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TEMA 19: GENTICA MOLECULAR.

1.-

INTRODUCCIN: EL CONCEPTO CLSICO DE GEN Y EL

NACIMIENTO DE LA GENTICA MOLECULAR.

El redescubrimiento de los trabajos de Gregor Mendel en el ao 1900 y la amplia

generalizacin de sus conclusiones a la que condujeron los trabajos de genetistas como
Morgan, Sturtevant y Muller en las primeras dcadas del S. XX, trajeron como consecuencia
la aceptacin prcticamente universal de los principios mendelianos de la herencia biolgica.
Esta aceptacin propici grandes avances en el conocimiento de los procesos genticos que
afectan tanto a las clulas individuales como a los organismos pluricelulares y a las
poblaciones de seres vivos.
El gran bagaje de conocimientos acumulados, que globalmente configuran lo que se
ha dado en llamar gentica clsica, no slo ha elevado nuestro nivel de comprensin de los
sistemas vivos hasta cotas insospechadas pocos aos antes, sino que su aplicacin en campos
como la agricultura y la medicina ha resultado enormemente beneficiosa para la humanidad.
Sin embargo, durante todo este perodo, que abarca la primera mitad del S. XX, el concepto
fundamental de la gentica, el gen, permaneca desprovisto de todo contenido material.
Aunque la teora cromosmica de la herencia haba establecido con claridad la localizacin
de los genes en el ncleo celular y, ms concretamente, en los cromosomas, los genetistas
clsicos desconocan por completo la naturaleza fsico-qumica del gen, as como los
mecanismos por los que ste, desde su sede en el ncleo celular, era capaz de dirigir la
maquinaria bioqumica de la clula y de replicarse con exactitud a lo largo de muchas
generaciones celulares. El gen mendeliano era una entidad indivisible y abstracta cuya
existencia era reconocida por sus efectos sobre clulas y organismos aunque su naturaleza
material continuase siendo un misterio. A la pregunta A)qu es un gen?@ un genetista clsico
probablemente respondiese que el gen es Aalgo@ capaz de controlar un carcter hereditario,
de replicarse a s mismo fielmente en las sucesivas
generaciones celulares, de recombinar con otros
genes en el proceso de divisin celular meitica y
de cambiar globalmente su estructura para producir
una alternativa diferente del carcter que controla
en el proceso conocido como mutacin. Conocer la
naturaleza fsica del gen y los mecanismos
moleculares mediante los cuales ste se replica y
controla un carcter hereditario, aunque de
indudable inters intelectual para el genetista
clsico, no es el objetivo de su trabajo, puesto que
las teoras y predicciones experimentales que
formula acerca de los mecanismos de la herencia, y
el xito de las mismas, no dependen de estos
conocimientos.
En los aos 40, el panorama hasta aqu
dibujado cambi radicalmente cuando un nutrido
grupo de cientficos, cuya formacin y
motivaciones eran muy diferentes de las de los
genetistas clsicos, comenz a interesarse por la
naturaleza del gen. Se trataba de investigadores

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que se haban formado en el campo de las ciencias fsicas y que estaban escasamente
familiarizados con los conocimientos acumulados en las dcadas precedentes por los
genetistas clsicos e, incluso, con la Biologa en general. Por razones que desarrollaremos a
continuacin, este grupo de cientficos centr su inters en la resolucin de un nico
problema: la base fsica de la informacin gentica.
Los antecedentes de este movimiento intelectual hay que buscarlos en la exposicin,
por parte de Niels Bohr (Figura 19.1), uno de los ms ilustres fsicos del S. XX, de la idea de
que algunos de los fenmenos biolgicos podran no ser completamente explicables en
funcin de conceptos fsicos y qumicos convencionales. En opinin de Bohr, y de algunos de
sus discpulos, la herencia biolgica era claramente uno de estos fenmenos.
Las ideas de Bohr, que en algn
momento
fueron
mal
interpretadas
y
tergiversadas con la intencin de resucitar la
vieja doctrina filosfica del vitalismo, no
llegaron a calar hondo entre la comunidad
cientfica hasta que en 1945 (inmediatamente
despus del final de la segunda guerra mundial),
Erwin Schrdinger (Figura 19.2), uno de los
padres de la mecnica cuntica, public un
pequeo ensayo titulado A)Qu es la vida?@, en
el que dichas ideas eran recogidas y
desarrolladas de manera mucho ms rigurosa.
Para Schrdinger, el nico problema real, aquel
en el que las explicaciones fsicas
convencionales podran resultar insuficientes,
era la naturaleza fsica del gen.
Las estimaciones de los tamaos de los
genes que se deducan de los anlisis realizados
por los genetistas clsicos en la mosca del
vinagre (Drosophila melanogster) indicaban
que stos eran similares a los de las mayores molculas conocidas. Si, como apuntaban estas
estimaciones, el gen no era ms que un tipo particular de molcula, se trataba, en opinin de
Schrdinger, de una molcula muy especial. En primer lugar, el gen demostraba ser una
molcula altamente estable, capaz de conservar su estructura especfica, y por lo tanto su
contenido informativo, durante largos perodos de tiempo y en un ambiente qumicamente
heterogneo como es el ambiente celular. En segundo lugar, lo que resultaba todava ms
desconcertante, la Amolcula gnica@ era capaz de dar lugar a copias fieles de s misma y
transmitirlas sin alteracin a lo largo de innumerables generaciones celulares. No exista
ninguna molcula conocida que reuniera estas caractersticas.
Schrdinger sugera en su ensayo que la molcula gnica podra ser un gran cristal
aperidico consistente en la sucesin de unos cuantos elementos ismeros y que la naturaleza
exacta de esta sucesin constituira el cdigo gentico. Apuntaba, adems, que, por el hecho
de que las propiedades exhibidas por la molcula gnica no resultaran explicables desde el
punto de vista de las leyes fsicas conocidas hasta la fecha, no haba que presuponer que
dicha molcula eludiese dichas leyes. Por el contrario, estas propiedades podran implicar la
existencia de Aotras leyes fsicas@, desconocidas por el momento, que, una vez descubiertas,
formaran parte integral de esta ciencia junto con las ya conocidas.
La propuesta de Schrdinger tuvo efectos inmediatos. Los fsicos de la poca se
encontraban sumidos en un gran malestar profesional, probablemente relacionado con el uso

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blico que se haba hecho de sus investigaciones al final de la segunda guerra mundial, y
estaban deseosos de dirigir sus esfuerzos hacia nuevas fronteras del conocimiento. En este
contexto, un fsico del prestigio de Erwin Schrdinger expone la idea de que el estudio de la
materia viva, y ms concretamente del gen, podra revelar la existencia de Aotras leyes
fsicas@ que aguardaban ah a que alguien las descubriese. Animados por esta posibilidad, un
buen nmero de fsicos decidi abandonar el campo de la investigacin para el que haban
sido formados y Adesembarcaron@ en las ciencias biolgicas con el objetivo de esclarecer la
base fsico-qumica de la informacin gentica.

2.-

LA NATURALEZA DEL MATERIAL HEREDITARIO.

