Practicas Microbiologia.2014ok-Casa

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA
GUA DE PRCTICA
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA PER
2014
PROLOGO
El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es indispensable

para el desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el
desarrollo de la agricultura y para el ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la
elaboracin de infinidad de productos tiles al hombre, en la generacin de
procesos productivos con menor contaminacin del medio ambiente y con
consumos de energa muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones genticas para que
puedan
producir
sustancias
diversas
de
gran
necesidad.
Estos
microorganismos pueden generar Enzimas que a su vez son empleados como
biocatalizadores para los nuevos bioprocesos.
El conocimiento de la microbiologa se hace imperiosa para
aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La presente Gua
Prctica se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en
conocimiento sistematizado sobre las tcnicas bsicas del manejo
Microorganismos en laboratorio para estudiantes de Ingeniera Qumica.
su
de
el
de
Los Autores
NDICE
PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES......................................................................................
PRCTICA 1
: BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA...................................................................
PRCTICA 2
: MICROSCOPIA; OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO,
COLORACION VITAL......................................................................................
PRCTICA 3
: PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:

SIMPLE Y DIFERENCIAL...............................................................................
PRCTICA 4
: COLORACIONES
ESPECIALES:
TINCION
MORFOLOGIA
DE
HONGOS.........................................................................................................
PRCTICA 5
: EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y

ESTERILIZACIN ..........................................................................................
PRCTICA 6
: PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO ...................................................
PRCTICA 7
: SIEMBRA DE MICROORGANISMOS.............................................................
PRCTICA 8
: CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS

58
PRCTICA 9
: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO....................................................
PRCTICA 10 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS.......................................

PRCTICA 11 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN
PLACA..............................................................................................................
PRCTICA 12 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM...............................................
PRCTICA 13 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS.............
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES
PRCTICAS ................................................................................................................................
BIBLIOGRAFA...........................................................................................................................
Recomendaciones Generales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este

tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio
Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla
completamente, slo podr quitrsela al salir de ste.
Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas
debern ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la
boca.
Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla.
No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse
sentado y en su equipo de trabajo.
Hablar slo lo necesario con los compaeros.
Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va
a realizar, si no entiende pregunte al profesor.
Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la
prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se
suspender para todo el equipo.
El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse
en la flama del mechero, antes y despus de su uso.
Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo
con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el
sitio indicado por el profesor.
Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos:
equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del
alumno.
Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material
para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra
salud.
Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio.
Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.
PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;

ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN
I.
OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de

materiales y equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el anlisis
microbiolgico.
3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control microbiolgico de
los alimentos.
II.
MARCO TERICO
El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer

paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.
2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la
esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de
material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del
calor seco debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los
niveles de electrlitos.
En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se
requiere ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del
organismo.
Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de
160-170C durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y
agujas de kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero
para eliminar rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de
Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se
esteriliza el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente
empleado para esterilizar material de vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se
encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor
uniformemente en todas partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe
conservarse a una presin de 1000g/cm 3 sobre la presin atmosfrica para obtener una
temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la
prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse con la
introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica, como resultado
de activacin o liberacin de una nucleasa.
El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y
filtracin de pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de
origen ribosmico y aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por
ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del
ARN ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas
elevadas.
a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 1535 minutos.
b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor
de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave
con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de
algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y
121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos
aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar;
autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica,
paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica

cilndrica.
Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de

agua).
Orificios superiores para purga de gases de combustin.

Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.
Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2.2
ESTERILIZACIN POR FILTRACIN
Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de

membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de
sustancias termolbiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de
infusorios, acetato de celulosa, etc.
II.3
ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA
Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad

como agente bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud
de onda, ste mtodo presenta muchas dificultades tcnicas.
III.
MATERIALES Y EQUIPO
IV.
Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

Erlenmeyer, tubos de ensayo
Papel craff, algodn, gasa, tijeras
Mechero de Bunsen
Horno Pasteur de aire caliente
Autoclave
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a) Preparacin de tubos matraces
-
Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones
de algodn respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos
ni apretados, ni largos ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente:
De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de
algodn de fibra, extendida, rectangular
Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la
longitud.
Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de
cono truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn
debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se
pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft
y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se
amarra con hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparacin.
b) Preparacin para proteger las pipetas
- En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con
auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus
extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma
oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma
ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsin para
protegerla y se rompe el resto de papel sobrante.
- Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin.
c) Preparacin de las placas Petri

- Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri
completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta
en el centro, se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel,
dndose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan
en tringulos, rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa,
dndosele una apariencia de paquete de regalo.
4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios
de vidrio o metal.
a) Procedimiento para la esterilizacin en horno
- Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que est funcionando.
- Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando
durante 60 minutos ms.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la
puerta del horno.
- El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn
oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha
calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha
calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

a) Procedimiento para la esterilizacin con autoclave
- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta).
Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo
la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar,
se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel
especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se
encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con
firmeza pero sin apretarlo demasiado.
- Abrir la vlvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4
minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que
todo el aire ha sido expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de
la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor
para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de
aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con
los utensilios estriles.
Autoclave
donde
se
introducirn
los materiale (tubos de ensayo)

Los
tubos
de
ensayo
antes
de
esterilizacin
su
deben
llevar sus tapones de algodn

respectivamente, los cuales debenc
errar
suavemente
no muy flojos ni apretados, ni 9

larg
os ni cortos, preparados
La
temperatura
llegar
regular
120C,
el
esperar 15 min
debe
despus
calor
II.
CUESTIONARIO
1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos?

ESTERILIZACIN CON CALOR SECO
ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO
2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del
control microbiolgico, por qu?
Atravez del cual se logra la destruccin total de microorganismos viables en un
determinado material
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento
el autoclave.
- Llene con agua el fondo del autoclave (hasta el soporte de lacanasta). Cercirese que
el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
-
- Introduzca en el autoclave la canasta con los materiales quese van a esterilizar, se
pueden aadir indicadores de la esterilizacin, comociertas piezas de papel especial
que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa del autoclave, cerciorndose de que la arandelade goma se encuentra en su surco.
Atornille a niveles iguales los sujetadoresde la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
- Abrir la vlvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento del autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor.Aguarde 3- 4 minutos hasta
que el chorro de vapor sea uniforme y continuo,esto indicar que todo el aire ha sido
expulsado del autoclave.
- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire.
Apritensel o s s u j e t a d o r e s d e l a t a p a d e l a u t o c l a v e y r
e d u z c a l a t e m p e r a t u r a ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deberregular el calor para conservarla.
Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- C u a n d o l a t e m p e r a t u r a d e s c i e n d a a m e n o s d e 8 0 C a b r a
lav l v u l a d e s a l i d a d e a i r e p a r a i g u a l a r l a s p r e s i o n
e d e n t r o y f u e r a d e l autoclave.
3. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas.

Y explique a que se debe tal diferencia.
4. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

FILTROS DE PROFUNDIDA
mayora
de
presentes.
Estos filtros estn elaborados por

una material fibroso (papel ,asbesto o
fibra de vidrio)dispuestos al azar, de
manera que adentro de la estructura
del filtro se crean vas tortuosas
donde pueden quedar retenidos la
10
los
contaminantes
Entre sus ventajas se encuentra su

alta capacidad de retencin de
partculas sobre su superficie y a
travs de toda su estuctura y que

permiten filtrar grandes volmenes.
Sin
embargo,
tienen
como
desventajas que no presentan un
tamao de poro uniforme y existe la
posibilidad de liberacin, hacia el
material filtrado, de partculas y
microorfganismos que hayan crecido
dentro del filtro
Dadas sus caractersticas los filtros
de
profundida
se
usan
principalmente como prefiultros, ya
que permiten eliminar las partculas
grandes pero no la eliminan total de
los microorganismos.
FILTROS DE SUPERFICIE: son filtros

elaborados generalmente de acetato
de celulosa o nitrato de celulosa y
contienen
poros
de
tamao
uniforme .Este tipo de filtro tiene
como ventaja que ,al conocer
exactamente el tamao del poro que
presentan,se
pueden
seleccionar
filtros capaces de retener la totalidad
de los microorganismos presentes en
una solucin.Sin embargo, se saturan
rpidamente y la velocidad de
filtracin a travs de ellos es lenta.
Para la filtracin esterilizante se
puede usar combinaciones de un
filtro de profundida con un filtro de
superficie que tenga un tamao de
poro de 0.22 micrometro .La mayor
parte de los filtros de membrana se
pueden esterilizar en autoclave y
luego se manipulan aspticamente al
ensamblar el equipo.
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upl
oad/facultad_farmacia/catedraMicro/
10_Esterilizaci%C3%B3n_por_filtraci
%C3%B3n.pdf
11
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I.
OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse
a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de
cultivo.
II.
MARCO TEORICO
2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De
acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no
energtica como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar
energa son necesarias para su desarrollo.
2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS
A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma
de mono o disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay
microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejas para obtener energa.,
como es el caso del almidn.
Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO 2 hecho que es
caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso
hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de
energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso
protenas an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de
amonio, o como peptonas etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a
pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son
tambin protenas que estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba
considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de
carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de
indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo
12
de peptona. Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso

para el cultivo de algunos protozoos.
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y
ciertos grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de
amonio, aminocidos, etc.
2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOS
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen
mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras
ocasiones lo pueden obtener a partir de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna,
tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.
C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por
ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su
concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a
concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el
crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es
muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de
componentes definidos que no son capaces de fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a
algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas
o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el
crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del
Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido
con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este
microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de
Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de
apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B
para el crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por
bloqueo de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas
bioqumicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
13
Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las
bacterias Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a
inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el
crecimiento de todas las Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato
de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas
incluyendo las coliformes.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO
Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.
- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que
considerar:
A. TEMPERATURA PTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en
funcin de los rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima
es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su
temperatura ptima sea 20 a 30C y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos
responsables de la putrefaccin de alimentos refrigerados.
- Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a
20C y la mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta
categora. Las bacterias patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura
ptima de 37C.
- Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura
mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que
crecen en fardos de heno, tuberas de agua caliente, aguas termales.
- Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por
debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.
14
RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Microorganismo
Bacillus psichrophilus
Microcococcus cryophilus
Pseudomona fluorescens
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Neisseria gonorrhoeae
Thermoplasma acidophilum
Bacillus stearthermophilus
Sulfolobus acidocaldarius
Pyrococcus abyssi
Pyrodictium occultum
Pvrolobus fumarii
Candida scotti
Saccharomyces cerevisiae
Mucor pusillus
Temperaturas cardinales (C)

Mnima
ptima
Mxima
-10
23-24
28-30
-4
10
24
4
25-30
40
6.5
30-37
46
0
37
44
10
37
45
30
35-36
38
45
59
62
30
60-65
75
60
80
85
67
96
102
82
105
110
90
106
113
0
4-15
15
1-3
28
40
21-23
45-50
50-58
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y
cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de
crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana
plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los
metabolitos que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las
bacterias. Es tpico que en la fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o
en la degradacin proteica utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se
alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener
el pH dentro de los lmites fisiolgicos.
15
EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Microorganismo
Picrophilus oshimae
Thiobacillus thiooxidans
Sulfolobus acidocaldarius
Lactobacillus acidophilus
Staphylococcus aureus
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Clostridium sporogenes
Pseudomonas aeuriginosa
Nitrosomonas
Bacillus pasteurii
Bacillus alcalophilus
Lmite
inferior
0
0.5
1.0
4.0-4.6
4.2
4.4
4.4
5.5-5.8
5.6
7.0-7.6
8.5
8.5
pH ptimo
0.7
2.0-3.5
2.5
5.8-6.6
7.0-7.5
6.0-7.0
6.0-7.0
6.0-7.6
6.6-7.0
8.0-8.8
SD
10.6
Lmite
superior
SD
6.0
4.0
6.8
9.3
8.4
9.0
8.5-9.0
8.0
9.4
SD
11.5
D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas
bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos;
este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y
sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy
altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los
microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de
disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del
Agua
1.00 (agua pura)
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
Ambiente
Sangre
Pan
Jamn
Salami
Conservas
Lagos salados
Pescado
salado
Cereales,
dulces
Chocolate
Leche
deshidratada
Microorganismo
Mayora de Gramnegativos
no halfilos
Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
Cocos,
Bacillus,
Fusarium,
Mucor,
Rhizopus
Staphylococus, Saccharomyces
Penicillum
Halobacterium, Aspergillus
Actinospora
Aspergillus
Saccharomyces
Xeromyces
E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO,
mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen
mejor en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien
tanto en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la
respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este
objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando
para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.
2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
16
Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De

acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:
2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA
A. MEDIOS SLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del
15%.
La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento,
purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin
a travs de medios especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de
antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.
B. MEDIOS LQUIDOS
Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin
de recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la
realizacin de inculos, para obtener
metabolitos primarios o secundarios, de los
microorganismos como: antibiticos, cidos lcticos, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de
cultivar.
C. MEDIOS SEMISLIDOS
Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser
inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia
semislida. Son tiles para algunas pruebas bioqumicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.
2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN
A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO
Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas.
Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes
bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que
facilitan el crecimiento de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que
nos permite aislar el microorganismo que buscamos.
A.2. MEDIOS SELECTIVOS
Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de
algn tipo bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y
el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios
selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y,
lo que es ms caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o
no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria
y especfica, es decir, diferencial; por ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno
que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el
17
crecimiento de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una

coloracin caracterstica para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de
aislamiento e identificacin.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa,
Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el
aminocido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato
como nica fuente de carbono.
B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL
Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de
las bacterias. Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de
nitrgeno, sales y agua. Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el
caldo comn, que est compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de
sdico y agua.
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas
durante perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios
generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su
crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener
cepas durante meses.
2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN
A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTTICOS
C. MEDIOS SINTTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS
2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN
A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO
18
III.
MATERIALES Y REACTIVOS
a. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza.
Esptula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.
b. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.
IV.
4.1. PREPARACIN
- Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est
indicada en la etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua
que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin
homognea, despus incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para
desprender e incorporar al conjunto las partculas del medio de cultivo que
hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su
disolucin.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe
adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y
resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.
4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser
necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121C.
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido
circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en
la posicin deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
19
o
o
En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)

