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Monografias

FFI 339 - Introdução à Espectroscopia

Ciências Físicas e Biomoleculares

Introdução

03

Princípios Básicos da Ressonância Magnética Nuclear Francesco Brugnera Teixeira

04

Espectroscopia de RMN Marcela Nunes

10

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) Renato Dantonia Paciência

17

Ressonância Magnética Nuclear César Moschio Fioravanti

22

Ressonância Magnética Nuclear por Tensor de Difusão Rafael Tuma Guariento

26

Espectroscopia Raman Carolina de Paula Campos

30

Espectroscopia Raman Eduardo Cocca Padovani

36

Espectroscopia Raman Gilson Campani Junior

41

Espectroscopia Raman – A Voz do Silêncio Letícia Fais

45

Efeito Raman Ricardo Simionato Boffa

57

Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier e seu Uso na Análise de Vinho 60 Vanessa Kiraly Thomaz Rodrigues

Espectroscopia Visível e Ultravioleta André de Campos Rauber

73

Espectroscopia de Fluorescência Pedro Michelão Neuber

78

Espectroscopia: História Geral, a Espectroscopia de Fluorescência e uma Possível Aplicação na Terapia Fotodinâmica 83 Ana Paula Pereira Guimarães

Espectroscopia por Fluorescência Jéssica Baleiro Okado

91

Espectro de Fluorescência Priscilla Jukeram Bergo

97

Fundamentos e Aplicações de Espectroscopia Ultrarápida de Bombeio-e-Prova (Pump-Probe Spectroscopy) 104 Caio Vaz Rímoli

Estudo de Proteína por Dicroísmo Circular Letícia Marchese

111

Princípio Básico sobre XPS Evandro José Molinari

117

Ressonância Paramagnética Eletrônica Luís Felipe Santos Mendes

123

Espectroscopia por Raios-X André Monteiro Pascoal

130

SAXS – Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo Bruno Luan Soares Paulo de Mello

135

Espectroscopia de Fotoelétron Jaqueline Yu Ting Wang

144

Dezembro de 2011

Introdução

Este é o primeiro compêndio das monografias elaboradas pelos alunos do curso de Ciências Físicas e Biomoleculares de 2011 do curso de Introdução à Espectroscopia do IFSC. Essas monografias são de autoria dos alunos e foram eleaboradas com o intuito de estabelecer os conceitos básicos das várias técnicas de espectroscopia que existêm. Algumas monografias enfocam mais os conceitos teóricos e outras os conceitos experimentais. Como o tema e o formato das monografias foram livres, há uma grande dispersão entre elas.

As monografias sofreram algumas modificações por conta de eventuais correções e tentativa de padronização de formato. Algumas figuras e equações sofreram perda de resolução devido à redução do tamanho e conversão para o pdf. Além disso, as algumas equações ficaram prejudicadas devido à conversão para “figura”. Devido ao grande número de equações e notações cientícas, não foi possível fazer todas as correções necessárias, portanto pode haver eventuais erros e falhas de tipografia.

Acredito que esse compêndio possa ser uma ótima referência para todos os alunos quando se fizer necessário o estudo de umas das espectroscópicas aqui listadas. Portanto, use esse material da melhor forma possível, e aprecie os trabalhos dos seus colegas.

São Carlos, 5 de dezembro de 2011.

Prof. Dr. Lino Misoguti

Princípios Básicos da Ressonância Magnética Nuclear

Francesco Brugnera Teixeira

INTRODUÇÃO

Neste trabalho apresentarei os princípios básicos da ressonância magnética nuclear (RMN) e também os principais fenômenos físicos que a tornam uma técnica espectroscópica.

físico s que a tornam uma técnica espectroscópica. Figura 1: Espectro 1 H do glicerol PRINCÍPIOS

Figura 1: Espectro 1 H do glicerol

PRINCÍPIOS BÁSICOS

Spin nuclear

O spin nuclear, assim como spins de qualquer outra

origem, é um fenômeno puramente quântico. Ele

representa um momento angular intrínsico do núcleo e não possui análogo clássico. É simbolizado pelo vetor I. Por restrições da mecânica quântica não podemos determinar o vetor I por completo, apenas seu módulo e uma de suas componentes, convencionada como direção z. O spin nuclear é quantizado, ou seja, não pode assimir qualquer valor, os valores possíveis do módulo

de I são:

I
I

2 = I I =

.

h

I

(

I +

1)

(1)

I é chamado número quântico de spin e é característico

de cada núcleo. Na técnica de RMN, I é dado para cada

tipo de núcleo:

(i)

Núcleos com número de massa ímpar possuem I semi-inteiros;

(ii)

Núcleos com número de massa par e número atômico par possuem I nulo;

(iii)

Núcleos com número de massa par e número atômico impar possuem I inteiro.

Núcleos do tipo (ii) não são ativos para as técnicas de RMN. Núcleos com I maior que ½ possuem momento quadrupolar magnético devido a sua distribuição não esférica de cargas. Os núcleos mais utilizados na

espectroscopia por RMN são 1 H, 13 C, 15 N, 19 F e 31 P com I = ½ e 2 H (deutério) com I = 1.

A projeção no eixo z do momento de spin I z também não assume quaisquer valores:

(2)de spin I z também não assume quaisquer valores: E o número quântico magnético m pode

E o número quântico magnético m pode assumir os valores:

o número quântico magnético m pode assumir os valores: Para cada valor de I podemos ter

Para cada valor de I podemos ter 2I + 1 valores de I z , ou seja, 2I + 1 estados, Na ausência de campos externos todos esses estados são degenerados e não há nenhuma direção preferencial para I. Para I = ½, apenas dois estados de I z são possíveis: com m = + ½ e m = - ½.

Interação do spin com o campo magnético externo

Núcleos com momento de spin I diferente de zero possuem também momento magnético µ que é colinear com I :

também momento magnético µ que é colinear com I : (3) γ é chamado razão magnetogírica

(3)

γ é chamado razão magnetogírica, pode ser maior ou menor que zero dependendo do núcleo e indica o quão receptível é o núcleo para a espectroscopia de RMN.

Ao aplicarmos um campo magnético externo B 0 , o momento magnético do núcleo µ interage com B 0 e a energia de interação é dada por:

(4)com B 0 e a energia de interação é dada por: Aplicando um campo uniforme na

Aplicando um campo uniforme na direção z, (B 0 = B 0 z):

um campo uniforme na direção z , ( B 0 = B 0 z ): (5)

(5)

Para I=1/2, as energias dos dois estados possíveis (α e β) e diferença entre elas são:

,
,
possíveis ( α e β ) e diferença entre elas são: , e (6) Para núcleos

e

possíveis ( α e β ) e diferença entre elas são: , e (6) Para núcleos

(6)

Para núcleos com I ½ , as transições entre níveis sucessivos (m = ±1) também possuem E= γ ħ B 0 . De fato, apenas esse tipo transição (m = ±1) é permitido pela regra de seleção. A condição de Bohr nos diz que a

frequência de radiação eletromagnética capaz de estimular a transição entre níveis respeita a condição:

a transição entre ní veis respeita a condição: (7) Como em outras formas de espectroscopia, a
a transição entre ní veis respeita a condição: (7) Como em outras formas de espectroscopia, a

(7)

Como em outras formas de espectroscopia, a condição de Bohr é apenas uma condição necessária para se observar transições entre estados de energia diferentes. Na espectroscopia por RMN, a radiação eletromagnética de frequência apropriada induz transições descendentes (emissão) e ascendentes (absorção) com idêntica probabilidade. Porém poderá haver um efeito que favoreça absorção ou emissão de energia se, numa amostra macroscópica, a população dos dois estados não for a mesma, como é o caso da aplicação de B 0 , vejamos.

Num ensemble de núcleos magnéticos idênticos de I = ½, a razão das populações dos estados em equilíbrio é dada pela distribuição de Boltzmann:

em equilíbrio é dada pela distribuição de Boltzmann: (8) A aproximação em série de Taylor pode
em equilíbrio é dada pela distribuição de Boltzmann: (8) A aproximação em série de Taylor pode

(8)

A aproximação em série de Taylor pode ser feita já que

E tem um valor muito menor comparado com kT. n é

o número total de núcleos (n = n α + n β ). Mesmo com

campos magnéticos B 0 da ordem de 14T, a 300K, aproximadamente 5 núcleos de 1 H em 100.000 estarão em excesso no estado de menor energia, justificando a

baixa sensibilidade da técnica.

Mas afinal, como podemos manipular os estados de spin nucleares através dum campo magnético para medirmos algum tipo de espectro? Para isso devemos saber como ocorre a interação radiação-spin e a precessão nuclear.

Ao aplicarmos o campo B 0 = B 0 z, sabemos que o momento magnético nuclear µ não se alinha na direção de B 0 , senão poderíamos determinar todas as componentes de µ ( µ= µ z z , µ x = µ y = 0), o que não é possível pela natureza da mecânica quântica. Como µ relaciona-se com I de forma colinear, e o módulo de I é sempre maior que o módulo da componente I z (relações 1 e 2) é razoável supor que as componentes I x e I y estão distribuídos num cone, conforme a figura abaixo:

estão distribuídos num cone, conforme a figura abaixo: Figura 2: Momentos angulares I e I z

Figura 2: Momentos angulares I e I z (eixo vertical) para os casos de (a) I = ½ e (b) I = 1. As componentes I x e I y não podem ser determinadas pela incerteza natural da mecânica quântica e estão distribuídas num cone.

Assumir que I x e I y , e consequentemente µ x e µ y , não podem ser determinados é o mesmo que dizer, num ponto de vista clássico, que essas componentes não são constantes de movimento, ou seja, µ x e µ y executam um movimento de precessão em torno de B 0 .

A precessão tende alinhar µ a B 0 , porém sem alterar a

componente I z (não havendo mudança energia). A equação de movimento nos diz:

mudança energia). A equação de movimento nos diz: Essa expressão identifica-se com a que descreve a
mudança energia). A equação de movimento nos diz: Essa expressão identifica-se com a que descreve a

Essa expressão identifica-se com a que descreve a

precessão:

expressão identifica-se com a que descreve a precessão: Desde que chamada frequência de Larmor , é

Desde que

chamada frequência de Larmor, é portanto:

Desde que chamada frequência de Larmor , é portanto: . A frequência de precessão, (9) Agora

. A frequência de precessão,

de Larmor , é portanto: . A frequência de precessão, (9) Agora compare as equações (7)

(9)

Agora compare as equações (7) e (9). Podemos ver que

a frequência de precessão do spin em torno de B 0

(Larmor) tem o mesmo valor da frequência da radiação eletromagnética que satisfaz a condição de Bohr! Podemos dizer que a radiação eletromagnética e os spins nucleares estão em ressonância. Esse mecanismo nos proporciona uma forma de interagir com o sistema. Aplicando radiação eletromagnética num ensemble de spins sujeitos ao campo B 0 , a interação com o sistema ocorrerá através da componente magnética B 1 oscilante de frequência adequada levando à excitação da amostra e consequente detecção.

Natureza do sinal RMN

Numa amostra composta de muito núcleos de I = ½ sujeitos ao campo B 0 = B 0 z, a pequena diferença de

RMN Numa amostra composta de muito núcleos de I = ½ sujeitos ao campo B 0

população entre os estados α e β gerará uma magnetização total M 0 = Σμ alinhada na direção z pelo fato das direções dos momentos magnéticos nucleares μ

estarem distribuídos aleatoriamente em torno da direção

z.

Ao

aplicarmos um campo oscilatório B 1 de frequência

adequada f L e perpendicular a B 0 , o binário μ x B 1 tanto

produzirá transições α → β e β → α como tende a agrupar os vetores μ, deixando-os em fase com a oscilação de B 1 . Devido a diferença de população entre

os estados α e β, como discutido anteriormente, as

transições α → β são favorecidas até que as populações

se igualem.

β são favorecidas até que as populações se igualem. Figura 3: Magnetização M 0 gerada a

Figura 3: Magnetização M 0 gerada a partir da aplicação do campo B 0 .

A magnetização resultante M, portanto, além da

diminuição de sua grandeza devido à diminuição do excesso de núcleos n α – n β , se desloca de um ângulo θ do eixo z e passa a precessionar em torno do eixo z com velocidade angular correspondente a frequência de

oscilação de B 1 (ω 0 = 2 π f L z). Em geral, as variações

da componente M y induzem corrente elétrica numa

bobina alinhada no eixo y. Temos assim um sinal elétrico quando a condição de ressônancia é atingida.

elétrico quando a condição de ressônancia é atingida. Figura 4: Magnetização total M gerada a partir

Figura 4: Magnetização total M gerada a partir da aplicação

de

B 1 variável de frequência f L = ω 0 /2π. M desloca-se do eixo

z

devido ao agrupamento dos momentos magnéticos μ e

precessiona em torno do eixo z com velocidade angular ω 0.

A intensidade do sinal elétrico gerado gerado por M y

será proporcional a sua variação temporal dM y /dt. Enquanto a potência da radiação absorvida é proporcional a B 1 2 , o sinal elétrico é proporcional a B 1 . Podemos dizer agora quais fatores aumentam a intensidade do sinal gerado:

(i)

Maior relação magnetogírica γ, pois aumenta E, há maior probabilidade de transição de estado e aumenta a magnetização da amostra M ;

(ii)

Maior intensidade de B 0 , leva a maior E e maior M ;

(iii)

Maior número de núcleos n, pois aumenta n α - n β e M ;

(iv)

Maior intensidade de B 1 acarreta em maiores probabilidades de transição;

(v)

Menor temperatura T aumenta n α - n β e consequentemente M.