En 1868, un mdico alemn llamado

Friedich Miescher (Figura 19.3) descubri,
cuando analizaba la composicin de ncleos
de clulas del pus procedente de vendajes
quirrgicos, un cuarto tipo de sustancia que
se aada a los ya por entonces conocidos
glcidos, lpidos y protenas como
componente esencial de la materia viva. Se
trataba de una sustancia cida, rica en
fsforo, que Miescher denomin nuclena y
que poco despus empez a conocerse con
el nombre de cido nucleico, denominacin
esta que haca referencia tanto a su carcter
cido como a su localizacin en el ncleo
celular.
Resulta
paradjico
que
esta
sustancia fuese descubierta slo tres aos
despus de que Mendel estableciese el
concepto de gen y que hubiesen de
transcurrir otros noventa hasta que dicha
sustancia fuese reconocida universalmente
como su soporte material.
El conocimiento preciso de la
qumica elemental de los cidos nucleicos
se demor bastante con respecto al de otras biomolculas orgnicas, probablemente debido a
su mayor complejidad estructural. En los primeros aos del S. XX se identificaron sus
componentes moleculares (pentosas, bases nitrogenadas y cido fosfrico). En la dcada de
los aos 20 se descubri cmo se unen entre s estos componentes para dar lugar a los
nucletidos y cmo se enlazan stos para dar lugar a los cidos nucleicos. Por la misma poca
se pudo reconocer la existencia de dos tipos principales de cido nucleico (DNA y RNA) as
como las diferencias estructurales entre ellos. Todava a comienzos de los aos 40 se
desconoca el hecho de que los cidos nucleicos eran en realidad macromolculas que
consistan en largas cadenas polinucleotdicas, formadas por centenares, miles e incluso
millones de nucletidos unidos por puentes fosfodister. Cuando en 1945 Schrdinger
propone a sus colegas fsicos investigar la naturaleza del material gentico, era comnmente
aceptado que la molcula de DNA consista en un tetranucletido cclico, formado por los
cuatro desoxirribonucletidos conocidos. La idea del tetranucletido provena de los anlisis
cuantitativos realizados sobre DNAs de unas pocas especies de seres vivos, que indicaban

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que en todos ellos las 4 bases nitrogenadas (A, T, G y C) se encontraban en cantidades
iguales.
Por otra parte, en la teora cromosmica de la herencia se estableca ya la localizacin
de los genes a lo largo de los cromosomas, dentro del ncleo celular. El anlisis qumico de
los cromosomas indicaba que stos estaban compuestos por DNA y protenas a partes
aproximadamente iguales. Todo indicaba pues que alguna de estas dos sustancias deba ser el
material hereditario.
La qumica elemental de las protenas era bien conocida ya cuando empez a
plantearse el problema de la naturaleza del gen. Aunque slo se haban dado los primeros
pasos en la determinacin de su estructura tridimensional, se haba establecido ya con
claridad que las molculas proteicas consistan en largas cadenas de aminocidos unidos
mediante enlaces peptdicos. Tambin se haba puesto de manifiesto que la identidad qumica
de cada molcula proteica vendra dada por la naturaleza y posicin de los diferentes restos
de aminocidos a lo largo de la cadena polipeptdica, es decir, por su estructura primaria.
En este contexto histrico, con un conocimiento bastante avanzado de la estructura
qumica de las protenas y relativamente pobre de la de los cido nucleicos, un buen nmero
de investigadores se decant inicialmente por las protenas como principales candidatas a
constituir la base qumica de la herencia. Resultaba claro para ellos que las largas cadenas de
aminocidos de las protenas respondan mejor a la idea del gran cristal aperidico
formulada por Schrdinger que el pequeo tetranucletido cclico en que pareca consistir la
molcula de DNA. Segn su punto de vista, la informacin gentica podra estar cifrada en
forma de diferentes secuencias de aminocidos, siendo stos los Aelementos ismeros@ a los
que Schrdinger haca referencia. En los prximos apartados de este captulo comprobaremos
que el tiempo y los hechos vinieron a quitarles la razn.
2.1.-

EL EXPERIMENTO DE AVERY.

La primera prueba de que el DNA era despus de

todo el material gentico, fue obtenida en 1944 por
Oswald T. Avery, y sus colaboradores C.M. McLeod y
M.J. McCarty en el transcurso de un trabajo experimental
en el que trataban de encontrar explicacin a un fenmeno
observado algunos aos antes por el mdico britnico F.
Griffith (Figura 19.4).
En 1928 F. Griffith estudiaba el proceso de
infeccin en ratones por Streptococcus pneumoniae, ms
conocido como Aneumococo@, una bacteria que se
encuentra entre los agentes causantes de la neumona
humana y que resulta especialmente patgena para el
ratn: la inyeccin en un ratn de esputos procedentes de
un paciente afectado de neumona neumoccica le
ocasiona a aqul la muerte en menos de 24 horas (Figura
19.5). El neumococo debe su carcter patgeno a una
cpsula de polisacridos que lo protege de los mecanismos
de defensa del animal infectado. Griffith haba aislado una
cepa mutante de esta especie, que haba perdido su capacidad para sintetizar esta cpsula y
que resultaban por lo tanto vulnerables a dichos mecanismos de defensa: los ratones
inoculados con bacterias de esta cepa no contraan la neumona y por consiguiente
sobrevivan. Ambas variantes podan distinguirse una de la otra con facilidad debido al

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aspecto de las colonias que formaban en las placas de cultivo, que tenan aspecto brillante
(S) en la variante patgena comn y aspecto rugoso (R) en la variante mutante no patgena.
El aspecto brillante o rugoso de las colonias era tambin una consecuencia de la presencia o
ausencia respectivamente de la mencionada cpsula de polisacridos.

En el curso de sus investigaciones Griffith descubri con sorpresa que los ratones
inoculados con mutantes R no patgenos mezclados con una muestra de bacterias S
patgenas previamente muertas por efecto del calor, contraan la neumona y moran a las
pocas horas. Las bacterias recuperadas de la sangre de los ratones muertos haban recuperado
su capacidad para sintetizar la cpsula de polisacridos y con ello su carcter patgeno y el
aspecto brillante de las colonias a las que daban lugar. El contacto con las bacterias S haba
producido en las bacterias R una transformacin RS que se transmita a las sucesivas
generaciones celulares. Aos ms tarde Griffith comprob que no era imprescindible que el
contacto entre las dos cepas bacterianas se produjese en el interior del ratn: la
transformacin tambin se produca en cultivos de bacterias R que crecan en contacto con
bacterias S muertas. Ms significativo an result el hecho de que la transformacin se
produjese como consecuencia del contacto de cultivos de bacterias R creciendo en contacto
con un Aextracto libre de clulas@ de bacterias S, es decir, no era imprescindible la estructura
celular intacta de las bacterias S muertas sino que una disolucin de sus componentes
moleculares solubles era suficiente.
Los experimentos de Griffith fueron el punto de partida del trabajo de Avery, McLeod
y McCarthy, que se plantearon identificar, en el extracto libre de clulas que se ha
mencionado, la naturaleza qumica del Aprincipio transformante@ responsable del fenmeno

