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LABORATORIO DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA

2013

Prctico N6
Identificacin de Hongos
Introduccin
Los hongos suelen definirse como organismos eucariontes sin clorofila y por lo tanto
hetertrofos, uni o multicelulares, de nutricin absortiva, con paredes celulares que est
compuesta fundamentalmente por polisacridos y por diversas protenas. Los polisacridos
ms importantes son la quitina (polmero de n-acetil glucosamina), el manano (polmero de
manosa) y
el glucano (polmero de glucosa). La mayora de los hongos conocidos vive sobre materia
orgnica muerta y por ende su principal rol ecolgico es la degradacin o descomposicin
de estos sustratos. Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los
championes) e indirectamente en la elaboracin de cerveza, vino y pan (Saccharomyces
cerevisiae o especies relacionadas con sta). Adems de la produccin de alimentos, los
mohos producen cido ctrico (Aspergillus niger), la penicilina (Penicillium notatu y
Penicillium chrysogenum). Existen otros antibiticos producidos por mohos estos son las
cefalosporinas, griseofulvina, cido fusdico.
Los hongos presentan bsicamente dos tipos
de
morfologas:
una
multicelular
denominada filamentosa y otra unicelular
denominada levaduriforme. Los hongos
filamentosos
(miceliares
o
mohos),
representan el crecimiento ms tpico de los
hongos microscpicos. En medios de cultivo
slidos y tambin sobre cualquier superficie
en la que se desarrollen, por ejemplo frutas u otros alimentos, producen colonias
algodonosas o pulverulentas que son muy caractersticas.
Fisiolgicamente los hongos se adaptan a condiciones ms severas que las bacterias.
Por ejemplo, los mohos se desarrollan en sustratos con concentraciones de azcar que las
bacterias no pueden tolerar ya que, los hongos no son tan sensibles a la presin osmtica
elevada. Los hongos toleran y se desarrollan en concentraciones de acidez elevadas,
soportan escalas de pH entre 2 a 9 pero el pH ptimo es 5.6. Aunque necesitan humedad
para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmsfera y del medio, los hongos
pueden vivir en ambientes deshidratados que sern inhibitorios para la mayor parte de las
bacterias.
Casi todos los hongos son estrictamente aerobios, pero su crecimiento se aumenta por la
presencia de oxgeno (las levaduras son facultativas y los mohos u hongos filamentosos
son estrictamente aerobios, con algunas excepciones); se desarrollan en condiciones de
temperatura muy variadas pero entre 22-30C es la temperatura ptima. La glucosa es una
fuente de carbono muy aprovechada por muchos hongos; otros azcares como, sacarosa y
maltosa y muchos carbohidratos ms complejos como almidn y celulosa son utilizados
por muchas especies.
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El nitrgeno inorgnico es aprovechado por algunas especies en forma de amonio o


nitratos; otras especies necesitan sustratos con Nitrgeno orgnico que, frecuentemente se
proporciona a los medios artificiales en forma de peptona.
La mayora de los hongos presentan reproduccin sexual y asexual. En algunas especies
coexisten las dos formas de reproduccin, denominndose holomorfo. El holomorfo, tiene
a la vez una forma de multiplicacin asexuada, conocida como anamorfo o mitosprico (o
estado imperfecto), y una sexuada, conocida como teleomorfo o meosprico (o estado
perfecto). Es relativamente comn que un mismo hongo tenga dos nombres, el del estado
anamorfo y el del estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de
forma independiente.
En un grupo importante de hongos solamente se conoce la reproduccin asexual, bien
porque no se conocen las condiciones adecuadas para que se desarrolle la forma sexual o
porque sta se ha perdido a lo largo de la evolucin. La reproduccin asexuada, puede
ocurrir por propagacin vegetativa a partir de fragmentacin de las hifas, ya que cada
fragmento puede producir una nueva colonia, o por l a formacin de esporas. Las esporas
asexuales generalmente se producen en hifas especializadas y se denominan de diferente
forma segn su morfologa. Los Zygomycota producen esporangiosporas en el interior de
una estructura en forma de saco denominada esporangio. Los Ascomycota y, en menor
grado, los Basidiomycota, producen esporas asexuales denominadas conidios que se
desarrollan a partir de una estructura denominada conidiforo. Segn su tamao se
diferencian en macroconidios y microconidios. Existen distintos tipos de esporas
asexuales:
Clamidosporas: esporas esfricas u ovoides
de pared gruesa que se forman dentro de las
hifas somticas. Son ms resistentes al calor y
a la desecacin que las otras esporas
asexuales.

Conidiosporas: Son esporas delgadas que


se encuentran en grupos o solas sobre hifas
especializadas llamadas conidiforos.
Algunos autores llaman conidiosporas a
todas las esporas asexuales.

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Esporangiosporas:
Son
esporas que se forman
dentro de una estructura en
forma de saco denominada
esporangio. La hifa que
porta el esporangio se
denomina esporangiforo.

Astrosporas u Oidio: Son esporas de paredes delgadas que se forman por


fragmentacin de las hifas.

Blastosporas: Son esporas que se forman por gemacin.

Las esporas sexuales se producen tras la fusin de los ncleos de dos hifas sexualmente
compatibles o de dos levaduras y posterior meiosis. De este proceso de reproduccin sexual
resultan las esporas sexuales, las cuales son usualmente ms resistentes al calor que las
esporas asexuales, pero sin llegar a tener la extremada resistencia al calor que presentan las
endosporas bacterianas y presentan latencia, es decir ellas slo germinan cuando son
activadas ya sea por un calentamiento suave o por ciertas sustancias qumicas. La
morfologa de las esporas sexuales es muy variada y tiene gran inters para la identificacin
fngica, ya que presentan diferencias caractersticas. Los hongos del Phylum
Basidiomycota producen basidiosporas
en el exterior de una estructura
denominada basidio, los Ascomycota
producen ascosporas en el interior de
una estructura en forma de saco
denominada asco y los Zygomycota
producen zigosporas.

Existen varios tipos de esporas


sexuales:
Zygosporas: Son esporas grandes de
pared gruesa que resultan de la fusin
de 2 gametos similares.

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Ascosporas: Se producen en una estructura en forma de saco, llamada asca, despus de la


unin de 2 ncleos. Las ascosporas se forman frecuentemente por procesos de cariogamia
de dos ncleos distintos; generalmente se forman ocho ascosporas, aunque pueden
formarse de dos o cuatro. A su vez, las ascas pueden estar incluidas o no dentro de un
ascocarpo.
De acuerdo a la forma en la cual se desarrolla el ascocarpo y el cual es utilizado como
carcter taxonmico de identificacin, se definen:

Los apotecios, son cuerpos fructferos con forma de copa, normalmente de colores
marrones claros, se pueden producir a partir de la germinacin de esclerocios o del
mismo material vegetal invadido por el hongo. Algunos alcanzan ms de un centmetro
de dimetro y dentro de l, se encuentran las ascas conteniendo ascosporas.
Los cleistotecios, son cuerpos fructferos con forma esfrica y que no poseen abertura
para la salida de las ascosporas, por lo tanto deben romperse para que estas se liberen.
Generalmente se producen sobre el tejido vegetal colonizado por el hongo. A simple vista
pueden observarse como puntos negros.
Los peritecios, son cuerpos fructferos con forma de
pera y con una abertura para la salida de las
ascosporas. Generalmente se producen sobre el tejido
vegetal colonizado por el hongo y a simple vista pueden
observarse como puntos negros.
Basidiosporas: Resultan de la unin de 2 ncleos sobre
una estructura especializada en forma de maza conocida
como basidio. Generalmente hay 4 por basidio.
.
Si bien la estructura microscpica es decisiva para la clasificacin,
para el miclogo experimentado las caractersticas visibles son muy
importantes debido a que, a simple vista, el aspecto de las colonias
es a veces tan caracterstico que le permite identificar enseguida el
tipo de hongo. Sin embargo, es indispensable para la clasificacin
final determinar las peculiaridades del hongo al nivel microscpico
que presentan estos microorganismos.
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Al microscopio ptico, los hongos filamentosos presentan unas estructuras tubulares,


formadas por mltiples clulas, que se denominan hifas. En los hongos filamentosos, las
hifas son tabicadas y presentan septos que delimitan las diferentes clulas. Sin embargo, los
hongos del Phylum Zygomycota presentan hifas que carecen de septos y se denominan
cenocticas o sifonadas.
El mejor mtodo para el estudio microscpico es el MICROCULTIVO que permite
observar cuidadosamente y a intervalos las estructuras microscpicas intactas, mientras que
en la tcnica de desprender una porcin del cultivo se altera muy seriamente la arquitectura
microscpica tanto que a veces es imposible reconocer el hongo.

Objetivo:

Identificar una especie de hongo filamentoso

Procedimiento:

Observacin macroscpica de mohos:

Determinar:
- tamao de la colonia, dimetro
- textura, lanosa, flocosa, granulosa, etc
- color, escala de colores
- presencia de surcos
- exudado
- produccin de pigmento, etc...
Observacin con lupa estereoscpica:
- Describir las caractersticas del micelio areo
Observacin microscpica de mohos:
Algunos caracteres microscpicos del micelio fngico:
-