Relaxação de spins nucleares e as equações de Bloch

A dinâmica dos spins devido aos campos magnéticos e

podem ser descritos a partir da equação análoga a uma

já estudada:

ondedescritos a partir da equação análoga a uma já estudada: Sendo B 1 um campo polarizado

a partir da equação análoga a uma já estudada: onde Sendo B 1 um campo polarizado
a partir da equação análoga a uma já estudada: onde Sendo B 1 um campo polarizado

Sendo B 1 um campo polarizado circularmente no plano

xy temos:

B 1 um campo polarizado circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10)

,

1 um campo polarizado circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10) Podemos

,

um campo polarizado circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10) Podemos ver

Nos levando a:

circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10) Podemos ver que M z
circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10) Podemos ver que M z
circularmente no plano xy temos: , , Nos levando a: (10) Podemos ver que M z

(10)

Podemos ver que M z varia apenas devido à atuação de B 1 , que é responsável pela transição de estado.

Mas a variação de M não se dá somente pela presença

de B 1 . Com os spins em contato térmico, na ausência de

B 1 , o sistema tende a voltar ao equilíbrio térmico, ou

seja, tornar M = M 0 , esse processo é denominado relaxação. As componentes de M tendem a voltar ao

ou seja, tornar M = M 0 , esse processo é denominado relaxação . As componentes

equilíbrio de forma exponencial, isso se traduz nas equações:

de forma exponencial, isso se traduz nas equações: (11) M x e M y voltam aos
de forma exponencial, isso se traduz nas equações: (11) M x e M y voltam aos
de forma exponencial, isso se traduz nas equações: (11) M x e M y voltam aos

(11)

M x e M y voltam aos seus de equilíbrio (M x = M y = 0) com o tempo característico T 2 , que é chamado tempo de relaxação transversal ou tempo de relaxação spin-spin. Deve-se ao fato de os spins voltarem a se distribuir aleatoriamente no cone de precessão e não envolve necessariamente transferência de energia. O nome spin- spin vem de estudo de amostras sólidas, onde a perda de coerência resulta da interação direta entre os spins de diferentes núcleos.

T 1 é designado tempo de relaxação longitudinal ou tempo de relaxação spin-rede. Novamente o segundo nome é derivado de estudos em amostras sólidas. Esse tipo de relaxação deve-se à recuperação de M z para M 0 , ocorre com a relaxação dos núcleos excitados por B 1 e envolve a transferência de energia dos núcleos excitados para outros graus de liberdade (energia cinética). A relaxação não é um fenômeno de emissão expontânea, mas o resultado de campos magnéticos flutuantes de apropriada frequência com origem nos movimentos moleculares da amostra. Os tempos de relaxação seguem a relação T 1 T 2 , devido a natureza das relaxações.

Finalmente, combinando os dois efeitos descritos pelos conjuntos de equações (10) e (11), a variação de magnetização total é descrita pelas chamadas equações de Bloch:

total é descrita pelas chamadas equações de Bloch : Equações de Bloch (12) Já que o
total é descrita pelas chamadas equações de Bloch : Equações de Bloch (12) Já que o

Equações de Bloch

pelas chamadas equações de Bloch : Equações de Bloch (12) Já que o sinal captado na

(12)

Já que o sinal captado na bobina depende de M y , as equações de Bloch preveem uma banda de forma Lorentziana no domínio das frequências como mostra a figura abaixo:

no domínio das frequências como mostra a figura abaixo: Figura 5: Sinal obtido pela bobi na

Figura 5: Sinal obtido pela bobina no eixo y (a esquerda) e o sinal de forma Lorentziana no domínio das frequências (a direita) após a transformada de Fourier.

A largura a meia-altura da banda obtida é descrita pela

uma

à

Por

e aa meia-altura da banda obtida é descrita pela uma à Por A inomogeneidade do campo pode

A

inomogeneidade do campo pode ser modelado por funções gaussianas e leva-nos a obter sinais de forma lorentziana + gaussiana.

meia altura da banda passa a ser

analogia define-se um tempo de relaxação efetivo

inomogeneidade de B 0 :

contribuição

relação

,
,

ao

mas,

de

de

fato,

banda

alargamento

devido

relação , ao mas, de de fato, banda há alargamento devido . . ESPECTROSCOPIA POR RMN

.

, ao mas, de de fato, banda há alargamento devido . . ESPECTROSCOPIA POR RMN Até

.

ESPECTROSCOPIA POR RMN

Até agora, os princípios físicos que explicam a ressonância magnética nuclear foram apresentados, porém, se pararmos para pensar, ao medirmos um espectro de 1 H de certo componente simples como o etanol ou qualquer outro composto, não haveria espectro algum! Só veríamos uma grande banda em certa frequência já que todos os prótons possuem mesma razão magnetogírica γ e sentem o mesmo campo magnético B 0 . Na realidade, essa última informação é falsa.

0 . Na realidade, essa última informação é falsa. Figura 6: Primeiro espectro do etanol obtido

Figura 6: Primeiro espectro do etanol obtido por Arnold et al. na Universidade de Stanford em 1951.

As correntes induzidas produzidas pelos elétrons próximos a certo núcleo tendem a diminuir o campo magnético local (lei de Lenz) em amostras diamagnéticas (que não possuem elétrons desemparelhados). Isso acarreta na mudança da frequência de ressonância f L para núcleos idênticos mas pertencentes a ambientes químicos diferentes, nos permitindo observar um espectro de frequências de ressonância. A esse efeito damos o nome de desvio

diferentes, nos permitindo observar um espectro de frequências de ressonância. A esse efeito damos o nome

químico ou chemical shift que nos revela a estrutura fina

do espectro.

Muitos outros efeitos causam o desdobramento ou deslocamento desses sinais, entre eles estão:

(i)

Acoplamento dipolar ou dipolo-dipolo;

(ii)

Acoplamento escalar ou spin-spin indireto;

(iii)

Interação núcleo-elétron;

(iv)

Momento quadrupolar, em núcleos com I1/2 .

Os fenômenos citados acima revelam a estrutura hiperfina dos espectros. Irei agora descrever brevemente

o que são e o que acarretam os três principais efeitos de desdobramento dos espectros: desvio químico, acoplamento dipolar e acoplamento escalar. Não estou dizendo que os outros efeitos não têm importância, a espectroscopia por RMN possui diversas aplicações e, certamente, os não citados aqui são importantes para algumas dessas aplicações.

Desvio químico

A origem do desvio químico já foi citado acima: as

correntes induzidas dos elétrons que blindam o núcleo de forma que ele sinta um campo magnético

adicional ao campo B 0 . De fato, não necessariamente está na mesma direção de B 0 ,

portanto a constante de proteção magnética ou constante de blindagem σ é uma grandeza tensorial. Porém, no estudo de líquidos e gases, apenas o valor médio de é determinado devido ao rápidos movimentos das moléculas e apenas o valor médio de σ

é importante. Para prótons, a constante de blindagem é

da ordem de 10 -5 e, para núcleos de alta massa, é da

ordem de 10 -2 . O campo magnético sentido pelo spin é:

de 10 - 2 . O campo magnético sentido pelo spin é: (13) Dois núcleos iguais,
de 10 - 2 . O campo magnético sentido pelo spin é: (13) Dois núcleos iguais,
de 10 - 2 . O campo magnético sentido pelo spin é: (13) Dois núcleos iguais,

(13)

Dois núcleos iguais, porém em ambientes químicos diferentes, absorvem radiação de frequências

ligeiramente diferentes. Com isso já podemos esplicar, pelo menos em parte, o espectro de 1 H do etanol

CH 3 CH 2 OH na figura 6. O pico de absorção a esquerda

(maior frequência) representa o próton ligado ao oxigênio, que, por ser mais eletronegativo, diminui a

blindagem do próton, aumentando o campo local e consequentemente a sua frequência de ressonância. O pico do meio representa os dois prótons ligados ao carbono central, pois sua intensidade está a dois terços

da altura do pico a direita, que por sua vez representa os

três hidrogênios ligados ao terceiro carbono. Simples,

não é? Sim, simples demais. Não foram levadas em conta as ligações de hidrogênio nem outras contribuições das correntes de indução de átomos

vizinhos. Se medirmos o espectro do etanol num solvente inerte como o CCl 4 , mostra-se que a banda do OH está a a direita (menor frequência) da banda do

CH 2 .

Por razões históricas, nos espectros de RMN a frequência de ressonância ou o desvio químico crescem da direita para a esquerda, pois isso representa um

crescem da direita para a esquerda, pois isso representa um aumento da constante de blindagem da

aumento da constante de blindagem da esquerda para a direita.

Uma forma de padronizar todos os espectros foi a introdução do desvio químico δ ij definido por:

δ

ij

=

( f

i

f

j

)

f

j

(14)

onde f j é a frequência de ressonância dum padrão que segue várias características bem definas (comumente usa-se os compostos TMS ou DSS) e f i a frequência do núcleo em questão. Pode-se observar facilmente que o desvio químico δ ij não depende de B 0 , tornando a escala independente do espectrômetro utilizado. O desvio químico dá-se na ordem de 10 -6 , por isso a escala é chamada geralmente de ppm, ou partes por milhão.

O desvio químico transforma a espectroscopia de RMN

numa ferramenta poderosa na identificação da estrutura de substâncias químicas. Cada grupamento químico terá seus desvios químicos característico. Na espectroscopia de 1 H particularmente, os desvios químicos são muito sensíveis à natureza do solvente e à presença de espécies paramagnéticas.

Acoplamento dipolar

O acoplamento dipolar advém da interação direta entre

spin de núcleos diferentes e é um dos agentes que causa

desdobramento nos sinais de RMN. O spin sente seu vizinho através de um campo magnético local

, onde r é a distância entre os spins e

θ o ângulo entre seus momentos de dipolo. No ângulo de 55 o , a contribuição da média temporal de B loc é nula, esse ângulo é denominado ângulo mágico em RMN de sólidos.

Em amostras líquidas ou gasosas, os rápidos movimentos moleculares causam rápida reorientação das moléculas em relação ao campo magnético, tornando a contribuição do acoplamento dipolar nula e não leva ao desdobramento de espectro. Para moléculas muito grandes onde o movimento térmico é reduzido, a média temporal de B loc não anula-se completamente, contribuindo com o alargamento de banda.

Acoplamento escalar

Através de mecanismos indiretos, os elétrons de ligação fazem com que o valor médio do campo magnético sentido por um núcleo dependa da orientação dos spins de núcleos vizinhos. Esse acoplamento indireto leva a um desdobramento do espectro de RMN normalmente.

Se tivermos 2 núcleos, A e X não equivalentes mas ambos de spin I = ½, como o HF, o sinal de A dependerá da orientação do spin de X. Os spins de X podem ser +1/2 e -1/2, levando ao desdobramento do sinal de A em dois (dubleto). Igualmente o sinal de X será um dubleto pois A pode assumir dois estados de spin (+1/2 e -1/2).

de A em dois (dubleto). Igualmente o sinal de X será um dubleto pois A pode
de A em dois (dubleto). Igualmente o sinal de X será um dubleto pois A pode
Figura 7: Desdobramento do espectro de RMN de dois núcleos A e X de spin

Figura 7: Desdobramento do espectro de RMN de dois núcleos A e X de spin I = ½ acoplados. Em cima a diferença entre os níveis de energia e em baixo o espectro correspondente se (à esquerda) os núcleos não estivessem acoplados (J=0) e (à direita) se os núcleos estão acoplados

(J>0).

A separação (em Hz) entre os picos é denominada

constante de acoplamento e é representada pela letra J.

A constante de acoplamento não depende da

intensidade de B 0 .

Em geral, um núcleo acoplado a outro de spin I e

quimicamente não equivalente ao primeiro terá um multipleto de 2I+1 componentes. Como é o caso do espectro 1 H do íon 14 NH 4 + (I = 1 para 14 N) que será um

tripleto pois os prótons encontam-se acoplados ao nitrogênio e nesse caso 2I+1 = 3. Nessa situação, J NH

será a separação entre picos consecutivos.

Se um núcleo estiver acoplado com o mesmo J a n

núcleos equivalentes, haverá 2nI+1 picos em seu espectro e se o núcleo estiver acoplado a núcleos de

diferentes JJ pode acontecer desdobramentos

consecutivos, como tripeto de dubletos na pirimidina. Não necessariamente os núcleos precisam estar diretamente ligados (distância de uma ligação) a outro núcleo para estarem acoplados e os picos não precisam

ter a mesma intensidade já que alguns estados

acoplados são mais prováveis que outros.

alguns estados acoplados são mais prováveis que outros. Figura 8: Espectro do etanol com resolução suficiente

Figura 8: Espectro do etanol com resolução suficiente para se ver o quarteto do grupo metileno e o tripleto do grupo metil.

