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MANUAL DE

BIOSSEGURANA

dezembro de 2001
PPGIm
Secretaria da Sade

Manual de Biossegurana

Parte IV
Manipulao de
Animais

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Sumrio

Sumrio
18.

Animais de Laboratrio....................................................................... 329

18.1.

Sade das Espcies Convencionais de Laboratrio ..................................... 329

18.2.

O Controle Sanitrio.............................................................................. 331

18.3.

Modelos Animais de Doenas Humanas .................................................... 333


18.3.1.

As Linhagens Geneticamente Padronizadas .............................................. 334

18.3.2.

As mutaes ....................................................................................... 335

18.3.3.

O Valor dos Modelos Animais ................................................................. 340

18.3.4.

Tabela e Figuras .................................................................................. 341

18.4.

Bibliografia .......................................................................................... 344

19.

Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao


Brasileira de Biossegurana................................................................ 347

19.1.

Introduo........................................................................................... 347

19.2.

Tcnicas de Transgenese ....................................................................... 348

19.3.

19.4.

19.2.1.

Microinjeo de DNA em Proncleo ......................................................... 349

19.2.2.

Infeco por Retrovrus ......................................................................... 350

19.2.3.

Clulas Embrionrias Indiferenciadas (Embryonic Stem Cells - ES)............ 351

19.2.4.

Espermatozides como Vetores .............................................................. 351

19.2.5.

Biolstica ............................................................................................. 352

Utilizao dos Animais Transgnicos ........................................................ 353


19.3.1.

Estudo da Regulao e Expresso Gnica................................................. 353

19.3.2.

Utilizao de Animais Transgnicos como Biorreatores ............................... 354

19.3.3.

Gerao de Modelos Animais para Estudos Biomdicos .............................. 354

19.3.4.

Introduo de Novas Caractersticas Genticas Importantes Economicamente 355

Legislao Brasileira de Biossegurana..................................................... 356


19.4.1.

Instruo Normativa N 12 .................................................................... 357

19.4.2.

Instruo Normativa N 13 .................................................................... 366

19.5.

Concluso............................................................................................ 368

19.6.

Referncias Bibliogrficas....................................................................... 369

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

18. A
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LAABBO
Sade o resultado do equilbrio entre um ser vivo, seu meio ambiente e os diversos
agentes que possam produzir doena.
O animal de laboratrio o principal elemento na pesquisa. Sua sade deve ser mantida
em condies ideais de modo a permitir reprodutibilidade dos resultados.
Fatores orgnicos e ambientais alteram o funcionamento do organismo do animal e
levam a resultados diferentes daqueles que seriam esperados e desejveis. Estes fatores
incluem principalmente as condies sanitrias (higiene), alimentao, gua, luz, rudo
ambiental etc.
Est amplamente demonstrado que modificaes na luminosidade ambiente levam a
alterao do funcionamento do eixo hipotlamo-hipfese, alterando de maneira de
maneira importante os nveis hormonais. A amnia, o constituinte da urina animal,
provoca irritao das vias areas e alterao do funcionamento heptico e do sistema
nervoso central. O rudo se constitui em fator estressante, modificando as respostas
neuro-endcrinas. A falta de higiene proporciona crescimento de bactrias e de parasitas
que podem levar o animal a apresentar diarrias e como conseqncia distrbios do
balano hidroeletroltico. Estas so apenas algumas das conseqncias de condies
inadequadas do ambiente onde vive o animal.
Cada experimento tem suas exigncias especficas, mas todos eles necessitam que os
animais estejam em boas condies de sade.
A exteriorizao do estado de sade se d pelo comportamento dos indivduos de uma
colnia quando se encontram isolados ou em grupos.
Conhecer as caractersticas de comportamento das diferentes espcies utilizadas de
grande importncia para as avaliaes dirias das colnias de animais. Em geral as
espcies animais apresentam um comportamento social bem definido como o
estabelecimento de padres de hierarquia e atribuies para os diversos membros do
grupo. O comportamento anormal dos animais pode ser um reflexo do ambiente
inadequado ou mesmo de pessoas envolvidas no trabalho.
Os mtodos para se avaliar o estado de sade dos animais so muitos e vo desde uma
anlise clnica (inspeo, palpao e auscultao) at os mtodos diagnsticos que
buscam pela contaminao microbiana ou por parasitas. Entretanto, o melhor dos
mtodos clnicos, nada mais que a inspeo, a observao metdica, diria e
organizada, dispensando exames aprofundados e dispendiosos. Na tabela 1 so
apresentados os principais fatores de interferncias nas colnias animais.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Tabela 18.1 - Fatores que podem interferir no comportamento normal dos animais de laboratrio.
FATORES

CONDIES

Alojamento

 Densidade populacional por gaiola, tipo de gaiola, freqncia


de trocas, qualidade da limpeza.

Higiene

 Pessoal: uniformes, banhos, limpeza das mos.


 Ambiental: remoo de poeiras e detritos, controle de
trnsitos das pessoas, isolamento de reas de manuteno dos
animais.
 Equipamentos: desinfeco, esterilizao, conservao.

Raes

 Qualidade, quantidade, prazo de validade.


 Estocagem em ambiente apropriado.

Animais

 Quarentena, controle sanitrio, seleo


isolamentos das espcies diferentes.

Equipe tcnica

 Postura, movimentao, manipulao, contenso.


 Conhecimento das principais
animais sob seus cuidados.

caractersticas

das

das

matrizes,

espcies

Tabela 18.2 - Correlao entre as condies normais de sade, os distrbios do organismo e suas
principais causas.
CONDIO NORMAL

DISTRBIOS/SINTOMAS

CAUSAS

Pele e Anexos
Plos homogneos,
brilhantes e sedosos
com insero firme.
Pele elstica, mida,
lisa.

 Perda de plos;

 Fungos, caros, sarna, bactrias e


eficincia alimentar;

 Ferimentos;

 Brigas, cama com resduos


grosseiros;

 Formao de
cicatrizes ou calos;

 Bactrias;

 Irritao da pele;

 Alergias, intoxicao;

 Plos sem brilho,


perda de plos.

 Anemia, hepatite, distrbios


metablicos.

Mucosas Aparentes
midas, brilhantes,
rseas.

 Secas, sem brilho,  Desidratao, anemia, deficincia


nutricional, hepatite, infeces,
branca,
amarelada
verminoses.
etc;
 Corrimento
nasal,
ocular (purulento).
(continua)

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Tabela 18.2 (continuao)


CONDIO NORMAL

DISTRBIOS/SINTOMAS

CAUSAS

Olhos
Brilhantes, midos,
vivazes.

 Secos, sem brilho,


com corrimento ou
purulentos.

 Desidratao, infeces,
conjuntivites, alergias.

Aparelho genital
Fmeas com ciclo estral  Aborto, infertilidade,  Disfunes hormonais;
regular (perodo
canibalismo.
 Deficincia nutricional;
especfico por espcie)
 Fmeas roedoras
mantidas em gaiola  Alta densidade de animais por
gaiola.
com outras fmeas,
por perodos
prolongados, entram
em fase de repouso
sexual (anestro).
Aparelho digestivo
Dentes ntegros,
 Emagrecimento
nmero e comprimento.
acentuado.
Esfago, estmago,
intestino, fgado,
 Fraturas de dentes.
pncreas.

 Crescimento anormal e quebras de


dentes (dificuldade de preenso
dos alimentos);
 Brigas, farpas de alimentos ou
outros resduos;

 Apatia, diarria.

 Ingesto de alimentos ou gua


contaminados por bactrias ou
vrus, deteriorados;

 Constipaes
intestinais.

 Desidratao.
(concluso)

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Agentes microbiolgicos e/ou parasitolgicos patognicos presentes nas colnias de
animais de laboratrio freqentemente tm sido responsabilizados por causar: alteraes
nos resultados experimentais, erro de interpretao do mesmo, morte dos animais das
colnias etc.
Atualmente uma exigncia o uso de animais sanitariamente definidos e livres da
patgenos especficos para a pesquisa. Devemos ter em mente que como as substncias
qumicas altamente puras utilizadas nos laboratrios de pesquisa, os animais de pesquisa
so reagentes biolgicos e seu padro de qualidade deve ser sempre uma exigncia de
quem os utiliza.
Os mtodos utilizados para verificar a qualidade sanitria dos animais podem ser de
vrios tipos:

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Monitorao microbiolgica: prtica de testes repetitivos padronizados, previamente


esquematizados e programados para evidenciar a presena de determinadas infeces
numa colnia animal.
Checagem espordica ou ocasional: quando uma infeco suspeitada testes especficos
so realizados visando identificar os patgenos mais provveis de causar as alteraes
clnicas e leses observadas.
Levantamento microbiolgico ou spot test: realizado para obter informao referente
prevalncia de infeces entre animais de laboratrio.
Na tabela 16.3 esto descritos alguns dos vrus
microbiolgica em colnias de animais de laboratrio.

indicados

para

monitorao

Tabela 18.3 - Infeces virais e os rgos afetados.


MICRORGANISMO

Adenovrus

HOSPEDEIRO

RGOS AFETADOS

 M, R, GP.

 Sistema respiratrio e trato


gastrintestinal.

 Toolans H1.

 R.

 Sistema nervoso.

 Kilham rat vrus.

 R.

 Sistema nervoso, fgado.

 M.

 Sistema respiratrio, trato


gastrintestinal, sistema nervoso, fgado
e sangue.

 R.

 Sistema respiratrio.

 C.

 Trato gastrintestinal e miocrdio.

 M, R, H, GP.

 Sistema respiratrio (M, R).

 H, GP.

 Sistema nervoso (H).

 M, R, H, GP.

 Sistema respiratrio (M, R).

 M, R.

 Sistema nervoso.

Parvovrus

Corona vrus
 Hepatite do
camundongo.
 Rat corona vrus.
 Rabbit corona vrus.
Paramixovrus
 Sendai.
 Simian.
 Pneumonia.
Paramixovrus
 Theiler (GDVII,
MHG).

Legenda: Camundongos (M), ratos (R), guinea pig (GP), coelhos (C), hamsters (H).

Os agentes microbiolgicos, principalmente os vrus, so altamente contagiosos e,


portanto, muito prevalentes nas colnias convencionais de animais de laboratrio. Uma
vez presentes, dificilmente se consegue elimin-los pelo carter enzotico que
apresentam. A erradicao da colnia e a descontaminao ambiental com posterior
recolonizao, adoo de tcnicas de manejo eficientes e implantao de sistemas de
barreiras de proteo nos biotrios tm sido a conduta mais indicada e utilizada.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Devemos ter em mente que a preveno a melhor das condutas quando trabalhamos
com animais de laboratrio. Nos biotrios convencionais os agentes infecciosos podem
ser introduzidos numa colnia e transmitidos de vrias maneiras para os animais de
laboratrio atravs dos materiais, objetos e equipamentos contaminados que entram nas
reas de criao, por meio de vetores mecnicos ou biolgicos (insetos), pela introduo
nos biotrios de animais oriundos de colnias contaminadas etc. J nos biotrios que
possuem sistemas de barreiras de proteo, a contaminao pode ser causada por falha
tcnica que interrompe o sistema de proteo.
No intuito de impedir as contaminaes dos animais por agentes patognicos, podemos
tomar algumas medidas preventivas como, por exemplo:
 implantao de sistemas de barreiras de proteo nos biotrios;
 treinamento da equipe tcnica e dos usurios dos biotrios para a adoo de tcnicas
de manejo adequadas;
 implantao de programa de monitorizao sanitria permanente;
 adoo de um programa de rotinas peridicas de desinfeco ambiental e
esterilizao de todo material que entrar em contato com a colnia;
 adoo do sistema de quarentena para novas espcies ou linhagens a serem
introduzidas no biotrio;
 vigilncia permanente para cumprimento de normas tcnicas funcionais previamente
discutidas e elaboradas.

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Desde a descoberta em 1902 por Garrod que a alcaptonria (aku) era uma desordem do
metabolismo de carter hereditrio (erro inato do metabolismo), vrias outras doenas
ou patologias humanas tm sido caracterizadas como uma deficincia gentica e, tais
descobertas se intensificaram ainda mais com as novas tcnicas de biologia molecular.
Paralelamente ao progresso da gentica humana, a gentica de camundongos ou o
estudo de modelos animais de doenas humanas foi criado (tabela 18.1). Tais modelos
ajudam na compreenso da patogenicidade de vrias doenas e, em muitos casos, so
usados para testar a eficincia e ausncia de efeitos colaterais de uma terapia gnica que
busca a compensao ou substituio da funo do gene defeituoso no homem.
O objetivo deste artigo de descrever como os modelos animais das doenas humanas
foram descobertos ou induzidos, suas vantagens e limitaes.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

18.3.1.

