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A RTCULOS CIENTFICOS

M ETODOLOG AS U T I LI Z ADAS EN LA I N V EST I GACI N DE


PLAN TAS AN T I T U M ORALES: DESCRI PCI N Y COM EN TARI OS

RESU M EN
En el presente reporte se han descrito los resultados obtenidos en el estudio de algunas plantas medicinales con
actividad citotxica conocida. Se ha reportado la actividad cit ot xica de las especies: Annona muricata, Annona
cherimolia, Annona reticulata, Persea americana, Physalis peruviana, Physalis angulata, Clinopodium vulgare,
y Croton palanostigma. Estos hallazgos han sido comentados a fin de sugerir las mejores
estrategias para efectuar un trabajo de investigacin futuro.
Palabras Clave: plantas medicinales, citotoxicidad, lneas celulares, cncer, apoptosis
SU M MARY
This article reviews the results obtained during the study of some medicinal plants with known cytotoxic activity.
The cytotoxic activity of the species: Annona muricata, Annona cherimolia, Annona reticulata, Persea americana,
Physalis peruviana, Physalis angulata, Clinopodium vulgare,
and Croton palanostigma, has
been reported. These findings were commented in order to suggest better strategies for future investigations.
Keywords: medicinal plants, cytotoxicity, cell lines, cancer, apoptosis
I N T RODU CCI N
El cncer es en la actualidad uno de los problemas de salud ms preocupantes de la humanidad. Se ha avanzado considerablemente en el conocimiento, tratamiento y la prevencin de la enfermedad. Sin embargo, quedan an muchas
lagunas teraputicas por descubrir. Resulta interesante sealar que los productos naturales han jugado un rol significativo en el descubrimiento y desarrollo de nuevas drogas, especialmente para agentes contra el cncer y enfermedades
infecciosas. Un anlisis efectuado sobre las nuevas drogas aprobadas para el tratamiento del cncer por la FDA de
las plantas medicinales se han convertido en importantes fuentes de agentes quimioterpicos como la vinblastina y el
paclitaxel obtenidos a partir de derivados de las especies Catharanthus roseus y Taxus brevifolia (1).
Los compuestos de origen natural presentan una gran diversidad de estructuras qumicas, comparado con las
pequeas molculas sintticas, y con frecuencia proveen de actividades biolgicas altamente especficas (2). Tal es
el caso del alcaloide persina, extrado de las hojas de Persea americana, que en un estudio efectuado sobre clulas
de cncer de mama humano, se observ que induca en forma selectiva arresto del ciclo celular en la fase G2-M y

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apoptosis caspasa-dependiente en las clulas sensibles, siendo esta ltima propiedad dependiente de la expresin

Se ha efectuado un enorme nmero de estudios para determinar la citotoxicidad y actividad antitumoral de diversas
trabajos que reportan resultados positivos frente a clulas tumorales (4).

MTODOS YTCNICAS UTILIZADAS


La tarea de bsqueda de plantas antitumorales y sus principios activos se inicia, frecuentemente, con la disminucin
del universo de probables plantas citotxicas, aprovechando los aportes de la medicina folklrica y tradicional, y de
conocimientos etnobotnicos que suelen ser acert ados y alentadores.
Las plant as as seleccionadas se extraen con solventes orgnicos y agua. Particularment e se usan los extractos alcohlicos o hidroalcohlicos por su sencillez y fcil manejo, y con el fin de cubrir un amplio espectro polar y apolar se
se requieren otros solventes. El extracto obtenido, para su utilizacin posterior, se resuspende o disuelve en dimet il
ellos toma en cuenta las variables y modelo siguientes:

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A= Control negativo: solvente+ prueba (de inhibicin de crecimiento).


B= Muestra, extracto de planta redisuelto + prueba (de inhibicin de crecimiento) B1-B2-B3: concentraciones crecientes del
extracto de planta redisuelto + pruebas.
C= Control positivo: producto antitumoral reconocido + prueba.
Prueba= todos los procesos previstos para la experiencia.

Es un esquema bsico del diseo experimental para est e tipo de investigacin, al cual se puede agregar pruebas
especficas.

REDUCCINDEL UNIVERSO DE PLANTASANTITUMORALES


Se logra realizando diversas pruebas que ant icipan si el extracto es efectivamente inhibidor o no del crecimient o
celular. Entre ellas:
a) Inhibicin del desarrollo de huevos fecundados de erizo de mar.
b) Inhibicin del crecimiento de fibroblastos de ratn.
Los resultados positivos de inhibicin son insuficientes para admitir su carcter antitumoral pero autorizan, ya con
un nmero de muestras reducido, para el paso siguiente: trabajar con clulas tumorales.

