). Sin embargo.68 resaltar que no fue hasta la cuarta semana que se observó un incremento similar en los grupos ablacionados. Los autores discuten que el conteo espermático pudiera estar relacionado con el peso y no con la edad. esto no ocurrió con el grupo unilateral. el grupo unilateral tendería a un mayor tiempo de respuesta en la producción de esperma con respecto al grupo bilateral. se sugiere que la masa espermática permanece en los vasos deferentes durante la quinta y sexta semanas. Cabe mencionar que la concentración de esperma de un reproductor macho de 35 g en condiciones reproductivas. En este sentido. que fue significativamente más alto que el del control. observaron una concentración de esperma de entre 25 y 30 millones por espermatóforo en camarones reproductores. lo cual es mucho mayor en comparación con nuestras muestras. lo que significa que la masa espermática se desarrolló desde los vasos deferentes y terminó como espermatóforo. Los pesos y conteos que reporta Ceballos-Vásquez et al. y que la formación del espermatóforo ocurriere quizás a partir de la séptima semana. volviendo a incrementarse hacia la cuarta semana para volver a disminuir hacia la sexta semana. fluctúa alrededor de los 20 millones de esperma por espermatóforo (Leung-Trujilllo y Lawrence. con camarones de 12 meses de edad (38 g) coinciden con los datos obtenidos en los controles de este estudio. con respecto a los grupos unilateral y control. esto se pudo deber a que la concentración de esperma no fue mayor a los 5 o 6 millones en el grupo bilateral. mientras que no fue del todo oscilante en el grupo unilateral. Esta oscilación se observó invertida en el grupo bilateral a durante las cuatro semanas. Sin embargo. Ceballos-Vásquez et al. Sin embargo. (2003). Se observa que el peso del espermatóforo no es un indicador de cambio. lo cual corresponde a la transferencia de espermátidas a los vasos deferentes durante la segunda semana.

conformadas por una cadena A. En la secuencia de aminoácidos traducida de camarón blanco que se muestra alineada con nueve secuencias de precursores de la hormona de la GA en decápodos en la Figura 26). en M. vannamei concuerda con los resultados obtenidos con planteamientos metodológicos similares en C. Dado que el vaso deferente distal es un tubo delgado y atraviesa el músculo torácico-abdominal. dándole una forma de “auriculares”. encontraron en camarones ablacionados unilateralmente un incremento significativo en el conteo espermático en espermatóforo con respecto a controles. lo cual no coincide con nuestros resultados. japonicus (Banzai et al. el ámpula terminal proximal. pero no se obtuvieron productos usando tejidos de ATP y VVD.. 2011). la GA se presenta como una cuerda muy delgada. 2007) y P. que conecta y comunica la parte mayor y más ancha (que se encuentra en el ámpula terminal) con la parte ubicada en la parte distal del vaso deferente medio.. ANÁLISIS MOLECULAR El éxito en la obtención de amplicones (por RT-PCR) a partir de ARN total de la ámpula terminal de L. se puede observar la estructura típica de los miembros de la familia de las tipo-insulinas. quadricarinatus (Manor et al. monodon (Mareddy et al. los . por lo que es posible que la obtención de amplicones sea más factible al usar este tejido o este influenciada por el estado reproductivo del camarón disectado. la GA se observa con un mayor tamaño en la parte distal del ámpula terminal en comparación con el vaso deferente distal y medio. De acuerdo a las observaciones histológicas reportadas en este trabajo..69 condiciones de los cultivos (alimentación. Alfaro y Lozano (1993). el amplicón que corresponde al precursor de la GA se obtuvo a partir de ARN total de la ámpula terminal distal. vannamei se usó ARN total de ATD y dVDM. Sin embargo. en este estudio se observó una tendencia al incremento en el conteo de esperma hacia la séptima semana. 2011). sin embargo. del vaso deferente distal y de la parte distal del vaso medio. temperatura y densidad). En L.

que aparentemente solo se expresan en la GA de machos decápodos. pacificus de la familia Palaemonidae y P. diferenciación y cambios estructurales del órgano genital en futuras investigaciones moleculares aplicados a la acuacultura.70 residuos de cisteína (C) en posición. pelagicus de la Portunidae. P. japonicus que con las de los demás decápodos reportados. quadricarinatus y C. se podrá demostrar el proceso molecular de la diferenciación sexual. Con los genes de la familia Pro-insulina reportados. con la finalidad de generar de nuevas estrategias técnicas para la reversión sexual en camarones comerciales. C. . respectivamente) mostraron mayor identidad con aquellas de P. uno doble y dos sencillos. P. una cadena B y ente ellas un péptido C. y las relaciones que se muestran en el dendrograma (Figura 37). Desde una perspectiva de regulación genética. japonicus son de la familia Penaeidae. vannamei. monodon y M. este estudio pudiera tener implicaciones importantes. destructor de la familia Parastacidae. concuerdan desde el punto de vista filogenético. ya que L. monodon y M. La secuencias de nucleótidos y de aminoácidos (obtenida y deducida. ya que permitiría establecer con detalle el desarrollo.

GA-Testículo en camarón blanco. • a partir de PL72. • sexos. En L. • provoca la hiperplasia de la GA. • camarón blanco es similar a la de los peneidos. la gónada se diferencia. ya sea en ovario o testículo.71 CONCLUSIONES • • En L. vannamei la meiosis no es regulada por el ciclo de muda en ambos La ablación unilateral y bilateral del tallo ocular en camarón blanco Se sugiere la existencia de un eje endócrino Tallo ocular (Eje órgano x/ La secuencia nucleotídica del precursor de la hormona de la GA del La secuencia de aminoácidos del precursor de la hormona producida por la GA del camarón blanco es similar en estructura a la de los demás decápodos y corresponde al grupo de las tipo-insulina (insulin-like). • glándula sinusal). vannamei el periodo de indiferenciación sexual comprende las primeras dos semanas como postlarva (PL12-PL16). . 7 laterales y 1 conducto deferente. El órgano genital de la hembra del camarón blanco comprende bilateralmente 1 lóbulo anterior. 8 laterales. 1 oviducto y 1 lóbulo • posterior. El órgano genital del camarón blanco macho comprende bilateralmente La GA comienza a formarse a partir PL48 y se encuentra interconectada en un tejido conectivo entre la base del bulbo eyaculador (CDM) y el 8º • lóbulo testicular. • 1 lóbulo anterior. En camarón blanco.

como punto de partida para futuros trabajos que involucren la dinámica de expresión del gen durante la diferenciación sexual así como su efecto con la ablación del pedúnculo ocular.72 RECOMENDACIONES La continuación lógica de estos estudios deberá ser la caracterización del gen que codifica la hormona de la GA en L. . Mediante el conocimiento de la secuencia de este gen es posible la generación de ARN de interferencia (ARNi) con el que se pudiera bloquear la expresión del gen que codifica la hormona de la GA. que ayuden a determinar la existencia de posibles cromosomas sexuales. vannamei. así como para intentar la localización del gen en cromosomas meióticos. teniendo como objetivo la reversión sexual del camarón blanco. Se recomienda la elaboración de sondas moleculares para su uso en trabajos encaminados a la localización de los sitios de síntesis de la GA en tejidos.

