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Nota Tcnica

Quim. Nova, Vol. 31, No. 1, 164-171, 2008


PLANILHA DE VALIDAO: UMA NOVA FERRAMENTA PARA ESTIMAR FIGURAS DE MRITO NA
VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS UNIVARIADOS
Fabiana Alves de Lima Ribeiro e Mrcia Miguel Castro Ferreira*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas SP, Brasil
Sandra Campilongo Morano, Lucimara Rodrigues da Silva e Ren Peter Schneider
Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 05508-900 So Paulo SP, Brasil
Recebido em 11/1/07; aceito em 18/5/07; publicado na web em 19/12/07

VALIDATION SPREADSHEET: A NEW TOOL FOR ESTIMATING THE ANALYTICAL FIGURES OF MERIT FOR THE
VALIDATION OF UNIVARIATE METHODS. This work presents the VALIDATION SPREADSHEET, a public domain tool that
can be used to evaluate the figures of merit for univariate analytical methods. A real example of BTEX determination in environmental
samples is included to illustrate its use. The spreadsheet has been developed for Excel and Open Office, and is available on the
internet at http//lqta.iqm.unicamp.br.
Keywords: spreadsheet; figures of merit; validation.

INTRODUO
O bom desempenho de qualquer tcnica analtica depende
crucialmente de dois parmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no seu
processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um mtodo durante as operaes de rotina de um laboratrio
estabelecendo os limites destes parmetros por meio da estimativa
das figuras de mrito, numa etapa conhecida como validao.
As figuras de mrito so, portanto, os indicadores quantitativos do escopo e do bom desempenho das tcnicas, e so descritas
na literatura especializada como: seletividade, ajuste da curva analtica e determinao da sua faixa de linearidade, sensibilidade do
mtodo, representada pelos limites de deteco (LD) e quantificao
(LQ), preciso, exatido e robustez1-8.
A estimativa destes parmetros pode variar de acordo com a
tcnica analtica empregada, ou com o protocolo de validao a ser
seguido. No intuito de padronizar estes procedimentos, a IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemstry) publicou
no final da dcada de 90 um guia para calibrao em Qumica
Analtica4. Ainda em 1990, as agncias regulatrias dos Estados
Unidos (FDA, Food and Drug Agency), Japo (MHLW, Ministry
of Health, Labour and Welfare) e Unio Europia (EMEA,
European Medicine Agency) passaram a organizar a Conferncia Internacional sobre Harmonizao (ICH, International
Conference on Harmonisation), para estabelecer padres para os
procedimentos de pesquisa e desenvolvimento de frmacos. Neste
contexto, o ICH elaborou um guia sobre validao de mtodos2,3
que tem sido utilizado tambm em outras reas de estudo que no
apenas a farmacutica. Na rea de Qumica Ambiental, os mtodos padres para anlise de contaminantes publicados pela Agncia de Proteo Ambiental Americana (EPA, Enviromental
Protection Agency) contm orientaes a respeito da validao
destes mtodos9.
No Brasil, os dois rgos que regulamentam a validao de
mtodos analticos so a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

*e-mail: marcia@iqm.unicamp.br

(ANVISA)10 e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e


Qualidade Instrumental (INMETRO)11.
Validar um mtodo um procedimento demorado, que requer
um grande nmero de experimentos analticos e clculos estatsticos, o que aumenta o custo das anlises.
Estabelecer um bom procedimento de validao requer um compromisso entre validar rpido, e com um nmero adequado de anlises, sem perder a qualidade das estimativas, o que um desafio
na rotina de um laboratrio devido s restries de tempo, custo e
potencial instrumental. Na busca deste compromisso, ferramentas
que permitam a estimativa das figuras de mrito de maneira rpida
e segura so de grande utilidade. Existem disponveis atualmente
no mercado diversos softwares comerciais para validao de mtodos, como o EffiValidation12, o Method Validation Pack da Agilent13
e o Validation Manager14.
O intuito deste trabalho apresentar e demonstrar a utilizao
da Planilha de Validao, uma alternativa aos softwares comerciais
para a etapa de validao de mtodos. Esta planilha permite a rpida estimativa das figuras de mrito, cabendo ao usurio apenas
introduzir as informaes referentes ao sinal analtico e s concentraes das espcies. Esta planilha no inclui a estimativa da
seletividade, por se tratar de um parmetro especfico para determinadas tcnicas analticas e cujo clculo no apresenta grande
complexidade.
Para exemplificar o uso da planilha, foi introduzida no incio
do texto uma breve reviso sobre figuras de mrito. Esta reviso
no tem a pretenso de detalhar extensivamente os procedimentos
necessrios para validar um mtodo analtico e sim apenas demonstrar como o clculo de cada parmetro realizado. Para uma reviso mais aprofundada possvel encontrar diversos trabalhos na
literatura cientfica1-7,15,16.
O uso da planilha foi ilustrado pela estimativa das figuras de
mrito para dados reais da implementao de uma metodologia
para anlises de benzeno, tolueno, etilbenzeno e o-, m- e p-xilenos
(conhecidos pela sigla BTEX) em amostras ambientais utilizando
cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas (GC/
MS). A metodologia escolhida o mtodo padro indicado pela
EPA17, que tem sido extensivamente aplicado para anlises desta
espcie de contaminante em amostras ambientais.