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observado. Para ello llevaron a cabo un fraccionamiento sistemtico del extracto libre de
clulas y ensayaron la capacidad transformante de las distintas fracciones sobre cultivos de
bacterias R. Tras ensayar con distintas fracciones del extracto (lpidos, glcidos, protenas,
etc.) con resultados negativos, comprobaron que la fraccin que contena los cidos nucleicos
induca eficazmente la transformacin. Un fraccionamiento ulterior llev a la conclusin de
que el principio transformante buscado no era otro que el DNA bacteriano: pequesimas
cantidades de este DNA purificado eran suficientes para transformar las bacterias R en
bacterias S. Avery y sus colaboradores demostraron tambin que el DNA de las bacterias
transformadas y de sus descendientes poda a su vez inducir la transformacin en otras
bacterias R y que en sucesivos ciclos de transformacin como los descritos se mantena esta
capacidad.
Tras estas experiencias las conclusiones de
Avery (Figura 19.6) estaban cada vez ms claras: el
DNA de las bacterias S muertas era la sustancia que
contena la informacin necesaria para hacer que las
bacterias R y su descendencia recuperasen su
capacidad para sintetizar su cpsula de polisacridos y
con ella su carcter patgeno, es decir, el DNA era el
material gentico de Streptococcus pneumoniae.
La publicacin de los resultados de Avery,
McLeod y McCarthy en 1944 provoc una oleada de
escepticismo crtico entre la comunidad cientfica de la
poca. Como ya se ha dicho, la mayora de los
investigadores apuntaba a las protenas como
principales candidatas a constituir la base qumica del
gen. Las principales objeciones incidan en el hecho de
que las tcnicas al uso de fraccionamiento y
purificacin de macromolculas no eran eficaces al
100%, de manera que una pequea cantidad de
protenas contaminando el extracto de DNA purificado
pudiera ser la responsable de la actividad transformante de ste. Analizada desde la
perspectiva actual esta objecin parece claramente formulada ad hoc en defensa de una idea
previa demasiado firmemente asentada: tenan que ser las protenas. En efecto, si el
material gentico consiste en protenas, no parece lgico afirmar que la actividad
transformante reside en una mnima cantidad de protena contaminante en la fraccin de
DNA purificado y no en la que contiene la mayor parte de las protenas de la clula. Sin
embargo, tales crticas propiciaron la realizacin de nuevos controles experimentales que
siempre confirmaron las conclusiones precedentes. El equipo de Avery trat el extracto el
DNA purificado de las bacterias S con proteasas (enzimas que degradan las protenas) sin
que esto afectara a su actividad transformante. Por otra parte, el tratamiento con
desoxirribonucleasas (enzimas que degradan el DNA) destrua en pocos minutos cualquier
rastro de dicha actividad. Otros experimentos, realizados por R.D. Hotchkiss, confirmaron
que la actividad transformante del DNA no se restringa al carcter virulento o no de las
cepas bacterianas, ni al aspecto liso o rugoso de sus colonias, sino que tambin operaba de
manera anloga para otros caracteres hereditarios, como la resistencia a distintos tipos de
antibiticos.
Los nuevos resultados experimentales no consiguieron diluir el escepticismo reinante.
Si nueve aos despus de la publicacin de los trabajos de Avery la comunidad cientfica
acept por fin el papel del DNA como molcula portadora de la informacin gentica, no fue

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por que se hubiesen realizado nuevos controles con resultados ms convincentes, sino
porque los grandes avances que se produjeron en este perodo acerca de la qumica de los
cidos nucleicos disiparon cualquier duda al respecto.
2.2.-

LA REGLA DE EQUIVALENCIA DE CHARGAFF.

La principal dificultad a la hora de reconocer al DNA un papel relevante en la

herencia biolgica resida en que nadie comprenda, a la luz de los conocimientos existentes
acerca de la qumica de los cidos nucleicos, cmo poda desempearlo. Ya se ha comentado
que a comienzos de los aos cuarenta se consideraba que la molcula de DNA era un
tetranucletido cclico formado por los cuatro desoxirribonucletidos posibles (dAMP,
dGMP, dTMP y dCMP). Incluso cuando en el curso de esta dcada se estableci que el DNA
era en realidad una macromolcula con peso molecular muy superior al que cabra esperar de
un simple tetranucletido, se interpret que ste vendra a ser la unidad monomrica
repetitiva que formaba los grandes polmeros de DNA, de manera similar a lo que
representaba la glucosa en los polmeros montonos de almidn y glucgeno. Era evidente
que una macromolcula con estas caractersticas no poda ser el cristal aperidico de
Schrdinger.
La persistencia de la idea del
tetranucletido tena su razn de ser en que
los anlisis de la composicin qumica de
DNA procedente de diferentes fuentes
biolgicas
parecan
arrojar
siempre
proporciones equimolares de las cuatro bases
nitrogenadas (A, G, T y C). A finales de los
aos 40 Erwin Chargaff (Figura 19.7) adapt
las recin descubiertas tcnicas de
cromatografa sobre papel a la separacin y
cuantificacin de los componentes de los
cidos nucleicos y las emple en el anlisis
de diferentes muestras de DNA. La mayor
precisin de estas tcnicas le permiti
comprobar que las cuatro bases nitrogenadas
no se encontraban necesariamente en
proporciones exactamente iguales. Adems,
Chargaff encontr que la composicin en
bases nitrogenadas difiere ampliamente
segn la procedencia biolgica de la muestra
de DNA.
Puede resultar hoy extrao el que no se detectase antes esta amplia variacin. Lo
cierto es que en las muestras de DNA analizadas hasta entonces, la mayora de ellas
procedentes de organismos eucariontes, las proporciones de las distintas bases nitrogenadas
oscilaban unos pocos puntos porcentuales con respecto al 25% que exiga la hiptesis del
tetranucletido, de manera que los primitivos mtodos de anlisis no permitan distinguir los
resultados de los que se obtendran si efectivamente las cuatro bases se encontrasen en
proporciones equimolares. En los aos subsiguientes se analizaron muestras de DNA
procedentes de diferentes especies bacterianas, pudiendo comprobarse que en las clulas
procariotas el espectro de variacin de la composicin en bases nitrogenadas es todava
mucho ms amplio que en las clulas eucariotas.

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La publicacin de los resultados de Chargaff no slo trajo consigo el rechazo
definitivo de la hiptesis del tetranucletido, sino que provoc un vuelco en la opinin de los
cientficos acerca del papel de los cidos nucleicos. En efecto, si el DNA no era despus de
todo un polmero montono, se haba esfumado el principal inconveniente de la candidatura
de esta macromolcula a constituir la base fsico-qumica de la herencia biolgica. Un largo
polmero formado por cuatro tipos de nucletidos en diferentes ordenaciones s poda ser el
cristal aperidico formado por unos pocos elementos ismeros que Schrdinger haba
sugerido. Adems, el hecho de que la composicin en bases nitrogenadas del DNA variase
ampliamente de unas especies a otras poda ser un reflejo de su especificidad biolgica. La
informacin gentica podra muy bien estar cifrada en forma de la secuencia especfica de
bases nitrogenadas de la cadena polinucleotdica y el fenmeno de la mutacin podra
explicarse como un cambio fortuito en dicha secuencia.
Los analistas de la historia de la Biologa molecular dudan a la hora de atribuir a un
cientfico en particular la formulacin de las ideas precedentes. Ms bien se inclinan por
afirmar que, a partir de 1950, la teora pareca flotar en el ambiente, provocando una gran
efervescencia investigadora alrededor de la molcula de DNA en los aos sucesivos.
Adems de todo lo dicho hasta ahora, los resultados publicados por Chargaff
contenan una informacin adicional acerca de la molcula de DNA, que andando el tiempo
result de importancia capital: a pesar de la amplia variacin encontrada entre las muestras de
DNA de diferentes especies, en todas ellas la proporcin molar entre el total de bases pricas
y el de bases pirimdicas era prxima a 1. Lo mismo pareca ocurrir con la adenina y la
timina por una parte y la guanina y la citosina por otra. Esta afirmacin, conocida como la
regla de equivalencia de Chargaff, revela un rasgo esencial de la molcula de DNA: aunque
la composicin en bases nitrogenadas de este polmero puede variar sin ninguna restriccin,
se cumple siempre que el nmero de adeninas es igual al de timinas y el de guaninas igual al
de citosinas; y, como corolario, que el nmero de bases pricas es igual al de bases
pirimdicas.