Agar TSI
Agar LIA
En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM
4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco,
protegidos contra la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien
cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo
limitado de conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones
adecuadas de conservacin es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4
8C.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con
cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la
tapa.
4.5. COMPOSICION
UTILIZADOS
PREPARACIN
DE
CADA
UNO
DE
LOS
MEDIOS
AGAR NUTRITIVO
Composicin
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar Agar,
12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparacin
_______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR MAC CONKEY
Composicin
Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.
Cristal violeta
0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio
5.0 g
Agar Agar 12.5 g. Agua destilada
1000 ml.
20
Preparacin
_______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: _______________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de
sacarosa,
Tiosulfato de sodio,
0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol,
24 mg., sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composicin
21
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de

metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua ___________________________________________
Segn su uso o utilizacin ___________________________________________
Segn la composicin _____________________________________________
Segn su presentacin. _____________________________________________
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml
Preparacin
_______________________________________________________________________________________
_________________________________________________________
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
_________________________________________________________
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
V.
1.
2.
3.
CUESTIONARIO
Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios
obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto,
Microaerofilo.
Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?
22
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.
Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento
microbiano, y clasifique en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su
crecimiento (psicrfilos. Psicrtrofos, mesfilos, termfilos, Hipertermfilos?
Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos.
Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen?
Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3 y qu
sustancias se le agregan para que cumpla esa funcin?
Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos?
Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene la consistencia
del agar blando?
23
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I.
OBJETIVOS
-
II.
Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

Saber llevar a cabo los diferentes mtodos de siembra e inoculaciones.
Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de
asepsia y esterilidad.
MARCO TEORICO
Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder
cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.
Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes
problemas:
5. Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
6. Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales
son contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener
cultivos puros.
2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo
adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias
vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin,
puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.
AISLAMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una
muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los
microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por
formacin de colonias separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr
caractersticas especiales, la morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo,
que puede ser lquido o slido.
Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se
logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la
identificacin especfica. Los trasplantes se pueden realizar:
1. De lquido a slido.
2. De lquido a lquido.
3. De slido a slido.
4. De slido a lquido.
24
2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION

Existen los siguientes materiales:
ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en
asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso
sencillo.
Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco
bastante cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir
muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra
las ms utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.
HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo,
nicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semislidos
y slidos.
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para
extender el inculo lquido previamente adicionado en la placa, a travs de una
pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer
empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra
desecacin, deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del
hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y
desechables.
PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio,
reutilizables por esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser
graduadas (contienen volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se
realizar con aspiradores para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no
25
contiene volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya aspiracin