Muitos efeitos, naturais e provocados podem levar ao desacoplamento entre núcleos. Dentre eles rápidas trocas, como a do próton de um grupo –OH, fazem com que os spins vizinhos enxergem apenas um campo magnético médio gerado por ele e não observa-se acoplamento com este. Elevados momentos de quadrupolo elétrico também geram desacoplamento pois as rápidas oscilações do campo elétrico promovem rápidas transições no estado de spin. O efeito de Overhauser nuclear (NOE) também é um causador de desacoplamento. Certas técnicas, por fim, geram desacoplamento intencional aplicando campo magnético oscilatório intenso de frequência igual a frequêcia de ressonância do núcleo.

CONCLUSÃO

Foram apresentados aqui apenas uma breve introdução do fenômeno de RMN e os princípios mais fundamentais da espectroscopia por RMN, porém para entendermos a fundo toda a teoria dos diversos tipos de experimentos realizados por RMN, é necessário um boa dose de mecânica quântica e álgebra matricial.

Não falei muito das aplicações da técnica, mas há muitas e muitas delas em diferentes áreas. Na química e na biologia estrutural, muitos experimentos podem ser realizados; desde simples fingerprints de pequenas substâncias até a elucidação de estruturas proteicas, dinâmica molecular, interação com ligantes e outros monômeros da mesma proteína. Cada tipo de experimento utilizado explora certos fenômenos físicos, por exemplo, o acoplamento dipolar que é fundamental na RMN de sólidos e tem seu efeito anulado ou reduzido em líquidos e sólidos, daí a importância de conhecer o background teórico de cada experimento a ser realizado.

BIBLIOGRAFIA

Ressonância magnética nuclear: fundamentos, métodos e aplicações (capítulos 1 e 2); Victor M. S. Gil e Carlos F. G. C. Geraldes; Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa; 1987.

Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice, Second Edition (Capítulo 1); John Cavanagh, Wayne J. Fairbrother, Arthur G. Palmer III, Mark Rance e Nicholas J. Skelton; Elsevier Academic Press; 2007.

Aula sobre “RMN no Estudo de Biomoléculas” da prof a . Claudia Elizabeth Munte, IFSC-USP.

• Aula sobre “RMN no Estudo de Biomoléculas” d a p r o f a .

Espectroscopia de RMN

Marcela Nunes

INTRODUÇÃO

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é,

atualmente, uma das técnicas mais versáteis para o estudo a nível atômico a estrutura e a dinâmica de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos, e também caracterização das interações e reconhecimento

molecular, nomeadamente interações proteína-proteína, proteína-ligante ou proteína-ácidos nucléicos, sendo

uma

técnica não destrutiva.

Esta

técnica tem como base o fenômeno de ressonância

para o estudo das propriedades físicas e químicas da matéria, explorando as propriedades magnéticas de núcleos atômicos. Em química, é frequentemente utilizada para o estudo da estrutura dos compostos usando técnicas uni ou bidimensionais simples substituindo as técnicas de cristalografia de raios-X.

Espectroscopia de RMN depende das variações de energia quantificáveis que podem ser induzidas em pequenas moléculas quando estas são submetidas à radiação eletromagnética. Este se relaciona com as

transições induzidas pelas radiofrequências entre estados quantificados de energia dos núcleos orientados

num campo magnético.

O núcleo de certos elementos e isótopos comporta-se

como se um fosse ímã girando em torno de um eixo, quando se coloca um composto contendo átomos de 1 H ou de 13 C em um campo magnético muito forte e simultaneamente se irradia o composto com energia eletromagnética, os núcleos podem absorver energia num processo denominado ressonância magnética. A absorção desta radiação pelos núcleos desses elementos é quantificada e da origem a um espectro característico.

PRINCÍPIOS BÁSICOS

RMN trata da interação da radiação eletromagnética com a matéria. Entretanto, esta se diferencia da espectroscopia óptica em vários aspectos, como:

- A separação dos níveis de energia

- A separação dos níveis de energia

é

r

resultado da interação do momento magnético μ

de

um

núcleo

atômico

com

o

campo

magnético

aplicado;

aplicado;

- A interação é com a componente magnética da

radiação eletromagnética ao invés da componente elétrica. Sendo que, o efeito de ressonância ocorre para

r

núcleos que possuem momentos magnéticos ( μ )e angulares ( ).

que possuem momentos magnéticos ( μ )e angulares ( ). Os núcleos apresentam momentos magnéticos e

Os

núcleos

apresentam

momentos

magnéticos

e

angulares

paralelos

entre

si,

respeitando

a

expressão momento angular
expressão
momento angular

, onde γ é o fator giromagnético. O

por

, onde é denominado de momento angular ou spin, cujos valores podem ser somente números inteiros ou semi-inteiros positivos. Na RMN é possível controlar a radiação eletromagnética e descrever a interação da radiação com os spins nucleares.

é

definido,

quanticamente,

PROPRIEDADES MAGNÉTICAS DOS NÚCLEOS

Quando a massa atômica (A) é par, porque Z e N são

pares, o numero quântico

sinal de RMN, mas quando , o núcleo pode ser considerado como uma partícula carregada girando em torno do seu próprio eixo com um momento magnético

em torno do seu próprio eixo com um momento magnético = 0, e o núcleo não

= 0, e o núcleo não possui

r

nuclear μ

ao longo deste eixo.

e o núcleo não possui r nuclear μ ao longo deste eixo. Figura 1: Movimento de

Figura 1: Movimento de rotação da carga do hidrogênio gera um campo magnético

A rotação de partículas carregadas gera um movimento magnético orientado segundo o eixo de spin, significando que estes núcleos funcionam como barras magnéticas.

que estes núcleos funcionam como barras magnéticas. Figura 2: Rotação do núcleo em um campo magnético

Figura 2: Rotação do núcleo em um campo magnético externo

que estes núcleos funcionam como barras magnéticas. Figura 2: Rotação do núcleo em um campo magnético

Quando os núcleos são submetidos a um campo magnético forte e uniforme, , sofrem uma torção e tendem a tomar uma orientação «permitida», em relação ao campo externo. Este alinha os núcleos que giram opondo-se à tendência desordenada dos processos térmicos. Porém, os núcleos não se alinham em posição perfeitamente paralela (ou antiparalela), em relação ao campo. O que ocorre é que os eixos dos respectivos spins ficam oblíquos em relação ao campo, e tal como a parte superior de um giroscópio, sofre um movimento de precessão, em que cada pólo do eixo nuclear descreve uma trajetória circular no plano do campo.

descreve uma trajetória circular no plano do campo. SOBRE O SINAL sinal da espectroscopia de RMN

SOBRE O SINAL

sinal da espectroscopia de RMN é resultante da diferença entre a energia absorvida pelos spins que

efetuam uma transição do estado de menor energia para

o estado de maior energia e a energia emitida pelos

mesmos que simultaneamente efetuam uma transição do nível de energia superior para o de energia inferior. O sinal é então proporcional à diferença populacional entre os estados considerados.

à diferença populacional entre os estados considerados. Figura 3: Formato das curvas dos dois sinais RMN

Figura 3: Formato das curvas dos dois sinais RMN observáveis.

A espectroscopia de RMN é um método sensível porque

a capacidade de detectar estas pequenas diferenças

populacionais é de certa forma acentuada. O sinal RMN

é formado por duas componentes defasadas em 90º.

Estas, quando são detectáveis, são compostas por uma componente de absorção e uma componente de dispersão, Figura 3, que podem ser observadas com a utilização de um detector de fase sensível. Porém, os espectros de RMN são habitualmente observados no modo de absorção, enquanto o de dispersão é utilizado para controle da frequência de campo.

RMN BIDIMENSIONAL – 2D

Um dos desenvolvimentos mais importantes para a espectroscopia foi o desenho de novos magnetos baseados em materiais supercondutores. Este novo tipo possibilitou o alcance de campos magnéticos maiores e mais estáveis levando à obtenção de espectros mais sensíveis e de melhor resolução, podendo-se estudar sistemas mais complexos. Entretanto, o grande desenvolvimento surgiu com o sistema de FT * - RMN bidimensional (2D), baseado nas técnicas de pulsação.

bidimensional (2D), baseado nas técnicas de pulsação. * FT – Transformadas de Fourrier . Em RMN

* FT – Transformadas de Fourrier.

Em RMN -1D, os spins são expostos a um pulso que detecta um sinal no receptor em função do tempo t. Já em RMN-2D, os spins são sujeitos a dois ou mais pulsos, com um intervalo de tempo t 1 . Após o segundo pulso, o sinal é obtido da mesma forma que para RMN- 1D, embora a variável de tempo passe a ser denominada de t 2 . Depois desta etapa, o espectrofotômetro repete o procedimento, mas com valor diferente de t 1 . Essa variação de t 1 modifica o sinal medido durante t 2 , que origina então, uma tabela bidimensional conténdo a intensidade do sinal como função da t 1 e t 2 . Após estas variáveis serem submetidas às transformadas de Fourrier, obtém-se um espectro de frequência bidimensional na forma de um mapa, que demonstra a dependência da intensidade do sinal em duas variáveis de frequência, denominadas F 1 e F 2 .

variáveis de frequência, denominadas F 1 e F 2 . APLICAÇÕES NA SAÚDE E NA PESQUISA

APLICAÇÕES

NA

SAÚDE

E

NA

PESQUISA

BIOLÓGICA

Atualmente, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear é utilizada em todos os ramos da química, tanto nas universidades como nos laboratórios industriais. Uma investigação típica em RMN, combina vários tipos de espectros 1D, 2D e por vezes até 3D ou 4D, e com a acumulação das informações pode ser fornecida uma

tipos de espectros 1D, 2D e por vezes até 3D ou 4D, e com a acumulação

figura detalhada da estrutura molecular. Por exemplo, a estrutura tridimensional completa de várias proteínas e outras macromoléculas biológicas é determinada com freqüência por este meio.

RMN também tem sido usada para o estudo das interações entre diferentes espécies moleculares (ex.

Enzimas - substrato), dos seus movimentos em líquidos

e polímeros, bem como para obtenção de informações

acerca das velocidades de certas reações. Ocupa um lugar elevado no campo da análise qualitativa e quantitativa, desde componentes em produtos alimentares, a fluidos biológicos e metabolitos em tecidos e órgãos de seres vivos intactos, de um modo não invasivo e não destrutivo.

A classe de possíveis aplicações da RMN é demasiado

grande para se efetuar uma lista exaustiva, porém algumas destas aplicações incluem:

- Verificação do grau de pureza das matérias primas;

- Análise de drogas e fármacos;

- Controle e qualidade de produtos químicos;

- Investigação de reações químicas;

- Investigação de substâncias desconhecidas, bem como análise de polímeros.

Por outro lado, a caracterização espacial do sinal de RMN da água (junto com o avanço da computação) permitiu, também, o desenvolvimento do domínio de imagem por ressonância magnética, hoje uma das técnicas fundamentais da medicina.

EXAME MÉDICO

O exame por RMN permite aos médicos analisarem as

estruturas internas do corpo sem ter de recorrer ao uso

de raios-x. Esta tecnologia possibilita a detecção de doenças em desenvolvimento ou anormalidades com maior antecedência. Basicamente, a RMN utiliza um poderoso campo magnético e ondas de radiofrequência que combinados produz imagens muita. A unidade de RMN parece um túnel aberto no meio de uma grande caixa, podendo possuir certas variações (vista frontal simplificada na figura 7).

variações (vista frontal simplificada na figura 7). Figura 6: Exemplo de imagem obtida através da ressonância

Figura 6: Exemplo de imagem obtida através da ressonância magnética

O procedimento para análise clinica é simples, com o

paciente deitado na maca, esta irá suavemente deslocar-

se para dentro do magneto onde o scaner será realizado.

Por vezes ocorre a introdução, via venosa de medicamento (agente de contraste) de forma a facilitar a visualização ou melhora das imagens. Sendo que este exame é um procedimento totalmente indolor, virtualmente sem efeitos colaterais.

totalmente indolor, virtualmente sem efeitos colaterais. DETECÇÃO DIRECTA DE HETERONÚCLEOS A elevada razão

DETECÇÃO DIRECTA DE HETERONÚCLEOS

A elevada razão giromagnética, γ, dos prótons, a qual é

responsável pela alta sensibilidade deste também causa

grandes interações dipolo-dipolo que levam a uma rápida relaxação dos núcleos. Este efeito provoca o alargamento das ressonâncias (podendo ate mesmo

desaparecer) na vizinhança de um centro paramagnético

ou em proteínas de elevada massa molecular. Este efeito

de alargamento pode ser diminuído através de sequências de pulsos como TROSY (espectroscopia de relaxação transversa optimizada, transverse relaxation- optimized spectroscopy) , CRIPT (transferência de polarização induzida por relaxação-cruzada, cross- relaxation-induced polarization transfer) ou CRINEPT (transferência de polarização correlacionada por aumento da relaxação, crosscorrelated relaxation- enhanced polarization transfer), ou através de esquemas mais elaborados de marcação isotópica, como a marcação isotópica de aminoácidos específicos, ou dos seus metilos, em que os prótons restantes da proteína se apresentam deuterados. Uma outra forma de diminuir este efeito, é o recurso à detecção direta de spins nucleares com uma razão giromagnética pequena, como

diminuir este efeito, é o recurso à detecção direta de spins nucleares com uma razão giromagnética

é o caso do 13 C. Esta metodologia foi desenvolvida

através de sequências de pulsos com detecção direta de

13 C para a identificação completa de heteronúcleos da cadeia carbonada, que podem fornecer informação sobre a estrutura e dinâmica das proteínas.