[A] = [T]
[G] = [C]
----------------------------------[A+G] = [T+C]
Aunque cuando public sus resultados Chargaff manifest que la constancia de estas
proporciones era algo digno de resaltar (noticeable), se mostr extraordinariamente
prudente a la hora de considerar si se trataba de una simple coincidencia o si realmente
revelaba algn rasgo importante de la molcula de DNA. Realmente, hubiera resultado
asombroso que Chargaff pudiera intuir el significado de su regla de equivalencia con la
informacin de que dispona en 1950.
2.3.-

EL EXPERIMENTO DE HERSHEY Y CHASE.

Entre los microorganismos cuyo estudio contribuy en mayor medida a la

comprensin de la estructura y funcin del gen hay que destacar a los virus, que sern
analizados en detalle en un captulo posterior. A comienzos de los aos 50 del S. XX los
virus eran ya reconocidos como parsitos intracelulares obligados, con un grado de

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organizacin inferior al celular, que se reproducan dentro de las clulas a las que
parasitaban. Se les relacionaba acertadamente con un buen nmero de enfermedades humanas
de las que eran responsables y se haba detectado su presencia en distintas especies animales
y vegetales. Tambin se haban descubierto virus que parasitaban y destruan clulas
bacterianas, los llamados bacterifagos.
La estructura de los virus es extremadamente simple en comparacin con la de los
organismos con organizacin celular: los ms simples constan de una cpside de naturaleza
proteica en la que se encierra un cido nucleico que puede ser DNA o RNA.
En 1952 Alfred D.
Hershey y Marta Chase (Figura
19.8) disearon un experimento
con el objeto de elucidar los
detalles del proceso de infeccin
de clulas bacterianas de la
especie Escherichia Coli por
bacterifagos T4. Las partculas
infecciosas de este fago estn
compuestas exclusivamente por
DNA y protenas. Hershey y
Chase queran saber como se
comportaba uno y otro tipo de
macromolculas durante el
proceso de infeccin. Para ello,
idearon una ingeniosa tcnica de
marcaje
mediante
istopos
radiactivos. Se percataron de que en las partculas virales la prctica totalidad de los tomos
de fsforo se encontraban en el DNA (en los grupos fosfato de la cadena polinucleotdica)
mientras que la prctica totalidad de los tomos de azufre se encontraban en las protenas (en
los aminocidos metionina y cistena). As, decidieron utilizar los istopos radiactivos 32P y
35
S para delatar respectivamente la presencia de DNA y de protenas. Para obtener partculas
vricas marcadas permitieron el crecimiento de un cultivo de fagos T4 sobre clulas de E. coli
en un medio en el que la nica fuente de fsforo eran iones fosfato (PO43-) marcado con 32P,
de manera que este istopo se incorporaba a todas las biomolculas de las clulas bacterianas
y de los fagos que se reproducan en su interior. Por otra parte, hicieron lo propio con fagos
obtenidos en un cultivo con iones sulfato (SO42-) marcado con 35S, que se incorporara
igualmente a las biomolculas de bacterias y fagos. De este modo, una vez aislados y
purificados los fagos obtenidos en uno y otro cultivo, dispusieron de dos cepas virales, una de
ellas con el DNA marcado con 32P y otra con las protenas marcadas con 35S.
Con las cepas virales obtenidas Hershey y Chase procedieron a infectar dos cultivos
de E. coli no marcados radiactivamente (cada uno de ellos con una cepa diferente). Tras
permitir la infeccin por un corto perodo de tiempo separaron por centrifugacin las
partculas vricas que no haban conseguido adherirse a ninguna clula y volvieron a
suspender las bacterias infectadas en un medio de cultivo nuevo. A continuacin sometieron
esta suspensin de bacterias infectadas a una violenta agitacin por medio de un agitador
Waring (un dispositivo que genera fuertes turbulencias en el lquido sobre el que acta), de
manera que las partculas vricas se desprendan (eran literalmente arrancadas) de la
superficie celular sobre la que se haban fijado. Se procedi entonces a centrifugar la
suspensin con el objeto de separar las bacterias, que se depositaban en el fondo del tubo de
la centrfuga, de las partculas vricas sueltas, que permanecan en el lquido sobrenadante.

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Seguidamente, se midi en un contador Geiger la fraccin total de radiactividad que se
haba depositado en el fondo del tubo y la que permaneca en el lquido sobrenadante. Por
ltimo, se ensay la capacidad de las bacterias infectadas para producir nuevos fagos
descendientes en su interior. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
1. En el cultivo bacteriano infectado con fagos marcados con 32P, es decir, con DNA
marcado radiactivamente, la mayor parte de la radiactividad se haba depositado en el
fondo del tubo de la centrfuga. La fraccin que no lo haba hecho as se encontraba
en el lquido sobrenadante de la primera centrifugacin, es decir, que se encontraba en
las partculas vricas que no haban conseguido infectar a ninguna clula.
2. En el cultivo bacteriano infectado con fagos marcados con 35S, es decir, con protenas
marcadas radiactivamente, la mayor parte de la radiactividad permaneca en el lquido
sobrenadante obtenido tras la agitacin violenta. La fraccin restante corresponda a
estructuras de la cpside viral que no se haban desprendido de la superficie celular
por estar demasiado intensamente ligadas a ella.
3. En ambos cultivos las bacterias infectadas recuperadas tras la agitacin violenta
conservaban prcticamente intacta su capacidad para dar lugar a nuevas progenies
virales a su vez con capacidad infectiva.

Hershey y Chase extrajeron rpidamente conclusiones de estos resultados (Figura

19.8b). De los dos componentes de la partcula vrica slo el DNA penetraba en el interior de
la clula durante el proceso de infeccin (por eso el 32P apareca asociado a la fraccin celular
tras la centrifugacin). Las protenas del fago permanecan en el exterior de la clula durante
todo el proceso de infeccin y se desprendan de la superficie celular por agitacin (por eso el
35
S apareca en el lquido sobrenadante). Es decir, la partcula vrica infecciosa se fija a la
superficie celular y de alguna manera inyecta su DNA en el interior de la clula. La cpside
proteica, una vez inyectado en la bacteria el DNA que albergaba en su interior, ya no resulta
ms necesaria en el proceso de infeccin, como prueba el hecho de que la eliminacin de
estos fagos fantasma por agitacin no altere la capacidad de las clulas infectadas para dar
lugar a nuevas progenies virales. Es la molcula de DNA vrico la que, una vez dentro de la

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clula, parece tomar el control de su metabolismo para que ste se ponga al servicio del
virus y comience a fabricar nuevas partculas infecciosas atendiendo a las instrucciones
cifradas en esa misma molcula. En otras palabras: el DNA es el material gentico del
bacterifago T4.
Los resultados obtenidos por Hershey y Chase eran especialmente concluyentes en lo
que se refiere al papel del DNA como molcula de la herencia, pues en su experimento queda
claro que el nico nexo material entre dos generaciones sucesivas de bacterifagos es una
simple molcula de DNA.
Por otra parte, las conclusiones de este experimento concordaban y reforzaban las
obtenidas ocho aos antes por el equipo de Avery. Pero ahora el escenario haba cambiado:
los recientes descubrimientos acerca de la qumica de los cidos nucleicos junto con los
resultados obtenidos por Chargaff sobre la composicin en bases nitrogenadas de diferentes
muestras de DNA haban preparado el terreno para que estas conclusiones gozaran de una
aceptacin mucho mayor que la que se depar a las publicadas por Avery. Probablemente, la
publicacin del trabajo de Hershey y Chase en el otoo de 1952 sirvi de estmulo para que
un buen nmero de investigadores se concentraran durante los meses siguientes en elucidar la
estructura tridimensional de la molcula de DNA.
2.4.-

LA ESTRUCTURA DEL DNA: LA DOBLE HLICE.

Una de las tcnicas de anlisis que result de mayor

utilidad para la comprensin de la estructura tridimensional de
las biomolculas fue la cristalografa de difraccin de rayos X.
Como ya se ha comentado en un captulo anterior, esta tcnica
fue aplicada con xito al estudio de la conformacin
tridimensional de las protenas.
El primer investigador en dirigir su atencin a la
estructura tridimensional del DNA fue William Astbury
(pionero tambin en la aplicacin de la cristalografa de RX al
anlisis de la estructura de las protenas). Ya en 1945, tras
deducir de la elevada densidad de las muestras de DNA que los
nucletidos deban encontrarse en la cadena polinucleotdica
fuertemente empaquetados o apilados unos sobre otros,
obtuvo algunos difractogramas de RX de la molcula de DNA que, a pesar de su baja calidad,
demostraban que efectivamente los nucletidos se
encontraban apilados con una separacin de 0,34 nm entre
cada dos restos sucesivos.
A comienzos de los aos 50 tres centros de
investigacin rivalizaban en el anlisis de la estructura
tridimensional de las biomolculas mediante cristalografa
de RX. Uno de ellos era el Instituto de Tecnologa de
California (Cal Tech), cuya divisin de qumica, dirigida
por Linus Pauling,(Figura 19.10) se haba apuntado
varios xitos notables en el descubrimiento de la
estructura secundaria de las protenas. Otro era el
Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge
(Inglaterra), dirigido por Sir Lawrence H. Bragg (Figura
19.9), en el que grandes cristalgrafos como John
Kendrew y Max Perutz centraban su atencin en el estudio

12
de las estructuras terciaria y cuaternaria de las protenas globulares. Fue en el Laboratorio
Cavendish donde coincidieron a comienzos de 1951 dos jvenes investigadores, James D.
Watson y Francis H.C. Crick, que estaban llamados a ser quienes desvelaran finalmente el
misterio del gen. Un tercer grupo se haba formado en el Kings College de Londres bajo la
jefatura de John Randall, que contaba con la colaboracin de Maurice Wilkins y de la experta
cristalgrafa Rosalind Franklin (Figura 19.11).

Entre 1951 y 1953 se desat entre estos grupos una especie de carrera por identificar
la estructura tridimensional del DNA, carrera que se desboc por completo cuando la
publicacin del experimento de Hershey y Chase a finales de 1952 puso a todos los grupos
sobre la pista correcta de cual era en realidad la molcula de la herencia. Linus Pauling, en
principio favorito para ganar esta carrera dado su enorme prestigio, no tuvo xito en esta
ocasin; public, a comienzos de 1953, una propuesta de estructura para el DNA que
contena errores de bulto que obligaron a descartarla inmediatamente despus de su
publicacin. En el Kings College, Rosalind Franklin haba desarrollado una tcnica que le
permita obtener fibras de
DNA altamente orientadas y
obtener as difractogramas de
RX de una calidad y lujo de
detalles muy superiores a los
conocidos hasta entonces.
Wilkins
y Franklin
se
encontraban a comienzos de
1953 intentando encajar sus
datos de RX dentro de un
modelo plausible para el DNA.
Mientras tanto Watson y Crick
(Figura 19.12) trataban de
construir su propio modelo
tridimensional basndose en
difractogramas de una calidad
muy inferior. No obstante, su
trabajo se encontraba muy
avanzado; haban analizado
cuidadosamente la estructura
de los nucletidos individuales
y se haban percatado de que

13
los datos obtenidos por Chargaff tres aos antes, sobre las proporciones de las bases
nitrogenadas, deban tener algn significado relevante, lo que probablemente fue una de las
claves de su xito posterior. Fue entonces cuando Jim Watson, durante una conversacin con
Maurice Wilkins, pudo ver algunos de los difractogramas obtenidos por Rosalind Franklin; la
simple inspeccin visual de aquellos difractogramas proporcion a Watson las claves que le
faltaban para resolver finalmente la estructura del DNA. En pocas semanas Watson y Crick
terminaron de encajar sus propios datos con lo que se apreciaba en los difractogramas de
Franklin y elaboraron un modelo definitivo que fue publicado en el nmero de abril de la
revista Nature. La carrera haba terminado.
El modelo propuesto por Watson y Crick, mundialmente conocido como la doble
hlice (Figura 19.13), presentaba las siguientes caractersticas:
La molcula de DNA est
formada por dos cadenas
polinucleotdicas antiparalelas,
es decir, si una cadena se
recorre en direccin 53, su
vecina discurrira en direccin
35.
Ambas cadenas se encuentran
formando un arrollamiento
helicoidal
de
tipo
plectonmico, es decir, para
separarlas
habra
que
desenrollarlas girando una
sobre la otra. El arrollamiento
es adems dextrgiro.
El conjunto forma una
estructura cilndrica con un
dimetro constante de 2 nm.
Los esqueletos azcar-fosfato
de las cadenas polinucleotdicas se encuentran en el exterior de la estructura,
formando lo que seran las guas de una especie de escalera de caracol.
Las bases nitrogenadas se proyectan desde los esqueletos azcar-fosfato hacia el
interior de la estructura y se disponen apiladas por pares formando lo que equivaldra
a los peldaos de la escalera.
Los pares de bases nitrogenadas estn formados invariablemente por una purina y una
pirimidina. Adems, siempre se encuentran enfrentadas adenina con timina por una
parte y guanina con citosina por otra.
Las dos cadenas polinucleotdicas se encuentran unidas por puentes de hidrgeno
entre grupos funcionales de las bases nitrogenadas que forman cada par. Cada adenina
forma dos puentes de hidrgeno con la correspondiente timina y cada guanina tres con
la citosina. Pares de bases diferentes a los establecidos no podran formar puentes de
hidrgeno.
La distancia entre cada par de bases sucesivo es de 0,34 nm. Cada vuelta completa de
la hlice (paso de rosca) alberga exactamente 10 pares de nucletidos, lo que se
corresponde con una longitud de 3,4 nm. Ambas periodicidades aparecan reflejadas
en los difractogramas.
Uno de los aspectos ms interesantes del modelo de Watson y Crick resida en que no

14
slo encajaba con los datos de difraccin de RX sino que adems proporcionaba una
explicacin para la hasta entonces desconcertante regla de Chargaff. En efecto, si todos los
pares de bases eran necesariamente A-T o G-C, en cualquier muestra de DNA el nmero de
restos de adenina deba ser igual al de timina y el de guanina al de citosina, de lo que se
deduce que el nmero total de bases pricas debera ser igual al de bases pirimdicas.
Adems, este emparejamiento especfico de las bases nitrogenadas podra encerrar un
profundo significado biolgico, pues, como Watson y Crick sugeran en su artculo en
Nature, tal emparejamiento podra ser la base del mecanismo por el que el material gentico
creaba copias de si mismo en cada ciclo de reproduccin celular. La complementariedad
interna de la doble hlice, regida por la regla de Chargaff, haca que cada una de las dos
cadenas polinucleotdicas que la formaban pudiera ser utilizada como molde para sintetizar
otra con una secuencia de bases complementaria.
La publicacin del modelo de Watson y Crick en abril de 1953 y la gran difusin que
tuvo en los meses posteriores diluy rpidamente cualquier resto de escepticismo acerca del
papel del DNA como material hereditario, que ya no volvi a ser discutido. Todo ello supuso
una autntica revolucin en el seno de las ciencias biolgicas y el nacimiento de lo que se dio
en llamar biologa molecular, rea del conocimiento que tuvo un gran desarrollo en las
dcadas siguientes y que ha contribuido de forma decisiva a nuestra comprensin actual del
funcionamiento de los sistemas vivos. Hay que destacar, sin embargo, que los fsicos que
haban desembarcado en la biologa con la aspiracin romntica de encontrar otras leyes
fsicas todava desconocidas se quedaron sin su recompensa. Por el contrario, todo lo que
hoy sabemos acerca de cmo los genes se replican y controlan los procesos celulares es
perfectamente explicable en trminos de procesos fsico-qumicos convencionales que ya
eran conocidos a mediados del S XX. El misterio del gen, que Schrdinger propona desvelar,
no consista ms que en la simple formacin y ruptura de puentes de hidrgeno entre las
bases nitrogenadas del DNA.
2.5.-

ESTRUCTURAS ALTERNATIVAS DEL DNA.

15
La doble hlice del DNA tal como fue descrita por Watson y Crick representa la
estructura ms comn de esta macromolcula (la llamada forma B). Aos ms tarde se
demostr que el DNA puede existir en al menos dos formas alternativas (la forma A y la
forma Z) que difieren ligeramente de la estructura original en aspectos como las distancias
entre nucletidos sucesivos o los ngulos de enlace entre los componentes de estos
nucletidos (Figura 19.14). Sin embargo, se ha comprobado que en estas formas alternativas
estn presentes los rasgos esenciales del modelo de Watson y Crick, es decir, la estructura
helicoidal y el emparejamiento especfico de bases.
Por otra parte, se ha podido comprobar que en algunos virus el DNA aparece en
estado monocatenario (una sola cadena polinucleotdica por molcula en lugar de dos), lo que
constituye una excepcin a la primitiva afirmacin de que el DNA es siempre una doble
hlice de cadenas polinucleotdicas. Sin embargo, se trata de una excepcin que confirma la
regla, ya que incluso en estos virus el DNA pasa por un estado bicatenario transitorio, que
resulta imprescindible para su replicacin durante el ciclo de reproduccin viral.

2.6.-

DESNATURALIZACIN E HIBRIDACIN DEL DNA.

La molcula de DNA es muy estable, gracias a la gran cantidad de puentes de

hidrgeno que se establecen entre las bases nitrogenadas a lo largo de las cadenas
polinucleotdicas y a las interacciones hidrofbicas generadas entre los anillos aromticos
apilados de estas bases. Sin embargo, de manera similar a lo que ocurre con las protenas, la
molcula puede desestabilizarse y abandonar su conformacin tridimensional caracterstica
en doble hlice como respuesta a cambios en el pH o a aumentos de temperatura. Este
proceso se conoce con el nombre de desnaturalizacin y sucede a valores de pH prximos a
13 o temperaturas alrededor de 100 C .

La temperatura a la que un 50% de la doble hlice se encuentra separada se conoce

como temperatura de fusin (Tm); su valor difiere de unas muestras de DNA a otras y est en
funcin del contenido en pares G-C. Esto es debido a que, al estar los pares G-C unidos por
tres puentes de hidrgeno frente a los dos de los pares A-T, es necesaria una mayor cantidad
de energa para desestabilizar una doble hlice rica en pares G-C. As, la temperatura de
fusin de una muestra de DNA es un indicador de su composicin en bases nitrogenadas.
La desnaturalizacin del DNA (Figura 19.15) puede seguirse experimentalmente
midiendo en un espectrofotmetro la absorcin de luz ultravioleta por la disolucin que lo
contiene. La absorcin de luz ultravioleta aumenta considerablemente con la
desnaturalizacin debido a que los anillos aromticos de las bases nitrogenadas absorben
mucha ms luz de esa longitud de onda cuando se encuentran desplegadas que cuando estn
apiladas en el interior de la doble hlice.
De manera anloga a lo que sucede con las protenas, la desnaturalizacin del DNA
es, en determinadas condiciones experimentales, reversible, siendo este proceso conocido
como renaturalizacin. Si las cadenas polinucleotdicas que resultan de la desnaturalizacin

16
se incuban a unos 65 C durante varias horas, se comprueba que las dobles hlices
originales se reconstruyen espontneamente. Paralelamente se produce el consiguiente
descenso en la absorcin de luz ultravioleta.
La renaturalizacin sirvi de base para el desarrollo de las llamadas tcnicas de
hibridacin del DNA. Si se mezclan muestras de DNA desnaturalizado procedentes de
especies diferentes y se incuba la mezcla en condiciones adecuadas para que se produzca la
renaturalizacin, una fraccin de las dobles hlices obtenidas sern hbridas, es decir, con
cadenas polinucleotdicas de una y otra especie. El porcentaje de hibridacin ser mayor
cuanto ms parecidas sean las secuencias de nucletidos de ambas especies, de manera que
este porcentaje puede utilizarse como un indicador del parentesco evolutivo existente entre
ellas. Antes de que estuviesen disponibles las actuales tcnicas de secuenciacin del DNA se
utilizaron con profusin las tcnicas de hibridacin para el anlisis de dicho parentesco.

3.-

EL RNA: ESTRUCTURA Y TIPOS.

Como ya se ha comentado con anterioridad, el conocimiento de la qumica elemental

de los cidos nucleicos se demor hasta la dcada de los aos 20 del S XX. En la dcada
siguiente fue reconocida por P. A. Levene la existencia de dos tipos diferentes de cido
nucleico (DNA y RNA) que diferan en algunos de sus componentes moleculares (el RNA
inclua ribosa y uracilo en lugar respectivamente de la desoxirribosa y la timina del DNA).
En esta misma poca se realizaron estudios citolgicos, usando colorantes y reactivos
qumicos especficos, para determinar la localizacin intracelular de uno y otro tipo de cido
nucleico. Se comprob que en las clulas eucariotas la casi totalidad del DNA celular se
encuentra en el interior del ncleo mientras que la mayor parte del RNA se encuentra en el
citoplasma (aunque algunas zonas del ncleo, en particular el nuclolo, tambin son ricas en
RNA). Por otra parte, del total de RNA citoplasmtico una fraccin muy importante se
encontraba asociado a determinadas protenas para formar unas partculas, visibles al
microscopio electrnico, que fueron denominadas ribosomas. Experimentos realizados
utilizando aminocidos marcados radiactivamente pronto demostraron que los ribosomas eran
el lugar de la clula donde se llevaba a cabo la sntesis de las protenas, por lo que ya desde
entonces se asoci al RNA con este proceso. Sin embargo, hubieron de pasar todava algunos
aos hasta que se comprendi cual es el papel concreto que el RNA desempea en el mismo.
3.1.-

ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL RNA.

La estructura tridimensional del RNA difiere claramente de la del DNA. En general

las molculas de RNA son monocatenarias (una sola cadena polinucleotdica), por lo que su
composicin en bases nitrogenadas no se ajusta a la regla de equivalencia de Chargaff. Sin
embargo, existen molculas de RNA que, aun siendo monocatenarias, presentan tramos con
secuencias de bases complementarias los cuales adoptan estructuras en doble hlice,
denominadas horquillas, de caractersticas anlogas a las del DNA. En ocasiones, cuando las
secuencias complementarias no son contiguas, se forman bucles de bases no emparejadas
dentro de las horquillas. En las dobles hlices de RNA la adenina se empareja con el uracilo,
que tiene estructura similar e idnticas posibilidades de formar puentes de hidrgeno que la
timina, y la guanina con la citosina.
Hoy sabemos que la funcin primordial del RNA en las clulas consiste en servir de
intermediario para transferir la informacin gentica cifrada en el DNA a la estructura
tridimensional de las protenas en el proceso de expresin de la informacin gentica, que
analizaremos ms adelante en este captulo. De todos modos, en algunos virus el RNA

17
constituye en s mismo el material gentico adems de servir de intermediario en el
proceso de sntesis de las protenas virales. En algunos de estos virus la molcula de DNA
que constituye el cromosoma viral es bicatenaria y presenta en toda su longitud estructura de
doble hlice. Tambin existen virus con cromosomas de RNA monocatenario.
3.2.-

TIPOS DE RNA.