se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos con micropipetas
utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio de
cultivo.
2.3. PREPAPACION DE INOCULOS
Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. As pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro
y, por otro lado, de una concentracin adecuada de microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el aislamiento mediante
tcnicas especficas, como es el caso de la siembra por estras en placa o por
agotamiento, o la tcnica de la placa invertida, que en general va a permitir el
crecimiento ms o menos separado de los microorganismos. Es muy til usar medios
de cultivo enriquecidos especficos y diferenciales que permitan el crecimiento del
tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma, una muestra
natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como puro.
METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de siembra estril. Si
la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta pasteur estril en
cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizar
2.4. PREPARACIN DE INCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de siembra estril. Si
la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipera pasteur estril en
cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizar posteriormente en el medio
especfico de cultivo.
Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se
homogenizar y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para
organismos patgenos coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer
aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la
utilizacin de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo
el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin posterior y de la
cantidad de inculo que se requiera.
Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de
cultivo slido, se utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se
verificar el cultivo, ej. siembra por agotamiento.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio
liquido, se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una
temperatura de 37C por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre
jvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un
medio slido, se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de
toda la placa incubndose a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se
requieren tambin cultivos jvenes.
Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo
de cultivo base.
A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de
microorganismos problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios
lquidos y el nmero de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por
comparacin de medios lquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el
caso de la escala de Mc-Farland formada por una batera de tubos cada uno de las
cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato brico. Cada tubo
corresponder a una determinada concentracin de microorganismos.
2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE AISLAMIENTO)
26
El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea lquido o slido se
denomina siembra o inoculacin.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina
resiembra.
La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio lquido.
2.5.1. SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO
Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.
2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACA
Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del
medio slido. Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos
planos del medio queden escasas clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se
irn multiplicando, logartmicamente hasta formar colonias puras.
Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de
distribuir el inculo.
Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de superficie del
medio se logra el aislamiento de mayor nmero de cepas microbianas.
CLASES DE SIEMBRA
7. Siembra por agotamiento o por estras.
8. Siembra por difusin.
9. Siembra por diseminacin.
a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE
Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una
cantidad adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los
extremos superiores de la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en ningn momento nuevos
inculos y no levantndose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.
- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho
inculo se depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un
extremo a otro de sta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y
girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos permitir
arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde qued la muestra hasta el otro
extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino sin
coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma direccin se repite la
operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar
hacia el interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada
vez que se va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para
separar estas colonias se realice en cada estra un flameado previo del asa de
siembra.
27
- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas
perpendiculares que debern cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta
queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra
estril una cantidad de inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los
cuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos
la misma operacin sin flamear el asa en todos los dems cuadrantes siguiendo un
orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema
observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o separadas.
- TECNICA DE LOS TRES GIROS
Se rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo con el asa de
platino y se siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de
platino giraremos la placa unos 90 y volveremos a sembrar una segunda vez. As
sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) sta
tcnica no es muy utilizada.
b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)

En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al solidificar las
colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirn para contaje de colonias.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una
temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de
inculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante
el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar
solidificar, la mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la
28
homogenizacin en este caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo,

para la determinacin de CMI (concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico
frente a determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).

Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml
segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el
asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de
clulas viables, antibogramas, etc.
2.6. SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADO
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de
muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta
realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie
del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos perodos,
as como para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la prueba de
ureasa.
b. SIEMBRA POR PICADURA

Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede
hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que
se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se
utiliza para la siembra de medios de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin fermentacin de Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo
se lleva a cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la
siembra por picadura y posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio
KIA y la prueba en medio citrato entre otras.
29
2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA

CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la obtencin de
cultivos puros, que estn constituidos por una nica especie microbiana. La mayora
de las aplicaciones en biotecnologa conlleve el uso de cultivos puros.
La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo
de dilucin. El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un
cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo
de modo que las clulas individuales queden separadas una de otras. Cada clula
aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro
puesto que las clulas que componen la colonia son la progenie de una nica clula
original.
Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo:
a.
Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de

un aislamiento en placa inicial debera dar lugar al repetir la operacin a
colonias todas del mismo tipo, y cuya morfologa concuerda con la del
aislamiento inicial.
b.
El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia

deberan mostrar un nico tipo celular. Los mtodos diferenciales de
tincin Gram, son tiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos
microbianos diferentes.
Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para
mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el
biotecnlogo tome prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la
contaminacin o de las soluciones con microorganismos no deseados.
III.
MATERIALES Y EQUIPOS
Material de Vidrio
10. Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100)
11. Placas petra
12. Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml
13. Erlenmeyer
Equipos
14. Estufa 37C
15. Autoclave
30
Otros materiales
16. Gradillas
17. Mechero Bunsen
18. Asas de siembra
19. Algodn
20. Pinzas
Reactivo y Medios de cultivo
21. Medios de cultivo
1. Agar Mc Conkey
2. Agar nutritivo
3. Agar Saboraud
4. Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
5. Agar SIM (tubos fondo)
6. Caldo SIM
31
IV.
PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS
4.1.
SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY

Muestra: Inculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA

Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
4.3. TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
V.
CUESTIONARIO
32
1.
2.
3.
4.
Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?

Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?
Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?
Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del
tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una
parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de
siembra?
7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?
33
PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE

COLONIAS
i.
OBJETIVOS
-
ii.
Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial utilizadas en la

identificacin de bacterias.
Estudiar caractersticas culturales de crecimiento de los microorganismos en medio
slido
Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos en medio lquido
MARCO TERICO
GENERALIDADES:
Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura, tamao,
consistencia, cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de
cultivos apropiados segn el tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los
nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo. La siembra de microorganismos se
realiza en medios slidos y lquidos.
Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una
Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao
generalmente es visible a simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una
misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como
los estafilococos o los estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color
caractersticos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es
constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones
dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias
en cultivos mezclados. Sin embargo, adems de stas caractersticas se requiere tambin
estudiar la fisiologa y propiedades inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una
identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula
individual pero es la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo, la pigmentacin
es aparente en la colonia, pero no en la clula individual, en el caso de la consistencia mucosa
de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula
muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies y
puede ir desde colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.
Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden
observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca
que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y
forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar..
34
La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas
concntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con
textura granular o amorfa.
Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las que las
colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos uno
de los pigmentados ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo
dorado. El pigmento no se aprecia en las clulas individuales a que se debe a grnulos
intracelulares muy pequeos para verse con luz transmitida.
iii.
MATERIALES Y EQUIPO
Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.