A detecção direta de spins nucleares de 13 C tem sido

utilizada não só em proteínas de elevada massa

molecular, como é o caso, por exemplo, da ferritina (um dodecahedro de 22 kDa por monômero), mas também

na identificação de resíduos na vizinhança de um centro paramagnético.

Este fato deve-se à detecção direta de 13 C não ser tão afetada pelo centro paramagnético como o 1 H, devido à pequena razão giromagnética do 13 C gerar uma diminuição nas contribuições paramagnéticas dipolares para a sua relaxação por um factor de (γ C /γ H ) 2 . Uma outra aplicação deste método é o estudo de proteínas intrinsecamente não estruturadas, uma vez que, ao contrário do próton, o 13 C apresenta uma maior dispersão de desvios químicos, o que acaba por solucionar o problema da grande sobreposição de sinais que se observa na frequência do 1 H dos espectros destas proteínas. Nesta metodologia, o espectro que correlaciona o 15 N do grupo amida com a carbonila da ligação peptídica, CON, é o espectro equivalente ao espectro 1 H - 15 N HSQC (correlação hetero-nuclear de quantum-simples), como sendo o espectro base para a identificação de todos os sistemas de spin (nomenclatura equivalente ao resíduo) da proteína e posterior identificação sequencial desses mesmos sistemas de spin.

SONDAS PARAMAGNÉTICAS

A presença de um íon paramagnético nas amostras de

RMN era vista como desvantagem e muitas vezes

tentavam-se substituir este íon por outro diamagnético,

de forma a evitar os efeitos de alargamento de linha nas

ressonâncias de núcleos na sua vizinhança. No entanto, nos últimos anos, o uso de sondas contendo metais paramagnéticos tem ganho interesse, uma vez que estas podem ser usadas como uma ferramenta para a obtenção de informação estrutural em proteínas, e de orientação e dinâmica de complexos proteína-proteína e proteína-ligante. O uso destas sondas permite a obtenção de restrições a longa-distância, através da determinação do aumento da relaxação paramagnética, de desvios de pseudo-contacto e de acoplamentos dipolares residuais (RDCs).

O tipo de efeito que se observa depende do íon paramagnético utilizado, sendo que os desvios de pseudo-contato e os acoplamentos dipolares residuais são observados quando o íon paramagnético (a maioria dos lantanídeos, Dy 3+ ) apresenta uma distribuição anisotrópica do spin eletrônico. Os RDCs são provocados pelo alinhamento induzido pelo paramagnetismo no campo magnético, estendendo-se a toda molécula, podendo ser utilizados na definição das

orientações relativas de domínios em uma proteína ou

de proteínas em complexos transientes, enquanto os

desvios de pseudo-contato, provocados pela interação através do espaço com o elétron desemparelhado, podem ser observados até uma distância de 40 Å do íon paramagnético, sendo proporcionais a 1/d 3 (onde d é a distância entre o spin nuclear e o íon paramagnético).

No caso dos íons paramagnéticos que apresentam uma distribuição isotrópica de spin eletrônico (ex., radicais nitróxido, e íon Mn 2+ ou Gd 3+ ), observa-se somente o aumento da relaxação paramagnética, que se deve à grande interação magnética dipolar que existe entre o elétron desemparelhado num centro paramagnético e um núcleo (observável em RMN) na sua vizinhança, o que provoca um aumento da taxa de relaxação desse mesmo núcleo. Este efeito depende da distância, d, entre o núcleo e o elétron, e a sua magnitude é diretamente proporcional a 1/d 6 , podendo ser observado

até 20-35 Å.

A utilização destas técnicas é possível quando as

metalo-proteínas em estudo apresentam locais de ligação de metais que podem ser substituídos por lantanídeos (ex., Ca 2+ , Mg 2+ e Mn 2+ ). No entanto, vários tipos de sondas com poder de ligação a locais específicos de cadeias polipeptídicas têm sido desenvolvidos:

- Através da ligação a um grupo tiol de um resíduo de

cisteína (natural ou introduzido por mutação dirigida) que se encontre exposto à superfície da proteína, como

é o caso das sondas de lantanídeos;

- Ou através da fusão, ao N- ou C-terminal da proteína, de pequenos peptídeos com afinidade para metais paramagnéticos.

- Outros tipos de sondas paramagnéticas onde não

ocorre a necessidade de ligação covalente proteína- sonda.

UTILIZAÇÃO

GENÔMICA ESTRUTURAL

Muitos são os fatores que contribuíram para o avanço

atual em pesquisa. Dentre estes, a melhora significativa

da instrumentação, como o aumento da sensibilidade

das crio-sondas em 13 C, o desenvolvimento de micro crio-sondas e pré-amplificadores, o aumento da sensibilidade em RMN através da utilização de campos magnéticos mais elevados, e a melhoria da eletrônica digital da última geração dos espectrômetros.

O surgimento de micro crio-sondas permite a redução

DE

DE

RMN

NOS

PROJETOS

na quantidade de amostra a serem utilizadas na aquisição de espectros para a determinação da estrutura

de proteínas. Estas sondas são usadas nas linhas de

seleção de proteínas alvo para a determinação das

melhores condições de estabilidade da amostra (temperatura, soluções tampão, pH, força iônica, detergentes ou outros aditivos), identificação de

da amostra (temperatura, soluções tampão, pH, força iônica, detergentes ou outros aditivos), identificação de

domínios de uma proteína mais complexa, para posteriores estudos estruturais por RMN ou cristalografia de raios-X. Neste campo, é rotina determinar o tempo de correlação da proteína na tentativa de determinar o seu estado de oligomerização em solução, nas condições (concentração de proteína, pH, força iônica) em que os estudos estruturais irão se realizar.

A otimização das condições de amostragem é essencial em sistemas como:

- proteínas de maior massa molecular;

- proteínas com vários domínios;

- proteínas membranares;

Esta otimização é feita através da análise da dispersão e distribuição dos desvios químicos das ressonâncias no espectro 1 H- 15 N HSQC da proteína alvo. A análise do

1 H- 15 N HSQC permite ainda avaliar o estado de pureza da proteína, a sua estabilidade em diferentes soluções tampão, temperaturas, contendo informação sobre a dinâmica da proteína.

METODOLOGIA

SIMPLES

PARA

CARACTERIZAÇÃO

DE

COMPLEXOS

PROTEÍNA-PROTEÍNA.

Dado o crescente numero de projetos de genômica estrutural, o numero de estruturas protéicas conhecidas vem crescendo exponencialmente. A contribuição da metodologia de ressonância magnética para os dados armazenados ainda é relativamente pequena se comparado com os obtidos por cristalografia de raios-X. No entanto, a RMN tem um papel extremamente importante na caracterização de interações biomoleculares, por se tratar da única técnica que permite obter informação, em condições próximas das condições fisiológicas, sobre a estrutura, a dinâmica molecular das biomoléculas, e a termodinâmica e cinética de interações biomoleculares.

Uma das metodologias mais utilizadas na caracterização de interações proteína-proteína por RMN é a perturbação dos desvios químicos, que permite o mapeamento da interface do complexo, informação esta que pode ser integrada em programas computacionais de forma a obter-se um modelo da estrutura do complexo. Esse procedimento tem sido muito utilizado na caracterização de complexos transientes e de baixa afinidade, como complexos de transferência eletrônica.

Outro método é a experiência de transferência de saturação, em que uma proteína A é deuterada e marcada com 15 N, enquanto que a outra proteína B (doadora) não é marcada. Neste caso, a saturação das ressonâncias da proteína B, não marcada, leva à atenuação de sinal por mecanismos de saturação cruzada, que são observados no espectro de 1 H - 15 N HSQC da proteína A.

Podem-se usar também acoplamentos dipolares residuais e o aumento da relaxação paramagnética na caracterização de complexos transientes. Neste caso, foi exemplificado a aplicação da primeira metodologia ao complexo entre o citocromo c3, uma proteína contendo quatro grupos hémicos (Fe-hémico hexacoordenado – octaédrico, 4 azotos da porfirina e dois ligandos axiais, Fe 3+ S=1/2 e Fe 2+ S=0), e a rubredoxina, que contém um íon ferro coordenado por quatro resíduos de cisteína (arranjo tetraédrico, Fe 3+ S=5/2 e Fe 2+ S=2).

O complexo citocromo c3 – rubredoxina foi

caracterizado de duas formas. Na impossibilidade de marcação isotópica do citocromo c3, a identificação do hemo que fica na interface do complexo, foi feita

através de uma titulação monitorizada por espectros 1 H.

O espectro 1 H do citocromo apresenta 16 ressonâncias

de grupos metilo dos quatro hemos, deslocadas para campo baixo devido ao efeito paramagnético do ferro (III). No estado oxidado, a adição de rubredoxina ao citocromo c3, provoca a relaxação seletiva de dois dos grupos metilo de um dos hemos (Hemo-IV). Por outro lado, como a rubredoxina pode ser marcada isotopicamante com 15 N, podemos identificar os resíduos da rubredoxina que estão na interface do complexo, através de uma titulação monitorizada por espectros de 1 H - 15 N HSQC.

A informação obtida através destas duas experiências

foi posteriormente usada num programa de acoplamento

molecular, obtendo-se um modelo da estrutura do complexo (Figura 8).

obtendo-se um modelo da estrutura do complexo (Figura 8). CONCLUSÃO A espectroscopia de Ress onância Magnética

CONCLUSÃO

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

tornou-se o método mais importante para a investigação

a nível molecular, permitindo obter informações tanto

da estrutura protéica quanto da dinâmica desta, uma vez

que existem relações muito próximas entre os dados

obtidos por 1 H-RMN e o arranjo dos prótons na

molécula em investigação. São várias as informações

que podemos obter num espectro, tais como:

dos prótons na molécula em investigação. São várias as informações que podemos obter num espectro, tais

Informação contida no espectro

- Número de linhas de ressonância

- Posição dos sinais de ressonância

- Intensidade relativa dos sinais de

ressonância

- Estrutura fina dos sinais de ressonância

Em muitos casos este conhecimento permite-nos:

- Predizer espectros de moléculas baseando-se somente

na fórmula estereoquímica;

- Propor estrutura para uma molécula desconhecida baseando-se apenas no seu espectro;

- Decidir entre várias estruturas possíveis para uma molécula baseando-se no espectro obtido, ou pelo menos um limite de várias possibilidades;

A aplicação da espectroscopia de RMN fundamenta-se

essencialmente na correlação empírica entre as estruturas com deslocamentos químicos observados e constantes de acoplamento.

Em termos de investigação clínica e desenvolvimento de imagem, a RMN direciona-se para determinados objetivos nomeadamente:

- Comparar a RMN com outras modalidades;

- Aproveitar as características únicas da imagem RMN;

- Determinar as técnicas mais úteis para cada local ou doença;

- Determinar a utilidade de medidas diretas de tecidos normais e de lesões benignas e malignas;

- Atuar com a cirurgia e radioterapia na preparação,

planejamento e estudo da resposta ao tratamento de

cancros e linfomas;

- Avaliar o problema da segurança;

- Desenvolver técnicas de aumento de contraste;

Apesar das notadas vantagens da RMN, este recurso também traz inconvenientes que se referem à impossibilidade da analise de misturas multicomponentes, ao elevado custo dos aparelhos e sua manutenção e a baixa sensibilidade em certos casos, devido às transições magnéticas nucleares serem pouco intensas. No entanto, nos últimos anos têm-se verificado diversos avanços na técnica que permitem contornar este problema, permitindo a expansão da aplicação da RMN a tópicos, tais como:

- Proteínas com mais de 25 kDa,

- Proteínas membranares,

Arranjo dos prótons

- Número de grupos de prótons equivalentes

- Tipo de grupos de prótons

- Número de prótons que provocam o sinal

- Posição dos grupos de prótons relativamente a cada um deles

- Proteínas contendo centros paramagnéticos,

- Proteínas desnaturadas,

- RMN de proteínas em células in vivo.

A aplicação da RMN a estes tópicos de interesse biológico foi possível devido a avanços significativos não só ao nível da instrumentação de RMN (campos magnéticos mais elevados e crio-sondas de maior sensibilidade), como também no desenvolvimento de novas sequências de pulsos, novos esquemas de aquisição de espectros multidimensionais, a detecção direta de 13 C, e também a marcação seletiva de aminoácidos, assim como a possibilidade de introduzir sondas paramagnéticas em proteínas.

Para além destas inovações na RMN de proteínas no estado líquido, tem-se ocorrido nos últimos anos o desenvolvimento da RMN de sólidos aplicada a proteínas membranares, a proteínas contendo regiões desordenadas ou homomultímeros de elevada massa molecular.

Os núcleos que são frequentemente observados por RMN biomolecular têm abundância natural ( 1 H e 31 P) ou podem ser enriquecidos através da expressão heteróloga, usando fontes de carbono e azoto enriquecidos nestes isótopos ( 13 C e 15 N).