Vol. 31, No. 1

Planilha de validao: uma nova ferramenta para estimar figuras de mrito

Estimativa das figuras de mrito


Linearidade: o ajuste da curva de calibrao
A linearidade de um mtodo expressa a faixa na qual o sinal
analtico, denominado varivel dependente yi, linearmente proporcional sua concentrao, denominada varivel independente xi, e a
equao matemtica que descreve esta dependncia conhecida como
curva analtica ou curva de calibrao. O ajuste de qualquer equao matemtica feito pelo mtodo dos quadrados mnimos, no qual
a melhor curva ser aquela que fornecer o menor valor para a soma
quadrtica dos resduos (Q) obtidos entre o sinal analtico medido
(yi) e o sinal analtico predito (^yi), para um conjunto de N pontos
experimentais, como demonstrado na Figura 1 (Equao 1)18,19.

Figura 1. Curva de calibrao mostrando a estimativa do resduo no sinal


analtico

(1)
O ajuste da curva pelo mtodo dos quadrados mnimos fornecer os coeficientes de regresso, que no caso de um ajuste linear
e angular
(yi = a0 + a1xi) so os coeficientes linear (a0 = y - a1 x)
(a1 = [(xi - x)(y i - y)]/(x i - x) 2), em que x o valor mdio
(

165

No entanto, apenas o valor do coeficiente de correlao no


suficiente para garantir a adequao do ajuste linear curva de
calibrao. Modelos de calibrao com alto resduo no sinal analtico (Figura 2a) ou pontos mal distribudos ao longo da faixa de
calibrao (Figura 2b) podero fornecer um bom coeficiente de correlao, mesmo que uma funo linear no seja a melhor descrio
para o comportamento entre as variveis dependente e independente4,7,16,18. Na curva apresentada na Figura 2b, por exemplo, uma equao polinomial passando pelos dois pontos do meio da curva poderia
apresentar um valor menor para a soma quadrtica dos resduos (Q,
Equao 1) que uma equao linear, o que significaria um melhor
ajuste. Para evitar problemas de falta de ajuste durante a modelagem, faz-se necessria a anlise cuidadosa do grfico dos resduos
do sinal analtico e a aplicao de testes para determinar a faixa na
qual a curva de calibrao apresenta um comportamento linear. Esta
faixa conhecida como range, ou faixa de aplicao.

Figura 2. Curva de calibrao com (a) alto resduo no sinal analtico e (b)
nveis de calibrao mal distribudos ao longo da faixa de calibrao

Anlise dos resduos


A anlise do grfico dos resduos permitir detectar problemas
no ajuste da curva como, por exemplo, desvios da linearidade (Figu-

) da concentrao (xi) para o nmero total de amostras

(N) utilizadas como padres de calibrao. Uma vez conhecidos, estes coeficientes podero ser utilizados para predizer a concentrao da
espcie de interesse em novas amostras a partir do seu sinal analtico.
A adequao do ajuste da curva fornecida pelo coeficiente de correlao, r, que a razo da covarincia entre a concentrao, x, e o
sinal analtico, y, (

), com o produto dos desvi-

os padres de x (

) e y (

),

conforme descrito na equao 2. O coeficiente de correlao apresenta uma faixa de magnitude entre -1 r 1, sendo que quanto mais
prximo de 1 ou -1, menor ser o erro em y e, portanto, melhor ser
o ajuste da funo matemtica escolhida curva de calibrao. Para
um ajuste linear, no caso hipottico de r = -1, todos os pontos da
curva de calibrao estaro contidos em uma reta com inclinao
negativa. No caso contrrio, se r = 1, todos os pontos da curva devero estar em cima de uma reta com inclinao positiva. Uma relao
no linear entre x e y resultar em um valor relativamente pequeno4,19,20.

(2)

Figura 3. Grfico dos resduos mostrando (a) desvios da linearidade, (b)


amostras atpicas, (c) heterocedastidade, (d) erros correlacionados e (e)
resduos com homocedastidade e normalmente distribudos

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Ribeiro et al.

ra 3a), presena de amostras atpicas (Figura 3b), heterocedastidade


(Figura 3c) e dependncia entre os erros (Figura 3d). Uma curva
bem ajustada dever apresentar erros com distribuio uniforme,
mdia zero e varincia constante (homocedastidade), e ausncia de
amostras atpicas (Figura 3e)4,16,20.
Teste de linearidade
As fontes de variao em qualquer modelo so caracterizadas
pela soma quadrtica dos resduos ((yi - y^i)) e o melhor modelo de
regresso ser aquele que minimiza esta soma quadrtica. O teste
de linearidade proposto na planilha eletrnica feito pela comparao dos resduos do ajuste linear ( y^i1 = a0 + a1 x) e do ajuste
quadrtico ( y^i2 = a0 + a1 x + a2 x2) utilizando-se um teste-F de
significncia.
Esta comparao feita estimando-se as somas quadrticas dos
resduos no sinal analtico a partir dos desvios padres obtidos em
cada ajuste. O desvio padro em cada caso pode ser obtido como
descrito nas Equaes 3 e 4, em que Sy1 o desvio padro calculado para o ajuste linear e S y2 o desvio padro para o ajuste
quadrtico4,15.
(3)

