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').

?r/- y

Secadoy Formulacinde
ProduccinMasiva,Separacin,
Biocontroladores
Microorganismos
""
i..)'
l
."''
14.
M. l. Gmez,A. Daz,M. Forer, O.Y. Prez.Laboratoriode ControlBiolgico,ProgramaNacional
Tibaitat,Km 14 va Mosquera- Santafde Bogot,
lvllP-Corpoica,Centrode Investigacin
Colombia.E mail:cbiologico@corpoica.org.co

lntroduccin
de medianoplazo,
se considera
comounabiotecnologa
de un bioplaguicida
Lageneracin
y desarrollo
ya queel procesode investigacin
requiereentretresy ochoaosde dedicala obtende diversasetapastcnicasque aseguren
cin.Su logroimplicael cumplimiento
el aislamento
del
Dichasetapascomprenden
seguro,eficazy confiable.
cinde un producto
de su actividad
biocontroladora,
el estudio
la evaluacin
su conservacin,
microorganismo,
suproduccin
masiva,
estudios
endichaactividad,
de accinimplicados
delosmecanismos
y
de dosis formasde aplicacin,
ensayosde
formulacin,
determinacin
de preformulacin,
ambiental,
toxicdad,
ecotoxicidad,
caracdetoxicidad,
estudios
de impacto
campo,estudios
y patentamiento.
molecular,
estudos
de mercado
terizacin
puedellevarsea cabomebiocontroladores
La produccin
masivade losmicroorgansmos
aputilizando
bioreactores
conlascondiciones
semislida
o sumergida
diantefermentacin
pH,oxigenodsuelto,
ptinutrmentos,
etc)paraobtenerun rendimento
tas (temperatura,
relacionada
con el
biocontroladora
estdrectamente
mo. En muchoscasos,la actvidad
tambinestrelacionada
con el
Estaactividad
sustratoque se utilizaparasu produccin.
puesfactorestalescomoel mtodode sepamanejoquese hagade la biomasaproducida,
y lasconlosprocedimientos
de secado,formulacin
racinquese utiliceparala biomasa,
pueden
que
para
tambin
tanto
la
viabilidad
su almacenamiento
afectar
diciones se utilicen
del microorganismo.
comola actividad
bocontroladora
la cualse
en el desarroffo
de un biopfaguicida
es la preformulacin,
Unaetapaimportante
de
la
determnacin
delas
organizadas,
conducentes
a
definecomounconjunto actividades
y de loscambiosquimicos,
fsicosy
caractersticas
delprincipio
activo(elmicroorganismo)
que stepuedasufrirsoloo en combinacin
con los auxiliares
de formulacin
biolgcos
parala elaboracin
(excipientes)
final.
necesarios
delproducto
nel
B a s a d o se n l o s r e s u l t a d o sd e p r e f o r m u l a c i sne d e s a r r o l l al a f o r m u l a c i d
debenformarun
bioplaguicida,
en la cual,el princpio
activojuntoconotrosmateriales
productoactvocontrala plaga,seguroy fcilde aplicar.Esteproductodebetener
propiedades
y adherencia
de cobertura
al sustratoen el cuales aplicado.
Sin embar-

46

. Produccih Maslva, Separacin, Secado y Fonrlacin

de MicroorEa

isrnos Biocontruladorcs

go, el tipo de formulacin

que se hagade un microorganismo
biocontrolador,
debe
estarde acuerdocon el hbitaten el questevayaa seraplicado.
Si el bioplaguicida
ha de ser aplicadoen las partesareasde la planta,la formulacin
debercontener
principalmente
quele confieran
propiedades
excipientes
de adherencia,
tolerancia
a la
y
que
a
la
luz
desecacin,altastemperaturasa
ultravioleta
del sol;mentras s steha
prncpalmente
de seraplicadoen el suelo,la formulacin
debercontener
excipentes
que protejan
al microorganismo
de la antimicrobioss
del sueloy que le ofrezcanestaquele permita
bilidadantecondiciones
de pH adversas,
ascomounabasenutricional
su establecimiento.
ObjetivoGeneral
de un bioplaguicida
con baseen microorganismos
Conocerel procesode desarrollo
la secuencia
de etapasde:produccin
biocontroladores,
siguiendo
masiva,separacin,
secadoy formulacn.
La prctica
estardivididaen cuatrosubprcticas:
1. Produccin
sumergida
de microorganismos
biocontroladores
biocontroladores
2. Produccin
de microorganismos
en mediossldos
y secadode hongosentomopatgenos
3. Tcnicas
de separacn
4. Formulacin
de microorganismos
biocontroladores
SubprcticaNol: Produccinsumergdade microorganismos
biocontroladores
Objetivos
- Describire identficar
etapasinvolucradas
en el procesode produccin
de
sumergida
levadurasy de hongosentomopatgenos
comoMetarhizium
anisopliae.
- Manejarlosequposde laboratorio
relacionados
(mcroscopio,
conla subprctica
cmara
de Neubauer,
cabnade flujolaminar,baotermostatado,
fermentador
de 4 litros).
- Aplcartcnicasde laboratoro
previamente
estandarizadas
como:conteoen cmarade
preparacn
y ajustede concentracn.
Neubauer,
de inculos
Mat6riales:
Fermentador
de 4 ltroscontodossusaccesoros
y 125ml.
Erlenmeyers
de 1000ml,500ml,250ml
Beaker