Uma vez que cada um destes núcleos dá origem a um sinal num espectro RMN, é de esperar que haja um grande número de sinais que se encontrem sobrepostos,

e que têm de ser identificados de forma a se extrair toda

a informação estrutural que contêm. Uma das formas de solucionar o problema da sobreposição de sinais nos espectros de RMN foi a introdução de espectros multidimensionais, RMN-nD. Estes espectros correlacionam a frequência de um sinal numa dimensão com outras frequências noutras dimensões, permitindo a identificação de sinais sobrepostos observados nos espectros unidimensionais.

Um dos espectros mais utilizados na RMN biomolecular, e que pode ser considerado como o espectro base, é o 1 H - 15 N HSQC, em que cada sinal observado corresponde a um próton ligado a um núcleo

15 N.

Uma vez que, numa proteína, cada resíduo, à exceção da prolina e do resíduo N-terminal, tem um próton ligado a um azoto na ligação peptídica, o número de sinais observados num 1 H- 15 N HSQC de uma proteína deve corresponder ao número de resíduos da sua cadeia polipeptídica (as cadeias laterais dos resíduos de asparagina e glutamina contribuem com dois sinais cada). Por este motivo, este espectro é considerado como sendo a impressão digital de uma proteína, e a dispersão dos sinais observados indica que a proteína se encontra estruturada.

BIBLIOGRAFIA

RMN Biomolecular – desenvolvimentos recentes e aplicações modernas da RMN à biologia, Sofia R. Oauleta e José J.G. Moura

Físico-química - Peter Atkins, Julio de Paula, 8° edição

Quantum chemistry & spectroscopy - Thomas Engel 2° edição

- Spectroscopy - Gary M. Lampman ; Donald L. Pavia George S. Kriz

chemistry & spectroscopy - Thomas Engel 2° edição - Spectroscopy - Gary M. Lampman ; Donald

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

Renato Dantonio Paciencia

INTRODUÇÃO

A ressonância magnética nuclear (RMN) é um

fenômeno que ocorre quando o núcleo de certos átomos

são postos em um campo magnético estático. Nem todos os núcleos possuem esse fenômeno já que ele é dependente de uma propriedade chamada spin. O RMN pode ser usado em espectroscopia para estudar as

propriedades físicas, químicas e biológicas da matéria. Já a espectroscopia pode ser definida como o estudo da interação de radiação eletromagnética com a matéria. A espectroscopia de RMN possui aplicações em várias áreas da ciência, sendo a mais importante o estudo da estrutura de compostos naturais usando técnicas de uma dimensão e de duas dimensões (para os compostos mais complicados). O princípio da espectroscopia de RMN é

a medida da intensidade de absorção ou emissão das

radiações eletromagnéticas em cada freqüência através uma faixa específica de freqüências. A freqüência de ressonância de um tipo em particular de núcleo será diferente quando este estiver em um ambiente químico diferente. Mudando a freqüência da radiofreqüência que excita e medindo a intensidade de absorção em cada freqüência, é possível detectar um núcleo e em cada caso o seu ambiente químico. Ao passo que a espectroscopia RMN de estado sólido é empregada na determinação da estrutura de compostos sólidos, a espectroscopia RMN de domínio de tempo é usada para determinar a dinâmica molecular em soluções Métodos recentemente desenvolvidos de RMN são capazes de analisar os coeficientes de difusão de um composto. O RMN é um campo que vem rapidamente crescendo e já se tornou tão vasto que levaria uma vida inteira para dominar todas as técnicas.

Quando os núcleos são colocados num potente campo

magnético uniforme, estes sofrem uma torção e tendem

a tomar uma orientação “permitida”, em relação ao

campo externo. Este último alinha os núcleos que giram

opondo-se à tendência desordenada dos processos térmicos. Porém, os núcleos não se alinham em posição perfeitamente paralela (ou antiparalela), em relação ao campo. Na realidade, os eixos dos respectivos spins ficam oblíquos em relação ao campo, e tal como a parte superior de um giroscópio, sofre um movimento de

precessão

Por volta de 1950, descobriu-se que as freqüências de

ressonância nuclear não dependem apenas da natureza dos núcleos atômicos, mas também do ambiente químico. A utilidade desta técnica tornou-se então muito óbvia, na medida em que poderia ser utilizada para determinar o número e o tipo de grupos químicos

num composto. Porém, quando associada a outros métodos espectroscópicos, a técnica de espectroscopia

de ressonância magnética nuclear, RMN, revolucionou

a metodologia deidentificação e caracterização das

moléculas fornecendo um grande volume de informações, fruto dos efeitos das ações inter e intramoléculares sobre os valores da orça do campo

magnético ao nível dos núcleos das moléculas.

ORIGEM DO SINAL:

Como os elétrons possuem o número quântico de spin (S), os núcleos de 1 H e de alguns isótopos também possuem spin. O núcleo do hidrogênio comporta-se como um elétron em que o seu spin é 1/2 e pode assumir dois estados: +1/2 e -1/2, o que pressupõe a existência de dois momentos magnéticos.

Observaremos à absorção de energia correspondente a transição entre os níveis de spin ½ e -½ quando se satisfaz a condição de ressonância:

½ e -½ quando se satisfaz a condição de ressonância: Figura 1: Momento angular e estados

Figura 1: Momento angular e estados de spin nuclear

Consideremos um spin nuclear I = ½. Neste caso, m = +½ e -½. A separação entre estes dois níveis é

ΔE = −γhH

0

(1)

Se a amostra é exposta a radiação de frequência ω de forma que:

(2)

hω = −γhH

0

0

E = − γ h H 0 (1) Se a amostra é exposta a radiação de

Observaremos a absorção de energia correspondente a transição entre os níveis de spin ½ e -½ quando se satisfaz a condição de ressonância:

(3)

ω

0

= −γH

0

Esta é a frequência de precessão dos spins no campo, ou Freq. de Larmor (equação 3)

dos spins no campo, ou Freq. de Larmor (equação 3) Figura 2: Ação do pulso de
dos spins no campo, ou Freq. de Larmor (equação 3) Figura 2: Ação do pulso de

Figura 2: Ação do pulso de RF e o aparecimento do sinal de RMN

(ONDA

CONTÍNUA)

O espectrofotómetro de ressonância magnética nuclear

é constituído por seiscomponentes fundamentais: um

magnete, que separa os estados energéticos do spin nuclear; um transmissor, que fornece a energia RF; o

suporte da amostra, provido de bobinas elétricas para a ligação desta ao gerador RF; um detector que processa os sinais RMN; um registrador que fornece o espectro; finalmente, um gerador para o “varrimento” do campo magnético da região de ressonância, para produzir

o espectro.

ESPECTROFOTÓMETRO

DE

RMN

para produzir o espectro. ESPECTROFOTÓMETRO DE RMN Figura 3: Aspecto esquemá tico dos componentes de um

Figura 3: Aspecto esquemático dos componentes de um espectrofotómetro de RMN.

ESPECTROS

RMN

E

ESTRUTURA

MOLECULAR

Para a maior parte dos fins, os espectros RMN de alta resolução podem descrever-se em termos de deslocamentos químicos e constantes de acoplamento.

Dois outros parâmetros por vezes referidos são os tempos de relaxação spin-rede e spin-spin dos núcleos. A rotação interna, as trocas químicas e outros processos podem afetar os tempos de relaxação, de modo a originar efeitos termos-dependentes sobre os espectros. Nos sólidos predominam as interações diretas dipolo-dipolo magnéticos, os tempos de relaxação são prolongados e o espectro de RMN é constituído por riscas muito largas. Nos líquidos e gases, as interações diretas dipolo-dipolo anulam se, em geral, pelos rápidos movimentos intra e intermoleculares, os tempos de relaxação são muito menores e observam-se espectros de RMN de riscas finas.

DESLOCAMENTO QUÍMICO

Se os prótons de uma molécula qualquer perdessem

todos os seus elétrons e fossem isolados dos outros

núcleos, todos estes absorveriam energia num campo magnético de intensidade bem determinada e para uma dada freqüência de radiação eletromagnética. No entanto, esta situação não corresponde à realidade.

Numa molécula, alguns núcleos de hidrogénio estão em regiões de densidade eletrônica maior do que em outros, pelo que teremos então prótons que absorvem energia em campos magnéticos de intensidades ligeiramente diferentes. Como resultado teremos sinais no espectro

de RMN que aparecem em diferentes posições. Desta

forma, estamos perante prótons que apresentam um deslocamento químico diferente.

Assim como o número de sinais num espectro de RMN diz-nos quantas espécies de protões existem numa molécula, a posição dos sinais ajuda-nos a determinar que espécie de prótons se trata: aromáticos ou alifáticos; primários, secundários, ou terciários; benzílicos, vinílicos ou acetilénicos; adjacentes a átomos de halogênio ou a qualquer outro grupo de átomos.

A circulação dos elétrons de uma ligação sob a

influência de um campo magnético externo gera campo magnético de baixa intensidade (campo induzido) que protege o próton em relação ao campo externo. Isto quer dizer que o campo magnético real que atua sobre o próton é menor do que o campo externo.

NÚMERO DE SINAIS E IDENTIFICAÇÃO DOS TIPOS DE PRÓTONS

Numa dada molécula prótons com o mesmo ambiente absorvem à mesma indução magnética aplicada e são designados por prótons equivalentes. O número de sinais no espectro de RMN diz-nos, então, quantos conjuntos de prótons equivalentes, ou quantas “espécies” de prótons, existem na molécula.

De forma a compreender o estabelecimento da equivalência entre os prótons de uma molécula, serão abordados alguns exemplos dados pelas seguintes fórm ulas de estrutura.

entre os prótons de uma molécula, serão abordados alguns exemplos dados pelas seguintes fórm ulas de
Tendo em conta que, para serem quimicamente equivalentes, os prótons têm de ser também estereoquimicamente

Tendo em conta que, para serem quimicamente equivalentes, os prótons têm de ser também estereoquimicamente equivalentes, dai que para as seguintes estruturas temos a seguinte análise.

que para as seguintes estruturas temos a seguinte análise. Assim temos que para uma mesma molécula
que para as seguintes estruturas temos a seguinte análise. Assim temos que para uma mesma molécula

Assim temos que para uma mesma molécula podem existir vários átomos dehidrogénio equivalentes, isto é, com o mesmo deslocamento químico. Portanto, o sinal destes prótons cai na mesma posição do espectro de RMN. Dizemos então que estamos perante prótons homotópicos.

Se a substituição de cada um dos átomos de hidrogênio pelo mesmo grupo leva à formação de compostos que são enantiómericos, então, os dois prótons considerados são enantiotópicos. Neste caso, os ambientes destes dois prótons são imagens um do outro num espelho plano e num meio aquiral comportam-se como se fossem equivalentes dando apenas um sinal no espectro.

Por outro lado, se a substituição de cada um dos átomos de hidrogênio pelo mesmo grupo leva à formação de compostos que são diasteroisómericos, os dois prótons considerados são diasterotópicos.

ACOPLAMENTO SPIN–SPIN

Desdobramento do sinal é o fenômeno que ocorre devido às influências magnéticas dos átomos de hidrogênio adjacentes aos átomos responsáveis pelo sinal. Este efeito é conhecido como acoplamento spin-spin. Este acoplamento spin-spin de prótons em carbonos adjacentes, também responsável por cada um dos picos observados, é também muito importante para a determinação da estrutura de compostos. Porém para o entender, há que ter em conta que os prótons não são somente afetados pelo campo magnético externo, mas também pelos campos magnéticos de todos os prótons dos carbonos adjacentes.

Quando estamos perante o acoplamento de um prótons com outro forma-se um pico duplo (dupleto), entre três prótons forma-se um pico triplo (tripleto) e assim por diante.Os sinais com múltiplos picos (mais de 7 ou 8) podem ser chamados multipletos.

picos (mais de 7 ou 8) podem ser chamados multipletos . Os efeitos do acoplamento spin-spin

Os efeitos do acoplamento spin-spin são transferidos principalmente pelos electrõesde ligação e não são usualmente observados se os protões acoplados estiverem separados por mais de três ligações sigma.

Porém, se os prótons que permitem o acoplamento, têm desvios químicos suficientemente distintos, o número

de

picos em 1 H-NMR é N+1, onde N é o número total

de

prótons quimicamente equivalentes em átomos de

carbono adjacentes. Esta dedução é uma regra

designada por regra do N+1.

A tabela seguinte ilustra o número de picos num multipleto, resultantes da regra N+1, e as intensidades ideais esperadas para cada pico.

N+1, e as intensidades ideais esperadas para cada pico. Assim temos que N Prótons irão desdobrar

Assim temos que N Prótons irão desdobrar os protões adjacentes em (N+1) picos. As intensidades destes picos são simplesmente o resultado das possíveis orientações

de

spin, portanto, os prótons de um grupo CH 2 podem

ter

os seguintes spins.

O

par intermédio é degenerado, portanto um próton

adjacente ao grupo CH 2 será dividido em três picos

distintos na razão 1:2:1.

A separação entre estes picos é referida como sendo a

constante de acoplamento, J,que é medida em Hz.

Os efeitos do desdobramento são vulgarmente descritos

recorrendo a um esquema designado por “árvore de desdobramento – splitting tree” que mostra a absorbância inicial a ser dividida, por uma constante de acoplamento J, em (N+1) picos.