(4)
A partir destes desvios estima-se a diferena entre as somas
quadrticas dos dois ajustes (DS2) segundo a Equao 5, em que N
o nmero de padres de calibrao utilizados na construo da
curva, e estima-se a significncia desta diferena em relao Sy22
com o auxlio de um teste F (Equao 6)4,15,21. Na Equao 6, F o
ponto de distribuio F no nvel de confiana escolhido, com f1 = 1
e f2 = N 3 graus de liberdade. Isto significa que se a razo S2 / sy22
F1,n-3, o ajuste linear mais adequado. Se, no entanto S2 / sy22 >
F1,n-3, considera-se um ajuste quadrtico mais apropriado15.

Quim. Nova

ra-se o LD como sendo a menor concentrao que pode ser detectada e que seja distinta do sinal analtico do rudo3,7.
Mtodo da relao sinal-rudo
Este mtodo pode ser aplicado em procedimentos analticos
que apresentam rudo da linha de base e estimado a partir da
comparao do sinal analtico obtido para uma amostra contendo
baixas concentraes da espcie de interesse com o sinal de uma
amostra do branco. Em geral, considera-se aceitvel uma relao
sinal-rudo de 3:1 ou 2:13,7.
Mtodo baseado em parmetros da curva analtica
Os dois mtodos descritos acima so muito utilizados pela sua
rapidez, mas apresentam como desvantagem o fato de basearem-se
em parmetros qualitativos. O mtodo de estimativa do limite de
deteco baseando-se em parmetros da curva analtica apresenta
maior confiabilidade estatstica, pois leva em considerao o intervalo de confiana da regresso. O LD neste caso definido como a
concentrao mnima de uma substncia que pode ser medida e
informada com 99% ou 95% de confiana3,6,8,17. No entanto, devido
complexidade dos clculos envolvidos nesta estimativa, este
mtodo tem sido menos utilizado que os dois mtodos anteriores.
Pela sua robustez, este foi o mtodo escolhido para a estimativa do
limite de deteco (LD) da planilha eletrnica.
A estimativa do sinal analtico a partir da equao de regresso
apresenta um erro padro, e o produto deste erro pelo valor apropriado de t da distribuio de Student21 permite calcular o intervalo de
confiana da curva analtica (Figura 4a), que tem a forma de duas
linhas hiperblicas ao redor da curva. O intercepto do limite superior do intervalo de confiana conhecido por y crtico (yc) e a sua
projeo no limite inferior uma estimativa da concentrao mnima que pode ser medida com um grau de confiana comprovado
estatisticamente, ou seja, o limite de deteco do mtodo (LD). As
Equaes 7 e 8 descrevem, respectivamente, o clculo de yc e LD3,4,15.

(5)

(6)
Sensibilidade do mtodo: o limite de deteco (LD) e o limite de
quantificao (LQ)
A sensibilidade de um mtodo definida pelos limites de
deteco (LD) e de quantificao (LQ)6,8,15,17. O LD a menor concentrao da espcie de interesse que pode ser detectada pela tcnica instrumental, enquanto o LQ a mais baixa concentrao que
pode ser quantificada dentro dos limites de preciso e exatido do
mtodo durante as operaes de rotina do laboratrio, em condies usuais1,6,15,17.
H trs formas de estimar os limites de deteco e de quantificao, e a escolha de uma delas deve levar em considerao a
tcnica analtica utilizada e o grau de confiabilidade estatstica
necessria: mtodo visual, mtodo da relao sinal-rudo, e mtodo baseado em parmetros da curva analtica3,4,7.

Figura 4. Curva de calibrao com ilustrao dos parmetros utilizados no


clculo do LD (a) e LQ (b)

(7)

(8)

Limite de deteco (LD)

Limite de quantificao (LQ)

Mtodo visual
No mtodo visual, realiza-se a anlise de amostras contendo
baixas concentraes conhecidas da espcie de interesse. Conside-

Mtodo visual
O limite de quantificao determinado pela anlise de amostras com concentraes conhecidas da espcie de interesse, e

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Planilha de validao: uma nova ferramenta para estimar figuras de mrito

corresponde menor concentrao que pode ser quantificada dentro dos limites de exatido e preciso do mtodo1-3,6,17.
Mtodo da relao sinal-rudo
Este mtodo adequado para procedimentos analticos que
apresentam rudo da linha de base. Neste caso, o LQ estimado a
partir da comparao do sinal analtico obtido para uma amostra
contendo baixas concentraes da espcie de interesse com o sinal
de uma amostra do branco e estabelecendo a concentrao mnima
em que a espcie de interesse pode ser quantificada com confiabilidade. Em geral, considera-se aceitvel uma relao sinal-rudo
de 10:12,3,7.
Mtodo baseado em parmetros da curva analtica
O LQ tambm calculado a partir do intervalo de confiana da
curva analtica, e sua estimativa pode ser observada na Figura 4b,
em que xc o valor da concentrao (x) no ponto em que o valor de
a0 intercepta a reta de regresso, e yh o valor de y para a projeo
de xc no limite de controle superior. As estimativas de yh, xc e LQ
podem ser realizadas respectivamente, pela utilizao das Equaes 9, 10 e 112-4,15. Na Figura 4, xc a concentrao no ponto em
que yc intercepta a reta de regresso e seu valor ser igual ao de xc
somente no caso ideal de retas com inclinao igual a 45.