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86 ANEXO .

o n l i n e Organogenesis and subsequent development of the genital organs in female and male Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei Rodolfo Garza-Torres. Introduction Information concerning development of internal and external sexual characteristics in commercially reared decapods is useful because there is gender dimorphism. Cherax destructor (Clark) (Fowler and Leonard. Alejandro M.aquaculture.: +52 612 123 8451. and decapods because the organ responsible for maleness is the androgenic gland (AG). The genital organ was fully recognized from postlarve day-16 (PL16) as a bilateral lobe located in the anterior region of the midgut gland (first anterior lobes) that connects to an anterior perpendicular collector tube that extends dorsally towards the posterior region of the midgut gland and forms an inverted U-shape collector. (2006) documented the structure of the AG in P.5–0. © 2009 Elsevier B. These lobes extend over the surface of the midgut gland beneath the pericardium. Maeda-Martínez Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR). 0044-8486/$ – see front matter © 2009 Elsevier B. e l s ev i e r. Aflalo et al. Playa Palo de Santa Rita.Aquaculture 296 (2009) 136–142 Contents lists available at ScienceDirect Aquaculture j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. Manor et al.. Rafael Campos-Ramos ⁎. as in the Malaysian prawn Macrobrachium rosenbergii (De Mann) (Sagi and Aflalo. 1990... 2001. the tenth bilateral lobe emerges from the distal region of the collector tube and continues dorsally along the intestine. México a r t i c l e i n f o Article history: Received 19 February 2009 Received in revised form 5 August 2009 Accepted 5 August 2009 Keywords: Androgenic gland Genital organ Penaeus (Litopenaeus) vannamei Organogenesis Sexual differentiation a b s t r a c t Timing of organogenesis and subsequent development of genital organs were studied in female and male Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei postlarvae. However. females grow larger than males. La Paz.. 1980a. C. 1990. (1983). amphipods.8–2. quadricarinatus (von Martens) (Khalaila et al. In freshwater prawns. This gland was discovered in the amphipod Orchestia gammarellus (Pallas) ⁎ Corresponding author. 70–74 mm).S. Sex determination and differentiation is particularly interesting in crustacean malacostracans like isopods. and the fourth bilateral lobe did not develop and regressed until apparently absorbed.6 g. 1. 23096. 1999). and Nakamura et al. and other American. Females .2 g. the posterior bilateral vas deferens emerges from the same region.V. Sagi et al. In freshwater prawns. 1953. E-mail address: rcampos@cibnor. Additionally. as in the Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei (Boone) (Chow and Sandifer. Around PL50 (0. 1954.08. the regulation of spermatogenesis during reproduction. 1991). Col.. This was linked to the timing of differentiation of external structures that differentiate the genders. an all-female culture would increase profitability for farmers based on size and market weight (Zhang et al. Campos-Ramos). andrectomy and implantation of the AG leads to partial or total gonad sex reversal.. doi:10. These studies agree that organogenesis of the AG occurs before or at the onset of spermatogenesis by the end of the second month of the postlarval stage. the male androgenic gland appears at the posterior-external wall of each anterior vas deferens. 2005. Alfaro (1994) and CamposRamos et al. CharniauxCotton and Payen (1985). vannamei. Laubier et al. (2006). Asian. rosenbergii (Nagamine et al.b. Malecha et al. (1992). 45–50 mm).1016/j. long after gender differentiation takes place by the formation of the male vas deferens within the first two weeks of the postlarval stage. including the AG and the time of gender differentiation. and in the production and secretion of hormones. Eight bilateral lobes in females (second to ninth) and the bilateral oviduct between the seventh and eighth lateral lobes and seven bilateral lobes in the male (second to eighth) are connected along the inverted U-shape collector tube. Gonad differentiation occurred from PL68 (1. 1996). Mar Bermejo 195. Shortly after organogenesis of the female gonad. Anatomy of the gonad appears to be unique for penaeid species. has been studied in male Penaeus japonicus (Bate) by Chim (1983). Timing of sex reversal studies in penaeids is discussed.V.mx (R. 2007). whereby one sex grows larger than the other does. All rights reserved. Tel. and Indian species reviewed by Campos-Ramos et al. vannamei is that it involves a significant differential growth at harvest size (Pérez-Rostro et al. such as M. No other penaeid species male has been examined for this detail. In males. Sagi and Cohen. All rights reserved. and therefore. which resembles those described in the literature for other malacostracans..C. c o m / l o c a t e / a q u a . The organogenesis of the genital organ. fax: +52 612 125 3625. where it was possible to differentiate the female ovary from the male testes. 2006). surrounded by connective tissue that attaches to the anterior vas deferens and the eighth testicular lobe. In penaeid shrimp. B. The relevance of sexual dimorphism in P. males grow larger than females. 1992).2009.012 (Charniaux-Cotton. sex reversal techniques. 1999). Barki et al. 2003. 2004).. 1960). the AG function in commercial penaeid species requires further investigation to understand its role in sex differentiation. external gender differentiation was recognized in the form of the thelycum in females and the gonopores in males. and Procambarus clarkii (Girard) (Taketomi and Nishikawa..

We also provide new evidence on the morphology of the female genital organs that is different from descriptions in previous reports on related species. and adult specimens were cultivated at the CIBNOR facilities. (1990). The genital organ of each gender was fully recognized through dissection in PL16.1.0 (Media Cybernetics). Japan). Shrimp were reared from postlarvae day-4 (PL4) in six 1000-L outdoor oval tanks maintained with filtered and aerated seawater (36–38 ppt salinity) at 27 ± 1 °C by submersible 300-W heaters at a density of 200 shrimp/ tank. numbered from second to Fig.2. Timeline of events of internal and external differentiation of gender A timeline of events of internal and external differentiation in females and males is shown in Fig. older shrimp (NPL20) were fed three times daily with live and frozen adult brine. and how they interconnect the vas deferens and testis. Timeline of events of internal and external differentiation of female and male Pacific white shrimp Penaeus vannamei. japonicus and corroborated by Chow et al. apparently participating in spermatogenesis and testis maturation. commercial pellets.9% NaCl saline solution. seven bilateral lobes in the male. with the objective of future production of female monosex populations for shrimp farming. and 137 crumbled. 1..R. . Organogenesis of the gonad (PL12 to PL16) After histological preparations. (2006). the body weight of shrimp ranged from 80–130 mg and body length from 15–18 mm.1. Shrimp were fixed in Davidson's solution (Howard and Smith. extends dorsally towards the posterior region of the midgut gland. vannamei) regarding the individuality of the testicular lobes connected to a horseshoe-shaped proximal vas deferens. Garza-Torres et al. Further. vannamei in concordance with the timing of the development of external structures that differentiate genders. 3. Chow et al. eight bilateral lobes in the female. Exchange of seawater was ~ 50% three times weekly and temperature of the seawater was adjusted to that of tank water before the exchange. 2A). which describes the ovary as a partly fused. External and internal examination was performed under a dissecting stereoscopic microscope (Olympus. 3. brine shrimp flakes. as described by King (1948). Prepared slides of the tissues were examined with a compound light microscope (Olympus. juvenile. 3. We present a timeline of events of internal and external gender differentiation that is critical for developing techniques for sex reversal. and their internal organs. rostrum tip to the end of the telson) were recorded. six to eight short lateral lobes. Along and perpendicularly connected to the inverted U-shaped collector. preadult. Kong and William (1988). The gonad was recognized in PL12 as a bilateral structure located dorsally at the anterior region of the midgut gland. 1988). External sex structures were analyzed.e. Mexico. non-multiple. The basic anatomy of the adult female genital apparatus in the literature is the original description by King (1948) for P. and Dall et al.2. 1. The review of Dall et al. Every four days (from PL4 to PL80). Bell and Lightner. setiferus (L. 1988) for 24 h and then in 70% ethanol until processed with the hematoxylin and eosin histological technique (Bell and Lightner. Morphology of the genital organ The first bilateral anterior lobe is connected to a main anterior collector tube that is perpendicular to the body axes. 2. Images were recorded with an attached digital camera and stored in the software Image Pro Plus 4. This study focused on the timing of organogenesis and subsequent development of the genital organs in female and male P. In the case of males. ten shrimp from the six tanks were randomly chosen and their weight (mg and g) and length (mm. Additionally. During this time. 1983. (1991) observed that it was a single. The postlarvae. no sign of gonad tissue was observed in PL4 and in PL8. the anterior lobe. which links each sex-development to a specific figure. setiferus and P. numbered from second to ninth lobe plus the bilateral oviduct (Fig. Shrimp up to PL20 were fed three times daily to apparent satiation with brine shrimp nauplii and commercial microparticulates (250–500 µm).). seminiferous tubule along each independent testicular lobe. having no record of the organogenesis of the oviduct and gonad differentiation into an ovary that would identify a female. (1990) of female penaeids describes the ovary as two independent bilateral structures with projecting lobes. Japan). we emphasized organogenesis and development of the AG. Tokyo. and forms an inverted U-shaped collector. Tokyo. as described by Pérez-Farfante (1988) and Campos-Ramos et al. i. bilaterally paired structure with projecting lobes. and the long posterior lobe. (1991) in two species of shrimp (P. Internal genital organs were stained with commercial aquarium methylene blue in 0. the original description by King (1948) was complemented by Chim (1983) in P. / Aquaculture 296 (2009) 136–142 have been excluded from these analyses. Materials and methods Shrimp postlarvae were obtained from a shrimp laboratory in La Paz City. Results 3. plus the oviduct at the sixth lateral lobe.

from PL28. seven bilateral lateral lobes. 4A).5–0. and then extends ventrally to the thoracic-abdominal muscle at the level of the third pereiopod. It extends upward and laterally. 3. Ventral view of genital organ in female (A) and male (B) located in the cephalothoracic region. Penaeus vannamei. Early external sex differentiation began around PL32. female oviduct (ov). Two external characteristics were evident: First. Ventral view of genital organ in adult female (28 g) showing one anterior and seven lateral lobes plus the oviduct.6 g and body length from 45–50 mm. Horseshoe-shape main collector tube (hmc). Second. and male vas deferens The bilateral oviduct is a single. Each vas deferens extends towards the lateral junction of the thoracic–abdominal and the oblique flexor 3. continuing laterally to the midgut gland. eighth lobe (Fig. the endopodite emerged as a tiny protuberance with one or two apical setae. which are lost in the following molts and remained as a tubular appendage forming the petasma. In addition. / Aquaculture 296 (2009) 136–142 Fig. (2006). which by PL28 developed clusters of cells in all gonadic lobes (Fig. 2B).2.138 R. Detailed morphology of these external structures is provided in Campos-Ramos et al. Over the following days. extend over the surface of the midgut gland beneath the pericardium. 3A). Early external sex differentiation (PL32 to PL44) 3. 4D). Exo-skeleton and midgut gland were removed. numbered from second to eight. collapsed tube. and oviduct (ov). The vas deferens are filiform. Penaeus vannamei. descending laterally and straightforward as a distal vas deferens that reaches ventrally to the internal region of the base of the fifth pereiopod as a primordial terminal ampoule. when the anterior region became wider and differentiated into a middle vas deferens that will function as ejaculatory bulbs.3. incomplete cavity (Fig. and the ninth distal abdominal bilateral lobe. Earlier development of the male vas deferens was clear after PL36. surrounded by a wide space of undifferentiated loose connective tissue (Fig. 3. 2.4. body weight ranged from 180–280 mg and body length from 25–35 mm. Early development of the gonad (PL12 to PL28) The initial morphology of the sex-undifferentiated bilateral anterior lobe was composed of unarranged cells of irregular shape (Fig.2. 4B). 4C). sharp ridges in the thelycum that is . body weight ranged from 0. and male vas deferens (vd). Therefore. the endopodite of females became wider at the external proximal and middle regions and started developing three or four proximal setae along its ridge and maintaining the apical setae. plus the bilateral oviduct (Fig. Exo-skeleton and midgut gland were removed. They represent the basic anatomy of the gonad. leaving no rudimentary lobe-tissue and an evident space between the third and the fifth lobes (Fig.2. the final morphology of the female gonad was composed of the first bilateral anterior lobe. Further external sex differentiation (PL44 to PL48) Further external sex differentiation began from PL44. PL24. Horseshoe-shape main collector tube (hmc). 3. 3B). and then descends parallel to the aorta that runs down the left side of the body between the thoracic–abdominal muscle and the intestine. gonadic lobes (Roman numbers). Fig. the tenth bilateral lobe emerges from the distal region of the collector tube and develops dorsally along the intestine through the five abdominal segments during the following eight days. 5).3. the proximal bilateral vas deferens continues from the distal end of the U-inverted collecting tube behind the midgut gland. gonadic lobes (Roman numbers). Garza-Torres et al. Ventral view of genital organ in juvenile female PL80 (3 g) showing a bilateral physical space (arrows) that corresponded to the fourth lobe (A). the protopodite of the first pair of pleopods had a rectangular articulation in females and the same articulation was notched in the distal region in males. In the female. It is located between the sixth and seventh gonadic lobes. The endopodite of males had one or two proximal and apical setae. Histology of female oviduct. In the male. abdominal muscles. with no distinguishable ejaculator medium bulb and composed of columnar epithelium cells with a lumen that forms a tubular structure and a longitudinal septum that divides the tube into a large chamber lined with epithelium and a smaller. Females started developing a pair of oblique. with a half-moonshaped cross-section that distinguishes it from the gonadic lobes (Fig. the fourth lobe did not develop and regressed until apparently absorbed.