Um esquema deste tipo é muito útil para a compreensão de modelos dedesdobramento mais complexos, como os que ocorrem no Br-CH 2 -CH 2 –CH 2 -OD, como se pode ver na seguinte figura:

mais complexos, como os que ocorrem no Br-CH 2 -CH 2 –CH 2 -OD, como se
RESUMO Um fenômeno muito importante que explica o aparecimento de sinais no espectro de RMN

RESUMO

Um fenômeno muito importante que explica o aparecimento de sinais no espectro de RMN e que resulta da presença de prótons vizinhos e da sua influência é o acoplamento spin-spin.

• O acoplamento spin-spin ocorre entre 2 ou mais grupos de prótons, se estes são:

-não equivalentes

-suficientemente próximos (a menos de 3 ligações σ)

• A intensidade de um sinal é determinada como sendo

a área abaixo da curva do espectro de RMN

• A intensidade do sinal é proporcional ao número de prótons equivalentes que lhe da origem.

origina

intensidade do sinal como função da t 1 e t 2.

então, uma tabela bidimensional que contém a

RESSONÂNCIA

MAGNÉTICA

NUCLEAR

APLICAÇÕES

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear

é hoje em dia usada praticamente em todos os ramos da química, quer nas universidades como também nos laboratórios industriais.

Uma investigação típica em RMN, combina vários tipos

de espectros 1D, 2D e por vezes até 3D ou 4D. É a

acumulação desta informação que fornece vulgarmente uma figura detalhada da estrutura da molécula. Por exemplo, a estrutura tridimensional completa de muitas

proteínas e outras macromoléculas biológicas tem sido determinada por este meio.

A espectroscopia de RMN também tem sido usada para

estudar não só a estrutura das moléculas, mas também a interação entre diferentes espécies moleculares (ex. Enzimas- substrato), para estudar os seus movimentos em líquidos e polímeros, bem como para obter informação acerca das velocidades de certas reações.

Ocupa, igualmente, um lugar saliente no campo da análise qualitativa e quantitativa, desde componentes

em produtos alimentares, a fluidos biológicos e metabolitos em tecidos e órgãos de seres vivos intactos,

de um modo não invasivo e não destrutivo.

 

A classe de possíveis aplicações da RMN é demasiado

grande para se efetuar uma lista exaustiva, porém

 

RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR BIDIMENSIONAL – 2D

algumas destas aplicações incluem: Verificação do grau

Um dos desenvolvimentos mais importantes para

de

pureza das matérias primas; Análise de drogas e

a

espectroscopia durante os anos de1960 – 1970 foi

fármacos; controlo e qualidade de produtos químicos;

o

desenho de novos magnetes, baseados em

investigação de reações químicas; investigação de

materiais supercondutores. Este novo tipo de magnetes

substâncias desconhecidas bem como análise de

possibilitou a obtenção de campos magnéticos maiores

polímeros.

mais estáveis levando á obtenção de espectros com muito melhor sensibilidade e resolução.

e

Por outro lado, a caracterização espacial do sinal de

A partir deste momento podia-seestudar sistemas mais complexos. Porém, o grande desenvolvimento surgiu com Ernst que desenvolveu em 1975 um sistema de FT- RMN bidimensional (2D), baseado nas técnicas de pulsação. O diagrama ilustra o desenvolvimento

RMN da água (juntamente com o desenvolvimento acelerado das capacidades de computação) permitiu, também, odesenvolvimento do domínio de imagem por ressonância magnética, hoje uma das técnicas imageológicas fundamentais em medicina e noutras áreas.

A

técnica adaptada aos objetivos do utilizador constitui

do tempo do método FT-RMN unidimensional (1D) e FT-RMN (2D).

Em RMN (1D), os spins nucleares são expostos a um pulso após o qual, é detectado um sinal no receptor em função do tempo t. Em RMN(2D), os spins nucleares são sujeitos a dois ou mais pulsos, com um intervalo de tempo t 1 .

Após o segundo pulso, o sinal é obtido da mesma forma que para RMN (1D), embora aqui se designe a variável de tempo por t 2 . Depois desta etapa, o espectrofotômetro retomo o mesmo procedimento mas repetindo-o com outros valores de t 1 . A variação de t 1

um excelente método de estudo do cérebro, medula espinhal, ossos esponjosos, pelve masculina ou feminina e grandes articulações. Para tal é utilizado e cada vez com mais regularidade nos hospitais, um aparelho de ressonância magnética de imagem, RMI,

que não é mais do que um aparelho de RMN especializado.

EXAME MÉDICO – RMN Ressonância Magnética Nuclear (RMN), ou RMI como

é

conhecida no meio, é um exame que permite aos

modifica o sinal medido durante t 2 . Esta situação

médicos analisarem as estruturas internas do corpo sem

modifica o sinal medido durante t 2 . Esta situação médicos analisarem as estrut uras internas

o recurso aos raios-x. Esta tecnologia possibilita aos médicos detectar doenças em desenvolvimento, ou anormalidades mais precocemente. Basicamente a RMN utiliza um poderoso campo magnético e ondas de radio freqüência e a combinação do campomagnético e radiofreqüência produz imagens muita claras de estruturas do corpo humano como o cérebro, espinha, articulações, coração e outros órgãos vitais.

O exame é realizado numa sala contendo grande

máquina de RMN designada pelos médicos por "Magnete". A unidade de RMN parece um túnel aberto

no meio de uma grande caixa, podendo ser de diferentes tipos, mas com um funcionamento semelhante.

de diferentes tipos, mas com um funcionamento semelhante. O procedimento para a anál ise clinica é

O procedimento para a análise clinica é o seguinte. O

paciente deita-se numa confortável maca que irá suavemente deslocar-se para dentro do magnete onde o scan (exame) será realizado.

Por vezes a "bobina", que é apenas um rádioreceptor especial, é colocada em torno da área do corpo a ser estudado, cabeça, joelho, fígado. etc. em outras situações, o técnico injeta um medicamento (agente contraste) através de uma injeção de forma a facilitar a interpretação das imagens do corpo do paciente. Os dados obtidos pelo scan são processados por um poderoso computador que os transforma em imagens muito nítidas que o médico especialista irá interpretar.

A RMN por si própria é um procedimento totalmente

indolor, virtualmente sem efeitos colaterais. Atualmente

milhões de pacientes tem feito esse tipo de exame comprovando ser extremamente seguro até porque a técnica utiliza apenas ondas de rádio e magnetização com as quais convivemos no dia a dia.

CONCLUSÃO

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

tornou-se num método standart em muitos laboratórios

de química. Esta técnica é reconhecidamente a mais

importante para a investigação a nível molecular, permitindo obter informação estrutural e dinâmica para qualquer estado da matéria, uma vez que existem relações muito próximas entre os dados obtidos por 1 H- RMN e o arranjo dos prótons na molécula em investigação.

São várias as informações que podemos obter num espectro tais como:

as informações que podemos obter num espectro tais como: Em muitos casos este conhecimento permite-nos -Predizer

Em muitos casos este conhecimento permite-nos -Predizer espectros de moléculas baseando-se apenas

na formula estereoquímica.

-Propor uma estrutura para uma molécula desconhecida baseando-se apenas no seu espectro.

-Decidir entre várias estruturas possíveis para uma molécula baseando -se no espectro obtido, ou pelo menos um limite de várias possibilidades.

A aplicação da espectroscopia de RMN baseia-se, deste

modo,

nacorrelação empírica das estruturas com deslocamento

s químicos observados e constantes de acoplamento.

essencialmente

Em termos de investigação clínica e desenvolvimento de imagem, a RMN direciona-se para determinados objetivos nomeadamente:

-Comparar a RMN com outras modalidades.

-Aproveitar as características únicas da imagem RMN.

-Determinar as técnicas mais úteis para cada local ou doença.

-Determinar a utilidade de medidas directas de T1 de tecidos normais e de lesões benignas e malignas.

-Interaccionar com a cirurgia e radioterapia na preparação, planeamento e estudo da resposta ao tratamento de cancros e linfomas.

-Avaliar o problema da segurança.

-Desenvolver técnicas de aumento de contraste.

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear, e

uma técnica que vem sendo muito usada fruto das

enormes vantagens que possui, nomeadamente a

possibilidade de estudar um elevado número de núcleos

e em todas as fases (gás, liquido e sólido),elevadas

intervalos de temperaturas, técnica não destrutiva e segura. Porém o recurso a esta técnica também traz alguns inconvenientes que se referem à insensibilidade do método, bem como a impossibilidade de analisar

misturas multicomponentes e ao elevado custo dos aparelhos e sua manutenção.

BIBLIOGRAFIA

pdf

• http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc16/v16_A04. pdf • http://www.ifsc.usp.br/~donoso/espectroscopia/ RMN.pdf

Ressonância Magnética Nuclear

César Maschio Fioravanti

Espectroscopia é o estudo da interação da radiação eletromagnética com a matéria. Essa radiação pode ser vista como uma onda com duas componentes, uma elétrica e outra magnética, que oscilam perpendicularmente entre si, sendo ambas também perpendiculares à direção de propagação da luz (Figura 1). A interação entre a radiação eletromagnética e a matéria pode ocorrer de duas formas: pela sua componente elétrica ou pela sua componente magnética.

Uma das diferenças fundamentais entre a ressonância magnética nuclear (RMN) e as outras formas de espectroscopia é no fato de que essa interação se dá com o campo magnético e não com o campo elétrico, como é o caso, por exemplo, do infravermelho ou do ultravioleta.

Para cada tipo de espectroscopia é exigido um tipo de excitação e, para cada uma delas, existe uma quantidade definida de energia. Isso quer dizer que uma radiação de freqüência determinada e característica é absorvida para uma determinada transição.

A RMN encontra-se na região das ondas de rádio. Em

um campo magnético, sob determinadas condições, uma

amostra pode absorver na região da radiofreqüência,

absorção essa dependente de características da amostra

e função de determinados núcleos presentes na

molécula, que são sensíveis à radiação aplicada.

na molécula, que são sensíveis à radiação aplicada. Figura 4: Ilustração da propagação de

Figura

4:

Ilustração

da

propagação

de

ondas

eletromagnéticas

 

A

grandeza física envolvida em RMN é o spin nuclear.

O

conceito de spin nuclear provém da Mecânica

Quântica. Esse conceito é fundamental para a compreensão do fenômeno e pode ser compreendido como uma propriedade que determinados núcleos apresentam. Tais núcleos, devido à sua configuração

nuclear, assumem um comportamento característico de momento angular, capaz de gerar um momento magnético (Figura 2), pois uma carga em movimento gera um campo magnético.

O momento magnético m gerado pode ser descrito em termos do número de spin I, cujos valores, calculados pela mecânica quântica podem ser 0, 1/2, 1, 3/2 etc. Núcleos que apresentam tanto massas atômicas quanto números atômicos pares não possuem spin, sendo, conseqüentemente, o número de spin igual a zero. É o caso do carbono 12, oxigênio 16, enxofre 32, entre outros .Esses núcleos não têm momento angular associado e, portanto, não exibem propriedades magnéticas, o que implica a ausência de sinais detectáveis por RMN. Caso se deseje detectar algum desses átomos deve-se utilizar isótopos, com spin não nulo.

átomos deve-se utilizar isótopos, com spin não nulo. Figura 5: Momento magnético gerado pelo momento angular

Figura 5: Momento magnético gerado pelo momento angular

Na ausência de um campo magnético, os spins nucleares estão orientados randomicamente, não apresentando nenhuma orientação definida. Entretanto, quando uma amostra é submetida a um campo magnético externo B 0 , de alta intensidade e homogêneo, os spins nucleares tendem a assumir determinadas orientações. Segundo a mecânica quântica, o número de conformações possíveis do núcleo quando submetido a um campo magnético é vale 2S+1.

quando submetido a um campo magnético é vale 2S+1. Figura 6: Ilustração do alinhamento do momento

Figura 6: Ilustração do alinhamento do momento magnético ao campo B 0

No caso de um núcleo com número de spin I = ½, apenas duas orientações são possíveis, quando há aplicação de um campo magnético: uma parcialmente alinhada ao campo magnético aplicado e outra parcialmente contra. O ângulo que define a orientação

uma parcialmente alinhada ao campo magnético aplicado e outra parcialmente contra. O ângulo que define a

do vetor com relação a B 0 também é determinado pela mecânica quântica (seus valores aproximados são 55º e

125º).

As duas orientações representam diferentes estados

energéticos. Isso acontece porque um núcleo com spin cria seu próprio campo magnético. Quanto mais paralelos forem esses dois campos (o do núcleo e o campo magnético externo), menor será a energia desse estado. Assim, o estado de menor energia é aquele que se encontra parcialmente alinhado com o campo e é denominado estado a (ou +½), e o estado de maior energia, o parcialmente contra, é denominado estado b

(ou - ½). As energias desses níveis podem ser descritas como Ea = - µB 0 e Eb = µB 0 , o que equivale a dizer que

a diferença de energia entre os dois níveis pode ser

expressa por: ΔE = (Eb - Ea) = 2 µB 0 . A diferença de energia ΔE que surge entre os dois níveis está relacionada com vários fatores, dentre eles, a intensidade do campo magnético B 0 aplicado: quanto maior for o campo magnético aplicado, maior será a diferença de energia entre os dois níveis e maior a diferença de população associada a esses níveis. Isso significa que, para uma melhor resolução de spins nucleares em ambientes químicos semelhantes, são desejáveis espectrômetros com campos cada vez mais intensos.