(9)

(10)

(11)
Preciso
O termo preciso fornece a disperso dos valores medidos em
torno de um valor mdio, e seu valor numrico estimado pelo
desvio padro relativo, ou DPR, para anlises de amostras contendo a mesma quantidade das espcies de interesse1-4,6,15,17. O DPR
ainda conhecido como CV (coeficiente de variao), ou ainda pela
sigla RSD proveniente do ingls relative standard deviation e
seu clculo realizado como descrito na Equao 12, em que s o
desvio padro (

) e x o valor mdio (

do nmero total de medidas N, sendo xi cada uma das medidas


individuais.
(12)
A preciso pode ser estimada em trs nveis: repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade. O termo repetibilidade, ou
preciso intra-corridas, define a preciso dos resultados obtidos dentro
do prprio laboratrio, por um mesmo analista e com a mesma
instrumentao6,17. O guia ICH recomenda que sejam realizadas nove
determinaes contemplando toda a faixa de calibrao, ou seja, trs
concentraes (baixa, mdia e alta) com amostras em triplicata, ou
um mnimo de seis determinaes em amostras contendo uma concentrao equivalente concentrao mdia da faixa de calibrao3.

167

A resoluo 899 da ANVISA segue o guia ICH e determina que


sejam realizadas nove determinaes contemplando toda a faixa de
calibrao1. O INMETRO recomenda que sejam realizadas de sete a
nove replicatas para o clculo do DPR5. A EPA no estabelece o
nmero de amostras a serem analisadas para a estimativa da preciso em geral17,22,23.
Cabe ressaltar que o termo utilizado em ingls repeatability.
No Brasil, o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Instrumental) adota o termo repetitividade e a
ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria) adota o termo repetibilidade1,5
A preciso intermediria, ou preciso inter-corridas, define a
preciso dentro de um mesmo laboratrio para medidas obtidas por
diferentes analistas, ou em diferentes dias, ou por equipamento diferentes17,22,23. A ANVISA recomenda um mnimo de dois dias diferentes com analistas diferentes1, e o ICH incentiva o uso de tcnicas
de planejamento experimental para este teste2,3.
O termo reprodutililidade define a preciso dos resultados obtidos para uma determinada anlise realizada por laboratrios diferentes, mas seguindo a mesma metodologia1,5-7,17.
Exatido
A exatido reflete a proximidade entre o valor medido (xi) e
um valor de referncia considerado verdadeiro (xv), e relaciona-se
com o erro absoluto de uma medida1,3,6,17. Pode ser estimada de
duas formas: aplicando-se a metodologia proposta em uma substncia de pureza conhecida, como por exemplo, padres certificados; ou pela comparao com os resultados obtidos utilizando-se
uma segunda metodologia, que seja bem estabelecida e com exatido e preciso conhecidas. A EPA recomenda que a exatido seja
fornecida como a diferena (Equao 13) entre o valor predito e o
valor considerado verdadeiro6,15,17, enquanto a ANVISA recomenda que este parmetro seja estimado como a razo destas duas concentraes (Equao 14)1. A Planilha de Validao fornece a exatido como descrito na Equao 13.
(13)

(14)
O guia ICH recomenda que a exatido dever ser estabelecida
ao longo de toda a faixa de calibrao especificada para o procedimento analtico somente aps a preciso e a linearidade terem sido
estimadas 3. A ANVISA estabelece que a exatido dever ser
verificada em trs nveis de concentrao, alta, intermediria e baixa,
e no mnimo com determinaes em triplicata1.
Robustez
A robustez de um mtodo a sua capacidade de resistir a pequenas variaes dos parmetros analticos sem alterar significativamente sua exatido e preciso, portanto, uma medida da quantidade de variabilidade que o mtodo pode suportar, sem perder a
confiabilidade, e sua estimativa depende do tipo de metodologia
analtica utilizada1,3,5,7.
A robustez de um mtodo pode ser estimada variando-se os
parmetros analticos e comparando a preciso obtida em cada determinao. A ANVISA1 e o ICH3 indicam uma lista de parmetros a
serem avaliados nos testes de robustez de metodologias analticas
para as tcnicas de preparo de amostras, espectrofotometria,
cromatografia lquida e cromatografia gasosa1. O INMETRO indica
o teste de Youden5.

168

Ribeiro et al.