8–2. and vas deferens (vd). and the area around the descending aorta on the left side of the body. 3. Secondary gonia cells transformed into primary oocytes that began previttelogenic primary growth by PL68PL72. However. 7A). The morphological detail of these structures is provided in Campos-Ramos et al. Detailed morphology of the AG in preadult and adult penaeid shrimp is provided in Charniaux-Cotton and Payen (1985). The nuclei of these cells are pushed to the periphery because of the fat content in the cytoplasm (Fig. the clusters of cells in the gonad differentiated into germinal epithelium. However. the gonad was still undifferentiated. Cross section of the oviduct located in the postero-lateral side of the midgut gland of a female in PL40 (C). / Aquaculture 296 (2009) 136–142 139 Fig. Shortly afterward. the intestine. Organogenesis of the AG and white adipose tissue (PL48 to PL52) In males. As the male grows. 7B and C). 5B). Penaeus vannamei. semi-arranged gonadic cells (sgc). which were rounded and tightened. Alfaro (1994). the thoracic–abdominal muscle. Aorta (a). Garza-Torres et al. 5A). midgut gland (mg). Subsequent development of the vas deferens and the AG The external appearance of the AG in juvenile shrimp was difficult to observe because it is small and transparent. 1988).6. Longitudinal sections of the gonadic anterior lobe in PL18 (A) and PL28 (B). primordial AG cells appeared by PL48. 8A and B). oviduct (ov). gathering in line. The germinal cells were larger than the original clustered cells and were rounded. 3. the side of the vas deferens that faces the oblique flexor abdominal muscle (Fig. intestine (i). By this time. After dissecting the vas deferens. Primary male spermatocytes. 4. connecting the internal distal region of the posterior ejaculator bulb with the eighth testicular lobe (Fig. During this time. surrounding the lumen. 5). the AG appears as a slender and compact mass of oval cells with prominent nuclei under histological examination. produced spermatids that were transferred into the lumen of the testicular lobe. development of an external connective tissue is evident at the wider middle region of the vas deferens. clustered gonadic cells (cgc). which indicates the location of the putative AG. Female oocytes grew larger and formed a pear-like or triangular shape and began filling and expanding the lobes that characterize the ovary. In preadult and adult shrimp. (2006). the bilateral anterior vas deferens continues to develop and turns into a huge median and folded vas deferens that takes the form of an inverted U (named “double fixture” by Treece and Yates. . The differentiation of the gonad occurred when both genders reached a body weight of 1. oblique flexor abdominis muscle (ofam). the dissection of any independent testicular lobe showed a long and single seminiferous tubule. Each of the median vas deferens includes the anterior and posterior ejaculator bulbs (Fig. 6A) from the male gonad (Fig.R. the AG appears as cords immersed in the connective tissue.7.2 g and a body length of 70– 74 mm. Longitudinal internal section of the posterior cephalothoracic region and the anterior abdominal region of a male in PL32 (D). 6B). oval cells accumulated in the area forming the AG tissue (Fig. (2006). females and males differentiated loose connective tissue into white adipose tissue filling the cavity in the posterior region of the midgut gland. and Campos-Ramos et al. characteristic of this species and males started developing gonopores at the coxa of the fifth pereiopods and the male appendage at the second pair of pleiopods. and apparently held and orientated by a thin fibrous connective tissue at the posterior-external wall of each vas deferens.5. by PL52. thoracico–abdominis muscle (tam). The connective tissue of the vas deferens also attached along the eighth testicular lobe so that the vas deferens and testis are held to each other in parallel (Fig. which distinguished the female gonad (Fig. 3. forming an oval tubular structure where gonia cells were at the periphery. Development of germinal epithelium and gonad sex differentiation (PL52 to PL72) By PL52.