Corpoica - MIP

47

I Curso-Taller Inlernacional Conlrol Biolgico

Shaker
Cabinade flujo laminar
Cmarade Neubauer
Cajasde Petri
PipetasPasteur
Tubosde ensayode 5 y 10 ml
Microscopio
Micropipetade 100 p|,5000 tl con sus respectivaspuntas

Metodologa:
1. Observarel montaiede levadurasy hongosfilamentososy compararcon las fotos dispuestasparatal fin.
2. Esterilzar
con calor seco (mechero)el asa redonda;usar cabnade flujo laminar.
3. Inocularel mediolquidoCaldo ExtractoMaltacon biomasade levaduraprovenientede
una caja de medioslidoAgar ExtractoMaltapreviamentecrecida.
4. Tomar una muestrade la suspensindel numeral3 con pipeta Pasteury depositarla
sobrela cuadrculade la cmarade Neubauer.
del inculoy
5. Leeren un cuadrantede la cmarade Neubauery calcularla concentracn
para
de 4x107
una
concentracin
ajustar
a
necesaria
la cantidadde aguadestiladaestril
clulas/m|..
25 ml del medioMLXOMcon 10 ml de la
de 125 ml conteniendo
6. Inocularel erlenmeyer
y
preparada
con
tapnde gasa-algodn.
sellar
suspensinanteriormente
temperaturay la agltacinen los valola
el
Ajustar
7. Ubicarel medioinoculadoen shaker.
previamente
res
estandarizados.
de
8. Tomaruna muestradel caldodel fermentadorde 4litros pararealizarla cuanlficacin
Comprobarel valorobteniel mtodode Somogyi-Nelson.
azcaresreductoresutlizando
do con el valoresperadoparaesta variablede respuesta
en mediolquidoen erlenmeyer
9. Observaref crecimientotipicode Metarhiziumanisopliae
d e 1 0 0 0m l .

Resultados
- El caldo orovenienlede fermentadorde 4 litrospresentaruna concentracin
aproximag/l para
seca
de
5.5
y
en
biomasa
aproximado
un
rendimiento
da de 2.5x10eclulas/ml
posteriorprocesode separacin.
- Despusde 4 das de incubacinbajocondicionesestandarizadas
se ha de obteneruna
una
concentracinde
lqudo
con
en
medo
biomasa fngica de Metarhziumanisoplae
g/1.
1x10roconidios/mly con un rendimientoen biomasaseca de 1'9

48

. Produccin Mesiva, Separacitr, Secado y Formulacin de MictoorEanisfltos Biocorrtrcladores .