MATERIAIS E MTODOS
A Planilha de Validao foi elaborada no software Excel da
Microsoft Office 200324 e testada nas verses 98, 2000 e XP, e
compatvel com a planilha eletrnica do pacote Open Office 2.025,
de domnio pblico. A planilha pode ser obtida no endereo eletrnico http://lqta.iqm.unicamp.br26.
Exemplo
A utilizao da planilha ser demonstrada por meio da estimativa das figuras de mrito para a implementao de uma metodologia
para determinao de BTEX em amostras ambientais, utilizando o
mtodo padro EPA8260B da Agncia de Proteo Ambiental
Americana17.
BTEX e a escolha da metodologia analtica
Os hidrocarbonetos volteis benzeno, tolueno, etilbenzeno e
xilenos so constituintes dos produtos derivados do petrleo, e esto freqentemente presentes no nosso modo de vida atual. Estes
compostos, em especial o benzeno, atuam como substncias
depressoras do sistema nervoso central e dependendo da concentrao e do tempo de exposio podem causar sonolncia, tontura,
fadiga, narcose e morte, alm de apresentarem um potencial
cancergeno quando absorvidos em alta quantidade27,28.
A contaminao de solo e guas subterrneas por vazamentos
de produtos derivados de petrleo, em especial os hidrocarbonetos
volteis, tem despertado cada vez mais a ateno dos rgos de
controle ambiental, devido ao risco que representam sade da
populao. Uma outra grande preocupao a facilidade com que
estes compostos se dispersam no meio ambiente, devido principalmente s suas caractersticas fsico-qumicas como baixo peso
molecular e relativa solubilidade em gua quando comparados com
outros hidrocarbonetos maiores, que permitem a sua rpida difuso por corpos aquticos e pela zona vadosa do solo27-29.
Os limites de potabilidade de gua definidos pelo Ministrio
da Sade (Portaria 518 de 25 de Maro de 2004) para estes contaminantes so baixos, 5 g/L para o teor de benzeno, 170 g/L para
tolueno, 200 g/L para etilbenzeno e 300 g/L para o teor total de
xilenos30, e a metodologia analtica para a sua quantificao deve
ser robusta tambm para baixos teores.
A metodologia sugerida pela Agncia de Proteo Ambiental
americana17 para anlise destes contaminantes em amostras de solo
e gua a cromatografia gasosa com deteco por espectrometria
de massas (CG/MS), que permite a identificao e quantificao
das espcies de interesse com aprecivel confiabilidade17. Neste
trabalho, utilizou-se esta metodologia com injeo de amostra por
headspace. A identificao dos compostos foi feita empregando-se
um detector de massas do tipo ion trap, e pela comparao com as
anlises de padres certificados.

zados cloreto de sdio p.a. (Merck), cido orto-fosfrico 85%


p.a.(Merck) e gua ultra-purificada num sistema UHQ-OS Elga.
Solues de calibrao
As solues de calibrao foram preparadas em frascos headspace
de 22 mL pela adio de 10 mL de soluo modificadora de matriz
(500 mL de gua MilliQ, 180 g NaCl, pH 2,0 ajustado com cido
fosfrico 85%), com volumes apropriados das solues de trabalho
contendo os padres de calibrao e padro interno utilizando
microseringas gas tight (Hamilton, Reno, Nevada). Os frascos de
headspace foram lacrados com selos de alumnio e septo de silicone.
As curvas de calibrao foram construdas na faixa de concentrao de 0,6 a 92,8 g/L para benzeno, tolueno, etibenzeno e oxileno, e 1,3 a 184,8 g/L para m- e p-xileno, pois estas espcies
apresentam coeluio. As curvas foram construdas com 5 nveis
de calibrao e 5 replicatas de amostra, utilizando-se como padro
interno 52 g/L de clorobenzeno-d5.
Procedimento
As anlises foram realizadas num sistema de GC/MS (Thermo
Finnigan, ThermoQuest, Cincinnati, OH) com coluna capilar RTX5MS de 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 m (Restek, Corporation,
Bellefonte, PA) e analisador de massas do tipo ion trap, equipado
com um injetor de headspace automtico Tekmar 7000 HT e um
sistema de aquisio de dados XcaliburTM 31. A deteco cromatogrfica foi feita no modo Total Ion Current (TIC). Para a corrida
cromatogrfica foi utilizado um fluxo de hlio de 1 mL/min, temperatura do injetor a 150 C, temperatura da linha de transferncia a
275 C, temperatura final a 280 C, e programa de aquecimento: 35
C-2 min; 50 C-0 min-6 C/min; 100 C-2 min-25 C/min; 280 C1 min-25 C/min. Para a aquisio dos espectros de massa utilizouse uma variao de massa de 33-180 u, no modo Full Scan 0.29
s e temperatura da fonte a 220 C.
O uso da planilha
A planilha eletrnica possui, no total, nove planilhas para o
gerenciamento dos dados e estimativa das figuras de mrito:
Instrues: esta planilha contm as instrues sobre como inserir os dados do mtodo analtico e realizar os clculos necessrios para a estimativa das figuras de mrito (Figura 5). De maneira
geral, os dados podem ser inseridos nos campos em branco e os
resultados obtidos encontram-se nos campos em amarelo.

PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes
Foram utilizados padres Supelco (Bellefonte, PA) e Accustandard, Inc (New Haven, CT) contendo benzeno, tolueno,
etilbenzeno e o-, m-, p-xilenos; padro interno Supelco (Bellefonte,
PA) contendo clorobenzeno-d5, fluorobenzeno, 1,4-diclorobenzenod4 e padro interno Accustandard, Inc (New Haven, CT) contendo
bromoclorometano, clorobenzeno-d5, 1,4-diclorobenzeno. As solues dos padres foram preparadas em metanol grau pesticida (Tedia,
Fairfield, OH), e para a soluo modificadora de matriz foram utili-

Quim. Nova

Figura 5. Planilha Instrues

Vol. 31, No. 1

Planilha de validao: uma nova ferramenta para estimar figuras de mrito

Dados da Curva: esta planilha permite a insero dos dados da


curva de calibrao, e a obteno da mdia, desvio padro e desvio
padro relativo (DPR) associado ao sinal analtico para cada nvel
de calibrao (Figura 6). Os campos permitem inserir dados de at
seis nveis de calibrao e at cinco replicatas.
Ajuste da Curva: contm o grfico dos ajustes linear e quadrtico
da curva de calibrao.
Grfico dos Resduos: contm o grfico dos resduos para o sinal
analtico predito pelo ajuste linear.
Parmetros de Validao: apresenta o desvio padro relativo (DPR)
associado ao sinal analtico para cada nvel de calibrao, os coeficientes linear (a0), angular (a1) e de correlao (r) do ajuste linear,
o resultado do teste de linearidade para 95, 99 e 99,9% de confiana e os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) para a 95,
99 e 99,9% de confiana (Figura 7).

169

de concentrao e para at dez replicata


Robustez: esta planilha permite a insero dos resultados analticos obtidos dos testes de robustez para at trs diferentes condies e as respectivas estimativas da exatido e da preciso em trs
nveis de concentrao e para at dez replicatas.
As planilhas so protegidas, o que impossibilita que os campos
referentes aos clculos sejam alterados. O usurio poder apenas
ajustar a formatao dos ttulos e escalas dos grficos nas planilhas
Ajuste da Curva e Grfico dos Resduos. Para tanto, basta clicar
duas vezes com o boto esquerdo do mouse sobre a linha do eixo
desejado e realizar os ajustes necessrios.
Resultados: Estimativa das Figuras de Mrito
A estimativa das figuras de mrito necessrias implantao do
mtodo para determinao de BTEX foi feita utilizando-se a planilha
de validao. Os resultados encontram-se descritos abaixo.
Ajuste da curva e teste de linearidade
Utilizando o teste de significncia descrito anteriormente foi
possvel determinar a faixa linear das curvas de calibrao. As curvas para benezeno, tolueno, etilbenzeno e o-xileno apresentaram
um comportamento linear para a faixa de concentrao de 0,6 a
92,8 g/L, enquanto para m+p-xileno esta faixa foi de 1,3 a 184,8
g/L, com coeficientes de correlao acima de 0,999. Os coeficientes da regresso podem ser observados na Tabela 1 e na Figura
1S do material suplementar.
Tabela 1. Coeficientes da regresso linear das curvas de calibrao
para BTEX
compostos

Figura 6. Planilha Dados da Curva

benzeno
tolueno
etilbenzeno
o-xileno
(m+p)-xileno

coeficientes da equao linear(i) Linearidade


a0

a1

Faixa Linear(ii)

-0,0076
0,0046
-0,0504
0,0322
-0,0686

0,0312
0,0442
0,0451
0,0488
0,0434

0,9998
0,9997
0,9992
0,9997
0,9992

0,6-92,8
0,6-92,8
0,6-92,8
0,6-92,8
1,3-184,8

(i) a0 = coeficiente linear; a1 = coeficiente angular; r = coeficiente


de correlao; (ii) valores em g/L
Anlise do grfico dos resduos
Os resduos representam a parcela da variabilidade dos dados
que no foi explicada pelo ajuste, e so interpretados com uma estimativa do erro do modelo. Os resduos devem ser normalmente e
independentemente distribudos ao redor do zero, e devem apresentar mdia zero e varincia constante. A anlise do grfico dos resduos para os padres BTEX apresentou este comportamento, como

Figura 7. Planilha Parmetros de Validao

Tabela 2. Limites de deteo (LD) e de quantificao (LQ)


estimados para o mtodo com 95, 99 e 99,9% de confiana
Compostos

Resduos: contm o sinal analtico predito para os ajustes linear e


quadrtico, e a estimativa dos resduos do sinal analtico, bem como
a estimativa da mdia dos resduos e da varincia dos resduos em
cada nvel de calibrao.
Preciso e Exatido: esta planilha permite a insero dos resultados analticos obtidos dos testes de repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade, e o clculo da mdia, desvio padro,
desvio padro relativo (%), resduo absoluto e exatido do mtodo,
que nada mais do que o resduo em porcentagem, em trs nveis

95%
benzeno
tolueno
etilbenzeno
o-xileno
(m+p)-xileno(i)
(i)

2,8
3,5
5,8
3,8
12,0

LD (g/L)
99% 99,9%
3,8
4,7
7,9
5,1
16,3

5,1
6,2
10,2
6,7
21,6

95%
4,2
5,2
8,6
5,6
17,9

LQ (g/L)
99% 99,9%
4,7
5,8
9,7
6,2
20,0

5,4
6,6
11,0
7,1
22,8

(m+p)-xileno coeluem, e considerou-se a rea total para


quantificao.