As Linhagens Geneticamente Padronizadas

As linhagens isognicas
Os roedores de laboratrio suportam relativamente bem um regime de cruzamentos
totalmente consangneo. Nos ratos e camundongos podemos fazer acasalamentos entre
irmos durante vrias geraes obtendo assim populaes de animais muito homogneas
do ponto de vista gentico. Estas populaes so denominadas linhagens isognicas
(inbred strains) e elas so muito estveis e geneticamente padronizadas:
 elas tm formas allicas homozigticas para todos os loci do genoma e
 o conjunto de alelos que compe o genoma so distribudos de forma aleatria.
Desta forma, fica claro que toda comparao feita entre camundongos provenientes de
linhagens diferentes revelar diferenas genticas. Para termos acesso a tais diferenas
devemos cruzar as diferentes linhagens e analisarmos a transmisso gentica de um ou
mais caracteres genticos de uma gerao outra.
Algumas destas linhagens so consideradas como modelos animais para a medicina pois
elas desenvolvem doenas como por exemplo linhagem NOD (Non Obese Diabetic)
(Festing M.W., 1996). Nesta linhagem, 80% das fmeas e 20% dos machos apresentam
espontaneamente uma diabete auto-imune insulino-dependente, anloga diabete
juvenil do homem.
Por outro lado, as linhagens isognicas podem apresentar diferenas quanto s reaes
aos agentes infecciosos. Neste caso observamos que enquanto algumas linhagens so
dizimadas pela infeco de um agente patognico, outras so resistentes. Isto foi
observado com os agentes Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi, Leishmania
major ou pela bactria Salmonela e as Micobactrias (Foote et al., 1997; Vidal et al.,
1993). Entretanto, neste caso a noo de modelo animal um pouco mais complicada
pois os mecanismos envolvidos no determinismo gentico das diferenas de sensibilidade
s infeces no so integralmente transponveis de uma espcie outra. Para ilustrar
esta afirmao podemos utilizar como exemplo o gene Mx (para Myxovirus resistance,
mapeado no cromossomo 16).
A maior parte das linhagens de camundongos de laboratrio sucumbe entre 48 e 72
horas aps terem sido infectadas pelo vrus da influenza, enquanto que a linhagem A2G
resiste a dose 500 vezes mais forte. Esta diferena de sensibilidade controlada por um
nico gene, o gene Mx que possu dois alelos: o alelo de resistncia Mx+ e o alelo da
sensibilidade Mx-, o alelo primeiro dominante sobre segundo. A clonagem e o estudo
molecular deste gene serviu para elucidar o mecanismo gentico que rege a sensibilidade
ou resistncia ao Myxovirus para todos os mamferos (Haller et al., 1980).
Ns podemos citar muitos outros modelos conhecidos como, por exemplo, a resistncia
ao vrus de Theiler. Entretanto sabemos que esta uma rea de estudo que s tende a
se desenvolver e as estratgias sero cada vez mais generalizadas de um caso para
outro. Todas, entretanto buscam o mesmo resultado, que dever ser o desenvolvimento
de vacinas ou de tratamentos para as doenas infecto-contagiosas.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

As linhagens isognicas de camundongos de laboratrio derivam todas de um pequeno


nmero de genitores, isto do ponto de vista gentico, significa que no existe muita
diferena entre os genomas. Por exemplo, todas estas linhagens possuem a mesma
molcula de DNA mitocondrial (herdado da me) e o mesmo cromossomo Y (herdado do
pai). Tal homogeneidade um fator positivo para o estudo da histocompatibilidade ou
estudos sobre a predisposio a algumas formas de cncer. Entretanto o uso destas
linhagens no adequado ao mapeamento gentico alta densidade (indispensvel
clonagem posicional), ou do estudo do imprinting gentico, ou o estudo dos efeitos da
epstasia etc. So por estas razes que foram criadas recentemente novas linhagens
derivadas de camundongos selvagens capturados na natureza.
Alm deste tipo de camundongos, podemos falar das linhagens congnitas, ou das
recombinantes (derivadas de duas linhagens isognicas parentais). Porm, todas estas
outras linhagens so produtos de cruzamentos e de selees a partir das linhagens
isognicas.

18.3.2.

As mutaes

As mutaes fazem surgir uma segunda forma allica permitindo assim a identificao
dos genes responsveis. Todos os seres vivos sofrem mutaes no genoma e todas estas
mutaes so produzidas de forma aleatria tanto nas clulas somticas, germinativas,
embrionrias e adultas.
Assim que elas so transmitidas s geraes seguintes freqentemente os seus efeitos
so deletrios ou patolgicos e podem, neste momento, servirem de modelo para
algumas doenas hereditrias humanas ou tornam-se, simplesmente, um utenslio para a
cincia.

As mutaes como modelos para doenas humanas


Nos camundongos e ratos de laboratrio existem mais de mil mutaes que representam
um estoque potencial de modelos animais. Pelos resultados experimentais, ns podemos
admitir que a freqncia de mutaes espontneas prxima de 5 x 10-6 por gameta e
por gerao para as mutaes recessivas e a freqncia em torno de 2 x 10-7 por gameta
e por gerao para as mutaes dominantes. Isto quer dizer que um camundongo entre
mais ou menos duzentos possu uma mutao em um locus qualquer.
Entre todas estas mutaes que vem sendo coletadas ao longo deste sculo, algumas
reproduzem uma sndrome muito prxima de uma patologia humana. Este o caso, por
exemplo, da mutao alcaptonria (aku) (Figura 18.1) a qual mapeamos sobre o
cromossomo 16 dos camundongos (Montagutelli et al., 1994). O mesmo gene (o do cido
homogentsico) afetado no homem e no camundongo e os sintomas so muito
parecidos nestas duas espcies (a urina torna-se escura oxidando-se aps o contato com
ar). Muitas outras mutaes como esta j foram descritas, mas acontece que os sintomas
de uma mesma doena podem ser mais severos de uma espcie a outra. A distrofia
muscular de Duchenne, da qual conhecemos um modelo animal que o camundongo
mdx, a conseqncia de uma mutao em um enorme gene de estrutura mapeado
sobre o cromossomo X. Tal mutao interrompe a produo de uma protena essencial na
miognese: a distrofina. No homem, os efeitos desta mutao so severos enquanto que
nos camundongos so quase imperceptveis. Este modelo interessante pois no dia em
que os geneticistas descobrirem a razo desta diferena de fentipo entre estas duas
espcies contendo a mesma mutao ns teremos progredido muita na compreenso
desta terrvel doena e talvez estejamos caminhando para a cura da mesma.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Mesmo sendo abundantes, as mutaes de camundongos e de ratos susceptveis de


serem modelos para os geneticistas humanos ainda so insuficientes. Ns conhecemos,
por exemplo, oito mutaes de camundongos cujos efeitos afetam a sobrevivncia dos
motoneurnios na medula espinhal, porm nenhuma destas mutaes serve como
modelo animal de uma neuropatia humana pois em nenhum dos casos, as localizaes
genticas coincidem com o mapeamento gentico humano. Este o caso, por exemplo,
da mutao progressive motor neuronopathy (pmn) (Figura 18.2) com a qual
trabalhamos, h algum tempo, tentando clonar o gene responsvel. Durante um certo
tempo ela foi considerada como sendo o modelo animal da Amiotrofia espinal humana
(SMA para Spinal Muscular Atrophy) do tipo I, a mais severa. Mapeamos esta mutao
na regio centromrica do cromossomo 13 de camundongos (Brunialti et al., 1995),
longe da regio cromossmica homloga ao cromossomo 5 local onde foi mapeado a
doena humana. Tal descoberta serviu para descartar este camundongo como sendo um
modelo animal para sndrome humana.
Esta constatao indica, por outro lado, que indispensvel coletarmos e mesmo
produzirmos em massa novas mutaes para suprir esta deficincia. Estatsticas feitas no
Jackson Laboratory (a Meca da gentica de camundongos) nos Estados Unidos e no
nosso laboratrio no Instituto Pasteur de Paris indica que, em torno de 60% de novas
mutaes espontneas ou induzidas, identificam um gene novo e no uma nova forma
allica de um gene j conhecido. Podemos deduzir ento, que o genoma de
camundongos est longe de estar saturado de mutaes sendo, desta forma, uma fonte
riqussima para o estudo de modelos animais para as doenas humanas.
Podemos aumentar o nmero de mutaes nos camundongos atravs da utilizao de
agentes mutagnicos qumicos ou fsicos. Os mutagnicos qumicos so mais cmodos de
que os fsicos, pois so mais baratos e fceis de serem utilizados. Entre eles o mais
conhecido e tambm o mais eficaz so o etil-nitroso-ura (ENU) (Brown S.D.M. et al.,
1998). Uma nica dose de 250mg/Kg do peso corporal, administrada via intraperitonial,
aumenta em at 102 vezes a freqncia de mutaes observadas. Com tal agente
mutagnico podemos produzir um grande nmero de alelos mutantes do mesmo locus, e
assim, estudarmos os diferentes domnios de uma mesma protena. Ns podemos
igualmente submeter uma populao de camundongos a uma forte presso mutagnica
para procurar, na descendncia, alguns fentipos que podem ser interessantes para uma
dada patologia. Este tipo de experincia foi realizado pela primeira vez por Vernon C.
Bode e colaboradores (1988) quando descobriram o modelo animal da fenilcetonria
humana (Figura 3). Tal experimento foi renovado pelos pesquisadores Alexandra
Shedlovsky e J. David McDonald (1990) que publicaram uma lista exaustiva de mutaes
pontuais induzidas nos camundongos no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) para
servir de modelo sndrome humana da fenilcetonria (PKU). Este modo de utilizao da
mutagnese muito interessante pois ela demonstra o valor dos modelos animais na
anlise dos diferentes aspectos de uma sndrome humana. Ela tambm mostra que
possvel induzir novas mutaes num mesmo locus ou em outros para proceder ao
inventrio de todos os caminhos implicados em uma doena metablica, este o caso da
fenilcetonria da qual pudemos conhecer todas as vias do metabolismo atravs deste
procedimento. Poderamos citar mais exemplos aonde a mutagnese foi utilizada na
identificao de novas mutaes que afetem um tecido ou uma funo em particular.
Podemos citar o exemplo de Jack Favor e colaboradores em Munique que isolaram mais
de 75 mutaes todas afetando o cristalino dos camundongos para provocar catarata. Ou
ento, o que foi feito pela equipe do Dr. Steve Brown na Inglaterra, aonde uma
experincia do mesmo tipo que a anterior foi realizada para saturar o genoma de
camundongos com mutaes que levam a surdez a fim de identificar os genes que esto
implicados no desenvolvimento do ouvido interno.

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

As mutaes como instrumentos para a pesquisa


Como j foi mencionadas anteriormente as mutaes permitem de identificar um gene
atravs de um fentipo patolgico ou anormal. Isto quer dizer que possvel clonar um
gene identificado unicamente por um alelo mutado do qual o fentipo , a priori,
interessante e isolar um gene cuja funo importante. Este foi o caso de Jeffrey
Friedman e colaboradores que clonaram os genes responsveis pela diabete (db) e pela
obesidade (ob) (Zhang et al., 1994) (Figura 18.4) nos camundongos e que eram
conhecidos unicamente pelos seus fentipos anormais. Utilizando os camundongos
exatamente como os geneticistas dos vegetais fizeram com Arabidopsis thaliana, como
uma fonte de genes a serem clonados, a equipe de Friedman identificou a protena
chamada leptina que est envolvida na regulao do metabolismo dos lipdeos e no
controle da satisfao alimentar. Este um dos muitos exemplos que poderamos citar
da identificao e clonagem de um gene unicamente atravs do seu fentipo patolgico.

As mutaes produzidas in vitro pela recombinao homloga nas


clulas embrionrias
O antigo sonho dos geneticistas de poderem provocar mutaes dentro de um gene
escolhido, a priori, foi realizado em decorrncia dos trabalhos realizados por Capecchi e
colaboradores (1989), estes conseguiram substituir in vitro, ou seja, dentro das clulas
embrionrias em cultura, uma seqncia de DNA normal por uma seqncia homloga
mutada. Esta tcnica, chamada de gene knock-out permite, em teoria, de inativar
qualquer gene desde que sua seqncia genmica seja conhecida. Tecnicamente
podemos inativar de maneira sistemtica todos os genes dos quais a seqncia seja
conhecida mas no a sua funo para podermos conhecer seus efeitos sobre o embrio
e/ou o adulto. Atravs deste mtodo j foi produzido muitos modelos animais de doenas
humanas. Este o caso das doenas de Tay Sachs, Werdnig Hoffmann (Amiotrofia
Espinal de Tipo I) e de muitas outras que j possuem um modelo animal obtido pelo
knock-out (Sango et al., 1995). At o presente momento esta tcnica usada
unicamente nos camundongos pois s nesta espcie que existe as clulas E.S.
(Embryonic Stem cells) e, na maior parte do tempo, elas s no permitem a produo de
um alelo nulo de um determinado gene. Atualmente novas tcnicas de inativao de
genes tm aparecido. Podemos citar o mtodo denominado cre-loxP (Gu et al., 1994)
com o qual podemos inativar um gene de forma especfica em um tecido determinado
com um tempo pr-estabelecido. Ns podemos cham-lo de inativao premeditada
espao-temporal. Esta tcnica a nica que possibilita a inativao de genes essenciais
durante o desenvolvimento embrionrio, porm ela perde sua especificidade tissular no
indivduo adulto.