biocontroladores
en meSubprcticaNo.2: Producclnmasivade microorgansmos
dios slidos
Objetivo
bsicospara la produccin
masivaen mediosslidosde
ldentificarlos procedmentos
y
y
la
anisopliae
Beauveria
basslana
cuantificar
concentracin
del hongoM.
Metarhizium
por
placa.
anisopliae mediodel mtodode conteoen
Materiales
Produccinen medio slido de arrcz (Metarhiziumanisopliael
preparadas
Cuatrobolsasde medioslidoarrozpreviamiente
Unacajade mediode cultivoconhongoesporulado
y sacabocados
Asasmicrobiolgicas
Produccinen medoslidode avena(Beauveriabassanal
preparadas
Cuatrobandejas
de medioslidoavenapreviamente
6 ml de unasuspensin
del hongoquecontenga'1X107
conidios/ml
y
Rastrillo
de Drigalsky Vrtex
Conteoen pfacade unidadesformadorasde coloniade Metarhiziumanisopliae
6 cajasde PetriconmedioS.B.R
5 tubosde ensayocon9 ml de Tween80 al 0,1%.
0.1 g de conidiosde Metarhizum
anisopliaepreviamente
tamizada.
PipetasPasteurde 100y 1000rl.
Metodologa
Produccnmasivade Metarhiziumansopliaeen medio slido de aoz
- Inocularen cabinade flujo laminarcada bolsade arozcon un discode mediode
Metarhizium
ansopllae
esporulado.
- Tapary sellarlasbolsas
- lncubarlasbolsasencuartode crecimiento
durantedocedasconluzconstante
v a 28oC
homogenizndolas
diariamente.

Corpoica- MIP

49

I C!t"-Ttll", tu".

Produccinmasivade Beauveriabassianaen medoslidode avena

- Encabinadefluiolaminar,
0.1g de
preparar
tomando
delhongoa inocular,
la suspensin
a un tubode ensayocon9 ml de Tween80 al 0.1%.
esporasfngicasy adiconandolas
por
Agitaren vrtex un minulo.
- En cabinade flujolaminar,
del hongo
inocular
cadabandejacon 1,5ml de fa suspensn
de Drigalski.
y extender
preparada
a lo largoy anchodela bandejaconrastrillo
anteriormente
- Cubrirlasbandejas
durantedocedasa 28oC.
conpapelvinipele incubarlas
Conteo en placa de unidades formadoras de colonia de Metarhizium anisopliae
-

en unvialesterlizado.
de Metarhizium
anisopliae
Pesar0,1g de conidos
I ml de Tween80 al 0,1%.
Agregarla biomasaa un tubode ensayoquecontiene
10-8,l0-9.
10-2,10-4,10-6,
sucesivas
Realizar
diluciones
En cajasde Petricon medioS.R.B.sembrar100p1de las diluciones10-8y l0-9 por
triplicado.
- Extender
de Drigalski.
en la cajaconrastrillo
la suspensn
- Incubara 28oCdurantecincodas.
- Realizar
de viabilidad.
conteode las u.f.c.porcajay evaluarlosporcentaies
Resultados
- En cuantoa la produccinmasivade M. anisopliae,despusde los doce das de
esporuladocolor
incubacindebenobtenersebolsascon el mediocompletamente
conidios/gde arroz
de 2X1010
verdeolivceocon unaconcentracin
- Encuantoa la produccin
losdocedasde incubacin,
masivadeB. bass,ana,
transcunidos
cubiertoporbiomasade color
las bandejas
con mediocomplemente
debenobservarse
de4.39u.f.c/cm'z
de medio.
en unaconcentracin
blancoy aspectopolvoso,
- Enel conteoen placade M.anisopl,ae
debenobserde loscincodasde incubacin,
despus
puntosdecolorblancosobrelasuperficie
delmedioquepuedensercontados
varsepequeos
7,8X 1010
u.f.dg
de aproximadamente
unaconcentracin
encontrando
confacilidad,
S u b p r c t i c aN o 3 : T c n i c a sd e s e p a r a c i ny s e c a d o d e m i c r o o r g a n i s m o s
biocontroladores
Objetivos
- Comprender
de separaciny secadode
las basestericasde las operaciones
biocontroladores.
microorganismos

50

. Poduccin Masit'a, Sepoacln, Secado ! Fomulacin de Microorganis

ros Biocoitrolsdores

'

- Entender
el funcionamiento
en las operaciones
de separade losequiposinvolucrados
ciny secado.
- Ubicarlasoperaciones
y secadoen la produccin
de un bioplaguicida
con
de separacin
baseen el hongoMetarhizium
anisopliae.
Materialesy equipos
20 tubosFalconparacentrifuga
JOUANG411
de
flujo
contnuo
Centrifuga
CARLPADBERG
Secadorde lechofluidoAEROMATIC
producido
Biomasa
fngicade Metarhizium
anisoplae
sobrearroz
Materialbolgico:
Metodologa
anisopl,ae
esporuladoy mezclarlacon 1 litro
1. TomarunabolsaconarrozconMetarhzum
para
lasesporasdelsustrato.
desprender
de tween80 al 0.1%
2. Pasarla mezclaanteriorporuntamizde mallade 1 mm(2 veces)conel finde separarel
fngica.
de la suspensin
sustratode produccin
la
obtenida
en el numeralanteriordurante10 minutos
3. Centrifugar suspensin
fngica
(tiempoestimado
porlitro)a unavelocidad
de flujocontide 20.000rpmen la centrfuga
nuoCARLPADBERG
4. Pesarla biomasaobteniday colocarlaen el secadorde lechofluido(previamente
por 17mina 50 oC)
precalentado
de airede entradade 125-130m3/h,y una
5. Graduarel equipocon un flujovolumtrico
delairea la entradade 50oC.
temperatura
6. Cambiarel flujovolumtrico
de airede entradaa I 05-110m3/hcuandohayantranscurriy
120minutos,comotiempototal
do 75 minutosdelsecado dejarsecarhastacompletar
delsecado.
Resultados
- Despusdel procesode separacinse obtendrbiomasafngicade Metarhizum
conun porcentaje
de humedad
del55%y unaconcentracin
de aproximadaanisopliae
mente6x1010
ufc/g.
- Despusde la operacin
fngicade
de secadoen el lechofluidose obtendrbomasa
de
Metarhiziumanisopliaecon un contendode humedaddel 10%y una concentracin
2x1010
ufc/g.

Corpoica- MIP

51

I Curso-Taller Internqcional Confiol Bioleico

SubprctcaNo4: Formulacin de microorganismos biocontroladores

Objetivo
C o n o c e rl o s d i f e r e n t e st i p o s d e f o r m u l a c i o n edsi s e a d a sc o n b a s e e n h o n g o s
y levadurastales como suspensiones
oleosas,polvosmojables,y
entomopatgenos
granulados
Materiales
Bomasafngicade los hongosMetarhiziumanisopliaey Beauveriabassana-Mezclador
HAMILTON
BEACHSCOVIL
TYLER
Granulometro
Atomizadores
Metodologa
Formulacin de suspensiones oleosas de aplicacin foliar
- Pesar3 gramosde la biomasafngicade M. anisopliae
previamente
secaday tamizada
- Incorporar
previamente
preparada.
oleosa
la biomasaa la suspensin
- Mezclarla susDensin
durante5
constante
en mezclador
Hamilton
Beachconvelocidad
minutos
- Tomar50 ml de la baseoleosay llevara 500ml conaguadestilada
- Incorporar
y aplicarel bioplaguicida
formadaen unatomizador
sobreel matela emulsin
rialvegetal
- Observar
del producto.
la adherencia
Formulacinde granuladosde aplicacinal suefo
- Granular
previamente
preparada
en ungranulador
la pastaa basedelhongoB. bassiana
de malla2.00mm.
- Colocarlosgrnulos
y secarlosa 25oCen estufade
de afuminio
formulados
en bandejas
de aire.
corriente
- Pesar150g de ungranulado
previamente
paradeterelaborado
conbaseen B.bassiana
(Voigthy Borns,1979)
usandola tcnicade granulometra
minarel tamaode partcula
paralamicesmarcaW.S.Tyler
.
en un shakervibratorio

52

. Produccin Masivo, Separacin, Secado y Formulacin de Microorganismos Biocorrtroladores .

Pasarla muestrapor una seriede tamicesordenados

de anibahaciaabajoen forma
descendente
a unavelocidad
constante
duranteg minutos.
Pesarel materialretenidoen cadauno de los tamices.Los pesosretenidospor cada
parctazar una curvade distribucin
tamizson utilizados
de partculas
vs tamaode
malla,en la cualse puedeobservarel porcentaje
del pesoretenidoporcadaunode los
tamicesy asdeterminar
y el porcentaje
el tamaode partcula
de polvosfnos(partculas
quepasana travsde la malla)delgranulado.
Resultados
Desanoflo
de unasuspensin
oleosacon baseen M. anisopliae
de unaconcentracin
y con buenascaractersticas
aproximada
de l xl0sconidios/ml
de adherencia
sobrela
superfcie
folary cutculade losinsectos.
Desarrollo
de un granulado
con baseen L bassrana
de unaconcentracin
aproximada
y conuntamaode partcula
de 1x1010
conidios/ml
queosctlaentre2.0y 1.5
homogneo
mm.
Referencia
Voigth,R.;Borns,M., 1979.Tratadode tecnologa
farmacutca.
p 181Acribia,
Zaragoza.
194.

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