170

Ribeiro et al.

pode ser observado na Figura 2S do material suplementar para o


benzeno. As outras espcies apresentaram comportamento similar.

Quim. Nova

requer valores de LQ pelo menos 5% abaixo dos teores permitidos


pela legislao para um composto em particular, para que se tenha
uma margem de segurana na sua determinao6,17. A margem de
segurana de 5% abaixo dos limites regulatrios foi alcanada para
todos os compostos para as estimativas do LQ realizadas com 95 e

Sensibilidade: LD e LQ
A aplicao de um mtodo analtico para anlises ambientais
Tabela 3. Preciso, exatido e robustez do mtodo

Nvel 1

Nvel 2

Nvel 3

Nvel 1

Nvel 2

Nvel 3

Cterica
(g/L)

Cpredita
(g/L)

24,7
24,7
24,7

23,6
22,8
23,3
23,2
1,7
48,4
45,7
45,8
46,6
3,3
72,3
72,0
75,1
73,1
2,3

1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR

48,3
48,3
48,3
71,4
71,4
71,4

Cterica
(g/L)

Cpredita
(g/L)

24,7
24,7
24,7

24,0
25,0
25,0
24,7
2,3
48,9
49,6
47,8
48,8
1,9
67,0
76,3
75,8
73,0
7,2

1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR

48,3
48,3
48,3
71,4
71,4
71,4

Benzeno
Exatido
Preciso
Robustez
(%)
Intermediria
-4,5
-7,7
-5,7
0,1
-5,5
-5,3
1,2
0,8
5,1

Nvel 2

Nvel 3

22,9
24,6
23,5
23,7
3,5
46,9
49,6
49,8
48,8
3,3
70,2
70,2
72,8
71,1
2,1

1
2
3

24,7
24,7
24,7

DPR
1
2
3

48,3
48,3
48,3

DPR
1
2
3

71,4
71,4
71,4

DPR

Etilbenzeno
Exatido
Preciso
Robustez
(%)
Intermediria
-2,8
1,2
1,2
1,2
2,6
-1,1
-6,2
6,8
6,1

Cterica
(g/L)
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR
1
2
3
x
DPR

23,2
24,8
23,8
23,9
3,6
44,5
47,0
49,6
47,0
5,4
70,0
70,0
72,5
70,8
2,0

Cterica
(/L)

49,1
49,1
49,1
96,1
96,1
96,1
142,0
142,0
142,0

25,9
27,0
25,6
26,2
2,8
49,0
46,7
51,3
49,0
4,7
72,8
71,6
79,7
74,7
5,9

26,1
27,2
25,8
26,4
2,8
47,2
51,8
49,2
49,4
4,7
73,7
72,4
80,7
75,6
5,9

Cterica
(/L)
1
2
3

24,6
24,6
24,6

DPR
1
2
3

48,2
48,2
48,2

DPR
1
2
3

71,2
71,2
71,2

DPR

(m+p) - xileno
Cpredita
(g/L)
46,3
46,5
49,7
47,5
4,0
96,2
94,8
98,0
95,3
1,7
140,0
154,5
148,1
147,5
4,9

Tolueno
Cpredita Exatido
Preciso
Robustez
(g/L)
(%)
Intermediria
23,5
22,9
25,2
23,9
5,0
47,8
47,6
47,2
47,5
0,6
71,5
74,7
73,8
73,3
2,3

-4,9
-7,3
2,0
-1,1
-1,5
-2,4
0,1
4,6
3,3

23,3
24,9
24,4
24,2
3,4
46,1
48,7
50,3
48,4
4,4
71,5
71,9
74,3
72,6
2,1

23,1
24,7
24,2
24,0
3,4
48,4
50,1
51,0
49,8
2,6
71,2
71,6
74,0
72,3
2,1

o-xileno
Cpredita Exatido
Preciso
Robustez
(g/L)
(%)
Intermediria
22,8
23,2
24,3
23,4
3,3
46,0
46,5
47,3
46,6
1,4
72,9
75,9
71,7
73,5
2,9

-7,5
-5,8
-1,4
-4,6
-3,6
-1,9
2,3
6,5
0,6

23,8
25,3
24,9
24,7
3,2
47,2
47,1
51,3
48,5
4,9
70,3
71,0
74,3
71,9
3,0

23,7
25,2
24,8
24,6
3,2
46,9
51,0
51,5
49,5
4,5
70,0
70,7
74,0
71,6
3,0

Exatido
(%)

Preciso
Intermediria

Robustez

-5,7
-5,3
1,2

48,7
52,3
52,3
51,1
4,1
98,9
91,9
98,1
96,3
4,0
147,9
149,5
148,3
148,6
0,6

48,3
52,3
52,3
51,0
4,5
92,0
98,1
100,2
96,8
4,4
148,0
149,5
148,3
148,6
0,5

0,1
-1,4
2,0
-1,4
8,8
4,5

x = mdia dos valores de concentrao; DPR = desvio padro relativo dos valores de concentrao em %; a robustez foi avaliada pela
determinao de BTEX em amostras de solo.