A transgnese
Com o desenvolvimento muito rpido da engenharia gentica, ns podemos hoje em dia,
acrescentar um gene clonado ou um fragmento de DNA ao patrimnio gentico de um
animal de laboratrio (Palmiter et al., 1982). Desta forma criamos um animal transgnico
que adquiriu de forma estvel uma informao gentica a qual no veio pelos canais
naturais da evoluo. Esta manipulao do genoma representa o avano mais
importante da gentica moderna.
Este mtodo, ao contrrio do anterior, pode ser aplicado a todas as espcies que
possuam DNAs clonados. A tcnica consiste em injetar diretamente um fragmento de
DNA clonado e linear, dentro de um dos proncleos com a ajuda de uma micro-pipeta. A
integrao do transgene se faz, provavelmente, de forma aleatria e, quase sempre,
durante a primeira diviso mittica do ovcito. Desta forma todas as clulas portam o

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Captulo 18 - Animais de Laboratrio

transgene no genoma. As vezes a integrao no homognea e o animal que resulta


chamado de quimera, pela justa posio de clulas transgnicas e normais.
A transgnese permite o acrscimo de um gene suplementar no genoma, sendo assim,
podemos dizer que uma gentica de adio opondo-se gentica tradicional que de
substituio de alelos. Pela transgnese ns podemos aumentar o nmero de cpias de
um gene qualquer e verificar se esta modificao da dosagem tem efeitos ou no.
Podemos tambm modificar a estrutura do transgnico e mudar, por exemplo, as
seqncias reguladoras que esto, na maior parte do tempo, situadas nas extremidades
5 das seqncias codificadoras. Assim ns podemos fazer com que o transgene seja
expresso em um estado do desenvolvimento diferente do estado normal ou que ele seja
expresso em um tecido diferente. Ao combinarmos todas estas possibilidades pudemos
obter vrios modelos animais de doenas humanas. Talvez um dos mais interessantes
tenha sido o que foi feito pela equipe do Dr. Hiromichi Yonekawa que mostrou que, ao se
produzir um camundongo transgnico para o gene humano que codifica para o receptor
do vrus da poliomielite, eles o tornaram sensvel infeco viral.
A mesma coisa foi feita para o vrus da hepatite C. Podemos dizer que tais trabalhos so
muito importantes na pesquisa sobre estas duas doenas pois agora dispomos de
modelos animais. Porm, ela causa ao mesmo tempo um problema de biossegurana
gerando novas espcies de animais sensveis s infeces, em outras palavras, ela
produziu um reservatrio potencial de vrus.
Vrios camundongos transgnicos para os receptores do vrus da AIDS foram construdos
mas, at agora, ainda no dispomos de um modelo animal. O grande problema est em
termos toda a estrutura que permita ao vrus de se replicar e de se encapsular de novo.
Tambm podemos falar de animais transgnicos resultantes da regulao anormal de um
gene. Talvez o melhor exemplo ainda seja, o do animal que tem uma super produo do
hormnio de crescimento humano (HGH). O resultado deste trabalho foi a produo de
animais muito maiores que os normais e com uma srie de patologias menores.
Vrios outros modelos foram obtidos pela interrupo do controle da expresso de um
gene. Este o caso dos transgnicos construdos partir das seqncias codificadoras
das clulas oncognicas regulados por promotores no especficos. Tais animais
desenvolvem um nmero elevado e freqente de neoplasias, mas quando, ao contrrio, o
promotor histo-especfico, o cncer ocorre em tecidos especficos.
A produo de animais transgnicos talvez seja o melhor caminho para estudar os
mecanismos da oncognese pois ela no requer uma translocao cromossmica
recproca para ativar o gene oncognico em questo. O melhor exemplo para a afirmao
anterior o modelo animal da leucemia aguda humana que foi obtido pela construo
artificial do chamado cromossomo Filadlfia humano (no homem a translocao
recproca 9q34-22q11 e nos camundongos a juno do 1 exon em 5 do gene bcr aos
exons em 3 do gene c-Abelson). Infelizmente estes animais no ajudaram na elucidao
da relao de causa e efeito que existe entre a presena do cromossomo Filadlfia e o
desenvolvimento de uma leucemia aguda pois tais animais morrem ainda pequenos.

338

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Modelos transgnicos resultantes da introduo de grandes fragmentos


de DNA nas clulas germinais de camundongos
Vrias equipes de pesquisadores tm obtido sucesso na produo de animais
transgnicos com a transferncia de grandes fragmentos de DNA clonados em Yeast
Artificial Chromosome (YAC) ou Bacterial Artificial Chromosome (BAC) dentro das clulas
germinais (Jacobovits et al., 1993) ou, simplesmente, atravs da injeo no proncleo do
DNA de YAC purificado. Tais transgnicos so utilizados no estudo da compreenso dos
efeitos de uma doena da qual no conhecemos exatamente o gene responsvel mas
temos a regio cromossmica aonde ele foi mapeado.
Como exemplo, podemos citar o animal transgnico chamado olhos pequenos (Sey/+),
este carrega no seu genoma um YAC de 420 Kb que possu o gene humano PAX6.
Durante este experimento foi observado que os animais portadores deste YAC vinham
super exprimindo o gene PAX6, conseqncia da integrao mltipla deste gene, e que
apresentavam uma desorganizao nos olhos microfitlmicos. Tal resultado mostrou a
importncia que tem o nvel de expresso do gene PAX6 para este rgo.
Dois outros modelos animais de doenas humanas tambm foram conseguidos usando-se
os YACs para as doenas de Charcot-Marie-Tooth e a Sndrome de Down.
Charcot-Marie-Tooth tipo I uma doena hereditria autossmica dominante que o
resultado da duplicao de uma regio que contm o gene PMP22 (protena mielnica
perifrica-22). O YAC humano contendo, entre outras seqncias de DNA, 40 Kb do gene
PMP22 humano foi introduzido nas clulas germinais de camundongos. O resultado foi a
produo de animais que sofrem de uma dimielinizao perifrica similar, porm mais
severa, que a da doena de Charcot-Marie-Tooth do tipo I.
A Sndrome de Down ou o mongolismo uma doena humana causada pela trissomia do
cromossomo 21 e ela est associada um certo nmero de defeitos e anomalias muito
bem caracterizadas. Ns podemos dizer que tais defeitos so mais ou menos uma
conseqncia direta das expresses anormais de uma srie de genes localizados sobre o
cromossomo 21 sendo a regio 21q22.2 a mais crtica. Para tentar entender melhor e
tambm poder definir um ou mais genes responsveis por esta Sndrome, Smith e
colaboradores (1997) construram vrios animais transgnicos cada um carregando um
YAC diferente contendo 2 Mb da totalidade da regio 21q22.2. Os camundongos que
possuam dois YACs diferentes e que no se sobrepunham no mapa fsico da regio,
apresentaram dificuldades de aprendizado indicando que ao menos dois genes contidos
nesta regio cromossmica so responsveis por este problema quando presentes em
mais do que duas cpias. Um destes dois genes foi identificado: o gene homlogo ao
gene dito mini-crebro de Drosfila, responsvel pelos defeitos na aprendizagem das
moscas.
No temos dvida alguma que a tecnologia de transferncia de fragmentos de DNA de
vrios tamanhos (pequenos, grandes ou extragrandes) para o genoma de camundongos
(transgnese) ter um grande impacto na gnese de modelos animais de doenas
humanas. Entretanto ela tem seus limites. Um deles que ela funciona pela adio de
uma seqncia exgena e no pela substituio de uma informao no genoma. Isto
significa que no possvel produzir uma alterao recessiva, exceto nos raros casos
onde ocorre interrupo acidental da uma seqncia codificadora.

339

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

18.3.3. O Valor dos Modelos Animais


Vrias vezes ns destacamos que os fentipos patolgicos dos modelos animais so, na
maior parte do tempo, diferentes aos das doenas humanas. Geralmente a mesma
mutao no camundongo e no homem provoca uma patologia mais severa neste ltimo.
s vezes as diferenas so extremas como, por exemplo, no caso da falta da protena
distrofina nos camundongos que quase no tem efeito algum enquanto que no homem
a causa da distrofia muscular de Duchenne. A mutao no gene hypoxantine fosforil
transferase (HPRT) no tem efeito algum nos camundongos, enquanto que a mesma
causa uma doena terrvel chamada Lesch-Nyhan caracterizada por um retardamento
mental no homem.
Na realidade, quando analisamos esta situao ns no deveramos estar surpresos com
o resultado pois, a priori, ns no temos razo alguma de considerarmos o camundongo
ou o rato como um homem em miniatura. Robert Erickson (1989) propem trs possveis
explicaes para estas diferenas: existem (i) variaes nas vias bioqumicas do
metabolismo entre o camundongo e o homem, (ii) variaes no desenvolvimento e (iii) a
relao entre tempo absoluto e tempo fisiolgico no desenvolvimento de uma doena no
a mesma entre o homem e o animal. Para justificar a primeira hiptese podemos
retomar o caso j falado acima do modelo animal da Sndrome de Lesch-Nyhan humana.
Quanto s diferenas no desenvolvimento, podemos falar da deficincia em anidrase
carbnica (CAII) que no homem causa osteoporose, calcificaes intracraniana e
retardamento mental, enquanto que a mesma deficincia nos camundongos no tem
efeito patolgico algum.
Enfim, as pesquisas sobre os metabolismos txicos so difceis de serem realizadas com
modelos animais pois so baseadas na acumulao dos agentes txicos ao longo do
tempo de vida do indivduo, assim fica evidente que os resultados patolgicos
encontrados nos animais, se houverem, no sero os mesmos que os encontrados no
homem.
Os modelos animais por mais teis e numerosos que sejam tm seus limites. Entretanto
eles so indispensveis no estudo das doenas genticas humanas pois permitem, por
exemplo, o estudo da patologia de uma sndrome ao longo do tempo, no
desenvolvimento de terapias gnicas, na descoberta de novos genes que podem ser uma
fonte para novos medicamentos (por exemplo a descoberta do gene obese de
camundongos que codifica para a leptina. Esta protena usada atualmente no
tratamento de um tipo de obesidade humana) ou nos genes modificadores que tm
papis determinantes na gravidade de um fentipo e que constituem novos alvos para
tratamentos. Ao combinarmos as diferentes tcnicas que esto disponveis hoje em dia
para a modificao do genoma dos animais de laboratrio, os geneticistas podero em
breve obter modelos que sejam mais fidedignos s doenas humanas. Podemos acabar
dizendo que a experimentao animal, a partir de agora, mudou radicalmente.

340

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

18.3.4.

Tabela e Figuras

A tabela abaixo mostra os stios da internet mais interessantes sobre a gentica de


camundongos e os modelos animais.
Tabela 18.4 - Fontes de informaes dos modelos animais
STIOS

INTERESSE

ENDEREOS

Informaes Gerais
 Pub Md.

+++

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/

 Search OMIM.

+++

 The Jackson Labotatory.

+++

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omn/searcho
mim.html
http://www..jax.org/

 Mouse and Rat Research


Home Page.

+++

http://www.cco.caltech.edu:80/~mercer/ht
mls/rodent_page.html

 MGI - Genes, Marcadores e


Fentipos.

+++

http://www.informatics.jax.org/locus.html

 Internet Resources for


Transgenic and Targeted
Muation Research.

+++

http://brut.gdb.org/Dan/tbase/docs/databa
ses.html

+++

http://www.angis.su.oz.au/Databases/BIRX
/omia/

+++

http://www.informatics.jax.org/locus.htlm

 MRC Mammalian Genetics


Unit - ENU UK - Programa de
Mutagnese nos
camundongos.

+++

http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/

 The Institute of Mammalian


Genetics - R. Balling Programa de Mutagnese
nos camundongos.

+++

http://www.gsf.de/isg/

 Lexicon Genetics, Inc Produo de modelos por


encomenda.

+++

http://www.lexgen.com/

 ILAR Home.

+++

http://www2.nas.edu/ilarhome/

 The Jackson Laboratory


Resources.

+++

http://www.jax.org/resources/documents/

Informaes de todas as
espcies animais
 OMIA.
Gentica
 Camundongo.
Criao de Modelos

Disponibilidade de Modelos

341

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Figura 18.1 - Mutao alcaptonria (aku)

A urina dos animais doentes torna-se escura aps o contato com o ar o que a oxidao.
Na foto o animal afetado est esquerda e na direita o normal

Figura 18.2 - Mutaao pmn

A fraqueza muscular dos animais pmn ( direita na foto) se caracteriza pela incapacidade
de esticar as patas posteriores quando erguemos os camundongos pelo rabo.

342

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

Figura 18.3 - Mutao fenilcetonria

Os camundongos pertencem a mesma linhagem (BTRB). A despigmentao vista no


animal de cor marrom um componente da sndrome da fenilcetonria.

Figura 18.4 - Mutao obeso (ob)

A massa corporal do animal obeso ( esquerda na foto) muito maior que a do animal
normal ( direita na foto)

343

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

1188..44.. B
A
AFFIIA
RA
GR
OG
BIIBBLLIIO
 BODE, V. C.; MCDONALD, J. D.; GUNET, J. L. & SIMON, D. A mouse mutant with
hereditary
hyperphenylalaninemia
induced
by
ethyl-nitroso-urea
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344

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

 SANGO, K.; YAMANAKA, S.; HOFFMANN, A.; OKUDA, Y.; GRINBERG, A.; WESTPHAL,
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differ in neurologic phenotype and glanglioside metabolism. Nature Genet. 11:
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345

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 18 - Animais de Laboratrio

346

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19. A
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maaiiss G
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Trraannssggnniiccooss)) ee aa L
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Luciana de Andra Ribeiro
Vasco Azevedo

1199..11.. IINNTTRRO
O
O

U
DU
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Durante sculos, produtores rurais vem praticando seleo artificial em vrias raas e
linhagens de animais domsticos, objetivando aumentar a freqncia de genes que
permitam a expresso de caractersticas economicamente relevantes. No entanto,
quando o objetivo a obteno de mudanas mais drsticas no potencial gentico, como
mudana da base alimentar (pasto x gros) ou nos requerimentos de mercado (reduo
de gordura), os produtores tm lanado mo de estratgias de substituio de raas ou
cruzamentos, transferindo genes de uma populao para outra, dentro de uma mesma
espcie (Cundiff et al., 1993). Na dcada passada, foram desenvolvidas tcnicas para
transferir genes especficos, com efeitos desejveis, no somente de uma raa para
outra, mas de uma espcie para outra (Pursel & Rexroad, 1993).
O desenvolvimento de tcnicas de introduo de genes em clulas somticas e
germinativas de animais domsticos e de laboratrio foi um dos principais avanos
tecnolgicos ocorridos nas ltimas duas dcadas. Animais geneticamente manipulados
tm fornecido novos modelos de estudos da regulao gnica, da ao de oncogenes e
das interaes celulares envolvidas no sistema imune. Alm disto, a tecnologia de
transgnese animal possibilita a gerao de modelos animais precisos para estudo de
doenas genticas humanas e a produo, em larga escala, de protenas recombinantes
de interesse farmacolgico humano (Jaenisch, 1988; Pursel & Rexroad, 1993 e Wall,
1996). Duas outras utilizaes de animais transgnicos, para um futuro prximo, a
produo de animais transgnicos (freqentemente sunos), que sejam imunes
rejeio, servindo como doadores de rgos para transplante em humanos
(xenotransplante) (Lanza et al., 1997) e para a produo de alimentos, esta ultima
permanece pouco explorada. Isto decorre devido ao reduzido nmero de genes de
interesse para a agropecuria que j tenham sido identificados, isolados, seqenciados e
clonados (Pursel & Rexroad, 1993).
Animais transgnicos podem ser definidos como aqueles que contm molculas de DNA
exgeno, introduzidas por interveno humana intencional, objetivando a expresso de
novas caractersticas (Wall, 1996). Por analogia, o gene transferido denomina-se
transgene (Pursel & Rexroad, 1993). Entretanto, a integrao por si s no garante a
expresso do transgene, e, uma outra definio seria, aquele animal que expressa o
transgene e que quando acasalado com animais normais, produz prognies que herdaro
este gene de forma mendeliana, devido a incorporao do transgene nas clulas
germinativas (Gordon & Ruddle, 1981).