Existen varios tipos de RNA que difieren en el tamao, estructura y funcin especfica
de sus molculas. Todos ellos se sintetizan en el ncleo celular a partir de secuencias de DNA
que sirven como molde y una vez sintetizados atraviesan los poros nucleares y se incorporan
a sus diferentes destinos en el citoplasma.
a) RNA ribosmico (rRNA).- Constituye alrededor del 80% del RNA celular total. Sus
molculas son monocatenarias y de gran longitud (varios miles de nucletidos). Algunas
de ellas presentan horquillas y bucles con secuencias internas complementarias. Se
encuentra en el citoplasma donde, en asociacin con diferentes protenas, forma parte
estructural de los ribosomas.

b) RNA de transferencia (tRNA).- Sus molculas son relativamente pequeas (75 a 90

nucletidos de longitud). Presentan una estructura caracterstica con horquillas y bucles
que les dan el aspecto de hojas de trbol cuando se representan sobre un plano: su
estructura tridimensional presenta en realidad forma de L invertida. El tRNA presenta
bases nitrogenadas diferentes a las caractersticas de los cidos nucleicos en una
proporcin que puede alcanzar el 10% del total. Su funcin consiste en transportar de
manera especfica a los diferentes aminocidos hasta los ribosomas para que all sean
ensamblados en las cadenas polipeptdicas en formacin. Existen alrededor de 50 tipos de
tRNAs que difieren en sus secuencias de nucletidos y en algunos aspectos de su
conformacin tridimensional; sin embargo todos ellos comparten algunas caractersticas:
En el extremo 5 de la cadena polinucleotdica hay un triplete de bases nitrogenadas
una de las cuales es siempre guanina.
En el extremo 3 la cadena polinucleotdica finaliza con la secuencia CCA y estas
bases no estn emparejadas. En este lugar es donde el tRNA se une a su aminocido

18
correspondiente.
La molcula presenta tres brazos cada uno de los cuales consta de una horquilla con
estructura en doble hlice y un bucle formado por bases sin emparejar (Figura 19.16). Se
distinguen el brazo T (por donde la molcula se une al ribosoma), el brazo D (lugar que
reconocen los enzimas especficos que unen los tRNA con sus aminocidos
correspondientes) y el brazo A (cuyo bucle presenta un triplete de bases, denominado
anticodon, que es complementario de otro triplete, llamado codon, que se encuentra en el
RNA mensajero, siendo esta complementariedad de gran importancia en el proceso de
sntesis de protenas).
c) RNA mensajero (mRNA).- Sus molculas estn formadas en general por varios miles de
nucletidos y tienen una estructura lineal, aunque en ocasiones presentan horquillas y
bucles. Su misin es trasladar la informacin gentica almacenada en el DNA hasta los
ribosomas para que all se exprese en forma de protenas. Los mRNA son en general
molculas de vida muy corta, ya que una vez cumplida su misin son degradados por
unos enzimas llamados ribonucleasas.
d) RNA nucleolar (nRNA).- Se encuentra en el nuclolo, donde tiene lugar su sntesis. Una
vez sintetizado se fragmenta por accin enzimtica y da lugar a diferentes tipos de rRNA
y tRNA.

4.-

LA REPLICACIN DEL DNA.

Cada vez que una clula se reproduce por divisin su material gentico debe ser
copiado para que las dos clulas hijas dispongan una copia completa del mismo. Uno de los
requisitos que debera cumplir una eventual molcula de la herencia, segn apuntaba
Schrdinger, es precisamente la capacidad para crear copias fieles de s misma de manera que
la informacin pudiese ser transmitida en las sucesivas generaciones celulares. Watson y
Crick se percataron, y as lo sugeran en su artculo de Nature, de que el modelo de
estructura en doble hlice que haban elaborado proporcionaba las bases fsico-qumicas para
un mecanismo de replicacin del DNA. En efecto, la estricta complementariedad de bases
nitrogenadas a lo largo de la doble hlice permite que cada una de las dos cadenas
polinucleotdicas que la forman pueda ser utilizada como molde para sintetizar una nueva
cadena complementaria. As, desenrollando las dos cadenas de una hlice original y
utilizando cada una de ellas como molde para sintetizar una nueva cadena, en la que los
nucletidos se irn aadiendo
conforme a las reglas que
rigen el emparejamiento de
las bases, se obtendrn dos
dobles
hlices
hijas
idnticas, portadoras de la
misma
informacin.
El
mecanismo que aqu se ha
esbozado fue propuesto por
Watson y Crick en un
artculo publicado en el
nmero de Nature de mayo
de 1953, aclarando as lo que
sugeran en su artculo del
mes anterior. Tal mecanismo
fue
conocido
como

19
replicacin semiconservativa para resaltar el hecho de que cada una de las dobles hlices
hijas conserva la mitad, es decir, una de las cadenas, de la doble hlice original.
El modelo de replicacin semiconservativa propuesta por Watson y Crick pareci
acertado a muchos investigadores por su sencillez y elegancia. Sin embargo, se plantearon
algunos modelos alternativos que no podan ser descartados a priori (Figura 19.17). Uno de
ellos era el modelo de replicacin conservativa, segn el cual la doble hlice original, sin
perder su integridad, sirve de patrn para sintetizar una doble hlice hija totalmente nueva, de
manera que la doble hlice original se conserva intacta a lo largo de las sucesivas
generaciones celulares. Otro era el modelo de replicacin dispersiva, segn el cual la doble
hlice original se descompone en infinidad de pequeos fragmentos, cada uno de los cuales
sirve de molde para sintetizar un fragmento complementario siguiendo las reglas de
emparejamiento de bases; a continuacin los fragmentos resultantes se empalman en el orden
correcto para dar lugar a dos dobles hlices hijas cada una de las cuales contiene fragmentos
de la original y fragmentos de nueva sntesis.
El modelo conservativo fue propuesto por algunos investigadores a la vista de algunas
dificultades tcnicas que pareca presentar el modelo semiconservativo. Estos investigadores
eran de la opinin de que la doble hlice del DNA se replicaba de una manera indirecta,
transfiriendo primero su informacin a un intermediario de otra naturaleza (probablemente
una protena), que servira despus de patrn para sintetizar una doble hlice totalmente
nueva. Por otra parte, el modelo dispersivo gozaba de muy pocos partidarios, ya que la
correcta ordenacin de los fragmentos de DNA requerira la presencia de una molcula
distinta del propio DNA que poseyese la informacin necesaria para ordenarlos; ello sera
equivalente a afirmar que esta molcula, y no el DNA, era en realidad el material gentico,
razn por la cual este modelo slo tena un cierto apoyo entre los pocos investigadores que
seguan atribuyendo este papel a las protenas.
4.1.-

EL EXPERIMENTO DE MESELSON Y STAHL.