O fenômeno da RMN ocorre na região das

radiofreqüências (MHz) e a interação da radiação eletromagnética com a matéria ocorre com a sua componente magnética. Portanto, para se proceder a RMN, deve ser aplicado um segundo campo magnético (chamado de B1), proveniente de uma fonte de radiofreqüência aplicada perpendicularmente ao campo B 0 . É esse segundo campo magnético que permite a observação de absorções em RMN.

Portanto, a absorção em RMN é uma conseqüência das transições entre o nível de menor energia e o de maior energia, possíveis pela aplicação de um segundo campo magnético na região da radiofreqüência. O momento angular L e o momento magnético m podem ser

representados por vetores e a proporcionalidade entre eles é chamada de constante giromagnética. Essa constante, que determina a freqüência de ressonância do núcleo, constitui um parâmetro muito importante em RMN e é representada por γ, apresentando um valor próprio para cada núcleo, podendo ser expressa pela

relação:

γ = 2πν / hI

onde h é a constante de Plank e I é o número quântico de spin nuclear. Se a constante giromagnética γ for positiva, como é o caso dos núcleos de 1H e 13C, o estado +½ representa um nível de menor energia. Caso

a constante giromagnética seja negativa, como, por

exemplo, para o 15N, ocorre o oposto. Substituindo-se

as equações anteriores (ΔE=hn e γ=2πµ/hI) , pode se chegar a:

ν

=

B

γ

0

2 π

que é a equação fundamental utilizada em RMN e que define a condição de ressonância de um núcleo. Classicamente a interação entre um núcleo com um momento magnético m e o campo B 0 faz com que o momento magnético precesse em torno daquele eixo. A freqüência desse movimento é chamada freqüência de

Larmor, e seu valor é dada pela expressão anterior. Os dois estados energéticos correspondem à precessão de

m em torno do eixo, alinhado. Considerando que o

campo B 0 esteja aplicado na direção z, no equilíbrio, os vetores dos momentos magnéticos estarão distribuídos

em dois cones, em torno dos eixos +z e.-z.

distribuídos em dois cones, em torno dos eixos +z e.-z. Figura 7: Cone de precessão nuclear

Figura 7: Cone de precessão nuclear e decaimento do sinal de RMN após aplicação do campo B 1

Os núcleos são excitados em uma região de freqüências

por um ou mais pulsos. Na ressonância, o campo B1, aplicado na forma de um pulso, faz com que alguns núcleos absorvam energia e seus momentos magnéticos nucleares passem a precessar no plano xy. Ou seja, o campo B1 altera a direção de precessão da magnetização, resultando em uma perturbação do sistema.

A nova componente gerada no plano xy pode ser observada com auxílio de um detector no mesmo plano

de precessão. Para isso, a fonte de radiofreqüência. deve

ser desligada. Quando isto ocorre, o sistema tende a retornar à situação original de equilíbrio. Este retorno é conhecido por processo de relaxação, que faz com que

os núcleos percam o excesso de energia e retornem às

suas posições originais de equilíbrio. O decaimento da

magnetização xy para retornar à sua posição de equilíbrio é exponencial e dá origem ao chamado sinal FID (Free Induction Decay). Sinais da FID (Figura 4) são detectados como uma função do tempo, encontrando- se aí todas as informações sobre

Sinais da FID (Figura 4) são detectados como uma função do tempo, encontrando- se aí toda

acoplamento e deslocamento químico contidos em um espectro de RMN.

Como existem vários núcleos em uma amostra, também são originados vários sinais de FID que se superpõem, de forma que se torna muito difícil a extração das informações desejadas (Figura 14). Para que as informações se tornem acessíveis ao usuário, ou seja, para que a interpretação do espectro seja facilitada, os sinais da FID são convertidos para um domínio de freqüências de ressonância, características de cada núcleo, através de uma operação matemática chamada transformada de Fourier. A transformada de Fourier dos diferentes sinais de FID dá origem ao espectro de RMN comumente analisado. Em outras palavras, um espectro de RMN consiste de uma série de ressonâncias em diferentes freqüências, denominadas deslocamentos químicos.

Os valores de deslocamento químico em unidades de freqüência são valores muito próximos. Por isso, é muito usual a chamada escala delta (δ), dada pela relação:

δ=ν amostra 10 6 /ν espectrometro

CH 3 CH 2 O‐ H
CH 3
CH 2
O‐ H

Figura 8: Espectro de RMN de etanol

Por meio da Mecânica Quântica, sabe-se que o desdobramento de um sinal, por exemplo de singleto para dupleto, (chamado de multiplicidade) pode ser dado pela relação 2nI+1, onde n é o número de núcleos vizinhos em diferentes ambientes químicos e I é o número de spin do núcleo que está sendo analisado. Para núcleos com spin I = ½ , a multiplicidade será dada simplesmente por (n+1).

Assim, no espectro de hidrogênio do etanol (Figura 5), , serão observados dois sinais devidos a acoplamento homonuclear: um relativo aos hidrogênios da metila e outro aos hidrogênios do grupo CH 2 , uma vez que se encontram em diferentes ambientes eletrônicos e que, portanto, apresentarão diferentes deslocamentos químicos. Como a multiplicidade é dada por (n+1) os três hidrogênios da metila têm dois vizinhos (os dois hidrogênios do grupo CH 2 ) logo, o seu sinal aparecerá no espectro como um tripleto (2 + 1 = 3), observado em torno de 1 ppm. Analogamente, os dois hidrogênios do grupo .CH2 têm como vizinhos os três hidrogênios da

metila e seu sinal será um quarteto (3 + 1 = 4), cuja absorção é observada em torno de 3,5 ppm.

Nas últimas quatro décadas, a realização de experimentos de RMN em várias dimensões elevou bastante a capacidade de resolução dessa técnica, ampliando seus horizontes de aplicação. A RMN em duas dimensões (RMN-2D) foi proposta em 1971 e hoje representa uma poderosa técnica para a elucidação estrutural de moléculas orgânicas, inorgânicas e principalmente de biomoléculas. Essas moléculas apresentavam espectros de difícil interpretação devido,principalmente, à superposição de sinais ao longo de toda a faixa espectral em uma dada região de freqüência. A RMN-2D possibilitou a interpretação dos espectros dessas moléculas, antes dificilmente identificadas pelos métodos em uma dimensão.

Para entender as razões disso e o que é um espectro de RMN em duas dimensões, assim como o seu processamento, é necessário compreender conceitos como tempo de preparação, tempo de evolução e tempo de detecção. Tempo de preparação é o período durante

o qual um sistema de spins é preparado para atingir o

equilíbrio térmico. Esse tempo pode incluir a aplicação

de um ou mais pulsos ou, simplesmente, ser um período

t diferente de zero; pode até mesmo nem existir,

dependendo do experimento que está sendo realizado. O importante é que o sistema de spins se encontre em equilíbrio antes que o experimento seja iniciado. O tempo de evolução (chamado t1) constitui o experimento de RMN propriamente dito, durante o qual

o sistema de spins evolui fora da situação de equilíbrio

pela aplicação de um ou mais pulsos, dependendo da informação que se deseja obter. O tempo de detecção (ou tempo de aquisição, chamadot2) é o período durante

o qual se adquire o sinal do FID.

é o período durante o qual se adquire o sinal do FID. Figura 9: Espectro de

Figura 9: Espectro de RMN 2D de uma proteína

Um experimento unidimensional pode apresentar esses três tempos. O tempo de evolução (t1) é fixo e o sinal recebido é apenas função do tempo de detecção (t2), que é variável. Em um experimento convencional em uma dimensão, o tempo de evolução t1 é zero e a detecção é realizada imediatamente após o pulso de radiofreqüência. Os spins sofrem ação do campo B1 e o resultado é, então, detectado. O sinal detectado no domínio temporal (FID) é transformado para o domínio das freqüências mediante a transformada de Fourier e o espectro resultante é um gráfico da amplitude pela

o domínio das freqüências mediante a transformada de Fourier e o espectro resultante é um gráfico

freqüência, chamado unidimensional porque apenas um dos eixos corresponde a freqüências de absorção.

Em um experimento bidimensional, é válido o mesmo raciocínio temporal. A principal diferença é que existem obrigatoriamente dois períodos variáveis: o tempo de evolução (t1, que em um experimento 1D pode ser zero) e o tempo de aquisição (t2). Fazendo-se uma série de experimentos nos quais variem progressivamente os valores do tempo de evolução, desde zero até t1, tem-se duas variações no domínio temporal: uma devida a t1 e outra devida a t2. Se uma série de FIDs for detectada a partir desses experimentos nos quais se variam os valores de t1, a transformada de Fourier ao longo de t2 dessas diferentes FIDs fornecerá uma série de espectros 1D. Se outra transformada de Fourier for realizada ao longo de t1, então poderemos obter um espectro bidimensional, com sinais observados ao longo de duas dimensões.

com sinais observados ao longo de duas dimensões. Figura 10: Exemplo de estruturas protéicas calculadas por

Figura 10: Exemplo de estruturas protéicas calculadas por RMN

Dessa forma, informações complexas, que antes apareciam em apenas uma dimensão (por exemplo, hidrogênios em ambientes químicos semelhantes que apresentam deslocamentos químicos muito próximos), aparecem agora em duas dimensões, facilitando a interpretação do espectro para determinação da estrutura molecular.

REFERÊNCIAS:

Harris, R.K. Nuclear Magnetic Resonance . A Physicochemical View Longman Scientific & Technical, England,1986.

Concepts in Magnetic Resonance,1989, 1, 7-13 , Daniel D.

http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/inside.htm

http://www.uff.br/fisicoquimica/docentes/ katialeal /didatico/Capitulo8.pdf

• http://www.uff.br/fisicoquimica/docentes/ katialeal /didatico/Capitulo8.pdf

Ressonância Magnética Nuclear por Tensor de Difusão

Rafael Tuma Guariento

INTRODUÇÃO

Desde sua criação em 1938, a Ressonância Magnética Nuclear tem revolucionado diversas áreas da ciência, indo desde a determinação da estrutura e o estudo da

dinâmica de moléculas pequenas (Fürtig et. al., 2003)

até a criação e novos conceitos em neurociências

(Logothetis et. al., 2001), sem contar, claro, a ampla

gama de aplicações clínicas em medicina.

De maneira geral, a técnica consiste em provocar

transições entre diferentes estados nucleares, tirando o

sistema do equilíbrio, e então medir seu decaimento para o estado estacionário, se assemelhando, grosso modo, às técnicas espectroscópicas que utilizam o conceito de transição eletrônica.

Com uma grande quantidade de tipos e escaneamento, há diversas implementações instrumentais dessa técnica, que apesar de compartilharem o mesmo princípio físico, são específicas para cada aplicação. Devido a este fato, neste trabalho optamos por tratar somente o mecanismo físico básico e nos aprofundarmos somente na técnica de Ressonância Magnética Nuclear por Tensor de Difusão.

Este método pode ser dividido em duas subcategorias de imageamento:

Imagem ponderada de difusão;

subcategorias de imageamento: Imagem ponderada de difusão; Imagem de tensor de difusão. DA RESSONÂNCIA MAGNÉTICA

Imagem de tensor de difusão.

DA

RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Para que seja possível aplicar a técnica de Ressonância Magnética Nuclear, é necessário que no sistema exista um átomo com spin nuclear total não nulo. Por razões de quantidade e de intensidade do sinal, em geral se utiliza o átomo de hidrogênio. Esta escolha é adequada para muitas aplicações médicas, dado que os sistemas biológicos são ricos em água, e sua medida pode fornecer informações valiosas sobre o funcionamento do organismo.

O núcleo atômico, por ser um corpo muito massivo (~1836 vezes mais massivo que o elétron) necessita de energias muito elevadas para que seja possível observar sua resposta a campos externos aplicados. Logo, como a intenção é medir os spins destas partículas, é necessário criar campos magnéticos muito intensos para conseguir um número razoável de spins alinhados. Idealmente, espera-se criar um campo tal que todos os spins estejam alinhados com o campo. Para isso é necessário termos a seguinte relação:

PRINCÍPIOS

FÍSICOS

BÁSICOS

termos a seguinte relação: PRINCÍPIOS FÍSICOS BÁSICOS Sendo μ o magneton de Bohr normalizado para a

Sendo μ o magneton de Bohr normalizado para a massa do próton. A verificação desta propriedade pode ser vista da Demonstração 1.

O primeiro, mais simples, cria uma imagem

tridimensional em que cada voxel(pixel tridimensional)

tem uma intensidade proporcional à difusão da água

naquele local, considerando que esta se difunde de maneira isotrópica pelo meio. O segundo leva em consideração anisotropias inerentes ao meio, e fornece além do coeficiente de difusão no local, a direção preferencial em que a água se difunde, permitindo assim a visualização de interfaces entre estruturas no corpo. Este método permitiu a realização de um procedimento conhecido como tractografia in vivo, possibilitando o diagnóstico de lesões cerebrais, além do desenvolvimento de importantes estudos em neurociência cognitiva (Filler, 2010).

de lesões cerebrais, além do desenvolvimento de importantes estudos em neurociência cognitiva (Filler, 2010).
Demonstração 1: Com um campo magnético suficientemente intenso, é possível ter todas as partículas alinhadas

Demonstração 1: Com um campo magnético suficientemente intenso, é possível ter todas as partículas alinhadas com o campo.

Calculando o valor do campo magnético aplicado para termos tal situação, temos:

magnético aplicado para termos tal situação, temos: Como alcançar tal valor é tarefa impraticável,

Como alcançar tal valor é tarefa impraticável, calculamos o percentual de moléculas que estarão alinhadas com o campo na situação de um campo da ordem de 1T:

Que é um número razoável de átomos, garantindo um bom alinhamento.

Ao alinhar os átomos com o campo magnético externo, são criados dois estados quânticos, um paralelo e um antiparalelo, com uma diferença energética de 2μB. Esta diferença energética, em unidades de frequência, é dada por:

energética, em unidades de frequência, é dada por: Que é uma frequência passível de ser alcançada

Que é uma frequência passível de ser alcançada por equipamentos emissores de radiofrequência!

Tendo em mãos estas informações, estamos preparados para explicar o funcionamento básico do método de Ressonância Magnética Nuclear.

Inicialmente o paciente é colocado no interior de um solenoide supercondutor que gera um campo magnético da ordem de 1 T. Um outro circuito a parte gera um outro campo magnético de menor intensidade (~ alguns mT), que cresce linearmente pelo paciente, criando um

gradiente espacial na intensidade do campo aplicado (Figura 1). Feito isso, sabemos que, em média, metade dos spins dos núcleos dos átomos de hidrogênio estão alinhados paralelamente ao campo. Então, é emitido um pulso de radiofrequência sintonizado justamente na diferença entre os níveis em uma dada “fatia” do paciente. Isso faz com que alguns poucos spins invertam o sinal do seu spin de paralelo para antiparalelo, e eventualmente criando uma componente do spin no plano X-Y (este fato não foi incluído no modelo da demonstração), tirando assim o sistema do seu estado estacionário.

tirando assim o sistema do seu estado estacionário. Figura 1: Um campo magnético é aplicado linearmente

Figura 1: Um campo magnético é aplicado linearmente sobre o paciente, de tal maneira que cada secção transversal deste possui uma frequência de Larmor característica, permitindo “sintonizar” a ressonância das moléculas com a onda eletromagnética aplicada.

Por estar fora do seu estado de equilíbrio termodinâmico, o sistema passa a apresentar uma dinâmica de decaimento exponencial para retornar ao mesmo, com uma constante de relaxação T 1 para os spins no estado antiparalelo, e T 2 para as componentes de spin no plano X-Y (Figura 2). Esta dinâmica foi modelada por Felix Bloch em 1946, cujas equações estão apresentadas na Figura 3 para o caso de um campo magnético alinhado com o eixo , possuem um papel fundamental para o imageamento por tensor de difusão.

papel fundamental para o imageamento por tensor de difusão. Figura 2: Perfil energético dos spins nucleares

Figura 2: Perfil energético dos spins nucleares dos átomos de hidrogênio antes e depois da aplicação do campo magnético externo. T1 e T2 são os tempos de decaimento dos estados nucleares após a excitação com ondas de rádio.

magnético externo. T1 e T2 são os tempos de decaimento dos estados nucleares após a excitação
Figura 3: Equações de Bloch – γ é a razão giromagnética do átomo em questão

Figura 3: Equações de Bloch – γ é a razão giromagnética do átomo em questão (no caso do hidrogênio)

RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR POR TENSOR DE DIFUSÃO

IMAGEM PONDERADA POR DIFUSÃO

Em 1956, H.C. Torrey modificou a equação de Bloch da magnetização transversal para incluir termos que levassem em conta a difusão das moléculas que contém os átomos de hidrogênio. A nova versão da equação, desconsiderando o termo de relaxação ficou com a seguinte forma:

o termo de relaxação ficou com a seguinte forma: Sendo G o gradiente do campo magnético

Sendo G o gradiente do campo magnético aplicado e D o tensor de difusão da molécula no meio. No caso de uma difusão isotrópica no meio, a equação pode ser solucionada, permitindo isolar o coeficiente de difusão do meio, caso a magnetização seja conhecida. Para tal feito, é emitido um pulso eletromagnético cuja frequência varia linearmente com a posição, fazendo com que os núcleos se alinhem, porém tenham frequências de precessão distintas, levando a uma dispersão do sinal. Após um determinado intervalo de tempo, é emitido outro pulso, porém com sentido oposto ao original, fazendo com que os átomos se realinhem, porém no sentido oposto. No entanto, esta “refocalização” não será perfeita, visto que os átomos se moveram devido à difusão das moléculas. Utilizando a solução da equação de Bloch-Torrey, a perda na intensidade do sinal entre o primeiro e o segundo pulso fica dada por:

do sinal entre o primeiro e o segundo pulso fica dada por: Sendo assim, é possível

Sendo assim, é possível encontrar o valor do coeficiente de difusão em cada “caixinha” do espaço tridimensional. Cada uma destas “caixinhas” é chamada de voxel.

No caso da difusão no meio em questão não ser isotrópica, isto ocorre, por exemplo, próximo a membranas celulares ou na interface de vasos sanguíneos e órgãos, é medido, na verdade, uma projeção da difusão em uma dada direção. Neste caso,

ao invés de chamar 'D' de coeficiente de difusão, o

chamamos de “Coeficiente de Difusão Aparente”(ADC

– do inglês Apparent Diffusion Coefficient). Esta

medida é a base do próximo método que será discutido.

IMAGEM POR TENSOR DE DIFUSÃO

Em 1990, Michael Moseley observou que a difusão da água na substância branca cerebral era anisotrópica, indicando que esta deveria ser modelada por um “Tensor de Difusão”. Logo após esta descoberta, em 1991, Aaron Filler e colegas conseguiram criar a primeira imagem dos tratos neurais utilizando a anisotropia da difusão da água, cuja patente foi publicada em 1992.

A técnica consiste em uma simples ampliação do

método de imageamento ponderado por difusão, em que

se repete o exame ao menos 6 vezes em ângulos

distintos, e pelas medidas do Coeficiente de Difusão Aparente, tenta-se reconstruir o tensor de difusão em cada voxel espacial. A partir destes dados, é possível, a partir dos autovetores da representação matricial do tensor de difusão, mensurar a direção preferencial de descolamento das moléculas de água. Assim, para gerar

a imagem tridimensional que será analisada pelo

médico, é associada a cada direção de deslocamento uma determinada cor (Veja tabela 1). É importante notar que apenas a direção pode ser determinada, o método

não fornece nenhum tipo de informação sobre o sentido

de difusão.

Tabela 1

Cor

Direção

Vermelho

Esquerda/Direita

Verde

Anterior/Posterior

Azul

Base/Topo

Um resultado de um exame realizado por esta técnica pode ser visto na figura 4.

realizado por esta técnica pode ser visto na figura 4. Figura 4: Resultados de um ex

Figura 4: Resultados de um exame de Ressonância Magnética Nuclear por Tensor de Difusão. À esquerda: Cérebro inteiro visualizado colorido com o código de pseudo-cores citado. No centro: Um subconjunto do trato neuronal da substância

pseuso-coloridos.

Retirado de Brun, A. et al., 2004

branca

do

cérebro.

À

direita:

Voxels

É importante notar que devido ao grande número de vezes em que deve ser repetida a medida do Coeficiente

de Difusão Aparente não há resolução temporal neste

exame, e são obtidos somente dados médios sobre a

difusão do fluido intraneuronal.

não há resolução temporal neste exame, e são obtidos somente dados médios sobre a difusão do

As técnicas descritas neste trabalho são capazes de fornecer informações importantes a respeito do funcionamento de órgão e detecção de diversos tipos de patologias e lesões. Em particular, o Imageamento Ponderado por Difusão tem sido um forte candidato para substituir o exame de Tomografia por Emissão e Pósitrons (PET Scan) no diagnóstico de certos tipos de câncer. Além disso, o Imageamento por Tensor de Difusão fornece informações de como as diferentes regiões do córtex cerebral se interconectam, dado que pode trazer uma contribuição importante para a neurociência cognitiva, dado que agora há um “mapa de conexões” das áreas de processamento do córtex do Sistema Nervoso Central. Além disso, este tipo de imageamento tem sido utilizado para o diagnóstico de lesões no trato nervoso devido a doenças como epilepsia (ver MacDonald et. al., 2011 e Ropper. et. al.,

2011).

REFERÊNCIAS

1. Brun, A., Knutsson, H., Park, H.-J., Shenton, M.E. & Westin, C.-F. Clustering Fiber Traces Using Normalized Cuts. Lecture Notes in Computer Science 3216/2004, 368-375 (2004).

2. Filler, Aaron (2010). "The History, Development and Impact of Computed Imaging in Neurological Diagnosis and Neurosurgery: CT, MRI, and DTI". Internet Journal of Neurosurgery 7 (1).

3.

Fürtig,

B.,

Richter,

C.,

Wöhnert,

J.

and

Schwalbe,

H.

(2003), NMR Spectroscopy of

RNA.

ChemBioChem,

4: 936–962.

doi: 10.1002/cbic.200300700

4. Logothetis NK, Pauls J, Augath M, Trinath T, Oeltermann A. (July 2001). "Neurophysiological

investigation of the basis of the fMRI signal".

(6843): 150–7.

Nature 412

5. MacDonald CL, Johnson AM, Cooper, D, et al (2011). "Detection of blast-related traumatic brain injury in U.S. military personnel". New England Journal of Medicine 364: 2091–2100.

6. Ropper A (2011). "Editorial: Brain injuries from blasts". New England Journal of Medicine 364:

2156–2157.

BIBLIOGRAFIA AUXILIAR

3. ANDRADE, Katia Cristine. Dinâmica da alteração perfusional induzida por estado de

apnéia utilizando fMRI [en línea]. Ribeirão Preto : Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidad de São Paulo, 2006. Disertación de Maestría en Física Aplicada à Medicina e Biologia. [citado 2011-11-25].

Disponible

Internet:

en

< http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59 135/tde-20042010-100103/ >. en 1. http://en.wikipedia.org/

Espectroscopia Raman

Carolina de Paula Campos

INTRODUÇÃO

Quando uma molécula é irradiada, a energia dos fótons

da fonte pode ser transmitida, absorvida, ou espalhada.

A espectroscopia Raman é baseada na detecção da luz

espalhada, geralmente tendo por fonte de radiação o laser. O espalhamento de radiação eletromagnética ocorre, porque o campo elétrico oscilante da radiação induz oscilação de elétrons na molécula, que por sua vez emite radiação eletromagnética. O espalhamento pode ser elástico, ou seja, os elétrons espalhados têm a mesma energia (freqüência) e, portanto, mesmo comprimento de onda, que o feixe de fótons incidente. Este processo é chamado de espalhamento Rayleigh. No entanto, uma pequena fração da luz é espalhada inelasticamente, ou seja, em freqüências diferentes, os fótons podem ganhar ou perder parte de sua energia durante o processo de espalhamento. Essa diferença de energia é igual à energia de uma transição que a molécula sofre em resposta, podendo ser uma transição eletrônica, rotacional ou vibracional. Este processo é denominado o efeito Raman.

A espectroscopia Raman é uma técnica espectroscópica

baseada nesse efeito e pode ser utilizada para estudar amostras sólidas, líquidas e gasosas.

HISTÓRIA

Embora o espalhamento inelástico de luz tenha sido predito por Adolf Smekal em 1921, somente em 1928

que foi observado na prática. O efeito Raman foi nomeado após um de seus descobridores, o cientista indiano Sir Chandrasekhara Venkata Raman observou o efeito por meio da luz do sol (1928, juntamente com K. S. Krishnan e independentemente por Grigory Landsberg e Leonid Mandelstam). Raman ganhou o Prêmio Nobel em Física em 1930 por esta descoberta realizada utilizando luz solar, um filtro de banda estreita fotográficas para criar luz monocromática, e um "filtro cruzado" para bloquear esta luz monocromática. Ele descobriu que uma pequena quantidade de luz tinha mudado de freqüência e passou através do filtro "cruzado". A teoria sistemática do efeito Raman foi desenvolvida pelo físico da Checoslováquia George Placzek entre 1930 e 1934. O arco de mercúrio tornou-

se a fonte de luz principal, primeiro com a detecção de fotografia e, em seguida, com detecção espectrofotométrica. No presente momento, lasers são usados como fontes de luz.

EFEITO RAMAN

Na mecânica quântica o espalhamento é descrito como uma excitação para um estado virtual com energia mais baixa do que uma verdadeira transição eletrônica, com retorno ao estado não excitado e com uma mudança na energia vibracional (figura1).

O espalhamento Raman (ou efeito Raman) é baseado em deformações no campo elétrico e determinado pela polarizabilidade molecular α. O feixe de laser pode ser considerado como uma onda eletromagnética oscilante com campo elétrico igual a E 0 . Após a interação com a amostra, um momento de dipolo elétrico P = αE 0 é induzido, deformando as moléculas e as transformando

em

dipolos

oscilantes.

O

dipolo

oscilante

afeta

a

amplitude da onda de luz incidente fazendo com que essa amplitude flutue com a freqüência da vibração. O campo elétrico da onda espalhada é descrito na Equação

1 a seguir:

 
 
    (1)
 

(1)

Onde:

 

E 0 = feixe de radiação incidente

α = polarizabilidade da partícula (facilidade de distorção da densidade eletrônica)