347

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

O primeiro experimento com transgnese animal foi realizado com clulas da linhagem
germinativa de camundongos em 1974. O genoma inteiro do vrus Simian foi
microinjetado na cavidade blastoclica de embries em estdio inicial do
desenvolvimento (Jaenisch & Mintz, 1974). Entretanto, a integrao de DNA viral s foi
detectada, em estudos subseqentes, quando embries de camundongos foram
microinjetados com o retrovrus da leucemia de Moloney, gerando a primeira linhagem
de camundongos transgnicos (Jaenisch, 1977). A partir dessa data, vrios protocolos
tem sido desenvolvidos, buscando-se alterar o gentipo de animais de maneira estvel.
A expresso do DNA exgeno, por sua vez, foi obtida tambm em camundongos, no
incio da dcada de 80 (Gordon & Ruddle, 1981; Palmiter et al., 1982, 1983).
Camundongos gigantes, gerados a partir da introduo do transgene (gene do hormnio
do crescimento humano sob o controle do promotor do gene da metalotionena de
camundongos) em embries de uma nica clula, demonstraram que a integrao foi
estvel e a expresso foi correta nos tecidos do animal adulto (Palmiter et al., 1983).
Estes resultados incentivaram a aplicao das tcnicas de transgnese, visando aumentar
a taxa de crescimento em animais domsticos.Coelhos, ovelhas e porcos transgnicos
foram obtidos, em meados da dcada de 80 (Hammer et al., 1985) e bovinos e caprinos,
no incio dos anos 90 (Pursel & Rexroad, 1993). Entretanto, a eficincia de transformao
obtida foi menor do que em camundongos.

1199..22.. T
E
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GE
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TCCNNIICCAASS DDEE T
Vrias tcnicas tm sido utilizadas para a introduo de genes em clulas germinativas e
em clulas somticas, de vrias espcies animais. Para a produo de animais
domsticos transgnicos as tcnicas mais utilizadas so:
 microinjeo de DNA em proncleo;
 infeco por retrovrus;
 clulas embrionrias indiferenciadas (embryonic stem cells);
 espermatozides como vetores;
 biolstica.
Dependendo da tcnica utilizada, o animal produzido pode constituir-se somente de
clulas que carregam o transgene (so os denominados animais transgnicos), ou de
conjuntos de clulas com ou sem o transgene (animais quimricos ou mosicos). Os
animais quimricos so constitudos de clulas de origens distintas, enquanto que, os
mosaicos so constitudos de clulas derivadas de um nico blastocisto original. As
tcnicas que envolvem a introduo de clulas transformadas em um embrio receptor
(por exemplo, a transfeco de clulas embrionrias indiferenciadas e, posterior,
introduo destas clulas em embries em estdio de blastocisto) daro origem a
animais quimricos. Por outro lado, tcnicas que transfectam diretamente as clulas do
animal a ser transformado, produziro animais mosaicos. Nas duas situaes, os animais
transgnicos s sero obtidos, aps o cruzamento de indivduos heterozigotos F1 com
animais normais (Notarianni & Evans, 1992).

348

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19.2.1.

Microinjeo de DNA em Proncleo

Esta tcnica consiste na microinjeo de genes, diretamente, no proncleo de um ovo


recm fertilizado (Gordon et al., 1980). Geralmente, mltiplas molculas de DNA em
tandem integram-se estavelmente no genoma do hospedeiro, em um nico stio de
insero (Jaenisch, 1988). Entretanto, nem sempre isto ocorre, por exemplo, Lacey et al.
(1986) observaram que o vrus do papiloma de bovinos ou integrava-se, estavelmente,
ao genoma de camundongos transgnicos ou mantinha-se como um epissomo,
dependendo da estrutura do DNA injetado.
A maior vantagem deste procedimento a eficincia em gerar linhas transgnicas que
expressem o transgene de maneira correta. Entretanto, esta tcnica limitada, no
podendo ser utilizada em embries, em estdio mais avanado do desenvolvimento
(Gordon, 1989). Outras limitaes desta tcnica so: rearranjos causados no genoma da
clula microinjetada e introduo de vrias cpias do transgene, originando animais com
expresso varivel do transgene (Gordon & Ruddle, 1981; Mahon et al., 1988). Em
animais domsticos, a proporo de indivduos transgnicos, que se desenvolveram a
partir de um ovo microinjetado, menor do que aquela observada em camundongos.
Isto ocorre devido a alguns fatores, tais como: difcil visualizao dos proncleos,
disponibilidade de ovos recm fertilizados, sincronismo dos animais receptores e
doadores, idade do animal doador e nmero de ovos transferidos, entre outros (Martin &
Pinkert, 1994).
A porcentagem de embries injetados que desenvolveram-se em animais transgnicos
varia de 1 a 3% em caprinos (Gavin, 1997), 0,3 a 4,0% em sunos (Pursel, 1997); 0,1 a
4,4% em ovinos e 0,7 a 3,2% em bovinos (Gagn et al., 1997).
Em aves, a microinjeo diretamente no proncleo no utilizada, pois os proncleos
feminino e masculino so mascarados pelo citoplasma opaco e, tambm, difcil
distinguir o proncleo masculino, que ir contribuir para a formao do zigoto, devido a
presena de proncleos masculinos supranumerrios. No sendo possvel injetar DNA,
dentro do proncleo, injeta-se, ento, no citoplasma prximo aos proncleos (Ginsburg &
Eyal-Giladi, 1987). A expresso de DNA exgeno, injetado no citoplasma de ovos
fecundados, foi verificada por Naito et al. (1991) e Sang & Perry (1989). Os genes
injetados mostraram-se, todavia, epissomais e perderam-se, gradativamente. A
produo de galinhas transgnicas, por microinjeo de DNA, no disco germinal de
zigotos e posterior cultura, ex vivo, do embrio at a ecloso, foi obtida, logo a seguir,
por Love et al. (1994) e Naito et al. (1994). Estes trabalhos demonstraram transmisso
estvel do DNA exgeno para a prognie, mas com baixa eficincia (menos de 1% dos
embries injetados apresentaram o DNA exgeno).
Para aumentar a taxa de transgenese em espcies superiores, muitas tcnicas tem sido
desenvolvidas visando melhorar a integrao dos transgenes, tais como:
bombardeamento de partculas (Ribeiro et al., 1999; Zelenin et al., 1997), insero por
retrovirus (Kim et al., 1993), espermatozides como vetores (Gagn et al., 1991) e
clulas embrionrias indiferenciadas (Cherny et al., 1994). Cada tcnica tem suas
vantagens em comparao com a microinjeo pronuclear, no entanto, nenhum mtodo
tem demonstrado sua habilidade em produzir bovinos transgnicos (Menck et al. 1998).

349

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19.2.2.

Infeco por Retrovrus

Genes exogenos podem ser inseridos no genoma de retrovrus e, estes podem ser,
ento, utilizados como vetores de DNA. Ao contrrio da tcnica de microinjeo de DNA
em proncleos, os retrovrus integram o gene exgeno, por um mecanismo precisamente
definido, no genoma da clula hospedeira. Somente uma cpia do vrus inserida em
determinado stio do cromossomo e nenhum rearranjo no genoma induzido, exceto
para uma pequena duplicao de uma seqncia do genoma no stio de integrao
(Jaenisch, 1988; Menck, 1998). A infeco por retrovrus pode ocorrer por exposio das
clulas a alta concentrao do vrus, por co-cultura em monocamada de clulas
infectadas com o retrovrus ou, no caso de aves, pela microinjeo do retrovrus
diretamente no blastodisco (Pursel & Rexroad, 1993).
A principal vantagem do uso de vetores retrovirais, para transferir genes em animais, a
facilidade de se introduzirem vrus em embries em vrios estdios do desenvolvimento.
No entanto, o tamanho do DNA a ser introduzido limitado (menos de 6 Kb) e,
geralmente, pode apresentar problemas de expresso do gene, devido alta
instabilidade de tais vetores. Outras desvantagens desta tcnica so: difcil manipulao
dos retrovrus; o animal resultante um mosaico, sendo necessrios, portanto,
cruzamentos, para a obteno de uma linhagem transgnica pura e a eficincia de
transformao das clulas germinativas baixa (Jaenisch, 1988; Pursel & Rexroad,
1993).
Em aves, a transferncia de genes para linhagens germinativas tem sido obtida por
infeco de retrovrus replicao-defectiva ou replicao-competente em embries, logo
aps a postura dos ovos (Bosselman et al., 1989; Briskin et al., 1991; Hughes et al.,
1986; Salter & Crittenden, 1989; Salter et al., 1987, 1993 e Shuman & Shoffner, 1986),
em vulos no fecundados (Shuman & Shoffner, 1986) ou em clulas germinativas
primordiais (Vick et al., 1993). Embora tais vetores retrovirais sejam apontados como a
melhor tcnica para a produo de galinhas transgnicas, ocorrem algumas
desvantagens. Primeira: a proporo de embries, oriundos de ovos infectados com
vrus, que transmitem o DNA exgeno para as suas prognies relativamente baixa.
Segunda: centenas ou milhares de ovos devem ser inoculados e um nmero similar de
prognies deve ser examinado, quanto presena do transgene, para identificar uma
galinha transgnica. Terceira: vrus replicao-competente provocam viremia crnica,
enquanto que vrus replicao-deficiente so difceis de se propagarem eficientemente.
Quarta: o tamanho do gene a ser introduzido, no vetor retroviral, limitado para cerca
de 2 kb para vrus replicao-competente e cerca de 6 kb para vrus replicaodeficiente. Vetores retrovirais, no entanto, permanecem muito atrativos, pois integram
somente uma cpia do DNA exgeno no genoma da clula infectada (Etches, 1996).
Alguns dos problemas associados com a infeco por retrovrus j foram eliminados com
a utilizao da tcnica denominada virofeco. Esta, consiste na co-transfeco de dois
plasmdeos, um dos quais possui somente o DNA exgeno e o outro, os genes que
codificam para as protenas necessrias para a replicao e integrao do vetor. Neste
sistema, no so produzidas molculas de RNA do vrus e, portanto, no h a formao
de novas partculas virais (Flamant et al., 1994). Este procedimento mostrou um grande
potencial para a introduo de modificaes genticas em clulas da blastoderme de
embries de galinha, sem a produo de vrus infecciosos (Flamant et al., 1994).

350

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19.2.3.

Clulas Embrionrias Indiferenciadas (Embryonic Stem Cells ES)

Concomitantemente com o desenvolvimento das tcnicas de microinjeo e infeco por


retrovrus, foram realizados estudos para estabelecer linhagens celulares, que pudessem
participar da formao de animais quimricos, colonizando as clulas germinativas. As
clulas embrionrias indiferenciadas (ES) so estabelecidas in vitro, a partir do cultivo de
clulas oriundas do boto embrionrio de embries em estdio de blastocisto. Estas
clulas mantm sua caracterstica de pluripotncia e conservam seu caritipo normal,
quando em cultura (Wagner et al., 1985). Genes podem ser eficientemente introduzidos
nestas clulas por transferncia direta de DNA ou por meio de retrovrus (Jaenisch,
1988). Quando injetadas em um blastocisto hospedeiro, as clulas ES transformadas
podem colonizar o embrio e contribuir para a formao da linhagem germinativa,
originando um animal quimrico para o gene exgeno (Robertson et al., 1986). A
possibilidade de seleo prvia, in vitro, de um gentipo particular, antes da introduo
das clulas no embrio, constitui o maior benefcio desta tcnica. Ademais, este mtodo
permite insero stio-especfica do transgene, por meio de recombinao homloga
(Capecchi, 1989). No entanto, a grande desvantagem para a produo de animais
transgnicos, que no se pode prever o destino das clulas ES e, estas podem no
originar as clulas germinativas. Outro fator importante, que os animais produzidos so
quimricos e, como no caso da infeco por retrovrus, so necessrios cruzamentos para
a obteno de uma linhagem transgnica pura (Gordon, 1989; Pursel & Rexroad, 1993).
Em animais domsticos, clulas ES foram desenvolvidas em bovinos (Niemann, 1998),
sunos e ovinos (Notarianni et al., 1991), no entanto, nenhuma destas clulas
contriburam para a formao da linhagem germinativa. Em porcos, quimeras foram
gerados atravs da injeo de clulas ES ou clulas germinativas primordiais (PGC =
progenitores de oocitos e espermatozoides). Bovinos quimricos tambm foram obtidos
com clulas ES, no entanto, nenhuma clula germinativa continha o transgene.
Camundongos so, ainda, os nicos animais transgnicos derivados de clulas
embrionrias indiferenciadas (Donovan et al., 1997).

19.2.4.

Espermatozides como Vetores

Espermatozides podem ser utilizados, como vetores, para a introduo de genes


exgenos no ncleo de ovcitos, no momento da fecundao. Camundongos e sunos
transgnicos foram produzidos, a partir da incubao dos espermatozides, em um meio
contendo o DNA exgeno, e com a subsequente utilizao destes espermatozides para a
fecundao in vitro (Lavitrano et al., 1989) ou inseminao no oviduto (Lauria &
Gandolfi, 1993). Trabalhos adicionais demonstraram a presena de genes exgenos em
embries, feto e animais adultos de coelho (Rottmann et al., 1996), bovinos (Gagn et
al., 1991; Rottmann et al., 1996; Sperandio et al., 1996), sunos (Sperandio et al., 1996)
e galinhas (Nakanishi & Iritani, 1993; Rottmann et al., 1992; Squires & Drake, 1993). No
entanto, a integrao estvel dos genes exgenos no genoma de animais adultos um
evento raro e a eficincia de produo de animais transgnicos baixa (Pursel &
Rexroad, 1993; Squires & Drake, 1993). Evidncias sugerem que mudanas na molcula
de DNA ocorrem principalmente dentro dos oocitos, representando um passo limitante na
produo de animais transgnicos, utilizando espermatozides como vetores de DNA
(Gandolfi, 1998).

351

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19.2.5.

Biolstica

A biolstica um mtodo fsico para a introduo de cidos nuclicos e outras substncias


no interior de clulas e tecidos intactos, pela acelerao de micropartculas de metal a
alta velocidade. Este processo tem sido descrito de diferentes formas e denominado de
vrias maneiras: bombardeamento de partculas, bombardeamento de micropartculas,
acelerao de partculas, biobalstica, gene gun, entre outros. Os inventores deste
processo, para uniformizar os diferentes termos e aparatos associados ao disparo de
materiais biolgicos no interior de clulas-alvos, denominaram-no biolstica (Sanford et
al., 1993).
O processo biolstico, inventado em 1984, por E. D. Wolf, N. K. Allen e J. C. Sanford, foi
originalmente desenvolvido para introduzir genes exgenos, no genoma nuclear de
plantas superiores (Klein et al., 1987). Comparada com outras tcnicas de
transformao, a biolstica pode ser considerada como o sistema que demonstra a menor
especificidade quanto uso de gentipos, permitindo trabalhar com espcies antes
julgadas de difcil transformao. Apresenta ainda outras vantagens como:
bombardeamento simultneo de muitas clulas, liberao de altas doses de DNA, cotransformao com dois ou mais plasmdeos, independncia quanto ao uso de protocolos
especficos de cultura de tecidos e relativa praticabilidade e eficincia da tcnica (Klein et
al., 1992; Sanford et al., 1993).
H muitas formas de acelerao de partculas microscpicas a velocidade altas, como
exigido pelo processo biolstico. Dos vrios mtodos de acelerao, o que tem-se
mostrado mais eficiente o de acelerao de micropartculas na superfcie de um
carreador macroscpico ou macrocarreador. O macrocarreador, em todos os mtodos,
impulsionado por uma onda de choque. Esta onda pode resultar de: exploso qumica,
exploso eltrica de uma gota d'gua, descarga de ar comprimido e choque de gs hlio
ou de nitrognio, gerado pelo mecanismo de ruptura de membrana. O macrocarreador
pode ser qualquer objeto pequeno, cuja superfcie frontal possa carregar micropartculas
e, cuja superfcie oposta apresente integridade coesiva bastante, para absorver a energia
da onda de choque e suportar acelerao sbita seguida de desacelerao abrupta
(Sanford et al., 1993).
O primeiro equipamento desenvolvido utilizava plvora para acelerar as micropartculas
de metal. Estas micropartculas, cobertas de DNA, so colocadas em um macrocarreador
de nilon, que acelerado, dentro de um tubo, pela exploso da plvora, at atingir um
anteparo de impacto. Somente as micropartculas continuam sua trajetria, por uma
pequena abertura no anteparo, at atingirem o tecido-alvo (Klein et al., 1987). Todo esse
processo ocorre, dentro de uma cmara, sob vcuo parcial. Este modelo bsico no
permite o controle da velocidade das partculas e, devido s variaes na quantidade de
plvora, que acelera o macrocarreador, apresenta alto grau de variabilidade em cada
bombardeamento. Este sistema causa tambm dano aprecivel ao tecido-alvo, devido
principalmente onda de choque e ao choque acstico. O uso de peneiras, entre o
anteparo de impacto e o tecido, minimiza o dano s clulas e melhora o perfil de
distribuio das partculas (Russel et al., 1992).
Sanford et al. (1991) desenvolveram um sistema de bombardeamento, onde uma
presso controlada de gs hlio acelera uma membrana de plstico carregada de
partculas (membrana carreadora). Aps percorrer curta distncia, a membrana
carreadora desacelerada, pelo impacto em uma tela fixa (tela de reteno) e somente
as partculas continuam o seu percurso, at atingirem o explante-alvo, sob vcuo parcial.
A presso controlada por um disco de ruptura, que pode apresentar diferentes
espessuras, de acordo com a presso desejada. A distncia, entre o disco de ruptura e a

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

membrana carreadora, pode ser modificada, permitindo variar a velocidade das


partculas, conforme o tipo de tecido-alvo a ser utilizado.
O primeiro trabalho de transferncia de genes em animais, utilizando a biolstica, surgiu
em 1989, onde uma linhagem de clulas de camundongos foi transformada com o gene
neo, que confere resistncia ao antibitico geneticina (Zelenin et al., 1989). Desde ento,
a biolstica tem sido utilizada para a transformao de clulas em cultura, de rgos
isolados e de tecidos de animais vivos (Johnston et al., 1991; Yang et al., 1990 e Zelenin
et al., 1991). As aplicaes potenciais desta tcnica so: anlise da expresso de genes e
promotores tecidos-especficos, terapia e imunizao genticas e, produo de clulas e
animais transgnicos (Klein & Fitzpatrick-McElligott, 1993).
A utilizao da biolstica para a produo de animais transgnicos foi demonstrada por Li
et al. (1995), onde clulas germinativas primordiais de embries de galinhas foram
bombardeadas com os genes neo e o da ovalbumina. Foi detectada a presena dos genes
exgenos nos espermatozides dos frangos nascidos. Estes foram cruzados com galinhas
normais e, dos 45 indivduos G1 nascidos, 10 apresentavam o transgene (22%). Na
maioria dos casos, o DNA exgeno desapareceu da prole G1, quando seus indivduos
alcanaram a maturidade sexual, sugerindo que, nestes casos, no houve integrao e a
transmisso do transgene foi epissomal. Dois outros trabalhos demonstraram a aplicao
da biolistica em embries de galinha dentro do prprio ovo (Muramatsu et al., 1997;
Ribeiro et al., 1999).

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As tcnicas de transgnese em animais foram desenvolvidas e otimizadas, visando
basicamente quatro principais linhas de pesquisa:
 o estudo da regulao e expresso gnica;
 a utilizao de animais transgnicos como biorreatores;
 a gerao de modelos animais para estudos biomdicos;
 a introduo de novas caractersticas genticas importantes economicamente.

19.3.1.

Estudo da Regulao e Expresso Gnica

Animais transgnicos tm sido amplamente utilizados para a elucidao dos mecanismos


moleculares que controlam a expresso e a regulao de diversos genes, durante o
desenvolvimento fetal e tecidos adultos. Por exemplo, elementos regulatorios dentro de
introns foram descobertos utilizando-se tcnicas de transgenese em animais (Brinster et
al., 1988; Palmiter et al., 1991); promotores, enhancers (amplificadores) e elementos
silenciadores de vrios genes tm sido identificados e caracterizados e; uma variedade
de promotores que controlam a expresso de genes tecido-especificos (por exemplo, em
rim, fgado, crebro, sangue e glndula mamaria) so, atualmente, utilizados para
direcionar a sntese de protenas em um tecido de interesse (Dziadek, 1996). Outra
grande aplicao da transgenia animal encontra-se na rea de biologia do
desenvolvimento, onde tem sido possvel estudar e construir mapas detalhados de genes
envolvidos no desenvolvimento embrionrio de uma variedade de espcies (Babinet,
1997).

353

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

19.3.2.

Utilizao de Animais Transgnicos como Biorreatores

A possibilidade de animais transgnicos expressarem protenas em determinados rgos,


utilizando-se promotores tecido-especificos, torna-os viveis como biorreatores de
protenas de importncia biomedica (Khillan, 1997). Animais domsticos podem servir
como biofbricas para a produo em larga escala de protenas expressas no sangue ou
no leite. O isolamento de protenas expressas nos fluidos (sangue e leite) tem vantagem
sobre os tecidos, pois os fluidos so constantemente produzidos e as protenas so fceis
de recuperar.
Swanson et al. (1992) produziram porcos transgnicos para o gene da -globina humana
sob o controle do promotor do gene da -globina de sunos e, estes expressaram de
moderado a altos niveis da -globina humano no sangue. Entretanto, a expresso de
protenas recombinantes circulantes no sangue mostrou-se prejudicial para a sade do
animal. Desta forma, glndulas mamarias passaram a ser utilizadas, devido a algumas
vantagens como: as protenas do leite no circulam no corpo do animal, o leite poder ser
coletado em grandes quantidades e protenas como -casena e -lactoglobulina so
expressas abundante e exclusivamente na glndula mamaria (Khillan, 1997). Assim,
protenas heterologas podem ser expressas nas glndulas mamarias, clonando-as em
vetores que contenham promotores e elementos regulatorios de genes que codificam
para protenas do leite, como a -casena e a -lactoglobulina (Wilmut et al., 1991).
Diversos trabalhos com ovinos, caprinos e sunos transgnicos tm sido realizados,
utilizando-os como biorreatores de protenas expressas no leite. Por exemplo, o fator IX
do coagulo de sangue humano (Clark et al., 1989) e 1 antitripisina (Wright & Colman,
1997) foram produzidos no leite de ovelhas transgnicas; o ativador de plasminogeno
humano ativo biologicamente, no leite de cabras transgnicas (Ebert et al., 1991); e a
protena C com atividade anticoagulante e a hemoglobina humana, no leite de sunos
transgnicos (Sharma et al., 1994 Velander et al., 1992). No entanto, os nveis de
produo destas proteinas foram geralmente muito baixos e variveis. Desta forma,
pesquisas adicionais, para compreender os mecanismos responsveis pelas variaes na
produo de protenas recombinantes so necessrias, antes de utilizar animais
transgnicos como biorreatores na industria biotecnologica (Clark et al., 1998; Khillan,
1997).

19.3.3.

Gerao de Modelos Animais para Estudos Biomdicos

Animais transgnicos tambm podem ser utilizados para estudar o mecanismo molecular
que contribui para a patologia de doenas humanas, assim como, para testar agentes
teraputicos que ou evitem o inicio da doena, ou diminua seu progresso ou reduza os
sintomas. Camundongos tem sido mais freqentemente utilizados como modelo animal
para um grande numero de doenas humanas, entre elas: fibrose cstica, arteriosclerose,
osteogenese imperfeita, -talassemia, obesidade, AIDS entre outras (Lowell, 1997;
McLachlan & Porteous, 1997; Miller & Rubin, 1997; Dziadek, 1996).
A transgenia em animais tambm tem sido aplicada na pesquisa de cncer. Uma
variedade de oncogenes de origem viril e celular tem sido identificados como causadores
de cncer em camundongos transgnicos (Clarke, 1994). Animais transgnicos, portanto,
tem se mostrado uma fonte alternativa para a elucidao da influncia da gentica,
fisiologia e ambiente no desenvolvimento do cncer (Kemp, 1997).

354

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Uma outra aplicao, dentro da rea de pesquisas aplicadas sade humana, a


utilizao de animais transgnicos doadores de rgos, que expressem fatores de
inibio rejeio. Camundongos e sunos transgnicos tem sido engenheirados para
expressarem altos nveis de fatores de inibio, na superfcie do endotelio de vasos e
capilares sangneos (Fodor et al., 1994) e, no caso de sunos, servirem como doadores
de rgos para humanos (xenotransplante) (Platt & Logan, 1997).

19.3.4.

Introduo de Novas Caractersticas Genticas Importantes


Economicamente

O objetivo nesta rea a produo de animais transgnicos que apresentem


caractersticas de importncia comercial, tais como: maior eficincia na converso
alimentar, maior quantidade de protena na carne, maior taxa de crescimento corporal,
maior produo de carcaa e resistncia doenas (Dziadek, 1996).
Os primeiros experimentos, visando o aumento da taxa de crescimento corporal, foram
realizados em sunos (Pursel et al, 1989). Sunos transgnicos foram obtidos para os
genes do hormnio do crescimento de bovino (GH) e o do fator liberador do hormnio do
crescimento (GHRF). No entanto, efeitos negativos foram observados nestes animais
como: reduzida performance reprodutiva, artrite, ulcera gstrica, dermatite, doenas
renais e morte prematura (Pursel et al., 1989). Estudos posteriores foram realizados em
porcos, ovelhas, gado e peixes transgnicos, utilizando o gene do hormnio do
crescimento. No entanto, todos os trabalhos mostraram um limite na manipulao
fisiolgica destes animais, j previamente selecionados para alta produo. Nenhum dos
animais tiveram um aumento significativo no peso corporal, mesmo tendo sido
encontrado altos nveis do hormnio do crescimento circulante (nas ovelhas alcanando
3000 ng/ml no sangue). Apesar do grande interesse em produzir animais com maior taxa
de crescimento corporal e rendimento de carcaa, existem somente poucos trabalhos
sobre a regulao do crescimento de animais pela manipulao do hormnio do
crescimento (Ward, 1997).
Outra estratgia potencial para o uso da transgenia em animais a possibilidade de se
alterar a composio do leite, aumentando, por exemplo, a quantidade de protenas
como a -casena. Modificaes significativas na composio do leite foram obtidas
principalmente camundongos, onde grande quantidade de protenas heterologas foram
expressas no leite. Entretanto, muitos estudos ainda so necessrios antes de utilizar
animais domsticos transgnicos produzindo diferentes tipos de leite (Mercier & Vilotte,
1997).
Animais transgnicos tambm tm sido gerados, visando a modificao da estrutura de
fibras txteis, tais como l e cashmere. O crescimento da l depende do nvel de cistena,
um aminocido que no normalmente sintetizado por clulas animais mas que pode ser
obtido na dieta alimentar. Ward et al. (1994) transformaram camundongos com dois
genes de bactrias, codificadores de protenas importantes envolvidas na biossintese da
cisteina, e observaram a expresso destas protenas no trato intestinal. Mtodos
similares foram tentados em ovinos, mas nenhum animal transgnico que expressasse
estas enzimas no intestino foi produzido (Dziadek, 1996). Damak et al. (1996), utilizando
o gene do fator de crescimento como insulina 1 (IGF1), com o objetivo de afetar o
metabolismo folicular e, portanto, a produo de l, produziram ovelhas transgnicas. Os
resultados mostraram um aumento de 6% na produo de l nos animais transgnicos e
nenhuma modificao das caractersticas da fibra. Este foi o primeiro trabalho
aumentando uma caracterstica de produo, por engenharia gentica, sem efeitos
detrimentais na sade ou reproduo.

355

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Por fim, uma outra aplicao das tcnicas de transgenese a produo de animais
transgnicos resistentes doenas. O custo com doenas tem sido estimado em cerca de
10 a 20% dos custos de produo total (Muller et al. 1997). Historicamente, o controle
ou a eliminao de agentes infecciosos em animais domsticos depende do uso de
vacinas e drogas, perodo de quarentena e erradicao. Mtodos utilizando transferncia
de genes tem se tornado atrativo, visto que programas de melhoramento convencional
atravs de seleo tm muitos problemas e so mais demorados. Estratgias de
imunizao baseada na transferncia de DNA tm por objetivo expressar, estavelmente
ou transitoriamente, componentes que forneam ou influenciem o mecanismo de defesa
do hospedeiro contra patogenos infecciosos (Muller et al. 1997).
Diferentes genes, que conferem resistncia a doenas genticas, j foram identificados e
clonados (Crittenden & Salter, 1990). O gene Mx1 de camundongos, por exemplo, que
confere resistncia seletiva ao vrus da influenza, tem sido utilizado em homens, bovinos,
sunos e ratos (Mller & Brem, 1991). A protena Mx1 inibe o acumulo de RNAm do vrus
e, portanto, animais transgnicos portadores deste gene so resistentes influenza. Este
tipo de translnea denominada imunizao intracelular (Meie & Arnheiter, 1997).
Uma outra alternativa, dentro de tcnicas de resistncia a doenas, a utilizao de RNA
antisense. Esta tcnica envolvendo animais transgnicos limitada (Han & Wagner,
1997). O principio desta tcnica consiste na hibridizao do RNA antisense com o RNAm
complementar alvo, inibindo a produo de produtos gnicos detrimentais (Han &
Wagner, 1997). O RNA antisense pode atuar de varias maneiras: 1) impedindo o
processamento do RNAm; 2) aumentando a sensibilidade do RNAm dsRNA
ribonuclease; 3) bloqueando a traduo do RNAm no ribossomo; 4) inibindo a exportao
de RNAm do nucleo; 5) modificando uma nica base do RNAm. O primeiro estudo
utilizando RNA antisense foi realizado em camundongos, visando a inibio da replicao
do vrus da leucemia (Han et al., 1991). Os resultados mostraram que todos os
camundongos transgnicos que expressaram RNA antisense no apresentaram os
sintomas da leucemia, enquanto nos camundongos controles, alguns morreram e outros
apresentaram diferentes estgios da doena. Outro estudo foi realizado em coelhos
contra o adenovirus h5 (Ah5), mas esta tcnica ainda limitada em animais domsticos
detrimentais (Han & Wagner, 1997).

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Os recentes avanos biotecnologicos que nos permitiu de criar animais geneticamente
modificados geraram a necessidade da elaborao de leis regulatrias sobre a produo
de animais transgnicos. Os riscos potenciais para o ambiente devem ser levados em
considerao. No caso dos animais domsticos existe um consenso que as modificaes
feitas pela transgene so de baixo risco, entretanto para os outros animais, o risco
ecolgico potencial tem que ser avaliado. Os organismos governamentais devem estar
implicados tanto na criao dos mecanismos de regulao, quanto os das suas
aplicaes.
Em 20 de dezembro de 1995, o governo brasileiro, atravs do decreto N 1.752
regulamentou a lei N 8.974 que estabelece normas de segurana e mecanismos de
fiscalizao para o uso das tcnicas de engenharia gentica na construo, cultivo,
manipulao, transporte e liberao no meio ambiente de Organismos Geneticamente
Modificados (OGM) com o objetivo de proteger a vida e a sade do homem, dos animais
e das plantas, bem como o meio ambiente. Alm de criar a Comisso Tcnica Nacional de
Biossegurana (CTNBio) e dispor sobre sua vinculao, competncia e composio.

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Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Todos os textos legais referentes a biossegurana no Brasil tais como leis e decretos
federais, resolues ministeriais, alm das instrues normativas estabelecidas pela
CTNBio
esto
reunidos
na
site
desta
comisso
(http://www.mct.gov.br/ctnbiotec/Default.htm).
A CTNBio estabeleceu duas instrues normativas (N 12 e 13) com normas e apndices
para trabalho em conteno e importao com Animais Geneticamente Modificados
(AnGMs) que transcrevemos abaixo1:
Estas instrues normativas so satisfatrias neste momento, entretanto a CTNBio se
reserva o direito de propor modificaes ou a criao de novas instrues caso o trabalho
com AnGMs apresente riscos particulares ou no tenha sido previsto pelo conhecimento
cientifico atual. Para a liberao planejada no meio ambiente de Organismos
Geneticamente Modificados existe uma Instruo Normativa (N 3) e de como proceder a
caso acontea liberao acidental.. No entanto no Brasil, os trabalhos com AnGMs so
feitos em regime de conteno e at o momento no foi pedida autorizao para
liberao no meio ambiente ou relatado algum acidente.

19.4.1.

Instruo Normativa N 12

Instruo Normativa N 12, publicada no Dirio Oficial da Unio - DOU - N 100-E, de 28


de maio de 1998, Seo 1, Pginas 10-12.
A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana - CTNBio, no uso de suas atribuies
legais e regulamentares, resolve:
Art. 1 O Trabalho em Conteno com Animais Geneticamente Modificados - AnGMs
obedecer s normas constantes do Anexo da presente Instruo Normativa.
Art. 2 A presente Instruo Normativa entra em vigor na data de sua publicao.

Luiz Antonio Barreto de Castro


Presidente da CTNBio

ANEXO
NORMAS PARA
MODIFICADOS

TRABALHO

EM

CONTENO

COM

ANIMAIS

GENETICAMENTE

Escopo
Estas normas aplicam-se ao trabalho em conteno com animais geneticamente
modificados (AnGMs). Microrganismos e plantas geneticamente modificados bem como a
manipulao gentica de seres humanos so tratados em regulamentao especfica.
A utilizao de animais em experimentos que envolvam inoculao de cido nuclico (ex:
vacinas de DNA ou terapia gnica) ser tratada em regulamentao especfica.

Texto livre.
357

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Definies
Para efeito destas normas, salvo se indicado diferentemente, certos termos sero
definidos da seguinte maneira:
 AnGM: Animal geneticamente modificado todo aquele que tenha cido nuclico
exgeno intencionalmente incorporado no genoma de suas clulas germinativas ou
somticas.
 CQB: Certificado de Qualidade em Biossegurana.
 CIBio: Comisso Interna de Biossegurana.
 CTNBio: Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana.
 NB-A: Nvel de conteno necessrio para permitir o trabalho com o animal
geneticamente modificado.
 Trabalho em conteno: Atividade com o animal geneticamente modificado que no
permita o escape ou liberao para o meio ambiente.
 Nveis de Biossegurana: Os AnGMs sero classificados como de nveis de
biossegurana 1, 2, 3 ou 4.
 Grupo de Risco: AnGMs do Grupo I so os AnGMs de nvel de biossegurana 1 e
AnGMs do Grupo II so os AnGMs de nveis de biossegurana 2, 3 ou 4.
Aplicao das Normas
Estas normas aplicam-se ao trabalho de pesquisa, produo, desenvolvimento
tecnolgico, ensino e controle de qualidade que utilizem animais geneticamente
modificados, em regime de conteno, realizado no territrio nacional.
Estas normas no se aplicam liberao planejada do animal geneticamente modificado
no meio ambiente, que obedece
norma especfica (Instruo Normativa n 3,
publicada no DOU n 221, de 13 de novembro de 1996, Seo 1, pginas 23691-23694).
As dvidas sobre a aplicao destas normas devem ser dirimidas junto CIBio a qual,
conforme o caso, solicitar esclarecimentos CTNBio.
Qualquer que seja o grupo do animal, a instituio dever requerer CTNBio extenso de
seu CQB para biotrios. No caso de NB-A1 para trabalho em regime de conteno com
AnGMs do Grupo I a prpria CIBio da instituio poder autorizar o incio de operao
do biotrio e enviar CTNBio a planta do mesmo e suas normas de funcionamento em
seu relatrio anual. Nos casos de NB-A2, NB-A3 ou NB-A4, para trabalho em regime de
conteno com AnGMs do Grupo II, a CTNBio realizar visita tcnica para aprovao do
mesmo.
Procedimentos
Responsabilidades a serem cumpridas:
 O responsvel legal da entidade e a CIBio ficam encarregados de garantir o fiel
cumprimento destas normas no que diz respeito ao trabalho em conteno com
animais geneticamente modificados.
 Instituies que desejarem trabalhar com AnGMs de qualquer Grupo devero possuir,
na sua CIBio, pesquisador com experincia comprovada na manipulao de animais
geneticamente modificados.

358

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 O Pesquisador Principal garantir o cumprimento destas normas, em conformidade


com o CQB e sob superviso da CIBio. Ele assegurar que todas as pessoas
envolvidas no trabalho sejam conscientizadas dos riscos envolvidos e que sejam
devidamente treinadas para o cumprimento destas normas.
 de responsabilidade da CIBio e de seus membros providenciar para que a CTNBio
seja avisada, em qualquer eventualidade, do no cumprimento destas normas.
Liberao Acidental De Animais Geneticamente Modificados No Meio Ambiente
Todas as atividades com animais geneticamente modificados em regime de conteno
devem ser planejadas e executadas de acordo com estas normas, de modo a evitar a
ocorrncia de liberao acidental.
Todo animal geneticamente modificado dever possuir um marcador gentico capaz de,
ao ensaio de seu DNA, identific-lo dentre uma populao de animais da mesma espcie.
Sempre que possvel, animais geneticamente modificados devero ter marcas
permanentes, capazes de identific-los inspeo macroscpica.
A ocorrncia, entretanto, de qualquer liberao acidental de animal geneticamente
modificado, dever ser imediatamente comunicada CIBio e CTNBio, anexando-se
relatrio das aes corretivas j tomadas e os nomes das pessoas e autoridades que
tenham sido notificadas.
O comunicado de tal ocorrncia CTNBio no isenta o proponente de qualquer outra
obrigao que possa ter, luz da legislao ordinria ou estatutos, e de informar as
autoridades competentes ou s pessoas que possam ser afetadas.
Apresentao de Propostas
Para qualquer atividade com animais geneticamente modificados classificados como
AnGMs do Grupo I ou AnGMs do Grupo II (ver definies abaixo), o Pesquisador Principal
dever encaminhar CIBio de sua instituio informaes detalhadas de acordo com o
Modelo para Petio constante do Apndice desta norma. No caso de AnGMs do Grupo I,
a autorizao ser concedida pela CIBio que, por sua vez, encaminhar informaes
relativas a essas atividades em seu relatrio anual a ser enviado CTNBio. Caso julgue
necessrio ou apropriado, a CIBio poder, a seu critrio, solicitar parecer conclusivo da
CTNBio sobre autorizao para trabalhos com AnGMs do Grupo I.
Para qualquer atividade com AnGMs do Grupo II, o Pesquisador principal submeter uma
proposta escrita CIBio, que encaminhar o pedido CTNBio, utilizando o Modelo para
Petio constante do Apndice desta norma. A Secretaria Executiva da CTNBio
comunicar CIBio a deciso da CTNBio.
Uma nova proposta dever ser apresentada para apreciao da CTNBio sempre que
houver alterao no organismo utilizado ou nas condies experimentais.
Trabalhos com AnGMs do Grupo II somente podero ser desenvolvidos aps anlise da
proposta e autorizao pela CTNBio.
A Secretria Executiva estar disponvel para esclarecimentos a respeito de qualquer
assunto relacionado a estas normas.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Classificao dos AnGMS quanto ao nvel de biossegurana