Micelio tabicado, hifas septadas, ramificadas, formando una maraa. Observamos la


periferia de la misma para encontrar conidias (macro y microconidias) o bien algunas
estructurasn morfolgicamante interesantes para el diagnstico micolgico.
Conidias: Microconidias, son unicelulares, pequeas, redondas, ovales o piriformes.
Presentan dos tipos de disposicin: a lo largo de la hifa (tipo acladium) en forma de
racimos. Unas veces son sesiles, otras nacen sobre cortos esterigmas. Las
macroconidias, son multicelulares, grandes, con tabiques transversales. Existen diversos
tipos: fusiformes, en raquetas y en lpiz o maza. A su vez pueden tener las paredes
gruesas o finas, ser lisas o rugosas, aisladas o en racimos.
Estructuras morfolgicas especiales: Casi todas variantes de tamao y forma de las
hifas septadas:
o Espirales: hifa fina enrollada en espiral.
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o Hifa en raqueta: ensanchamiento oval de una porcin media o terminal de una


hifa.
o Cuerpos nodulares: filamentos engrosados formando nudos sobre si mismo.
o Hifa peptinada: pequeas prolongaciones en un solo lado de la hifa, que adopta
as forma de peine.
o Hifa retrgrada: hifa que nace en sentido contrario, en ngulo agudo, al resto de
las ramificaciones.
Empleo de claves para la identificacin de los hongos filamentosos ms comunes.

Hongos levaduriformes
Las levaduras son filogenticamente un grupo diverso de hongos; sus formas teleomorfas
(sexuales) se distribuyen en dos clases principales; Ascomicotina y Basidiomicotina, su
denominacin levadura describe el predominio unicelular de estos organismos que en su
divisin celular vegetativa se realiza por gemacin por fisin.
Las levaduras poseen numerosas aplicaciones en la biotecnologa tradicional y moderna, ya
que participan en procesos de produccin de alimentos, protenas de organismos
unicelulares, productos con valor aadido y en las ltimas dcadas se han incorporado a la
industria biotecnolgica como hospederos para la produccin de protenas de eucariontes.
A pesar de las ventajas que poseen, algunos gneros son causantes de micosis en el hombre
y, en algunos casos, son patgenos oportunistas asociados a enfermedades como el VIH.
Tambin son causantes del deterioro de alimentos frescos y elaborados para el consumo
humano. Por estas razones se hace imprescindible la identificacin exacta de las levaduras
de inters industrial, clnico y ambiental.
La identificacin taxonmica de las levaduras puede ser realizada tomando en cuenta
diferentes criterios que complementan su diagnstico especfico:
el morfolgico
el bioqumico
el fisiolgico
Para la identificacin de levaduras, en los ltimos aos se han desarrollado nuevas tcnicas
diagnsticas, independientes del cultivo, con la intencin de mejorar la sensibilidad y
reducir el tiempo necesario para obtener su resultado:
el inmunolgico. (Deteccin de antgenos o anticuerpos )
el gentico
El inters general de su clasificacin e identificacin se relaciona con una necesidad de
enfrentar un tratamiento adecuado en las infecciones de aquellas formas patgenas
comprender la interaccin de las especies en la naturaleza, la seleccin conveniente en
la produccin de alimentos y en las fermentaciones industriales por sus diversas
capacidades metablicas
Aspectos Morfolgicos.
Observacin Macroscpica : Toma en cuenta las caractersticas que desarrollan las
colonias de levadura que crecen en diferentes medios, siendo su mejor medio de cultivo y
aislamiento el Agar Sabaouraud. y/ harina de Maz .
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Aspectos Microscpicos
La separacin de las levaduras en gnero y ocasionalmente en especie,
se realiza corrientemente a travs de la apariencia microscpica por el
reconocimiento de las los estado vegetativos y sexuales. Definiendo en
estos sentidos; forma celular, gemacin, hifas, blastoconidias,
clamidosporas, artrosporas y ascosporas.
La observacin se efecta alrededor de 400 500X en microscopa de luz y en
inmersin cuando es necesario distinguir ornamentacin de ascosporas.