which agrees with the development of P.. possibly because of the morphology and development of the midgut gland.. and vas deferens (vd). with the few previous investigations of penaeids regarding internal and external morphology and sexual differentiation (Chim. (1992) in P. and in (B) spermatogonia (sper). it would be higher. This stage is represented by and. to some extent. white adipose tissue (wat).. vannamei and. (1991). 3A in female and Fig. Campos-Ramos et al. whereas oviducts and vas deferens grow from tissue from the genital organ that differentiates into columnar epithelium. The organogenesis of the AG in P. which is eight days later than the time reported by Nakamura et al. 1992). Cross section of gonad in female (A) and male (B) in PL72. Garza-Torres et al. which indicate a germinal zone. japonicus. setiferus by Chow et al. Primordial androgenic cells (pagc). From an anatomical point of view. the bilateral anterior lobe was observed by histological examination in PL12 as the first recognizable gonadal structure. japonicus (Charniaux-Cotton and Payen. (1983). which is about PL50. if the fourth lobe would develop. Nevertheless. In contrast. Campos-Ramos et al. 2006). the gonad first appears as two masses of germ cells associated with somatic cells by PL8. Instead. Arrow in (A) shows pear-like or triangular shape oocytes (ooc). at each PL-stage. 1992. 2006). as observed in P. of penaeids described by King (1948) and Dall et al. 1983. vannamei. Laubier et al. In P. 1985) or P. 1991.. Charniaux-Cotton and Payen. our earliest identification of the female oviduct and filliform male vas deferens was in PL16. these clusters of cells form oval tubular structures where gonia cells gather around a lumen. which in turn. and more external than the other lobes. According to Charniaux-Cotton and Payen (1985). japonicus (Nakamura et al.. Penaeus vannamei. in general. Cross section of the vas deferens of male in PL44 (A) and in PL52 (B). vannamei matches the description of P.5 g and 45 mm. vannamei and P. differentiated into white adipose tissue around the intestine and midgut gland in both genders. this lobe regresses. By PL52 (0. Chow et al. It appears that primordial AG cells differentiated independently from the loose connective tissue. androgenic gland cells (agc). the female genital organ in P. 1992). vannamei begins at the posterior–lateral region of each vas deferens. vannamei (Alfaro. in general. However. synchronized by the external development of the female thelycum and male gonopores and internally by the appearance of the male AG. Once the gonad of each gender was developed. The AG is immersed within a connective tissue that interconnects the vas deferens and the eighth testicular lobe. (1990) does not match what we found.140 R. Nakamura et al. 6.. 1983. japonicus and P. japonicus by Chim (1983) and in P. indicating the time of gonadal differentiation. there was not a difference in gonad development among the ten shrimp sampled. posterior-external wall (pew). This structure appears to be unique for penaeid species (Laubier et al. japonicus (Nakamura et al. The AG cells may originate from mesoderm cells that formed the connective tissue that holds testicular lobes beneath the pericardium. the physical position of the fourth lobe would coincide with the wider and higher transversal axes of the anterior midgut gland. However. 4. According to Laubier et al. From PL68 to PL72.. the duration that postlarvae remain gender-undifferentiated is remarkably short after Fig. 2B in male) may suggest that the fourth bilateral lobe forms during the early network of mesodermic cells that give structure of each gonadic lobe. 5. and the entire genital organ is difficult to analyze during these early stages. external gender differentiation was delayed until shrimp reached 0. Therefore. These authors recognized the entire male genital organ by PL11.5 g and 45 mm). The evident separation between the third and fourth lobes in both genders (see Fig. Chow et al.. Both genders have a basic anatomy of a bilateral anterior lobe and independent lateral lobes arranged symmetrically on each side of a single collecting tube with an inverted U or horseshoe shape. It appears that in both P. 1994. the clusters of cells gathering at the gonadal lobes are mesoderm cells. The regression of this lobe is not clear. 1983. larval metamorphosis. / Aquaculture 296 (2009) 136–142 Fig. Discussion The anatomy of the genital organ in male P. (around 2 g and 72 mm) shrimp showed early developing oocytes. this study). . Our description of genital organogenesis concurs. Penaeus vannamei. many other species have not been studied with this detail. vannamei.. 1991. 1985. which was not previously observed in P. around a lumen (lu).

Detail of vas deferens from B (C). spermatogonia gather at the periphery of the testicular lobe and the lumen is filled with secondary spermatocytes and spermatids. 1980a. is well documented in the literature (Nagamine et al.. the gamete production cycle. rossembergii. (2006) found that external gender differentiation occurs during the same time of development under two temperature conditions at 27 and 32 °C. the lumen phase. such as M. andrectomy induces feminization (vitellogenesis) in young male prawns. This unsuccessful experiment may be related to the lack of adequate knowledge of the process of sex differentiation in penaeid shrimp compared to freshwater prawns.’ where sustentacular cells retreat and align to form a cavity where late spermatids are transferred to the posterior vas deferens. The size of shrimp was a good guide of gender development under the rearing conditions of this study. as reported for C. 2002). 1990.. Therefore. Initially. In males. In theory. secondarily.. Although the AG is unique among malacostracans. the evidence from the two species of penaeids that have been studied indicates that this gland is not involved in sex determination or sex differentiation because the gender differentiates earlier. 7. (2006). proximal vas deferens (pvd). testicular lobes (tl).b. rosenbergii have been recently reported (Manor et al. Pro-insulin-like genes expressed exclusively in the AG of male C. In penaeids. where spermiogenesis continues. size must not be a factor to assume a gender development. vannamei possesses a stable genetic sex determination system that is not influenced by environmental conditions. Sagi et al. where shrimp size was variable. and terminal ampoule (ta). Certainly. the AG induces masculinization and secondary sexual male characteristics and inhibition of vitellogenesis in implanted young females. males also have reproductive molt cycles. The spermatid–spermatozoa mass is transported along the vas deferens. posterior ejaculatory bulb (peb). forming the spermatophore that will be expelled through the gonopores and renewed every molting cycle. wrapped. when external gender differentiation is observed. since gametogenesis begins after the AG is formed. According to Parnes et al. 2007. Penaeus vannamei. P. / Aquaculture 296 (2009) 136–142 141 Fig. (2006). 2006). (1991). and stored in the terminal ampoule. According to Campos-Ramos et al. medium vas deferens (mvd). In contrast. 1.’ where spermatogenesis is supported by multi-functional sustentacular cells. According to Chow et al. this study may have . We conclude that in both genders of P. vannamei. In freshwater prawns. Aflalo et al. Ventral view of male genital organ in PL48. generates late spermatids. independent in each seminiferous tubule. distal vas deferens (dvd). vannamei. soon after transformation of larvae. Horseshoe-shape main collector tube (hmc). which is the same biotechnological sex reversal principle used in M. Most likely. anterior ejaculatory bulb (aeb). the interconnection between the vas deferens and testis seems to be related to spermatogenesis and testis maturation or some regulatory process of ovary inhibition. external gender differentiation develops around 15–20 days earlier than gonad differentiation..5 g (A). the cord phase. The discovery of these specific genes may show molecular processes of sex differentiation and may provide clues to innovative strategies for sex reversal techniques in commercially reared freshwater prawns. quadricarinatus (Khalaila et al. The strategy to induce sex reversal and produce male monosex aquaculture in freshwater prawns. eighth testicular lobe (etl). Garza-Torres et al. It is necessary to identify external and internal gender structures. It remains unknown whether implantation of the AG and andrectomy in penaeid shrimp will be successful in sex reversal. From a gene regulation perspective. which are resumed in Fig. However. 2009). and adult (26 g) (B). includes two distinguishable phases where sustentacular (supporting epithelial) cells play a role in expanding and contracting the lumen to begin a new cycle from primary spermatocytes produced by spermatogonia. it is still unknown if the AG is involved in the eyestalk-AG-testis endocrine axis. Campos-Ramos et al. as described by King (1948). and can be delayed under low temperature at 18 °C and unfavorable biological and environmental conditions. 0. if no reproductive behavior occurs.. previous studies and our study should be taken into account. rossembergii. Li and Xiang (1997) attempted reversing the gender of Fenneropenaeus chinensis (Kishinouye) without success. quadricarinatus and male M. Ventura et al.R. any surgical procedure on the vas deferens or an AG implantation in females would compromise the fate of gonad differentiation in P..

