LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRA

Juan David Grisales Cardona

Juan David Jaramillo Orozco
Daro Ricardo Ortega Jaramillo
Mara Camila Zuleta Gonzales

John Querubn Franco Aguirre

INSTRUMENTACIN Y METROLOGA I

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
ESCUELA DE MICROBIOLOGA
MEDELLN
2013

OBJETIVOS

1. Reconocer el adecuado funcionamiento del espectrofotmetro.

2. Determinar experimentalmente la longitud de onda ptima de tres
soluciones coloreadas por medio de la realizacin de una curva espectral.
3. Analizar los datos obtenidos en las pruebas de precisin y exactitud.
4. Comprender el funcionamiento del espectrofotmetro en calidad del tiempo.
5. Relacionar el uso de la espectrofotometra con el campo de estudio de la
microbiologa.

1- MARCO REFERENCIAL
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar
la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas que
absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida dependen de forma lineal de la concentracin. Adems es usada para
identificar compuestos por su espectro de absorcin y conocer la concentracin de
un material o sustancia, esto ltimo permite, seguir el curso de reacciones
qumicas y enzimticas as como determinar enzimas y protenas incluso cidos
nucleicos. [1]
Para hacer este

tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, como ya

sabemos es un equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por
medio de una longitud de onda especifica. La cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la concentracin del soluto presente, es entonces as que
la concentracin de un soluto colorido en solucin puede ser determinada en el
laboratorio mediante la medicin de su absorcin de luz a una longitud de onda
especfica.
Las muestras en estos equipos se utilizan en estado lquido y se colocan en el
compartimiento de las muestras de celdas transparentes de diferentes tamaos y
materiales.

En espectroscopia el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de radiacin

electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es
una regin de energa muy alta.
En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que
corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la longitud
de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada.
La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm.
La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad
de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y l a
absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos
indica la cantidad de luz absorbida por la misma,

Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud
de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin:
A = log I/Io = cl
La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su concentracin
a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con ellas-; tambin
depende de la distancia que recorre la luz por la solucin a igual concentracin,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms molculas se encontrar; y por ltimo, depende de , una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extincin- que es especfica de cada cromforo

2- ESPECIFICACIONES TCNICAS DEL EQUIPO:

Interfaz estndar de interfaz serial: RS-232-C
Rango de medicin: 0 a 2500 A
Exactitud fotomtrica: < 0.005 A 0 a 0.500 A
< 1 % 0.501 a 2500 A
Precisin fotomtrica < 0.003 A 0 a 0.600 A
< 0.5 % 0.601 a 2500 A
Deriva: 0.003 A en 30 en 30 min
Rango de longitud de onda: precisin alta en los 7 filtros 340, 405, 500, 5046,
578,620, 670 nm
Paso de banda: Rango UV (340 nm) = 10 nm
Rango visible (405-670 nm) < 6 nm
Compartimiento de cubeta: para la celda de flujo y cubetas desechables,
temperatura controlada.
Control de temperatura: usa regulador de temperatura 25 C 30C o 37 C ;
estabilidad < 0.1 C hasta 20 C.
Temperatura ambiente, estabilidad < 0.2 C hasta 15 C 32 C

Cubetas: utilice solamente,

AMES Semi microcuvettes 500 a 2100 microlitros
AMES microcuvettes
Aspirasinprogrammable de volume(500 a 6000 microlitros)

3- TABLAS Y GRAFICOS

1. LECTURA

ESPECTRO

DE

ABSORCION

PARA

SOLUCIONES

COLOREADAS:
LONGITUD DE

SOLUCION

SOLUCION

SOLUCION

ONDA

AMARILLO-

ROJA

AZUL

VERDE

Tabla 1

340

0.296

0.254

0.114

405

1.426

0.138

0.194

500

0.072

0.518

0.232

546

-0.005

0.410

0.615

578

-0.001

0.188

0.838

620

0.001

0.006

0.265

670

-0.003

0.001

-0.002

Absorbancia

Espectro de la solucin amarillo-verde

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2

340

405

500
546
578
Longitud de onda

620

670

Grfico 1

Absorbancia

Espectro de la solucin azul

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1

340

405

500

546

578

620

670

Longitud de onda

Grfico 2

Espectro de la solucin roja

0.6

Absorbancia

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
340

405

500

546

578

620

670

Longitud de onda

Grafico 3

2. CONTROL DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA

LONGITUD DE
ONDA

500nm

ABSORBANCIA
0.403
0.404
0.404
0.405
0.405
0.405
0.405
0.404
0.404
0.405

DS 6.99 x10-4

X: 0.404

Tabla 2
3. CONTROL DE ESTABILIDAD FOTOMETRICA

ABSORBANCIAS EN 500 nm
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,404
0,403
X 0.4037
DS 4.63 x10 -4

0,404
0,404
0,403
0,403
0,403
0,403
0,403

Tabla3

Absorbancia en longitud de onda

de 500 nm

Estabilidad fotomtrica
0.4042
0.404
0.4038
0.4036
0.4034
0.4032
0.403
0.4028
0.4026
0.4024

Grfico 4

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480 510 540 570 600
tiempo en segundos

4- CALCULOS:
A. EXACTITUD Y PRECISION

%Inexactitud = (Absorbancia hallada-Absorbancia Esperada)

Absorbancia Esperada

= 0.404 0.408 * 100

0.408
=

Imprecisin

-0.98 %

CV = DS

* 100

X
CV = 6.99 x10-4 *100

= 0.17 %

0.404
B. ESTABILIDAD

Deriva = (Absorbancia final- Absorbancia inicial)

Absorbancia inicial
= 0.403 -0.404 *100

= - 0.2 %

0.404

Ruido

CV = DS

* 100

X
CV = 4.63 x10-4
0.4037

*100

= 0.115 %

*100

* 100

5- METODOS

METODO PARA MYB

Bilirrubina: mtodo colorimtrico para la determinacin de bilirrubina directa y total

en suero y otros lquidos biolgicos. [2]
La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanli-co diazotado
produciendo un pigmento color rojo-violceo (azo-bilirrubina) que se mide
fotocolorimtricamente a una longitud de onda de 530 nm. Si bien la bilirrubina
conjugada (directa) reacciona directamen-te con el diazorreactivo, la bilirrubina no
conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que
posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubinatotal
(conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de
cafena al medio de reaccin.
La bilirrubina es un producto de desecho derivado del grupo hemo de la
hemoglobina de los eritrocitos daados o senescentes, que son destruidos en las
clulas retculoendoteliales. Una vez producida, la bilirrubina se transporta al
hgado en asociacin con la albmina. La bilirrubina en el hepatocito se conjuga
con el cido glucornico y se excreta en la bilis. Existen una serie de
enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a la produccin, captacin,
metabolismo y excrecin de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia. [3]

METODO PARA MIA

Determinacin de fosfatos en aguas por espectrofotometra:

Para la determinacin del contenido de fosfatos solubles en una muestra de agua
mediante espectrofotometra ultravioleta-visible. Se aplica el mtodo de adicin
estndar para eliminar interferencias con otros compuestos.
El mtodo propuesto para determinar fosfatos se basa en la formacin de un
heteropolicido con el reactivo vanado-molbdico (de color amarillo y soluble en
agua) cuya absorcin de luz se mide a 420 nm. Para el ortofosfato, la formacin
de este complejo tiene lugar segn la reaccin:

(PO4)3 + (VO3) + 11(MoO4)2 + 22 H+ P(VMo11O40)3 + 11 H2O (1)

En esta identificacin interfieren concentraciones apreciables de Fe(III), silicato y
arseniato, entre otras especies. Es decir, estas especies absorben luz a la longitud
de onda utilizada (420 nm, absorcin del P(VMo11O40)3). Para eliminar dicha
interferencia se preparar un blanco (sin fosfato) cuya absorbancia se restar de
la del resto de las muestras. Adicionalmente, es posible que la absorbancia del
complejo se vea afectada por efectos de matriz. La matriz puede potenciar o
atenuar la absorbancia de luz por el complejo, lo cual puede conducir a resultados
errneos. Para minimizar este efecto, aplicaremos el mtodo de adiciones
estndar, que consiste en la adicin de cantidades crecientes del analito de inters
(fosfato en nuestro caso) a una cantidad fija de muestra. ste procedimiento
resulta ms efectivo que un calibrado externo (recta de calibrado con disoluciones
patrn) cuando la matriz interfiere en la deteccin. En esta prctica estudiaremos
la importancia de los efectos de matriz, determinando la concentracin de fosfato
mediante ambos mtodos y comparando los resultados.

5- ANALISIS
En el experimento de lectura del espectro de

absorcin para soluciones

coloreadas, se obtuvieron datos que correspondieron debidamente a cada rango

de longitud de onda ptima de cada color indicado por la teora. Estos fueron
(referencie tabla 1):
Para la solucin amarrilla (esta solucin se torna un poco amarillo verdoso) en la
longitud de onda que se determin mayor absorbancia (1.426) fue en 405 nm, y
en el grfico 1 se puede evidenciar ms puntalmente; por ende la longitud de onda
optima para una solucin amarilla es de 404 nm.
Para la solucin de color azul se demostr que la longitud de onda optima es 578
nm, ya que se present una absorbancia mayor (0,838) con respecto a las dems.
(Grfico 2). Aunque la longitud de onda ptima para el color azul es de 580, el
espectrofotmetro utilizado no la tiene, en su reemplazo nos permite utilizar la de
578 nm.

En la solucin de color rojo en la longitud de onda que alcanza una mayor

absorbancia es en 500 nm, a esta longitud de registr 0.518 de absorbancia.
(Grfico 3).
En la prueba de control precisin y exactitud fotomtrica (referencie tabla 2), los
datos arrojados por el instrumento estn dentro de los limites de aceptabilidad,
puesto que al hacer los clculos se confirma una inexactitud de -0.98 % y el
%inexactitud aceptado es de +-3 %. El instrumento tiene exactitud. Al calcular la
impresin del instrumento obtenemos un coeficiente de variacin menor de 1.5 %
el cual fue de 0.17%, podremos decir entonces que el instrumento presenta
precisin.
En el experimento de estabilidad fotomtrica se observa una deriva del - 0.2 % y
un ruido del 0.115 %, por lo anterior se puede deducir que la medicin present
ms ruido que deriva pero en un porcentaje muy bajo encontrado dentro de los
criterios de aceptabilidad.

6- CONCLUSIONES

El conocer el adecuado uso del espectrofotmetro permiti obtener en el

laboratorio resultados con alta calidad analtica en las mediciones que son
emitidas por ste.

Se determin la longitud de onda ptima a las tres soluciones coloreadas

teniendo como resultados las siguientes: solucin amarilla 404 nm, para
solucin de color azul 578, y para la solucin de color rojo una longitud de
onda de 500 nm, concluyendo que los datos obtenidos experimentalmente,
se encuentran dentro de los datos tericos.

Se identific que el equipo presenta una adecuada precisin y exactitud

determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.

Se conocieron algunas aplicaciones (medicin de fosfatos en aguadeterminacin de bilirrubina en sueros) que tiene la espectrofotometra en
el campo de estudio de la microbiologa tanto industrial-ambiental como en
el bioanlisis.

CIBERGRAFIA
[1] Espectrofometra: Espectros de absorcin y cuantificacin colorimtrica

de

biomolculas.http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf
[2] http://es.scribd.com/doc/8510425/Tecnica-de-bilirrubina
[3]http://www.biosimex.com.mx/pdf/insertos/QUIMICA%20CLINICA/11515%20115
11%2011510.pdf