ASPECTOS ESPECIALESA CONSIDERAR


Mecanismos de accin.- Determinar el mecanismo de accin es un procedimiento que confiere seguridad y confianza a una relacin causa-efecto. Es un tema muy importante que ha concitado la atencin de expertos cientficos
y eminentes filsofos, quienes se plantean si una relacin simple causa-efecto, acompaada o no de anlisis estadsticos, puede garantizar una relacin causal y otorgar calidad cientfica a un determinado fenmeno o proceso, la
acupunt ura por ejemplo; o si se debe, necesariamente, establecer su mecanismo de accin. En diversos trabajos de
investigacin de plantas citotxicas se est realizando la verificacin de hiptesis acerca de los posibles mecanismos
de accin, planteados para cada caso.
Es conocido el efecto traumtico (por efectos secundarios) de los quimioterpicos, motivo por el
que se estudia la especificidad de los extractos obtenidos, es decir, si son efectivos slo para las clulas tumorales, o
si t ambin son txicos para la clula normal. Con este fin se ejecutan las mismas pruebas de verificacin con clulas
normales y con clulas tumorales, comparando el crecimiento en ambos casos.
En pocas anteriores las Farmacopeas y particularmente el Codex Francs regulaban las preparaciones farmacuticas, los extractos fluidos, extractos secos, cocimientos, infusiones, tinturas, etc... Las tinturas se pre-

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Son muy importantes estos tipos de estudios acerca de la de Concentracin Inhibitoria porque permiten definir las
dosis recomendables de extractos o principios activos y conducen a su mejor aplicacin en las diversas formas farmacut icas a prescribir.

productos galnicos obtenidos mediante procesos sencillos en los que se aumenta la cant idad total a ingerir, y se
consigue elevando su concentracin al prepararlos como t inturas, extractos, tablet as u otras formas medicamentosas. Nos preguntamos si la cantidad ingerida actualmente se corresponde con la requerida para lograr efecto
siones se venden en el mercado informal.
Tal vez est e hecho justifica la denominacin de aliment o; producto nutracetico o suplemento alimentario, como
califica estos productos para su registro la FDA de los Est ados Unidos.
Debe tenerse en cuenta que al concentrar principios activos de corteza, de hojas, flores o semillas tambin pueden
concentrarse otras sustancias que exhiban efectos secundarios indeseables. Aparentement e, los procesos empleados
a la fecha en muchos casos no incrementan significativamente estas propiedades negat ivas en razn de los bajos
niveles de ingestin total de estas sustancias; pero esto podra no ocurrir, lo que deber evitarse, para cuyo efecto
han de realizarse estudios serios al respecto.

LA MOLCULA FARMACOQUMICA
Como quiera que el problema de encontrar la molcula qumica responsable de la accin farmacolgica fue parte
del desarrollo histrico de la farmacia, durante su tarea de encontrar nuevos medicamentos lo fue tambin su
solucin que precis la necesidad e importancia del reconocimiento de esta nica molcula qumica teraputica, la
det erminacin de su estructura y de las dosis requeridas para superar situaciones adversas de salud o para alcanzar
tigacin de este tipo, que finalmente condujo al monofrmaco. Con ello se consigui eliminar otras molculas indeseadas pero no todos los efectos adversos, ya que se mantienen an los efect os secundarios propios de la molcula
teraputicamente activa. Para aislar y caracterizar esta molcula y su estructura a partir de un extracto, se efecta el
fraccionamiento sucesivo siempre referido a su actividad inhibitoria de crecimiento, operacin que permite reducir
progresivamente el nmero de subfracciones obtenidas hasta llegar a la molcula qumica responsable. Con este fin
se emplean diversos tipos de cromatografa y otras tcnicas que se mencionan en posterior prrafo de esta nota, en

POTENCIACIN DE EFECTOS
Sin embargo, algunos especialistas en Etnomedicina y Fitofarmacia consideran conveniente mantener formas farmacuticas con mltiples compuestos qumicos, segn la hipt esis de que su asociacin potencia los efectos de muchas
de ellas. Wagner et al. publicaron su trabajo sobre Uncaria tomentosa (ua de gato) en el que ensayaron unir 2
Uncaria
verificada. Esto porque segn los resultados de sus trabajos, sumados los efectos individuales de los alcaloides aislados, no hacan el efecto total del extracto obtenido. Inesperadamente, hallaron mejores resultados al asociar estos
alcaloides con taninos.
Por ot ra parte, puede suponerse que algunos de los metabolitos, especialmente los secundarios, pueden contribuir
con un eslabn (un elemento o grupo orgnico) de la cadena qumica que representa al mecanismo de accin y as
concretarlo; o a la inversa, puede impedir la cont inuidad de esta cadena por sustitucin o transformacin qumica.

teraputicos esperados e impedir efectos secundarios indeseables o interacciones medicamentosas de consecuencias


negativas.
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ANLISIS DE EXPERIENCIAS PUBLICADAS


Dada la gran cantidad de trabajos y ensayos efectuados, hemos t omado una muestra de los mismos a fin de encontrar patrones comunes de metodologa que puedan servir de gua para aquellos investigadores que deseen efectuar
investigaciones futuras para elucidar la actividad antitumoral de especies vegetales.
Annona muricata
Tambin conocida en nuestro medio como guanbana, los primeros estudios qumicos se llevaron a cabo en las
planta. Se ha reportado que Annona muricata
encontradas en frutos, corteza y hojas. Quispe, A. et al. demostraron que el alcaloide acetogenina muricin H pre-

Por ot ra part e, Arroyo, J. et al. desarrollaron su investigacin sobre la mezcla del extract o et anlico de hojas de
Annona muricata y el extracto acuoso de la raz de Krameria lappacea, a fin de determinar el efecto citotxico de
(sistema nervioso). Se observ efecto citotxico de los dos extractos combinados, mientras que los ext ractos por
s solos no demostraron citotoxicidad. Los autores atribuyeron el efecto citotxico a las saponinas triterpenoides
presentan efectos anticancergenos (11), (12). Esta conclusin resulta interesante pues ampla el espectro de estudio
hacia otros metabolitos secundarios que estn presentes en el extracto de Annona muricata.
Annona cherimolia
Annona cherimolia es otra especie perteneciente al gnero Annona y familia Annonaceae, de la que se han aislado
una serie de compuestos con propiedades citotxicas. Kim, D. et al. demostraron el poder citotxico de los alcaloides
acetogeninas annomolin y annocherimolin aislados de las semillas de Annona cherimolia, sobre las lneas celulares
-

Annona reticulata
Conocida por anona roja, esta especie es oriunda de Amrica Central y de sus semillas se ha aislado el alcaloide
et al. confirmaron la citotoxicidad del compuest o frente a todas las lneas celulares
utilizadas. Se observ que en la lnea celular T24 de cncer de vejiga se produjo una interrupcin y detencin en la
fase G1 del ciclo celular. Se indujo la expresin de los genes pro apoptticos Bax y Bad (14).
Persea americana
La Persea americana (palto) es una planta perteneciente a la familia de las Annonaceae. Se han efect uado diversos
et al. evaluaron la actividad
cit ot xica del alcaloide persin extrado de las hojas de Persea americana, mediante la exposicin de las lneas hutasa de apoptosis por citometra de flujo. La persina indujo el arresto celular en la fase mit tica G2-M y apoptosis

Physalis peruviana
La Physalis peruviana (aguaymanto) es una especie peruana usada t radicionalmente en el tratamiento del cncer,
et al. se de-

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mostr un mayor efecto citotxico del extracto et anlico de hojas y tallos de Physalis peruviana frent e a las lneas

alentador ya que sugiere la presencia de metabolitos secundarios con una muy buena actividad citotxica, y que
ameritan una investigacin mas detallada.
Physalis angulata
trado compuestos denominados phisalinas que presentan fuerte act ividad citotxica in vitro, y confirmada in vivo
(19). En otro estudio realizado por Damu, A. et al
pertenecientes al grupo de phisalinas y whitanolidos, los que mostraron una clara actividad citotxica al enfrentarse

Clinopodium vulgare
El Clinopodium vulgare (clinopodio) es una planta usada tradicionalmente en Bulgaria como cicatrizante y en el
tratamiento de verrugas ocasionadas por virus. Dzhambazov, B. et al., en base a un trabajo previo, efect uaron un

Aunque no llegaron a determinar con exactitud la naturaleza qumica de los compuestos con actividad citotxica,
se encontr fuerte actividad antitumoral sobre estas lneas celulares. Se identific dos grupos de compuestos, el
primero, una combinacin de glicsidos, tuvo efecto sobre la adhesin celular; el segundo grupo causo vacuolizacin
celular masiva (21).

sor de la tos. A fin de determinar su actividad antitumoral, Blatt, C. et al. evaluaron la citotoxicidad del extracto
metablico de la corteza del tronco versus un panel de lneas celulares cancerosas humanas: BC1 (cncer de mama
humano), Lu1 (cncer de pulmn humano), Col2 (cncer de colon humano), KB (carcinoma epidermoide humano),
KB-V (+VLB) (KB multidrogo resistente evaluado en presencia de vinblastina), KB-V (-VLB) (KB multidrogo resistente
toma humano), y como complemento determinaron la actividad antimittica mediante clulas ASK cultivadas. Del
dad frente al panel de clulas cancerosas utilizadas (22).
Croton palanostigma
El Croton palanostigma (sangre de grado) es una planta medicinal cuya resina roja obtenida de la cort eza es usada
en el t ratamiento de lceras gastrointestinales, cicat rizacin de heridas y el cncer. Para evaluar esta ltima propiedad, Sandoval, M. et al. evaluaron el potencial efecto anticanceroso de la sangre de grado sobre las lneas celulares

DI SCU SI N
Hemos sealado los resultados obtenidos en algunos trabajos de investigacin que mostraron resultados de accin
cit ot xica de plantas medicinales frente a diferentes lneas celulares de cncer. En casi t odos los casos, se utilizaron
lneas celulares humanas de los tipos de cncer ms comunes (pulmn, colon, mama, entre otros) y que presentan
una mayor prevalencia en la poblacin. Sin embargo, hay que tener en cuenta el hecho de que los diversos t ipos de
cncer solo responden a frmacos especficos, y en consecuencia, se hace necesario disear modelos experimentales
con el mayor nmero posible de lneas celulares, a fin de determinar su especificidad.

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un procedimiento comn en las metodologas seguidas. Es necesario efect uar pruebas control de este tipo a fin de
det erminar si los extractos o principios activos puros pueden inducir citotoxicidad en clulas sanas.
Las pruebas control deben referirse no solo al tipo de clulas, sino tambin al uso de una sustancia control con actividad antineoplsica conocida, y a los solventes utilizados.
Bsicamente, de acuerdo a los resmenes expuestos, podemos dividir a los trabajos de investigacin en dos grupos: a) aquellos que solo determinaron citotoxicidad y b) aquellos que determinaron citotoxicidad y elucidaron el
mecanismo de accin de la sustancia. La elucidacin del mecanismo de accin es una tarea compleja que solo debera efectuarse en el caso de sustancias puras, ya que con el conocimiento a fondo de dicho mecanismo se puede
avanzar en el estudio de la molcula y llegar a la fase de estudios clnicos y finalmente convertirla en una droga de
uso aprobado.
Con respecto a las familias y gneros considerados, hay clara evidencia de que las especies vegetales pertenecientes
al mismo gnero (caso de Physalis peruviana y Physalis angulata y Annona cherimolia, Annona muricata y Annona
reticulata) o pertenecientes a la misma familia (caso de Persea americana y el gnero Annona, ambos pertenecientes a la familia de las Annonaceae), es decir, emparentadas, tienen un met abolismo muy semejante, que da
origen al mismo grupo de metabolitos secundarios, lo que permitira dirigir la bsqueda de plantas con actividad
antitumoral en base a la especie y familia.
PERSPECT I VAS
mente. El uso de modernas tcnicas de identificacin t al como la Resonancia Magntica Nuclear, Espectrometra de
Masas, Espect roscopia Infrarroja, etc; y tcnicas analticas como la cromatografa (en todas sus variantes), electroforesis, tcnicas de aplicacin de istopos y enzimologa, han result ado en la correcta elucidacin de las frmulas
estructurales exactas y las ms importantes vas metablicas.
Adicionalmente, la gentica ha cobrado un mayor impulso gracias al desarrollo del proyecto genoma humano y
se estn aplicando estas tcnicas para caracterizar el genoma completo de plantas usadas por el hombre. Recientemente, el Consorcio pblico italo-francs para la caracterizacin del genoma de la vid, ha logrado elucidar por
completo la secuencia de esta planta, dando un gran avance en el entendimiento de la sntesis de metabolitos y
enfoque experimental basado en genmica funcional, para facilitar el descubrimiento de genes que participan
en el met abolismo secundario de las plantas. Este mtodo en el futuro podra llevar a la creacin de novedosas
obviamente se puede dirigir a la sntesis de sust ancias con poder antitumoral y citotxico.

REFEREN CI AS BI BLI OGR FI CAS

4. Graham , J. Comunicacin personal

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