AnGM de Nvel de Biossegurana 1: So considerados animais geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 1 aqueles que, aps as manipulaes genticas
sofridas, no tiverem alteradas suas caractersticas de transmissibilidade de doenas
para outras espcies vegetais ou animais, incluindo seres humanos, ou que no
apresentarem vantagens seletivas quando liberados no meio ambiente. Animais que,
aps manipulao gentica, passem a conter genoma, ainda que completo, de vrus no
levam doenas infecciosas transmissveis, sero considerados como de Nvel de
Biossegurana 1.
AnGM de Nvel de Biossegurana 2: So considerados animais geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 2 aqueles que, aps manipulao gentica,
passem a expressar substncias sabidamente txicas para animais, incluindo o homem,
ou vegetais e que, para tais toxinas, existam formas efetivas de preveno ou
tratamento. Tambm so considerados como de Nvel de Biosegurana 2 animais que,
aps manipulao gentica, contenham mais de 75% do genoma de vrus manipulados
em Nvel de Biosegurana 1 (Instruo Normativa n 7, publicada no DOU n 133, de 09
de junho de 1997, Seo 3, pginas 11827-11833), capazes de levar a doenas
infecciosas transmissveis. So ainda considerados animais geneticamente modificados
de Nvel de Biossegurana 2 aqueles que, aps manipulao gentica, possam ser
susceptveis infeces que normalmente no ocorram na espcie equivalente
(possibilidade de quebra da barreira entre espcies).
AnGM de Nvel de Biossegurana 3: So considerados animais geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 3 aqueles que aps a manipulao gentica,
contenham mais de 75% do genoma de vrus manipulados em Nvel de Biossegurana 2
ou 3 (Instruo Normativa n 7, publicada no DOU n 133, de 09 de junho de 1997,
Seo 3, pginas 11827-11833). Tambm so considerados como animais geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 3 aqueles que, aps manipulao gentica,
passem a ser considerados mais aptos sobrevivncia no meio ambiente que os
equivalentes no geneticamente modificados.
AnGM de Nvel de Biossegurana 4: So considerados animais
geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 4 aqueles que, aps manipulao gentica,
contenham mais de 75% do genoma de vrus manipulados em Nvel de Biossegurana 4
(Instruo Normativa n 7, publicada no DOU n 133, de 09 de junho de 1997, Seo 3,
pginas 11827-11833). So tambm considerados animais geneticamente modificados
de Nvel de Biossegurana 4 aqueles que, aps manipulao gentica, passem a
expressar substncias sabidamente txicas para animais, incluindo seres humano, ou
vegetais e que, para tais toxinas, no existam formas efetivas de preveno ou
tratamento.
Classificao dos AnGMS Quanto ao Grupo de Risco
AnGM do Grupo I: So considerados AnGMs do Grupo I os animais geneticamente
modificados de Nvel de Biossegurana 1.
AnGM do Grupo II: So considerados AnGMs do Grupo II os nimais geneticamente
modificados de Nveis de Biossegurana 2, 3 ou 4.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Nvel de Biossegurana para Trabalho com Animais Geneticamente Modificados


(NB-A)
Existem 4 nveis de biossegurana para trabalho com animais geneticamente
modificados. O nvel de biossegurana do biotrio e Salas de Experimentao dever ser
sempre igual ou maior do que o nvel de biossegurana do animal geneticamente
modificado a ser utilizado.
O credenciamento de biotrios e Salas de Experimentao NB-A1 ser realizado pela
CIBio da instituio interessada e dever ser comunicado a CTNBio no seu relatrio
anual. O credenciamento de biotrios e Salas de Experimentao NB-A2, NB-A3 e NB-A4
ser realizado pela CTNBio, aps solicitao por parte da CIBio da instituio interessada.
Para cada solicitao, a CTNBio dever nomear um membro para emitir parecer tcnico
sobre a adequao as normas vigentes em relao ao Nvel de Biossegurana do AnGM.
Este membro da CTNBio poder, se assim julgar necessrio, sugerir medidas que no
estejam previstas nesta Instruo Normativa. Para todos os nveis de segurana os
biotrios devero possuir, no mnimo, as seguintes caractersticas:
 A porta principal dever estar sempre trancada. O acesso ao biotrio dever ser
restrito s pessoas credenciadas, conforme determinado pela CIBio da Instituio.
 A construo do Biotrio dever ser de tal forma a facilitar limpeza e desinfeco e
evitar o acmulo de poeira.
 Animais de diferentes espcies e no envolvidos em um mesmo experimento devero
estar alojados em reas fisicamente separadas.
 Todas as reas que permitam ventilao devero conter barreiras fsicas para impedir
a passagem de insetos e outros animais.
Biotrio e Sala de Experimentao NB-A1:
Adequados para trabalho com animais geneticamente modificados
Biossegurana 1. Devero ter as caractersticas mnimas descritas acima.

de

Nvel

de

Todo material proveniente dos animais geneticamente modificados dever ser descartado
de forma a impossibilitar seu uso como alimento por outros animais, salvo o caso em que
este seja o propsito do experimento, ou se especificamente autorizado pela CIBio,
CTNBio ou outra instituio competente, se aplicvel.
Toda manipulao dever ser realizada de forma a evitar a liberao acidental do animal
geneticamente modificado no meio ambiente.
Biotrio e Sala de Experimentao NB-A2:
Adequados para trabalho com animais geneticamente modificados de Nveis de
Biossegurana 1 e 2. Alm das condies exigidas para NB-A1, as condies descritas
abaixo tambm devero ser obedecidas.
 O Presidente da CIBio dever estabelecer normas para que apenas as pessoas
autorizadas, qualificadas e cientes dos riscos inerentes aos experimentos tenham
acesso ao biotrio. Quando apropriado, estas pessoas devero estar vacinadas contra
os agentes infecciosos relacionados ao experimento.
 necessrio que haja uma Ante-Sala entre a rea de livre circulao e a rea onde os
animais esto alojados. Toda a forma de ventilao existente entre a rea de
circulao livre e a Ante-Sala e entre a Ante-Sala e a Sala dos Animais devero
possuir barreiras fsicas que bloqueiem a passagem de insetos ou outros animais.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 Material contaminado dever ser apropriadamente acondicionado conforme boas


prticas laboratoriais para desinfeco, que poder ocorrer fora do biotrio.
 Agulhas, seringas ou qualquer outro instrumento que possa causar soluo de
continuidade da pele devero ser acondicionados em recipientes resistentes at o
momento da desinfeco.
 obrigatrios o uso de mscara, gorro, luva, e protetores para os ps. Estes
materiais devero ser sempre descontaminados aps o uso.
Biotrio NB-A3:
Adequados para o trabalho com animais geneticamente modificados de Nveis de
Biossegurana 1, 2 ou 3.
Alm das condies exigidas para NB-A2, as condies descritas abaixo tambm devero
ser obedecidas:
 O biotrio dever conter, no mnimo, 4 reas distintas: Ante-Sala, Sala de Materiais,
Sala para Animais e Sala de Experimentao.
 O fluxo de ar dever ocorrer sempre no sentido da Ante-Sala, Sala de Materiais e,
finalmente, Sala para Animais e Sala de Experimentao. O ar insuflado dever ser
esterilizado. A sada de ar tambm dever conter filtros esterilizantes para purificao
do ar que sai da Sala dos Animais. As Salas dos Animais e de Experimentao
devero, necessariamente, conter presso de ar negativa em relao Sala anterior
e jogar o ar, aps filtragem, para o meio externo.
 O biotrio dever possuir sistema de controle automtico de presso atmosfrica para
detectar alteraes na presso atmosfrica, sistema este capaz de acionar alarme
para acusar o defeito.
 Os animais devero ser sempre alojados em sistema de microisoladores (gaiolas com
filtro de barragem para microrganismos).
 Os animais jamais devero deixar as Salas apropriadas.
 Nenhum material biolgico capaz de propagar o agente infeccioso poder deixar o
biotrio antes de eliminada a viabilidade do agente infeccioso (por exemplo, a
extrao de cidos nuclicos de rgos ou clulas dever ser realizada dentro do
biotrio).
 Todo o lquido efluente do biotrio NB-A3 (pias, guas de bebedouros, ralos,
autoclaves, etc.) dever ser descontaminado antes de liberado no sistema de
esgotamento sanitrio, atravs do tratamento em caixas de conteno. Este
procedimento dever ser avaliado pela CIBio e aprovado pela CTNBio.
 Na Ante-Sala e na Sala de Material dever existir pia e chuveiro, com torneiras que
permitam acion-los sem o uso das mos. No devero existir pias, chuveiros ou
qualquer ralo na Sala de Animais ou Sala de Experimentao, para reduzir a
possibilidade de escape de material contaminado.
 A CIBio dever determinar testes de segurana para permitir o transporte de
qualquer material biolgico proveniente dos animais para instalaes com
classificao inferior a NB-3.
 necessrio que exista a possibilidade de descontaminao de material dentro do
biotrio. Isto dever ocorrer atravs da utilizao de autoclave com porta dupla, uma
abrindo pela Sala de Materiais e outra abrindo pela Sala de Animais ou Sala de

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Experimentao, se esta existir. Dever existir um incinerador na Sala de Animais ou


na Sala de Experimentao.
 Os animais devero ser incinerados antes do descarte.
 Todas as superfcies devero ser descontaminadas diariamente e sempre aps o
trmino de qualquer manipulao. Manipulaes independentes em um mesmo dia
necessitam descontaminaes independentes.
 Nenhum material biolgico, capaz de conter formas viveis do agente infeccioso,
dever sair do biotrio antes de ser descontaminado.
 necessrio que os usurios utilizem vestimenta apropriada (aventais, gorros,
mscaras, sapatilhas e protetores de sapatos, luvas, etc), a ser trocada na Ante-Sala.
Isto no corresponde a simplesmente utilizar avental sobre a roupa comum. No
permitida a entrada ou sada de pessoal sem que ocorra troca de vestimenta. A
vestimenta utilizada no biotrio dever ser autoclavada no prprio biotrio antes de
lavada ou de seu descarte.
 A CIBio dever estipular um procedimento de emergncia a ser tomado em caso de
acidentes laboratoriais, de acordo com o risco dos agentes aos quais os usurios
possam ter sido expostos. Dentro de cada Sala dever haver um sistema de alarme
capaz de acionar as medidas necessrias, sem que haja necessidade do usurio
acidentado deixar o biotrio sem seguir as normas de descontaminao, o que
poderia aumentar a gravidade do acidente.
 Ser exigida a obteno de amostras de soro referncia dos usurios antes do incio
dos trabalhos em ambiente NB-A3. A CIBio dever propor um sistema de vigilncia e
monitoramento dos usurios para deteco de possveis contaminaes pelos agentes
em uso.
Biotrio NB-A4:
Adequado para o trabalho com animais geneticamente modificados de Nveis de
Biossegurana 1, 2, 3 ou 4.
Alm das condies exigidas para NB-A3, as condies descritas abaixo tambm devero
ser obedecidas.
 O prdio dever ser uma construo isolada, no ligada a outro prdio. A rea onde
este prdio se localiza dever ser patrulhada 24 horas por dia.
 O acesso a esta rea absolutamente restrito a pessoal com comprovada
experincia, certificada pela CIBio e aprovada pela CTNBio.
 Dever existir patrulhamento ininterrupto, a cargo da instituio, de forma a controlar
no s o acesso ao biotrio, mas tambm a reas que do acesso ao
biotrio.Somente pessoas credenciadas pela CIBio podero transitar pela rea de
acesso ao biotrio. tambm necessria a presena, 24 horas ao dia, de vigilncia a
ser localizada prximo porta de entrada do biotrio. Alm do sistema de acesso por
carto magntico ou cdigos digitais, o vigilante dever solicitar identificao
institucional de cada usurio. Todas estas informaes devero ser registradas e
arquivadas por um perodo mnimo igual a 5 vezes ao maior perodo de incubao das
diferentes doenas que possam ser causadas pelos agentes infecciosos aos quais os
usurios esto expostos.
 O acesso ao biotrio dever ser controlado por um sistema que permita a
identificao de cada usurio, bem como o horrio e tempo de utilizao do biotrio.
Todas as portas devero permanecer sempre trancadas e sua abertura dever ser
controlada por uso de cartes magnticos ou cdigos digital.
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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 O biotrio dever possuir, pelo menos, 6 reas distintas:

1. Ante-Sala com presso de ar negativa em relao rea de circulao e


capacidade de esterilizao do ambiente.

2. Sala de Troca de Vestimenta com trs divises, sendo que um chuveiro fica na
diviso central. Na primeira diviso (prxima Ante-Sala), dever haver
armrios individuais para o usurio guardar a roupa. Dever tambm haver
armrios fechados para guardar as roupas a serem utilizadas pelos usurios. Na
Sala do Chuveiro, dever haver chuveiro, pia e capacidade de esterilizao do
ambiente. Pias e chuveiros devero ser acionados por sistema independente do
uso das mos. Na terceira diviso dever haver sacos para acondicionar a roupa
j utilizada no laboratrio, que dever ser autoclavada antes de ser descartada.

3. Sala de Materiais com pia e capacidade de esterilizao do ambiente. Na Sala


de Materiais dever haver um autoclave para cada Sala de Animal, Sala de
Experimentao e Sala de Necropsia existente no biotrio, com porta dupla, uma
abrindo para a Sala de Materiais e outra para as Salas de Animais, de
Experimentao e de Necropsia.