Pruebas Bioqumicas
Se utilizan en conjunto con los aspectos macroscpicos y microscpicos en el anlisis de
taxa mas menos cercanas relativas a la fermentacin y asimilacin de una variada fuente
de carbono.
Las levaduras varan genricamente en su capacidad de fermentar azcares, medida como
la produccin de CO2, utilizando generalmente: D-glucosa, D-galactosa, sacarosa, maltosa,
lactosa, rafinosa y trehalosa
Las pruebas de asimilacin de azcares y otros compuestos carbonados y nitrogenados
miden el crecimiento en condiciones aerbicas, en forma comparativa. La asimilacin de
nutrientes en forma separada sobre un medio sinttico base se denomina Auxonograma
donde se apreciar el crecimiento selectivo de una levadura en la cercana de este sustrato
dispuesto sobre filtros de papel absorbente, o en pocillos de agar.
Sistemas semi automticos y automticos
Corresponde a diferentes
mtodos de asimilacin de nutrientes
comercializados, que en conjunto simplifican y reunen un conjunto de
pruebas para una rpida identificacin.
Actualmente existen en el mercado sistemas estandarizados de
identificacin (kits) para conocer el perfil bioqumico de las levaduras.
Estos kits permiten una identificacin ms rpida de las levaduras
aisladas que los mtodos clsicos de asimilacin y fermentacin. La
ventaja ms importante es que estos sistemas proporcionan una
identificacin que surge de una base de datos sobre miles de biotipos de
levaduras, que incluyen diversas variaciones y patrones de utilizacin de substratos
Mtodos genticos
Estos mtodos se basan esencialmente en el anlisis directo del ADN de la levadura; las
diferencias entre las propiedades de este DNA se denominan polimorfismo, el cual hace
posible su distincin. El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de
diferenciar grupos y especies que taxonmicamente estn muy prximas, pero que tienen
propiedades muy diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y
organolpticas Estas tcnicas se basan en la caracterizacin e identificacin de especies
utilizando marcadores moleculares, normalmente de ADN, de cada especie o cepa.
-. Secuenciacin de genes ribosomales: Los genes ribosomales presentan una secuencia
bastante conservada a nivel de gnero y especie en los organismos Eucariotas, por lo que se
trata de anlisis genticos muy tiles para establecer relaciones filogenticas. La tcnica
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consiste en amplificar estas regiones conservadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) y
posteriormente secuenciar los fragmentos amplificados. Esta tcnica tambin permite
diferenciar especies.
-. Anlisis de perfiles de restriccin de ADNr (RFLP): Esta tcnica (Restriction
Fragment Length Polymorphisms) consiste en el anlisis de perfiles de restriccin mediante
la comparacin de los patrones de restriccin de diferentes regiones de la zona ribosomal.
sta tcnica es muy utilizada para la identificacin de especies de inters biotecnolgico y
en estudios ecolgicos y de dinmica poblacional.
-. PCR: Las dos cadenas de ADN se separan y consiste en amplificar una regin del
genoma por PCR (Polymerase Chain Reaction) y posteriormente estos fragmentos
amplificados se someten a una electroforesis en gel de poliacrilamida. Los fragmentos se
separan segn su tamao. Esta tcnica se emplea en la caracterizacin e identificacin de
levaduras y bacterias vnicas, tambin en estudios de biodiversidad.
-. FISH: Se basa en la utilizacin de unas sondas de ADN o ARN marcados y un
fluorocromo (Fluorescente In Situ Hybridization), que son capaces de hibridarse por tener
cidos nucleicos complementarios. Posteriormente a la hibridacin, se observan las clulas
marcadas al microscopio de fluorescencia. Es una tcnica muy interesante, ya que permite
diferenciar especies dentro de una misma muestra, utilizando sondas especficas y
diferentes fluorocromos. Permite una buena exactitud en la diferenciacin de especies,
siendo til para estudios de diversidad poblacional y deteccin de levaduras en diferentes
muestras
Objetivo:

Conocer los mtodos convencionales para la identificacin de especies de levaduras

Procedimiento prctico
1.- Auxonograma:
a) Asimilacin de azcares:
Realice una suspensin del cultivo de levadura incubada durante
24 hasta 72 horas en Agar Sabouraud, en 5 ml de agua destilada,
a una concentracin equivalente al 4-5 del Mc Farland
Siembre por difusin 1 ml de la suspensin en Agar Base
Nitrgeno fundido en placa Petri y homogenice
Deje solidificar a temperatura ambiente y disponga 4 discos de papel filtro con los
diferentes azcares que se le proporcionarn en cada placa. Incube a 30C por 24
horas
b) Asimilacin de Nitrato:
Realice una suspensin similar al punto anterior a una densidad similar al Mc
Farland N 1

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Siembre por difusin 0,1 ml de la suspensin en Agar Base Carbono fundido en


placa Petri homogenice y deje solidificar
Disponga en el centro de la mitad de la placa algunos cristales de KNO3 y una gota
de agua peptonada al 1% tal como se le indicar.
Incube por 48 a 96 horas a 30C
2.-

Fermentacin de azcares :
Inocule la cepa de levadura en caldo glucosado con indicador de pH y produccin
de CO2
Incube a 28C por 10 a 14 das. Observe a las 48 72 horas la produccin de gas

3.-

Produccin de ureasa
Siembre en estra en Agar urea
Incube por 48 horas

4.-

Morfologa:
Siembre por agotamiento sobre Agar Corn Meal
Disponga 3 cubre-objetos desengrasados y estriles en la superficie en forma
equidistante
Incube por 48 horas a 28C
Observe directamente al microscopio
Distinga las estructuras que caracterizan la morfologa de su cepa

5.-

Identifique su gnero y especie utilizando las claves que se le proporcionaran.

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