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Therefore. stylirostris (Stimpson. 1798 and M. following vitellogenesis (Dall et al. recognized by complete synapsis of bivalents.. AMMM. 1997. Playa Palo de Santa Rita.JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY. 1990. Browdy.mx.. meiotic prophase.. and Rafael Campos-Ramos (RGT. which suggests that there is no relationship between molting and the first meiotic prophase. 2) genetic recombination.1 In female decapods. 1990). Guerrero-Tortolero. DAGT. Yano. Carpenter. 1767) (Chow et al. 1989). to the molt cycle. mature males attach their glutinous spermatophore onto the hard thelycum of females having advanced gonad maturation at inter-molt stage.. Baja California Sur. and ovulation (spawning) according to the molt cycle (Qiu.. and L. pre-molt. 1993. in penaeid species with an open thelycum such as L. japonicus. and the red flagellated shrimp Acetes chinensis Hansen. 1995. mature males insert their spermatophore into the soft thelycum of newly molted immature females. 1994). Alcivar-Warren et al. Examples are M. Some reports indicate that it begins at the onset of spawning. 1988. Litopenaeus vannamei. mating occurs around two hours before final oo¨cyte maturation and spawning. revealing a high chromatin density and a complex tangled arrangement in the nucleus. and post-molt stages in all individuals.. Fawcett. from the formation of the synaptonemal complex to diplotene is described during molting stages. daguet04@cibnor. 1990. Danitzia A. mating with spermatophore transfer takes place before vitellogenesis (Yano. Farfantepenaeus duorarum (Burkenroad. 1988. correspondence.1651/10-3316. There is a discrepancy in reports of female decapods regarding when meiosis I begins. Most species have a diploid number of 88 chromosomes. in open-thelycum species. and the rest have a v-shape.. 2011 DESCRIPTION OF MEIOSIS IN FEMALE AND MALE PACIFIC WHITE SHRIMP LITOPENAEUS VANNAMEI (DECAPODA: PENAEIDAE) Rodolfo Garza-Torres. chinensis (Jixun et al. 1979. von Wettstein et al. Most of the meiotic cells in both genders were observed at pachytene. 1994) involves three important processes: 1) pairing of the homologous chromosomes (synapsis). Dall et al. rgarza@cibnor. Me´xico ABSTRACT The first meiotic prophase was analyzed in both genders of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. 31(1): 75-81. La Paz. neurosecretory and endocrine organs control the ovarian development (vitellogenesis). Alejandro M. 1995). there are no comprehensive studies of meiosis in crustaceans. Both genders have 44 bivalents. associated with final maturation. 1997). japonicus.mx. and with a progressively decreasing length. Campos-Ramos. which is difficult for karyotype analysis. 1888) (Hayashi and Fujiwara. 1939). where ovulation and meiosis I characterize the maturating stage of oo¨cytes (Yano. Nuclei at the diplotene stage were obtained from male testes in Marsupenaeus japonicus (Bate. Loidl. Schmekel et al. Sperm counts from the vas deferens and spermatophores support a continuous production of male gametes. 1874). and Litopenaeus setiferus (Linnaeus. Col. 1956. of which around 40 have an o-ring configuration. 75 . 1956. where chromosome synapsis and genetic recombination occur during the zygotene and pachytene stages. Therefore. and there is only one report of this stage in the female ovary of F. vannamei (Chow et al. meaning that most bivalents present chiasmata at both ends. Currently. 1891). HOB. The synaptonemal complex (SC) is a protein complex that forms during the first meiotic prophase. 1989). Maeda-Martı´nez. respectively (Moses. 1992). and oo¨cyte maturation begins until reaches final maturation and spawning. 2006). 1988). almaeda04@cibnor.mx) Centro de Investigaciones Biolo´gicas del Noroeste (CIBNOR). Counting of highly condensed bivalents has led to establishing the haploid number of species and confirmed the diploid number that was previously obtained. 1919 (Decapoda: Sergestidae). 1986). where meiosis I starts prior to spawning (Quiu. Fenneropenaeus chinensis (Osbeck. and hence. In contrast. In this case. Hortencia Obrego´n-Barboza. 23096. In penaeid species with a closed thelycum such as Penaeus monodon Fabricius. Farfantepenaeus aztecus (Ives. pachytene. RCR. the beginning of meiosis I is independent INTRODUCTION Mitotic chromosomes have been comprehensively studied in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei (Boone. Bernhard.

by histology of F. MATERIALS AND METHODS Specimens of L. aztecus (Clark et al. Spermatogenesis continues along the ejaculatory bulbs and the spermatozoa mass is stored in the terminal ampoule. 1948). Bar represents10 mm. A histological study of L. In male shrimp. 1. a closed-thelycum species like M. This study describes meiotic stages in gonads of both genders of L. 2005). of final maturation and spawning. . vannamei using fluorescent probes for DNA and tubulin and confocal microscopy (Hertzler. in contrast to the fully synapsed bivalents at pachytene stage (double arrowheads). in contrast to the molt-related formation of the spermatophore (Heitzmann et al. vannamei. 1879 (Okumura and Aida. and female (C) and male (D) at pachytene stage stained with orcein. and in the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii de Mann. not related to the molt cycle. 2011 Fig. 2000). the molt cycle. Parnes et al. testes produce spermatids that are transported to and accumulate in the vas deferens. stage is distinguished from pachytene stage because homologous chromosomes have just synapsed and started to ‘‘zip-up’’ in one direction. Litopenaeus vannamei. The arrested oo¨cyte stage at metaphase I is shown to occur in L. (2006) confirmed the timing of formation of the spematophore. or 2) progresses as ‘‘packages’’ of meiotic cells from post-molt to pre-molt stages or at a specific molt stage. During zygotene. VOL. NO.. Additionally. vannamei shows that spermatogenesis is a continuous process. it is possible to observe chromosomes (lateral elements) that are still unpaired (small arrowheads). The molt stages were based on the description of de Oliveira-Cesar et al. japonicus. Zygotene. 31. hence. and elucidates whether meiosis is: 1) continuous and not dependent on the molt cycle. 1980). thinner and longer than pachytene bivalents are seen because of a less condensation stage of chromatin. 1993). where it is wrapped in secretions from glands forming the spermatophore (King. apparently from one end to the other (big arrowheads). Tangled-arranged synaptonemal complexes of female (A) and male (B) at zygotene stage.76 JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY. vannamei were obtained at the CIBNOR facilities.. 1.