4. Sala de Animais com capacidade de esterilizao do ambiente. A passagem


entre a Sala de Materiais e a Sala de Animais dever ser feita por porta dupla,
com abertura automtica, para que no haja necessidade do uso das mos.

5. Sala de Experimentao com capacidade de esterilizao do ambiente e


comunicao, por meio de porta dupla automtica, com a Sala de Animais.

6. Sala de Necropsia com incinerador.

 No devero existir pias, chuveiros ou qualquer ralo na Sala de Animais ou Sala de


Experimentao, para evitar a possibilidade de escape de material contaminado.
 Todas as Salas devero ter presso de ar negativa em relao Sala anterior, com
sistema de fluxo no permitindo a volta de ar de uma Sala com material contaminado
para reas limpas. Dever haver sistema de controle automtico de presso do ar,
capaz de detectar alteraes na presso atmosfrica e acionar sistema de alarme
automtico, que trave todas as portas do biotrio.
 O sistema de filtrao utilizado para exausto de ar dever possuir dupla barreira de
filtragem, sendo que, no caso de mal funcionamento de uma delas, a segunda ser
suficiente para liberar ar esterilizado.
 O sistema de ar dever ser validado por firma com experincia comprovada.
 O sistema de alimentao de gua dever possuir mecanismos que impeam o fluxo
contrrio de gua. Todo o sistema de esgotamento sanitrio da construo dever ser
independente, com sistema de descontaminao antes do descarte.
 Ao entrar no biotrio o usurio dever deixar a Ante-Sala e, na Sala de Troca, deixar
a vestimenta na 1 diviso e se vestir com as roupas apropriadas para o biotrio
(calas, camisas, jalecos, luvas, gorros, mscaras, sapatos e protetores de sapatos,
etc) que se encontram esterilizadas. Para sair do biotrio o usurio dever deixar as
roupas na Sala anterior Sala do chuveiro, em recipiente prprio para
descontaminao. Todo usurio dever, obrigatoriamente, tomar banho antes de
cada sada do biotrio.
 Nas reas onde se encontram os animais ou na Sala de Experimentao e na Sala de
Necrpsia, dever haver conteno de 100% do ar circulante no ambiente NB-A4, em
relao aos usurios. Isto poder ser obtido por sistema de "linha da vida" ou uso de
sistema de conteno total em linha. Assim, no espao entre as portas que separam a
Sala de Materiais e as Salas com ambiente NB-A4, dever haver espao para troca de
vestimenta, no caso de utilizao da "linha da vida". No caso de conteno em linha,
a mesma vestimenta poder ser utilizada.
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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 A entrada de qualquer material para as Salas de Animais dever ser realizada, via
autoclave de duas portas, ou o mesmo dever ser esterilizado antes de sua entrada.
 O vigia responsvel pelo patrulhamento da rea de acesso ao biotrio dever estar
apto a acionar o esquema de emergncia, em caso de acidente, que ser informado
pelo usurio pelo sistema de alarme.
 Os animais devero ser incinerados antes do descarte.
 Nenhum material biolgico capaz de propagar o agente infeccioso poder deixar o
biotrio. Qualquer experimento utilizando material biolgico dever ser realizado
dentro da Sala de Experimentao.
Observao Importante
A CTNBio poder, a qualquer momento, nomear uma Comisso Tcnica para determinar
se as normas aqui estabelecidas satisfazem os critrios de biossegurana para trabalho
com animais geneticamente modificados que possam apresentar riscos particulares ou
no previstos pelo conhecimento cientfico atual.
Apndice
Requerimento para trabalho em conteno com animais geneticamente modificados
(AnGMS)
Ilmo. Sr. Presidente da CTNBio/CIBio
 Nome do Representante Legal da Instituio/Unidade Operativa/Presidente da CIBio.
 Instituio e Endereo. Fax/Fone/E-mail.
 Nmero do CQB.
 Nome do Pesquisador Principal.
Vem requerer autorizao para trabalho em conteno com animais geneticamente
modificados (AnGMs), em cumprimento Instruo Normativa n 12/98.
 Informe a espcie do animal a ser geneticamente alterado.
 Informe o procedimento de alterao gentica a ser utilizado.
 Informe se pretende estabelecer uma colnia com o AnGM.
 Informe as caractersticas do material gentico a ser inserido.
 Descreva as atividades biolgicas que adquiridas/perdidas pelo AnGM.
 Informe a possibilidade de alterao nas caractersticas de patogenicidade do AnGM.
 Informe a possibilidade do AnGM ganhar alguma vantagem seletiva sobre os
correspondentes no modificados geneticamente, quando de um possvel escape para
o meio ambiente.
 Informe a possibilidade de risco de transmisso de doenas para outros animais,
incluindo seres humanos, ou vegetais.
 Informe se o AnGM passar a expressar alguma protena com potencial sabidamente
txico. Se positivo, informe se existe ou no forma de tratamento.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 Procure subsidiar o parecer da CTNBio esclarecendo aspectos que no foram


abordados por este requerimento e que voc julgue relevantes para o esclarecimento
sobre o nvel de biossegurana do AnGM.
 Inclua literatura cientfica que possa dar subsdios para o parecer da CTNBio.
 Data.
 Assinatura do Pesquisador Principal e do Presidente da CIBio.

19.4.2.

Instruo Normativa N 13

Instruo Normativa N 13, publicada no Dirio Oficial da Unio - DOU - N. 103-E, de 02


de junho de 1998, Seo 1, Pgina 28.
A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana - CTNBio, no uso de suas atribuies
legais e regulamentares, resolve:
Art. 1 A importao de animais geneticamente modificados para uso em trabalhos de
conteno obedecer s normas constantes do Anexo da presente Instruo Normativa.
Art. 2 O cumprimento desta Instruo Normativa no exime o requerente do respeito
legislao especfica em vigor para a introduo de animais no pas, afeta aos Ministrios
da Agricultura, da Sade ou do Meio Ambiente (art. 7, Lei 8.974/95).
Art. 3 A presente Instruo Normativa entra em vigor na data de sua publicao.

Luiz Antonio Barreto de Castro


Presidente da CTNBio

ANEXO
NORMAS PARA IMPORTAO DE ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS (AnGMs)
PARA USO EM TRABALHO EM REGIME DE CONTENO
Escopo
Estas normas aplicam-se importao de animais geneticamente modificados (AnGMs).
Microrganismos geneticamente modificados (incluindo bactrias, fungos, vrus, clamdias,
riqutsias e micoplasmas), linhagens celulares, parasitas e organismos afins so tratados
em regulamentao especfica.
A obedincia a estas normas no exime o importador do cumprimento dos trmites
previstos pela legislao em vigor.
Habilitao para Importao
A importao ser sempre feita por uma entidade que possua CQB - Certificado de
Qualidade em Biossegurana (Lei n 8.974/95, Instruo Normativa n 1, publicada no
DOU n 174, de 6 de setembro de 1996, Seo 1, pginas 17694-17696), extensivo ao
seu biotrio.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

A importao ser efetivada somente para uso em trabalho de conteno pela instituio
que realizou a importao. A transferncia de AnGM da instituio importadora para
outra instituio dever ser realizada obedecendo as normas de transporte de OGM (Lei
n 8.974/95, Instruo Normativa n 4, publicada no DOU n 247, de 20 de dezembro de
1996, Seo 1, pginas 27820-27821).
A habilitao para importao depender da classificao do AnGM. O processo de
importao do AnGM dever ser avaliado pela CIBio da instituio responsvel pela
importao, segundo normas para trabalho em conteno com animais geneticamente
modificados (Lei n 8.974/95, Instruo Normativa n 12, publicada no DOU n 100-E,
de 28 de maio de 1998, Seo 1, pginas 10 - 12).
de responsabilidade da CIBio a classificao do animal geneticamente modificado como
sendo do Grupo I ou do Grupo II.
Se a CIBio classificar o animal como do Grupo I (AnGM de nvel de biossegurana 1), a
habilitao ser emitida diretamente pela CIBio.
No caso de animais geneticamente modificados do Grupo II (AnGMs de nveis de
biossegurana 2, 3 ou 4), a habilitao para importao ser dada pela CTNBio, aps
solicitao por escrito da instituio interessada, em formulrio constante do Apndice.
Os cuidados para transporte e os procedimentos de emergncia, no caso de escape ou
acidente durante a importao, sero previamente comunicados CIBio pelo responsvel
pela solicitao de importao.
As embalagens usadas para o transporte devero obedecer s normas para transporte
de organismos geneticamente modificados (Lei n 8.974/95, Instruo Normativa n 4,
publicada no DOU n 247, de 20 de dezembro de 1996, Seo 1, pginas 27820-27821)
ou legislao especfica, quando pertinente.
Apndice
Requerimento de habilitao para importao de animais geneticamente modificados
(AnGMs) para trabalho em regime de conteno
Ilmo. Sr. Presidente da CTNBio / CIBio
 Nome do Representante Legal da Instituio / Unidade Operativa / Presidente da
CIBio.
 Instituio e Endereo / Fax / Fone / E-mail.
 Nmero do CQB.
 Nome do Pesquisador Principal.
Vem requerer habilitao para importao de animais geneticamente modificados
(AnGMs) para trabalho em regime de conteno, em cumprimento Instruo Normativa
n 13. Procure responder de maneira objetiva as seguintes perguntas:
 Informe a espcie do animal a ser geneticamente alterado.
 Informe o procedimento de alterao gentica a ser utilizado.
 Informe se pretende estabelecer uma colnia com o AnGM.
 Informe as caractersticas do material gentico a ser inserido.

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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

 Descreva as atividades biolgicas que sero adquiridas/perdidas pelo AnGM.


 Informe a possibilidade de alterao nas caractersticas de patogenicidade do AnGM.
 Informe a possibilidade do AnGM ganhar alguma vantagem seletiva sobre os
correspondentes no modificados geneticamente, quando de um possvel escape para
o meio ambiente.
 Informe a possibilidade de risco de transmisso de doenas para outros animais,
incluindo seres humanos, ou vegetais.
 Informe se o AnGM passar a expressar alguma protena com potencial sabidamente
txico. Se positivo, informe se existe ou no forma de tratamento.
 Procure subsidiar o parecer da CTNBio esclarecendo aspectos que no foram
abordados por este requerimento e que voc julgue relevantes para o esclarecimento
sobre o nvel de biossegurana do AnGM.
 Inclua literatura cientfica que possa dar subsdios para o parecer da CTNBio.
 Data.
 Assinatura do Pesquisador Principal e do Presidente da CIBio.

1199..55.. C
O
O
USS
LU
CL
NC
ON
CO
As diversas tcnicas de transgnese utilizadas em animais demonstram o interesse dos
pesquisadores em conseguir um mtodo eficiente de transferncia de genes no menor
tempo possvel. Dependendo do interesse do estudo e da espcie, diferentes tcnicas
podem ser aplicadas. Dentre elas, a mais eficiente em mamiferos a microinjeo em
pronucleos de ovos recm-fertilizados, mas, no entanto, quando se deseja a substituio
de um gene, outras tcnicas como clulas ES so mais apropriadas. Assim, dependendo
das aplicaes, as tcnicas de transgenia em animais tem se mostrado bastante til e
com variadas aplicaes nas reas do conhecimento.
No esperado ou no desejado efeitos da transgenese em animais de laboratrio ou
domsticos so devidos a: 1) uma incompleta compreenso dos mecanismos regulatrios
que so exigidos para um padro normal de expresso, 2) efeitos na expresso do
transgene que depende do sitio de integrao do transgene, 3) o conhecimento
incompleto de todas as funes fisiolgicas de produtos geniosos especficos.
Os resultados de estudos transgnicos para melhorar caractersticas em animais
domsticos (por exemplo, animais transgnicos para o hormnio do crescimento)
demonstram que significativos aumentos na produtividade so frequentemente
associados a efeitos detrimentais que levam a uma diminuio na performance geral.
Pesquisas futuras so necessrias para compreender qual o nvel do produto do
transgene no ira perturbar as propriedades fisiolgicas que so normalmente
delicadamente balanceadas nos animais. Esforos combinados de fisiologistas e
biologistas moleculares so necessrios para compreender quais modificaes no
metabolismo do animal no iram comprometer sua sade. Os benefcios e riscos a longo
prazo da transgenese devem ser cuidadosamente avaliados.

368

Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

Apesar da necessidade ainda de muitos estudos, a produo de animais transgnicos tem


sido cada vez mais explorada, visando transferir de maneira estvel e eficiente o gene de
interesse entre espcies diferentes. Pesquisas futuras so necessrias em todas as reas
e o que se deseja que as modificaes genticas sejam viveis do ponto de vista
econmico e que satisfaam os preceitos ticos. Como medida preventiva, atualmente
uma subcomisso da CTNBio de especialistas de notrio saber cientifico e tcnico esto
debruados na elaborao de um cdigo de tica de manipulaes genticas.
O nosso pai um dos poucos do mundo que possuem uma legislao to bem elaborada
e atual. As leis so criadas em respostas as necessidades e aos anseios de uma
determinada populao, hoje com a economia globalizada as leis tendem a serem
universais. O nosso grande desafio que os nossos avanos neste campo sejam
respeitados nos protocolos internacionais.

1199..66.. R
ASS
CA
FFIIC
R
GR
OG
BIIBBLLIIO
REEFFEERRNNCCIIAASS B
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Manual de Biossegurana, Parte IV Manipulao de Animais


Captulo 19 - Animais Geneticamente Modificados (Transgnicos) e a Legislao Brasileira de Biossegurana

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