Vol. 31, No. 1

Planilha de validao: uma nova ferramenta para estimar figuras de mrito

99% de confiana (Tabela 2). Com exceo do benzeno, todos os


outros analitos apresentaram LD e LQ abaixo de 5% dos limites
regulatrios para um nvel de 99,9% de confiana. Os valores de LD
foram sempre menores que os valores de LQ, como era esperado.
Preciso, exatido e robustez
Os parmetros preciso, exatido e robustez foram estimados
em trs nveis de concentrao, um para valores de concentrao
na primeira metade da curva de calibrao, outro na regio intermediria e outro na segunda metade, sempre em triplicata. A
robustez foi testada pela quantificao do BTEX em duas matrizes
diferentes, gua e solo, previamente contaminadas com as espcies em estudo. Os resultados encontram-se na Tabela 3, em que
possvel observar que, para todos os casos, o DPR no excedeu o
limite de 15% estabelecido pela EPA para anlise de compostos
orgnicos volteis por GC/MS utilizando injeo por headspace17.
A preciso foi estimada como repetibilidade e preciso intermediria. Para esta ltima, as medidas foram feitas uma semana
aps a primeira medida, e por um outro analista. No foram feitos
estudos de reprodutibilidade.
A robustez foi estimada variando-se a matriz estudada. O mtodo foi desenvolvido para anlises de gua e solo contaminado
por BTEX. Foram realizadas determinaes em amostras de gua
e de solo, e o DPR obtido nos dois casos mostrou-se dentro dos
limites estabelecidos pela EPA17.
CONCLUSO
O que moveu este trabalho foi a necessidade de estimar os limites de deteco, quantificao, e o teste de linearidade, utilizando-se as informaes da curva de calibrao, por se tratarem de
estimativas baseadas em critrios estatsticos mais rgidos que as
estimativas realizadas pelos mtodos visual e da relao sinal-rudo. Os clculos envolvidos nestas estimativas no so triviais, e
faz-se necessrio no somente o uso de planilhas de clculo como
o Excel, mas tambm um conhecimento mais avanado das suas
ferramentas estatsticas.
A estimativa dos outros parmetros como ajuste da curva, exatido, preciso e robustez mais simples, mesmo para aquele usurio com pouca experincia no uso de planilhas. No entanto, estes
parmetros foram includos para que a planilha permitisse a estimativa de todas as figuras de mrito necessrias validao de um
mtodo.
O desempenho da planilha eletrnica foi testado com um conjunto de dados real de determinao de BTEX em amostras
ambientais, e todas as figuras de mrito foram estimadas com sucesso, cabendo ao usurio apenas inserir os dados referentes ao
sinal analtico, s concentraes dos padres de calibrao, e no
caso dos testes de exatido, preciso e robustez, as concentraes
preditas e de referncia.
MATERIAL SUPLEMENTAR
As planilhas Ajuste da Curva, Grfico dos Resduos, Preciso
e Exatido, e Robustez podero ser visualizadas no material suplementar do artigo, disponibilizado em http://quimicanova.sbq.org.br,
na forma de arquivo PDF, com o acesso livre e gratuito.

171

AGRADECIMENTOS
Ao apoio financeiro do CTPETRO atravs da FINEP
(6400046000 REHISOL), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico e Tecnolgico CNPQ (S. C. Morano e L. R. Silva) e
Coordenadoria de Aperfeioamento do Pessoal de Nvel Superior
CAPES (F. A. L. Ribeiro).
REFERNCIAS
1. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA); Resoluo 899 de
29 de maio de 2003 Guia para Validao de Mtodos Analticos e
Bioanalticos.
2. International Conference on Harmonisation (ICH); Guidance for Industry
Q2A: Text on Validation of Analytical Procedures, March 1995.
3. International Conference on Harmonisation (ICH); Guidance for Industry
Q2B: Text on Validation of Analytical Procedures, November 1996.
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Chemistry, Pure Appl. Chem, 1998, 70, 993.
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Qumicos; DOQ-CGCRE-008, Reviso: 01 de maro de 2003.
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dtr2001.saude.gov.br/sas/PORTARIAS/Port2004/GM/GM-518.htm,
acessada em Janeiro 2007.
31. Finnigan XcaliburTM software, version 1.2, Califrnia, (1998-2000).

PLANILHA DE VALIDAO: UMA NOVA FERRAMENTA PARA ESTIMAR FIGURAS DE MRITO NA


VALIDAO DE MTODOS ANALTICOS UNIVARIADOS
Fabiana Alves de Lima Ribeiro e Mrcia Miguel Castro Ferreira*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas SP, Brasil
Sandra Campilongo Morano, Lucimara Rodrigues da Silva e Ren Peter Schneider
Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 05508-900 So Paulo SP, Brasil

Figura 1S. Planilha Ajuste da Curva

Figura 2S. Planilha Grfico dos Resduos


*e-mail: marcia@iqm.unicamp.br

Material Suplementar

Quim. Nova, Vol. 31, No. 1, S1-S2, 2008

S2

Figura 3S. Planilha Preciso e Exatido

Figura 4S. Planilha Robustez

Ribeiro et al.

Quim. Nova