1 mechero Bunsen
2 asa bacteriolgica
35
IV.
TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA

SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
36
CONSISTENCIA (probarla con el asa)

Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido
Difusible o no.
CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a travs de
la colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar
Crecimiento en caldo Nutritivo
37
Crecimiento en medio semislido
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el Texto, las
figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consistencia
Color
Luz
transmitida
Luz
reflejada
CALDO
Bacteria
Pelcula
Turbidez
Sedimento
38
MEDIO SEMISLIDO
Bacteria
Movilidad
iv.
CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven,
injuriado y envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una
caracterstica de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de hidratos de
carbono?
39
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I.
INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando
la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la
suspensin, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de
nefelometra. Por estos procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el
cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin
bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en el cultivo. El
espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este
aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso
de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin
bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la
cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como
disminucin de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz
absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero de
bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la transmitancia y la absorbancia
se expresa matemticamente de la siguiente manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.
Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy
til el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin
necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la
manipulacin.
II.
OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.
2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.
III.
FUNDAMENTO TERICO
Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en
cantidad, en la mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se
divide en dos nuevas clulas, proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas
hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e
iones inorgnicos.
El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el
tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de
duplicacin,na entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en
solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso
das.
40
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO

Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo
que ha crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas
variables por minuto peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene
una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente
y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se
encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que
deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el
crecimiento se reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin
celular y las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza
nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma
exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos
metablicos txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin.
4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con
el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad
aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.
Fases de Crecimiento
Latencia
Exponencial
Estacionaria
Rezago
Adaptacin
Logaritmo
Divisn celular
Crecimiento
Nutrientes se agotan
Acumulan metabolitos txicos
Sesa crecimiento
Muerte
Declinacin
8,0
Turbidez
(densidad ptica)
Viables
0,75
D e n s i d a d p ti c a
L o g 1 0 o rg a n i s m o s
v i a b l e s /m l
9,0
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0
0,1
Tiempo
IV.
PARTE EXPERIMENTAL
4.1
- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Caldo Luria Bertani estril
- Jeringa descartable de 10 cc.
- Contmetro
Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubacin a 37C
- Microscopio
- Espectrofotmetro
V.
METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo
discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro
diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de
crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las clulas en fase de latencia, que
41
proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio

nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un
ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores:
la edad y genotipo del inculo, de la temperatura, de la concentracin en
nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de
toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado
en la fase de crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las
clulas crecen rpidamente, y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y
estacionaria, la mayora de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La
velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de
la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para
definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento
equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de
generacin).
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van
acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo,
hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase
estacionaria las clulas no estn todas en el mismo estado fisiolgico; algunas
todava se estn dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero
la poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los
nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al nmero de clulas que
se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.
Realizacin (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en
condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.)
1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente
(entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un
matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril.
3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda
aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia
con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani estril antes de cada medida.
5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas
en refrigeracin hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje
de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.
42
v.
CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con medio de
cultivo estril?
2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de multiplicacin de
una bacteria?
3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
43
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS
I.
OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de contaje celular.
II.
FUNDAMENTO TERICO
Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas
microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la
densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables.
Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la
relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes,
entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de
contaje celular como el Cell Coulter.
Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms
sencillos. Nos basta con una cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer,
y un microscopio. Una cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca
una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presente unas seales que
determina un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero
de partculas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de partculas
en la suspensin de origen.
La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el
centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula
como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre
dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida
0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste
dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
44
Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las
cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser:
Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que
en el microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25
milmetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de
contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en

microscopa. En la imagen puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las
que usas en el laboratorio de prcticas.
El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar la

cantidad de clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas.
2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan
algunas clulas.
3) La precisin es difcil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teido la muestra.
5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja densidad. En el asa de
bacterias, en una suspensin de clulas con menos de 10 6 clulas por mililitro, se
podran ver pocas o ninguna bacteria.
III.
-
IV.
Cultivo de E. coli
Matraz
Cmara del Neubauer
Estufa
- Cultivo de levadura
- Pipetas
-Pipeta Pasteur
- Microscopio
METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea cantidad de
suspensin con una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequea en la superficie
pulida de la cmara de recuento cerca del extremo del cubre. La suspensin
entrar en la cmara por capilaridad. Una cmara adecuadamente llenada
45
contiene clulas solo en el espacio contenido entre el cubre y la cmara de

recuento. No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.
V.
CUESTIONARIO
1.- Investigue las caractersticas de:

Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje celular, Otros
mtodos de recuento celular
2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales.
3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.
46
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE

DILUCIN EN PLACA
I.
OBJETIVOS
Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de

inculo.
II.
INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de colonias, la
tcnica por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en cantidades conocidas se
deposita en cajas petri estriles, se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de
45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el
inverso de la dilucin que corresponda permite estimar el nmero de microorganismos viable
por gramo o mL de muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo,
condiciones fisicoqumicas y tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a
determinado grupo de microorganismos. Esta tcnica permite la mayora de las veces
cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.
SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los
casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky
tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables,
antibogramas, etc.
TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION

Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua estril segn los
casos. Se adicionar una cantidad de muestra liquida o slida en los tubos sabiendo la
cantidad de muestra o inculo que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar.
Con la pipeta estril se tomar una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se
homogeniza. Repetimos la operacin anterior con el tercer tubo y as sucesivamente hasta
obtener la dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por ej. l0 -4 y 10-5 inocular en placas de
cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estril. Incubar a
temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de
este mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la
47
muestra y se diluye hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placas
y se le deja solidificar.
III.
MATERIAL REACTIVOS
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tincin de
Gram, Cajas Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.
IV.
METODOLOGA
SIEMBRA POR DILUCION

Preparacin de reactivos y medio de cultivo:
Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril, de acuerdo a la
figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en cajas de petri bajo
condiciones estriles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes
Se realizar el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300
colonias, pues hay menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no hay diluciones
subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se
multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se multiplica
por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el nmero de
cuadros que ocupa la caja.
El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la dilucin y
considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra).
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al inicio de la
cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49
48
Fig. 1
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la preparacin y dilucin de
muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilucin 10 -1, 102
, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a
45C, mezclar rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
1. Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300
colonias.
2. Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilucin
utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo
o mililitro, segn el caso
3. Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y
mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para
cada una de las diluciones y establecer la relacin de los dos recuentos
V.
RESULTADOS
Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS
EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir.
Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica.
49
VI.
CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el aislamiento de
microorganismos.
2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de
microorganismos.
3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el nmero de
colonias por el inverso de la dilucin?
4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes y cules no y
porque?
5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida?
6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms diluciones, en muestra
fresca o procesada, por qu?
50
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I.
OBJETIVO
-
II.
Obtener ndulos de Rhizobium de races de alfalfa.

Observacin microscpica de bacterias de Rhizobium
FUNDAMENTO TERICO
La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la alimentacin
humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interaccin
natural de estas plantas con una bacteria del suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente
importante, como medida para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que
deterioran el suelo y contaminan el ambiente.
La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su
hospedero, lo infecta a travs de los pelos radicales para que en la matriz de las clulas
corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un tejido
hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de la leguminosa para entonces Rhizobium
ha perdido su pared celular y se ha transformado en un bacteroide, mientras que por la
enzima llamada nitrogenasa fija el N 2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al
ribosoma vegetal para la sntesis de protenas vegetales; simultneamente por la
fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirn como fuente de
carbono y energa para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa
mantenerlo activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicacin de
fertilizantes qumicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su
peso seco y mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al
bajar su costo de produccin y la contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital
para una agricultura sustentable.
51
GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES

Grupo de
Inoculacin
cruzada
Grupo de alfalfa
Grupo del trbol
DE Rhizobium LEGUMINOSA
Especies de
Gnero
Rhizobium
hospedero
R. meliloti
R. leguminosarum
biovar trifolii
Leguminosa
incluida
Medicago
Melilotus
Alfalfa
Trebol dulce
Trigonella
Trifolium
Alholva
Trbol
III. MATERIALES Y REACTIVOS

