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MARIANA FICHER

73317

MAYARA B. ROSSI DE ALMEIDA

73088

THAIS ISEPPE BALAN

Extrao, Purificao e Isolamento da enzima Batroxobina


FARMCIA 4 PERODO

Trabalho
apresentado

disciplina
de
Enzimologia do Curso de Farmcia do Centro
Universitrio Hermnio OmettoUniararas.

Prof.MauricioMazzi

ARARAS/SP
NOVEMBRO/2013

INTRODUO
No Brasil so conhecidas aproximadamente 260 espcies de serpentes
divididas em 9 famlias, que podem ser encontradas por todo o pas.Porm
existem4 principais famlias: Colubridae (189 espcies), Boidae (10 espcies),
Viperidae (22 espcies) e Elapidae (18 espcies). Segundo a Fundao
Nacional da Sade, aserpente peonhenta que mais preocupa a Sade Pblica
a Bothrops, da famlia Viperidae (Cardoso,2005).
O gnero Bothrops possui aproximadamente 30 espcies, e as mais
conhecidas so: Bothrops atrox, Bothrops erythromelas, Bothrops jararaca,
Bothrops jararacussu, Bothrops alternatus e Bothrops neuwiedi. As Jararacas
so causadoras de mais de 90% dos ataques ofdicos no Brasil, elas so mais
encontradas em litorais e possuem hbitos noturnos e terrestres, e so
agressivas, em sua maioria (Castro, 2011).
O que muitos no sabem que por mais apavorante que uma serpente
possa ser, elas podem nos trazer muitos benefcios medicinais alm de
controlar a populao de roedores e pragas. Tambm tem grande importncia
em pesquisas relacionadas coagulao sangunea, devido ao de suas
hemotoxinas (Stidworthy, 1974).
O veneno da Bothrop s complexo e possui diversas substncias com
atividade proteoltica, hemorrgica e coagulante. Dentre elas esto as
serinoproteases, que apresentam atividade enzimtica tendo outras protenas
como substrato,exercendo efeitos sobre a hemostasia circulatria, e uma delas
a Batroxobina a qual o nosso principal tema a ser abordado (Bittencourt,
2011).
A Batroxobina uma enzima trombina-smile (similar trombina) que
tem ao direta sobre o fibrinognio convertendo-o em fibrina. Desempenha
uma atividade coagulante ou anticoagulante, atravs da inibio ou ativao
dos fatores de coagulao, e no sofre interferncia pela heparina, que atua na
trombina impedindo a transformao do fibrinognio em fibrina (Buchi, 2010).

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Entendem-se

como

ativadores

do

tipo

pr-coagulantes

os

componentes do veneno que clivam o fator X ou fator II (pr-trombina) da


cascata de coagulao, gerando trombina. No entanto, os ativadores do tipo
trombina-like so aqueles que clivam diretamente o fibrinognio em fibrina, sem
a necessidade de gerao de trombina (Braudet al., 2000).

utilizada

como

medicamento

no

tratamento

de

doenas

trombticas,infarto do miocrdio ou em kits laboratoriais para diagnstico de


doenas da coagulao sangunea, onde detecta os nveis de fibrinognio e se
h deficincia ou anormalidade nos mesmos (Castro, 2011).
Sua extrao pode ser feita atravs de liofilizao, e sua purificao e
isolamentopode ser feita atravs da cromatografia por excluso molecular e
HPLC de fase reversa, aps pode-se aplicar em eletroforese em gel de
poliacrilamida. As tcnicas apresentam certa dificuldade e alto custo, e obtmse pequenas quantidades da enzima, mas para solucionar tais problemas
possvel utilizar tcnicas de clonagem como expresso de protenas
recombinantes para produzir a enzima em alta escala (Cardoso, 2005).

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Caractersticas:
A Batroxobina uma serino-protease que diminui os nveis de
fibrinognio no sangue, agindo de forma similar a trombina. um glicopeptideo
de cadeia simples, com uma massa molecular de 28 a 60kDa, acredita-se
ocorrer este tipo de variaopara cada espcie de serpente.
Apresenta atividade anticoagulante in vivo e pr-coagulantein vitro. Na
figura 1 abaixo, a estrutura da Batroxobina recombinante.

.
Figura 1. Batroxobina recombinante.

Serinoproteases:
So enzimas proteolticas abundantes nos venenos de serpentes da
famlia Viperidae e constituem aproximadamente 20% do total de protenas.
Pertencem a uma famlia de peptidases conhecidas como Tripsina e
desempenham muitos papis biolgicos, principalmente na digesto (tripsina e
quimotripsina), hemostasia (fatores de coagulao) e resposta imune medida
por IgA.Por issotemgrande procura na rea farmacutica como alvo de drogas
relacionadas hemostasia.

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Trombina:
Enzima

multifuncional

que

desempenha

importante

funo

na

hemostasia. Alm de atuar sobre o fibrinognio produzindo fibrina, um


potente ativador de plaquetas, promovendo a sua ativao e agregao.
Apresenta tambm propriedades anticoagulantes, ativando a protena C. Seu
pH timo de aproximadamente 7,3 sendo compatvel ao do sangue.
um fator importante na complexa cascata de coagulao, onde na
figura 2 estrepresentado de forma clara sua ao.

Figura2. Cascata de coagulao simplificada.

Trombina-Smile:
As enzimas presentes no veneno botrpico so ditas com atividade do
tipo trombina que atua diretamente no fibrinognio convertendo-o em
fibrina,sem formao de trombina. Quando as cadeias de aminocidos do
fibrinognio

so

expostas

essas

enzimas

uma

liberao

de

fibrinopeptdeos A e/ou B, dependendo do local em que o fibrinognio


clivado, observando-se a formao de um cogulo de fibrina (atividade
trombina-smile) ou ainda a destruio da molcula de fibrinognio (atividade
fibrinogenoltica)

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A Batroxobina no ativa o fator VIII da cascata de coagulao
(responsvel pela formao de cogulos densos) e age diretamente no
fibrinognioclivando fibrinopeptdeo A que gera monmeros de fibrina,
resultando

em

cogulos

frgeis

translcidos,

que

so

facilmente

dissolvidos.Abaixo, a Tabela 1mostra a comparao entre a Trombina e


aBatroxobina.

Tabela 1. Comparao ente Trombina e Batroxobina

Heparina:
Anticoagulante natural extrado do fgado. Ela atua inibindo a trombina,
impedindo a transformao de fibrinognio em fibrina, tornando o sangue mais
fluido e aumenta a concentrao de lipdeos na circulao. utilizada em
sndrome coronariana aguda, trombose venosa profunda, embolia pulmonar,
etc. Devido ao seu efeito anticoagulante, cria um grande risco de sangramento
excessivo (hemorragias), trombocitopenia (queda do numero de plaquetas),
reaes alrgicas, entre outros.
A Batroxobina no sofre sua ao,pois no forma trombina, assim pode
ser utilizada em testes de coagulao em pacientes que esto fazendo uso de
heparina que no ocorre interaes entre elas.

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Ao Teraputica e Uso em diagnstico:
Serinoproteases principalmente aquelas com atividade trombina-like esto
sendo ferramentas teis nos estudos de aplicaes clinicas devido a potencial
aplicao teraputica como infarto agudo do miocrdio, desordens do sistema
de coagulao sanguinea, trombose arterial e venosa. Estratgias em inibir a
trombognese tem como objetivo o uso teraputico de inibidores da funo
plaquetaria, anticoagulantes, que previnem a deposio de fibrina.
Diferente da Trombina que produz cogulos firmes e resistentes , as
serinoproteases hidrolizam o fibrinognio produzindo ento cogulos mais
frgeis mais facilmente dissolvidos pelo sistema fibrinoltico. O resultado a
diminuio do estoque de fibrinognio in vivo, obtendo um efeito anticoagulante
, que consequentemente reduz a viscosidade do sangue e melhora o fluxo
sanguineo.
So bastante conhecidos como agentes

desfribrinogenantes

as enzimas:

ancrod (isolada de Callosellasma rhodostoma) , batroxobina(isolada da


peonha Bothrops atrox) e crotalase (isolada de Crotalus adamanteus), essas
trs enzimas apresentam atividade coagulante in vitro, proteoltica e estersica,
embora o mecanismo de ao desfibrinogenante seja um efeito proteoltico
sobre o efeito do fibrinognio circulante.
Ancrod e batroxobina tem sido usadas em pacientes com trombose profunda e
infarto do miocrdio e trombose arterial perifrica. O tratamento bem tolerado
e com efeitos colaterais raros.
Batroxobina tambm til em testes diagnsticos para mensurar nveis de
fibrinognio em presena de heparina (tempo reptilase), para caracterizar
funes do fibrinognio em desfibrinogenemias e para remover fibrinognio de
amostras para testes trombina dependente. A presena de

produtos de

degradao de fibrina, hipofibrinogenemia, e defeitos na polimerizao de


fibrina ( desfibrinogenemia) acarretam no prolongamento do tempo reptilase.
A composio protica das peonhas de serpentes, tem assumido uma
importncia significativa onde toxinas isoladas tem sido reveladas como

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valiosos instrumentos de pesquisa no apenas no aspecto teraputico
especifico ligado a acidentes ofdicos , mas tambm por seu amplo potencial
farmacolgico que atuam no equilbrio hemosttico e investigao da funo
plaquetria.
A Tabela 2 apresenta as substncias originadas de veneno de serpentes
utilizada pra tratamentos e diagnsticos laboratoriais.

Tabela 2: Substncias do veneno de serpentes utilizadas em tratamentos e


diagnsticos.

Veneno Precioso
O fracionamento das peonhas no Brasil s feito por laboratrios
ligados a universidades e institutos de pesquisa, mas muitas empresas de
biotecnologia esto pesquisando derivados sintticos para substituiros
componentes presentes na mesma.
A indstria farmacutica chega a pagar at US$ 500 pelo grama do
veneno cristalizado de jararaca, o que equivale a 22 vezes o preo do grama

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de ouro, mas os investimentos so altos, as cobras morrem facilmente e os
mtodos de extrao so traumticos para elas, podendo ser feitas apenas
uma vez ao ms. extrado aproximadamente 300 mg de veneno e aproveitase pouco destes ricos componentes, que so perdidos nos processos de
purificao.
So exigidos altos padres de qualidade dos laboratrios que utilizam a
peonha para produo de frmacos, j que ela possui muitas toxinas de
funes diferentes e complexas, que podem trazer muitos riscos sade.

Veneno que cola


Um aspecto interessante destas enzimas encontradas nas Bothrops
a capacidade de formar uma espcie de cola de fibrina, que um agente
homeosttico e selante para os tecidos degradados podendo ser utilizado em
processos cirrgicos.
Composta por fibrinognio, fibrina e ons de clcio. As molculas de
fibrinognio so clivadas e convertidas em monmeros de fibrina, principal
componente do cogulo formando uma rede adesiva.
Esta colatem efeito imediato e pode ser aplicada principalmente em
rgos slidos como a pele, nervos, fgado e corao. Em artrias deve-se ter
muito cuidado, pois pode haver um entupimento das mesmas.

Doena de Von Willebrand


uma doena de origem gentica que provem de uma deficincia ou
diminuio da protena chamada de fator de von Willebrand (FvW) que junto
com o fator VIII forma um complexo estvel de no-coagulao e coagulao
respectivamente.

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Isto ocorre devido a uma mutao no cromossomo 12,que no
interrompe um sangramento como deveria, causando hemorragias. Ela ainda
no tem cura e deve ser tratada com medicamentos quando necessrio.
Uma queda no nmero de plaquetas pode ser decorrente da
Batroxobina, pois possui atividade agregante plaquetria na presena de fator
de Von Willebrand.

Tempo de Trombina
O tempo de trombina (TT) feito adicionando-se a trombina humana a uma
amostra de plasma. A trombina converte o fibrinognio solvel em fibrina,
formando o cogulo. O tempo normal de 17-24 seg, sendo que aps 60
segundos, o cogulo encontra-se slido, firme e aderente parede do tubo
quando este invertido. Um tempo de trombina alargado ou a formao de um
cogulo

sem

as

caractersticas

acima

citadas

existe afibrinogenemia, hipofibrinogenemia (fibrinognio

significa

que

plasmtico

<

lOOmg/dL) ou disfibrinogenemia. A coagulao intravascular disseminada


(CIVD) o principal exemplo prtico de uma hipofibrinogenemia grave
adquirida.

Tempo de Reptilase
O tempo para a formao do cogulo medido aps a adio de uma
concentrao de trombina exgena ao plasma.Este ensaio depende da taxa de
formao da fibrina. Quando o plasma suficientemente diludo, o fibrinognio
se torna o fator limitante na formao do cogulo quando a trombina aderida.
O tempo de formao do cogulo ento mensurado. As quantidades de clcio
aderida no teste deve ser ajustada para dar um tempo "normal" de formao do
cogulo plasmtico entre 8 e 9 segundos. Limitaes do teste: afetado pela
concentrao e reatividade do fibrinognio, aumentado na presena de
produtos de degradao do fibrinognio e na presena de substncias

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inibitrias como a heparina e quando h grande quantidade de produtos de
degradao da fibrina.
TEMPO DE REPTILASE: este reagente obtido do veneno da Bothrops Atrox ,
sendo utilizado no lugar da trombina exgena, para a diferenciao de vrias
causas de alargamento do TTPA (tempo de trmboplastina parcial ativada). O
reptilase

normalizar

tempo

de

coagulao

quando

causa

do

prolongamento do TT for o uso de heparina. Se com a utilizao da reptilase o


tempo de formao do cogulo ainda se mantiver anormal isso indica que a
causa possa

ser uma hipofibrinogenemia ou disfibrinogenemia.

Uma

concentrao de reptilase adicionada ao plasma e o tempo de formao do


cogulo medido. A hipofibrinogenemia e a presena dos produtos de
degradao do fibrinognio prolongaro o tempo de formao do cogulo. A
heparina no afeta o tempo de reptilase.

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EXTRAO, PURIFICAO E ISOLAMENTO DA ENZIMA BATROXOBINA

Extrao
Coletar o veneno da serpente Bothrops em micro tubos e congelar em 20C. Liofilizar, pesar, pegar uma pequena amostra e estocar mantendo
refrigerao.
Isolamento e Purificao
Para a realizao da purificao optou-se como primeiro passo, o
processo de cromatografia por excluso molecular. Amostras de 50mg do
veneno bruto de Bothropsatroxforam suspensas em 1ml de tampo bicarbonato
de amnio (NH4HCO3) 1M pH 8,0 e centrifugadas a 9000 rpm durante trs
minutos, o sobrenadante foi aplicado em coluna cromatogrfica de excluso
molecular contendo Sephadex G-75 previamente equilibrada, e eluda com
tampo bicarbonato de amnio 0,5 M pH 8,0.
Fraes

de

2,5

ml

foram

coletadas

monitoradas

em

espectrofotmetro a 280nm. Todas as fraes foram submetidas avaliao de


atividade proteoltica para o reconhecimento da atividade de serinoprotease
com o substrato BApNA (Nbenzoil- D,L-arginilparanitroanilida). Este substrato
sinttico que cliva na ligao de arginina liberando o cromforo p-nitroanilina
como produto da reao de hidrlise, a qual produz uma colorao amarela.
A frao com atividade de serinoprotease foi purificada em uma coluna
analtica de HPLC de fase reversa.
As amostras obtidas da etapa de purificao HPLC-F R foram
analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de SDSPAGE.

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RESULTADOS
O perfil cromatogrfico do veneno de Bothropsbarnettiem Sephadex G75 mostrou seis fraes denominadas Bbt-I, Bbt-Ia, Bbt-II, Bbt-IIaBbt-III, Bbt-IV
(Figura 4). As fraes foram submetidas a ensaios de atividade proteoltica
sobre o BApNA para deteco da frao de interesse com maior atividade
enzimtica, assim mesmo foram testados ensaios de tempo de coagulao
sobre fibrinognio bovino com o propsito da identificao da serinoprotease.
Os resultados mostram que a frao Bbt-Ia apresentou maior atividade
enzimtica e um tempo de coagulao maior em comparao com as outras
fraes. A frao Bbt-Ia foi coletada e quantificada para sua purificao.

Figura 3. Cromatografia de excluso molecular em Sephadex G-75 (110 x 4,0cm) do


veneno bruto de Bothropsatrox.

A frao em estudo foi submetida cromatografia em HPLC de fase


reversa

em

coluna

de

hidrofobicidade

analtica.

perfil

cromatogrficoapresentou um total de 13 picos (Figura 5). S a frao 11


apresentouatividades enzimticas com propriedades serino-protease de tipo
trombina- like e foi nomeada de TLBbar. A protena de interesse foi eluda em

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tempo de reteno de 41minutos e 60% de tampo B (60% de acetonitrila,
0,1% de TFA).

Figura 4. Cromatografia lquida de alta eficincia em coluna de fase reversa C8 da


frao Bbt-Ia (frao de excluso molecular). Os picos foram monitorados na absorbncia de
280nm.

Eletroforese SDS-PAGE
A figura 6 mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida do veneno
total de B.atroxe das fraes correspondentes aos passos cromatogrficos,
como so exclusomolecular G-75 e HPLC fase reversa. A frao 4apresenta
uma nica banda proteica (massa molecular aparente de 28 kDa) de
mobilidade eletrofortica restrita que denota homogeneidade molecular.

Figura 5. Eletroforese em gel de poliacrilamida.

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Confirmao do grau de pureza de TLBbar
A confirmao do grau de pureza da serinoprotease isolada do veneno
de Bothropsatroxfoi obtida atravs de HPLC em coluna de fase reversa. A
Figura 7 apresenta um perfil com um nico pico agudoque foi eludo com tempo
de reteno de 41 minutos.

Figura 6. Cromatografia lquida de alta eficincia em coluna de fase reversa.

Avaliao da atividade coagulante


Foram analisadas as atividades coagulantes das 13 fraes obtidas da
cromatografia HPLC fase reversa e avaliada a concentrao de protena de
cada umadelas pelo mtodo de Bradfor. A frao que apresenta maior
atividade coagulante TLBbar (frao 11). Ela registra um tempo de
coagulao sobre fibrinognio bovino de 8 segundos, as demais fraes(exceto
a 12) coagularam aps de 60 segundos (Tabela 3).

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Tabela 3. Atividade coagulante sobre o fibrinognio bovino das fraes obtidas da


cromatografia de HPLC e concentrao de protena obtida da purificao (Atividade coagulante
foi expressa em segundos).

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DISCUSSO
Na Amrica do Sul, venenos de serpentes do gnero Bothropsvm
sendoestudados devido a sua predominncia e importncia mdica em pases
como Brasil,Argentina, Colmbia, Equador, Venezuela, Bolvia e Peru, j que
as serpentesbotrpicas so as responsveis por 90% dos acidentes ofdicos
que acontecem nestespases (Funasa, 2002).
O veneno de serpentes formado por uma mistura de peptdeos e
protenas (principalmente enzimas), os quais conferem ao veneno as
propriedades farmacolgicas.
As Serinoproteases de veneno de serpentes (SVSPs) esto entre as
enzimas de venenos melhores caracterizadas e afetam o sistema hemosttico.
Elas atuam sobrevrios componentes da cascata de coagulao, causando
sobre as clulas dapresa um desequilbrio no sistema hemosttico, atividades
semelhantes trombina, porisso as SVSPs so tambm chamadas de
trombina-like (Serrano, 2005).
O isolamento das SVSPs trombina-like de grande interesse para a
comunidade cientfica, devido ao desenvolvimento de reagentes diagnsticos,
no tratamento dealteraes hemostticas (Marsh; Williams, 2005).
Devido s diferenas naturais e a biodiversidade das enzimas entre as
serpentes de diferentes espcies e origens geogrficas, o estudo de novas
serinoproteases podeprover conhecimentos relevantes para o entendimento de
suas funes para a busca denovas alternativas farmacolgicas.
At o presente momento nenhum estudo abordou a caracterizao
bioqumica, estrutural ou farmacolgica de serinoproteases do veneno de
Bothropsatrox. Opresente trabalho descreve o isolamento e purificao de uma
serinoprotease comoatividade trombina-like denominada TLBbar.
A enzima de interesse (batroxobina) foi purificada atravs da
combinao de duas etapas cromatogrficas:

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Cromatografia de excluso molecular Sephadex G-75 seguida de
HPLC de fase reversa (C8), usando bicarbonato de amnia (0,5 M) e
acetonitrila (66%), respectivamentecomo tampes de eluio. Este tampo tem
a vantagem de no interferir na atividadeenzimtica das amostras, conferindo
rapidez ao processo e mantendo afuncionalidade das protenas, podendo ser
utilizadas em estudos biolgicos posteriores.
O perfil cromatogrfico de excluso molecular do veneno total de
Bothropsatroxapresenta seis fraes (Bbt-I, Bbt-Ia, Bbt-II, Bbt-IIa, Bbt-III, BbtIV) (Figura3). Atividades coagulantes s foram encontradas na frao Bbt-Ia.
HPLC de fase reversa da Bbt-Ia permitiu isolar 13 fraes (Figura 4). A
frao 11 evidenciou alta atividade coagulante com um tempo de coagulao
de 8segundos (tabela 3), as outras fraes coagularam aps 60 segundos.
Portanto, a frao11 que foi denominada como TLBbar confirmou sua atividade
serinoproteasesrealizando-se a caracterizao enzimtica e farmacolgica.

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CONCLUSES
A metodologia utilizada no processo de purificao de TLBbar a partir
do veneno Bothropsatrox, demostrou ser rpida e eficiente conservando as
suasatividades biolgicas.
TLBbar uma serinoprotease com massa molecular relativa de ~28,5
kDaconformada por 258 resduos de aminocidos e um ponto isoeltrico de
7,5. SerinoproteaseTLBbar com atividade trombina-like apresenta atividade
procoagulantesobre plasma humano, evidenciado na dose coagulante mnima
(DCM) de31,14g assim mesmo foi evidenciado alta coagulabilidade (8
segundos) sobrefibrinognio bovino.
A TLBbar pode ser considerada uma nova serinoprotease trombinalike, com potencial clnico, j que no apresenta efeitos txicos (miotoxicidade,
edema,hemorragia), pelo contrrio, evidencia um potente efeito pr-coagulante.

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