The lobes of gonads were dissected and processed using two techniques and three staining protocols: the air-dried technique.5 with 0. A slightly modified technique to observe the SC in tilapia (Campos-Ramos et al. inter-molt (Stage C).nih. + (nuclei rarely present). and D: orcein staining.. B.GARZA-TORRES ET AL. gently shaken. Finally. Slides were washed gently with running tap water and then distilled water. and dissected 8 h after injection. was injected with 5-mg colchicine per body gram. Measurements of the diameter of each nucleus (mm) were made in six nuclei at each meiotic stage with Image J software (http://rsb. Slides first were stained in 2% orcein in 45% solution acetic acid solution for 5 min. (2006).gov/ij/index.. 2001) was used on the shrimp gonad.: MEIOSIS IN LITOPENAEUS VANNAMEI 77 Fig. ++ (few nuclei present). C: DAPI staining. and late pre-molt (Stage D3). showing 44 bivalents. followed by a rinse in ethanol and then airdried. Litopenaeus vannamei. Another group.info. rinsed twice in distilled water. Bar represents10 mm. 1980). Each group consisted of six ovaries and six testes in each of the following stages: late post-molt (Stage B). the upper 500 mL were transferred to another tube containing 500 mL 4% paraformaldehyde (dissolved with 1 N sodium hydroxyl and buffered to pH 8. slides were stained with 50% silver nitrate (Howell and Black. and horizontally airdried under a fume hood.5 with 0. The relative abundance of nuclei of each molt stage was recorded as: 0 (nuclei not present). after identifying the molt stage.5 mL tube at 4uC. and then air-dried. Meiotic cells were photographed with a compound light microscope equipped with fluorescence and attached digital camera. 2.2% Triton X-100 solution. The genital organs (Garza-Torres et al. and then incubated for 10 min at room temperature.2 M sodium tetraborate). early pre-molt (Stage D1). and the criteria for identification of meiotic stages were based on the descriptions of von Wettstein et al. buffered to pH 8. The resulting cell suspension was left for one hour in a 1.html). of freshly prepared and cold Carnoy fixer (3:1 methanol to acetic acid). consisting of one hour of hypotonic shock in distilled water and then three changes lasting 15 min each.01 M sodium tetraborate. 2009) of one group of immature adult shrimp (25-27 grams body weight) were dissected after identifying the molt stage without any treatment (control). About 100 mL of the fixed cell suspension was pipetted onto three microscope slides. +++ (nuclei . A. followed by dissociation of tissue in 50% solution acetic acid. Three slides per gonad were prepared according to Campos-Ramos (1997) by dropping and immediately absorbing the liquid in a pre-warmed slide around 30uC. Slides then were stained with DAPI (49-6- diamidino-2-phenylindole). Female (A and B) and male (C and D) at early diplotene stage. which consisted in cutting the gonad tissue with small scissors in 1 mL 0. once in ethanol. (1984) and Loidl (1994).

The control group showed zygotene (++) and pachytene nuclei (++++) only. VOL. PA). Horsham. 16. The average of counts from the bilateral vas deferens and from both spermatophores was obtained for each shrimp. D). showing 44 bivalents. To contrast the qualitative information obtained from male germ cell meiotic stages. B. but the group injected with colchicine showed zygotene (++). The nature of the SC in our sample showed each pair of homologous chromosomes synapses end-to-end. Normality (Kolmogorov-Smirnov’s test) and homogeneity of variances (Levene’s test) of data were calculated. A. tangled arrangement in the nucleus. 3.1 mm deep. commonly present). Sperm counts were made with a hemacytometer (0. early diplotene (Fig. 2011 Fig. with the exception of the leptotene stage (0). Statistical significance was set at P . revealing high chromatin density and a complex. orcein staining. NO. 1C. and advanced diplotene (++). and manually homogenized in 1 mL sterile seawater. 31. Female (A) and male (B) at advanced diplotene stage. 1. and ++++ (nuclei abundantly present). pachytene (++++). cut in small pieces. 0. Chicago. followed by orcein staining. Most of the meiotic cells in both genders remained at the pachytene stage. recognized by the complete synapsis of bivalents.78 JOURNAL OF CRUSTACEAN BIOLOGY. Both genders showed all stages of meiosis I. The SC was not resolved with DAPI staining and with tissue that was fixed with paraformaldehyde and stained with silver nitrate. RESULTS The best technique for observing the SC was the air-dry method. early diplotene (+). In all shrimp of both genders.05. Diplotene stage was resolved better with the orcein and DAPI protocols than with the silver nitrate protocol. DAPI staining. and advanced . Mitotic spreads (C and D) from spermatogonia staining with orcein. Vas deferens and spermatophores from the terminal ampullae were dissected. Mean nucleus diameter and sperm counts among the molt stages were compared with ANOVA using SPSS v.0 (SPSS. zygotene (Fig. Litopenaeus vannamei. Bar represents10 mm. 2A-D). Hausser Scientific. pachytene (Fig. B). IL). 1A. quantitative data of sperm cells were obtained from six males at each molt stage.

Xie et al. 4.. 1997. apparently according to the present study. which distinguishes female gonad differentiation. The many bivalents that are tangled in the nucleus made it impossible to measure each bivalent and recognize any bivalent associated with a putative sex bivalent. When analyzing the SC in spermatocytes of diploid and triploid F. 2). We found that the beginning of meiosis I in female L. pachytene. occurs independently from vitellogenesis. the tentative karyotype is 4m + 10sm + 56st + 18t. Further improvement of the SC technique in gonads of shrimp is required. This is still controversial and requires confirmation. and pre-molt stages. Our study also confirmed that spermatogenesis in male L. final maturation. most invertebrates. 3C.. 3 103 vas deferens spermatophores Fig. D).: MEIOSIS IN LITOPENAEUS VANNAMEI 79 Table 1. in male L. 38 6 8 mm in males). In terms of spreading of nuclei. and under reproductive conditions. 3A. 1993. rosenbergii. 1988. vannamei is 88 chromosomes (Campos-Ramos. DISCUSSION The meiotic cells in gonad of L. it was possible to obtain the haploid chromosome number of 44 because nuclei contained the highest degree of bivalent condensation. we suggest that meiosis I occurs after differentiation of the gonad in juveniles and the ovary continues to accumulate arrested oo¨cytes in previtellogenic growth. 2006) are two separate physiological processes. they found that it was extremely difficult to locate well-spread nuclei for analysis. leaving homologous chromosomes attached by chiasmata. This was easier to process than the paraformaldehyde fixative and silver staining that is commonly used. and by the time of spawning. Campos-Ramos. annelids. the oo¨cyte resumes meiosis. intermolt. chinensis using transmission electron microscopy. Hertzler (2005) has documented the arrested oo¨cyte stage at metaphase I in spawning females. previttelogenic primary growth occurs from day 70 as postlarva. Most of these chromosomes are subtelocentric and telocentric (37 pairs) that. vannamei is continuous and is not related to the molt cycle. 1990. (1993). Early diplotene nuclei in both genders had. DNA synthesis in testes at the pre-molt stage is at least three times higher than at the post-molt and inter-molt stages. The nuclear mean diameter gradually diminished from the zygotene (95 6 16 mm in females. and therefore. a reduction and disabling of the SC occurred.. 1991). and when compared to the inter-molt stage of the blue-claw morphotype (Sagi et al. Mean sperm counts (6 SE) from the vas deferens and spermatophorores during molt stages of Litopenaeus vannamei. Sperm counts from vas deferens and spermatophores were not significantly different during the molt stages (Table 1).. no other bivalent structures. such as the orange-claw morphotype of male freshwater prawn M. The production of gametes by meiosis (non-molt related) and the elimination of old sperm (molt-related) (Heitzmann et al. including arthropods. secondary oo¨cyte maturation (vitellogenin) takes place. hence. some mollusks. Mean nucleus diameter (6 SD) at zygotene. According to Bernhard (1990). the molt cycle. Stage B postmolt Stage C intermolt Stage D1 premolt Stage D3 premolt 1581 6 243 1235 6 329 1356 6 219 1437 6 229 1837 6 317 1906 6 204 1765 6 212 1862 6 351 vannamei.GARZA-TORRES ET AL. 2006). The separation of the first meiotic polar body from the oo¨cyte is evident . From the arrangement of the SC and the low resolution of the technique. The diploid chromosome number in L. 1986. Female oo¨gonia (++) and male spermatogonia (+++) were observed during these molting stages. No statistical difference was obtained. There was no significant difference in the nuclear diameter at each meiotic stage between genders. Litopenaeus vannamei. the SC from gonads was best obtained through the air-dried technique using Carnoy as a fixative and stained with orcein. diplotene (Fig. Therefore. there is no a general rule that spermatogenesis should be continuous in all male species of decapods. a method to obtain better spreading of bivalents. Alcivar-Warren et al. 88 6 15 mm in males) to the pachytene (66 6 9 mm in females.. vannamei is continuous. and the haploid number is 44 bivalents (Chow et al. Yano. and diplotene stages in females and males. Therefore. specifically. which support the histological observation of Heitzmann et al. At adulthood. B) were observed at post-molt. 4). have an o-ring configuration during early . Parnes et al. . (2008) observed tangled bivalents without revealing further characteristics. 1988). Spermatids (++++) and immature sperm (++++). 7 min after spawning (Dumas and Campos-Ramos. which agrees with Heitzmann et al. recognized by the complete synapsis of bivalents. of the 44 bivalents. 1997). As the first meiotic prophase continued to the diplotene stage. 40 with an o-ring configuration and the rest had a ‘‘v’’ configuration (Fig. and the tunicates arrest the oo¨cytes in Metaphase I. neither technique was able to unravel bivalents. Most of the meiotic cells in both genders remained at the pachytene stage. 60 6 8 mm in males) and to diplotene (42 6 10 mm in females. Because of high chromatin density. and only males showed a few mitotic nuclei containing 88 chromosomes (Fig. According to Garza-Torres et al. 1999). more than a 50% decrease (Fig. At these stages. According to CamposRamos (1997). and spawning. In other decapods. Some reports of female decapods indicate that meiosis I in oo¨cytes begins at the onset of spawning (Qiu. such as kinetochores and attachment plaques were observed. (2009). as well as previtellogenic oo¨cytes (+++) were common during the molt cycle. vannamei showed the general features of prophase I that are observed in eukaryotes. (1993).

which is sexlinked to the female W-sex chromosome (Bowen. In marine shrimp. J. Masabanda. Ako. In any case. E. Warren. J. Sterling. A. Obrego´n-Barboza.. T. (2008) observed all-female triploid shrimp and stated that it was not possible to explain the sex-determining mechanism. In. Thanks to Adriana Landa for technical assistance. a scenario that is common in gonochoric animals since achiasmatic meiosis is rather rare. London. 2006a.g. Ginsburger-Vogel and Charniaux-Cotton. Garza-Torres. Z. Penman. J. A. ACKNOWLEDGEMENTS Funding was provided by Centro de Investigaciones Biolo´gicas del Noroeste and Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologı´a (CONACYT grant 101556-2008) awarded to RCR. and G. Metabolism and Growth. On some species of the genus Palaemon Fabr. and K. W.. Preston. T. S. Bate. B. In freshwater prawns and marine penaeid shrimp. Dougherty. B. This explanation seems controversial because triploid male shrimp do exist. and P. Journal of Crustacean Biology 17: 666-673. it also appears that a WZ sex determination system is common (see CamposRamos et al. 2008. These observations suggest that there is recombination in most bivalents in both genders. Browdy. Aquaculture Research 37: 1583-1593. Kirk (eds. Xu. 24: i–xc + 1–942. chinensis (Li et al. Rothlisberg. Sharples. Guerrero-Tortolero. pp. 441-447. which could represent bivalents having a ‘‘v’’ configuration and where only one crossover occurs. a sexlinked mutation. Bard.. Chromosome studies on the marine shrimps Penaeaus vannamei and P. A. (2003) observed a skewed sex to female in a 4:1 proportion in triploid shrimp. In. W. Talbot (ed. Barlow. J. 1999. Guerrero-Tortolero. MaedaMartı´nez. S. A. Vol. Notes from the Royan Zoological Museum of the Netherlands at Leyden 1 (41): 165-184. Moss. In. G. Morphological and biochemical changes in the muscle of the marine shrimp Litopenaeus vannamei during the molt cycle. D. S. S. Charniaux-Cotton. Bernhard. V. W. 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