Material Biolgico
- Races de alfalfa con ndulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bistur
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)
IV. METODOLOGA
1. Preparacin del Medio PSA
Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas
estn cocidas.
Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2
g agar agar autoclave 120C 15? Y proceder a plaquear
2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium
- Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa.
- Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma, tamao.
- Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo sobre un porta
objeto y dejar caer el lquido interno para realizar un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
- Realizar coloracin Gram
- Observacin en el microscopio a 100X
3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA
Esterilizacin de ndulos
- Disponer los ndulos en un matraz de 100 ml
- Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
- Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 8 minutos, decantar
- Lavar con agua destilada estril 3 veces
52
- Realizar la diseccin del ndulo con la ayuda de pinzas y bistur sobre papel estril.
- Dejar caer el lquido interno del ndulo seccionado apretando con la pinza o pasar
sobre la superficie del medio.
- Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 27C en estufa, 5 das.
V. CUESTIONARIO
-
Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium.
Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium.
Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.
53
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I.
FUNDAMENTO TEORICO
La deteccin de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas

constituye una prctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatologa. Para ello se
utilizan medios selectivos, indicadores y generales que nos permiten identificar desde el
total de bacterias contaminantes (realmente slo se detecta una cierta parte de la
poblacin total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial inters como agentes
contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos
sufridos por el producto durante su manufacturado o almacenamiento.
II.
PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la

presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:
Escherichia
coli
Samonella typhimurium
Proteus
morganii
Enterobacter aerogenes.
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua
contaminada en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a
continuacin:
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.9 ml ClNa 0.9%
MUESTRA
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las
diluciones 10-5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C
durante la noche en posicin invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el nmero de
colonias y se multiplica por los factores de dilucin correspondientes.
1)
Determinacin de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las diluciones

-5
10
y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la forma descrita. Una
vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosceas y se multiplican ambos nmeros
por los factores de dilucin. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas
y/o rosas al azar y se extiende un inculo denso sobre la superficie de una placa de agar
2)
54
EMB, incubando a continuacin a 37C durante toda la noche. En este medio,

confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos
verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias ms rosceas y nunca reflejos.
Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes.
Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las
diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C
durante 24-48 horas. Sobre este medio
Salmonella y Proteus generan metabolitos
alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosa, mientras que los
eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena forma de
detectar coliformes).
Con estos datos, hay
que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua
contaminada que dan
colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o
Proteus, hay que reinocularlas en caldo de urea y en TSI. Sobre caldo de urea la
estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da negativo para ambas
actividades. En TSI nicamente la estirpe de
Salmonella debe aparecer con
precipitados negros (por produccin de SH 2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el
resto de los caracteres siguientes:
3)
S. typhimurium
P. morganii
Fondo*
Pendiente
Ennegrecimiento
A+G
A+G
Alcalino
Alcalino
S
No
(*) A indica produccin de cido y G de gas.
III. RESULTADOS
55
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES

PRCTICAS
1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10%
PREPARACIN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada
2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%
PREPARACIN
Azul de metileno
5.0 gr
Agua destilada
100 ml
3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM
A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FRMULA:
Cristal violeta
2.0 gr
Etanol al 95%
20 ml
Oxalato de amonio
0.8 gr
Agua destilada
80 ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio
10.0 gr
Agua destilada
20.0 ml
Yodo metlico
5.0 gr
Etanol, aforar a
100.0ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metlico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA
FORMULA
Acetona
1
volumen
Etanol al 95%
2 volmenes
D) COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina
0.5 gr
Agua destilada
100.0 ml
PREPARACIN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con
ms
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
FORMULA:
Fucsina bsica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin
2.- Aadir la fucsina bsica y disolver
3.- Aadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO
FORMULA
cido clorhdrico 3.0 ml
56
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIN
Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml
5.- MEZCLA CRMICA
Dicromatode potasio
cido sulfrico concentrado
Aguadestilada
20.0 gr
20.0 ml.
250.0 ml.
57
BIBLIOGRAFIA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General. Canoabo
CARPENTER, Philip. 1969. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial Interamericana, S.H.
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FARRAS, Ramn Pars J. Bioqumica de los Microorganismos. Ed. Revert, S.A., Espaa,
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WARD, Owen P. Biotecnologa de la Fermentacin, Ed. Acribia, S.A. Espaa, 1991.
58

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: CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE COLONIAS

: CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO....................................................

PRCTICA 10 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS.......................................

La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este

EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;

1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de

El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer

2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica

Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de

Orificios superiores para purga de gases de combustin.

ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de

ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA

Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad

Material de vidrio: pipetas, palcas Petri

4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

c) Preparacin de las placas Petri

4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

los materiale (tubos de ensayo)

llevar sus tapones de algodn

no muy flojos ni apretados, ni 9

1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos?

3. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas.

4. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

Estos filtros estn elaborados por

Entre sus ventajas se encuentra su

travs de toda su estuctura y que

FILTROS DE SUPERFICIE: son filtros

2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

de peptona. Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Temperaturas cardinales (C)

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De

crecimiento de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una

En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)

Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de

Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.

2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION

HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)

contiene volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya aspiracin

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)

homogenizacin en este caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo,

c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).

2.6. SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

b. SIEMBRA POR PICADURA

c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA

Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de

El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia

SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY

4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA