COLORACIN DE

PAPANICOLAOU PARA
CITOLOGA CRVICOUTERINA
ASPECTOS TCNICOS - CIENTFICOS

PRINCIPIO DEL MTODO

La coloracin de Papanicolaou es un mtodo basado en la
diferenciacin de color de los componentes celulares, se
aplica a los diversos tipos celulares para la tipificacin celular y
diagnstico de cambios malignos.
Los ncleos son coloreados con la hematoxilina de Harris
(coloracin bsica), el citoplasma con un colorante de
naturaleza alcohlica y policromtica coloracin de eosina
(coloracin cida) y la queratina citoplasmtica, cuando est
presente, se colorea con orange G6.
Nota: El cido fosfotngstico presente en la solucin de la
eosina determina el color del citoplasma.

Colorante de Hematoxilina
Se realiza con hematoxilina de Harris, colorante cido. Es
muy estable, tiene una duracin aproximada de 6-12
meses. Dentro de sus componentes tenemos:
Hematoxilina inactiva: el componente activo es la
hematena que se obtiene de la oxidacin (maduracin)
de la hematoxilina con xido rojo o amarillo de mercurio.
Una vez que se da la coloracin toma un color rojo
vinoso, tonalidad que toman los ncleos.
- Sulfato de potasio y aluminio: (piedra alumbre o
alumbre comercial) mordiente; sin esta sustancia no
dara color la hematoxilina, su color es mbar claro.

Colorante de Hematoxilina
Suministra las cargas positivas, que actan como puentes
qumicos para unirse a las cargas negativas de la hematena y
del cido fosfrico de las cadenas de DNA nuclear.
- cido acetil glacial: diferenciador. Incrementa la precisin de
la tincin nuclear y estabiliza el colorante. Previene la
oxidacin.
- Alcohol corriente al 96%: evita la contaminacin con hongos.
- Agua destilada.
- xido de mercurio (amarillo).

Colorante EA
Se realiza con EA 50 o EA 36 (eosina-alcohol). Se
pueden preparar diferentes tipos EA: 25, 31, 36,
50, 65, se clasifica segn sea la concentracin del
light green. Dentro de sus componentes tenemos:
Eosina cida. Es el colorante de fondo o contraste,
en unin con el colorante nuclear da tono rosa al
citoplasma. Colorea el citoplasma de clulas
escamosas, nuclolos y eritrocitos.
Light green: cido. Da tono verde-azul a los
citoplasmas de: clulas intermedias, capa
profunda, columnares, histiocitos, y leucocitos.

Colorante EA
La competencia entre la eosina y el light green en las clulas,
es la base de la coloracin diferencial del citoplasma.
- Vesuvina: bsico. Determina o contrasta los colores verdeazul o rosa de los citoplasmas. Puede reemplazarse por el
Bismarck Brown.
- cido fosfotngstico: mordiente. Une el light green con las
protenas de la clula.
- Carbonato de litio: diferenciador. Se utiliza en solucin
acuosa saturada.
- Alcohol corriente al 96%.
- Agua destilada.

Colorante orange G6

- Cristales de orange G6.

- cido fosfotngstico.
- Alcohol corriente al 96%.
- Agua destilada.

ETAPAS DE LA COLORACIN
Fijacin
Hidratacin
Coloracin nuclear
Deshidratacin

Montaje

Coloracin citoplasmtica

Aclaramiento

Enjuague

MTODO DE COLORACIN
Antes de la aplicacin del mtodo, se debe verificar la fecha
de vencimiento de las sustancias y reactivos por utilizar.
Una vez fijado el extendido, se inicia el proceso sumergiendo
en:
a) Alcohol corriente al 96% por 10 segundos, cuando la
muestra ha sido fijada en alcohol 96.
Alcohol corriente al 96% por 5 minutos, cuando la muestra ha
sido fijada en forma de cubierta (1).
b) Lavar con abundante agua de cao.

MTODO DE COLORACIN 2

Luego sumergir en:

a) Hematoxilina por 1 a 3 minutos (2).
b) Lavar con abundante agua de cao.
c) Sumergir en solucin acuosa de HCL al 0,5% de 1 a 4 veces
hasta
que empiece a cambiar de color (3).
d) Lavar con abundante agua de cao.
e) Sumergir en agua amoniacal al 0,5%.
f) Lavar con abundante agua de cao.

MTODO DE COLORACIN 3
Secar cuidadosamente el exceso de agua con gasa por los
bordes sin tocar el frotis, luego sumergir en:
a) Alcohol corriente al 96% por 10 segundos (4).
b) Orange G por 2 minutos (5).
c) Alcohol corriente al 96% por 5 segundos (6).
d) Alcohol corriente al 96% por 5 segundos (7).
e) EA-36 por 2 minutos (8).

MTODO DE COLORACIN 3

Luego deshidratar sucesivamente en:

a) Alcohol corriente al 96% por 5 segundos (9).
b) Alcohol corriente al 96% por 5 segundos (10).
c) Alcohol absoluto por 10 segundos (11).
d) Alcohol absoluto por 10 segundos (12).
Luego sumergir sucesivamente en:
a) Xilol o neoclear por 10 segundos (13).
b) Xilol o neoclear por 10 segundos (14).
c) Xilol o neoclear por 10 segundos (15).

MTODO DE MONTAJE
Para el montaje sobre la lmina portaobjeto, an hmeda,
usar unas gotas de blsamo de Canad y cubrir con laminilla o
con resina sinttica previo secado de la lmina portaobjeto.
En caso de aplicar lquido de montaje sobre el frotis, no se
requiere el uso de laminilla cubreobjeto.

Resina o lquido para

montaje
Blsamo del Canad. ndice de refraccin: 1,53, es una
oleorresina natural, se obtiene del abeto. Desventajas: toma
color amarillo, se decoloran las placas, demora mucho tiempo
para secarse.
Entelln. ndice de refraccin: 1,49. Sinttico. Es una
combinacin de resinas (solucin de polmeros) disueltos en
xilol o neoclear. Ventajas: seca en 20 minutos, se conserva
transparente; las placas duran aproximadamente 5 aos sin
decolorarse. Puede considerarse como opcin el uso del
neomount, que especficamente utiliza neoclear.

RESULTADOS DE TINCIN
Ncleos:
La funcin del colorante nuclear es dar coloracin perfecta al
ncleo, colorear al mnimo el citoplasma y no cambiar en el
transcurso de la coloracin citoplasmtica.
La cromatina y la membrana nuclear toman el color azul
oscuro o prpura mientras el nuclolo obtiene el color rojo,
rosado o naranja.

RESULTADOS DE TINCIN
Citoplasma:
La funcin del colorante citoplasmtico es permitir la neta
diferenciacin entre clulas eosinfilas y cianfilas, sin dar
matices intermedios; dar una coloracin homognea, estable
y transparente y no disminuir la coloracin del ncleo a causa
de una excesiva acidez.
El citoplasma presenta el color amarillo o naranja, si hay
presencia de queratina. Caso contrario el color vara de verde,
azul o gris.

ANOTACIONES IMPORTANTES
PARA TENER EN CUENTA
La coloracin de Papanicolaou puede suspenderse
solamente en los alcoholes al 95% o en el xilol, aunque
un aumento en el tiempo de los alcoholes puede dar
citoplasma plido.
El nivel de los colorantes y alcoholes debe cubrir toda la
placa.
Los colorantes nuclear y citoplasmtico deben cambiarse
aproximadamente cada 2000 lminas.
Los alcoholes, el xilol y los colorantes deben filtrarse con
frecuencia, para evitar contaminacin.
La hematoxilina debe filtrarse cada que presente un
precipitado metlico, para evitar que se forme un
pigmento caf, lo cual impide la visualizacin de las

ANOTACIONES IMPORTANTES
PARA TENER EN CUENTA
Las lminas deben enjuagarse muy bien en alcohol al
70% para quitar el exceso de NH3 y evitar as la
decoloracin posterior.
La preparacin de colorantes (solucin madre) debe
hacerse con alcohol etlico puro.
Guardar los colorantes en frasco oscuro.
Los alcoholes utilizados en el proceso de la coloracin
pueden prepararse con el alcohol isoproplico; es ms
econmico.
Las modificaciones de la coloracin de Papanicolaou se
basan principalmente en la reduccin en el nmero de
alcoholes, la preparacin de las soluciones y los tiempos
utilizados; esto se ajusta en cada laboratorio hasta