Un brillante experimento realizado por M. S.
Meselson y F. W. Stahl (Figura 19.18) en 1957
demostr que el modelo semiconservativo propuesto
por Watson Y Crick era el correcto. El diseo
experimental se bas en el uso de dos istopos
estables del nitrgeno: el istopo ms abundante en
la naturaleza (14N) y un istopo pesado (15N), ms
escaso. En primer lugar Meselson y Stahl
dispusieron dos cultivos de la bacteria E. coli
creciendo sobre un medio en el que la nica fuente
de nitrgeno era NH4Cl. En uno de los cultivos el
NH4Cl contena el istopo normal del nitrgeno
(14N) y en el otro el istopo pesado (15N). De este
modo, el istopo correspondiente a cada medio de
cultivo se incorporaba a todas las biomolculas
nitrogenadas de las bacterias que crecan en l,
incluyendo los cidos nucleicos. A continuacin
extrajeron el DNA de las clulas de uno y otro
cultivo, lo mezclaron y lo sometieron a
centrifugacin a alta velocidad en un gradiente de
densidad de CsCl. As comprobaron que el DNA

20
ligero y el DNA pesado que haban incorporado uno u otro istopo se situaban en dos
bandas perfectamente distinguibles en el
tubo de la centrfuga (Figura 19.19).
En una segunda fase de su
experimento
Meselson
y
Stahl
transfirieron bacterias que haban estado
reproducindose
durante
varias
generaciones en un medio de cultivo con
nitrgeno pesado a un medio de cultivo
con nitrgeno ligero, de manera que, a
partir del instante de la transferencia,
todo el DNA que se sintetizase en las
clulas
transferidas
incorporara
exclusivamente
nitrgeno
ligero.
Seguidamente, a intervalos regulares de
20 minutos (equivalentes al perodo de
generacin de las bacterias) extrajeron el
DNA de sucesivas muestras del cultivo y
lo sometieron a centrifugacin en
gradiente de densidad de CsCl.
El xito del experimento de
Meselson y Stahl radic en que su diseo
permita formular predicciones sobre los
resultados en funcin de cada uno de los
tres modelos de replicacin propuestos,
siendo
los
resultados
predichos
perfectamente
distinguibles
y
excluyentes entre s.
En efecto, si el modelo de
replicacin fuese semiconservativo como haban predicho Watson y Crick, todo el DNA
extrado tras los 20 primeros minutos consistira en dobles hlices formadas por una cadena
ligera (recin sintetizada) y otra cadena pesada (la original), lo que se traducira en un DNA
de densidad hbrida que en el tubo de la centrfuga ocupara una posicin intermedia entre
las correspondientes al DNA pesado y el ligero. Transcurridos otros 20 minutos, es decir,
en la segunda generacin de bacterias tras la transferencia, la mitad de las dobles hlices
seran de densidad hbrida mientras que la otra mitad seran totalmente ligeras, dando lugar
en el tubo de la centrfuga a dos bandas en las posiciones correspondientes.
Si por el contrario la replicacin respondiese a un modelo conservativo nunca
apareceran bandas hbridas, pues el DNA de las bacterias de la primera generacin estara
compuesto por dobles hlices la mitad de las cuales seran totalmente ligeras (las recin
sintetizadas) y la otra mitad totalmente pesadas (las originales), de manera que en el tubo de
la centrfuga aparecera una banda ligera y otra pesada. Lo mismo ocurrira en la segunda
generacin de bacterias, con la nica diferencia de que la proporcin de hlices ligeras
respecto a hlices pesadas sera de 3:1 en lugar de 1:1, lo que se traducira en una mayor
densidad de molculas de DNA ligero en la banda correspondiente.
En el caso de que la replicacin siguiese un modelo dispersivo los resultados
obtenidos en la primera generacin seran iguales a los que predice el modelo
semiconservativo: el DNA extrado de las bacterias de la primera generacin estara formado
por fragmentos ligeros y fragmentos pesados que se repartiran en una y otra cadena

21
polinucleotdica de la doble hlice, y ello dara lugar a la aparicin de una nica banda en
el tubo de la centrfuga que ocupara la posicin correspondiente al DNA de densidad
hbrida. Esta banda hbrida persistira en la segunda y sucesivas generaciones, aunque cabra
esperar que tras varios ciclos de replicacin, al ir aumentando la proporcin de fragmentos
ligeros con respecto a los pesados, empezasen a aparecer dobles hlices totalmente ligeras
que iran formando una banda en su posicin correspondiente.
Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl se ajustaban con precisin a los
predichos por el modelo de replicacin semiconservativa. No obstante, dado que tambin
eran parcialmente compatibles con el modelo dispersivo (al menos en lo que se refiere a las
bandas obtenidas con el DNA de la primera generacin), realizaron una posterior
comprobacin con el objeto de descartar definitivamente este modelo. Tomaron una nueva
muestra de DNA de las bacterias de la primera generacin y, antes de centrifugarlo,
procedieron a desnaturalizarlo. As, al separar fsicamente las dos cadenas polinucleotdicas
que integran la doble hlice deberan obtenerse dos bandas (una ligera y otra pesada) en el
tubo de la centrfuga en el caso de que la replicacin fuese semiconservativa, o bien una sola
banda hbrida en el caso de que fuese dispersiva. Los resultados de este ltimo experimento
no dejaban lugar a dudas: Watson y Crick haban acertado tambin con el mecanismo que
rige la replicacin del DNA.
4.2.-

OTRAS CARACTERSTICAS DE LA REPLICACION.

Una vez demostrado el carcter semiconservativo de la replicacin del DNA se

plantearon nuevos interrogantes acerca de algunos aspectos del proceso. En primer lugar cabe
preguntarse si en la replicacin de una gran molcula de DNA se desenrollan y separan
primero las dos cadenas polinucleotdicas en toda su longitud para luego servir cada una de
ellas como molde para la sntesis de su complementaria?, o bien los procesos de separacin
de las cadenas y la sntesis de sus complementarias estn de alguna manera acopladas en el
espacio y en el tiempo?

22
Los estudios realizados por John Cairns y otros investigadores en la dcada de los
aos 60 demostraron que la replicacin del DNA es ordenada y secuencial, es decir, se inicia
en unos puntos fijos del cromosoma, y el crecimiento de las nuevas cadenas de DNA se
produce de manera simultnea al desenrollamiento de la doble hlice original.
Para elucidar este y otros aspectos de la replicacin del DNA, Cairns utiliz una
tcnica basada en istopos radiactivos denominada autorradiografa. En un cultivo de E. coli
introdujo en el medio de cultivo timina tritiada (timina en la que los tomos de hidrgeno
haban sido sustituidos por su istopo radiactivo 3H), de manera que esta base nitrogenada se
incorporaba a las cadenas de DNA en crecimiento. Transcurridas dos generaciones procedi a
la extraccin del DNA bacteriano mediante una tcnica que respetaba la integridad de las
molculas extradas (lisis de la pared celular con enzimas especficos) y permiti que estas
molculas sedimentasen lentamente sobre un papel de filtro que despus fue cuidadosamente
montado sobre una placa con emulsin fotosensible. La placa se guard en la oscuridad
durante dos meses y a continuacin se procedi a su revelado. Las emisiones de los tomos
de tritio incorporados al DNA en los restos de timina haban impresionado la placa
fotogrfica creando unas figuras que se correspondan con cromosomas bacterianos en
distintos estadios de replicacin (Figura 19.20). El anlisis de estas imgenes, adems de
proporcionar la primera prueba directa del carcter circular del cromosoma bacteriano,
condujo a la conclusin de que la replicacin comienza en un nico origen, en el que se
forma una nica burbuja de replicacin que va creciendo a medida que el proceso avanza.
Posteriores refinamientos de la tcnica de autorradiografa, consistentes en el uso de
pulsos de timina tritiada de pocos segundos de duracin, permitieron obtener imgenes de
las zonas del cromosoma en las que est teniendo lugar la replicacin del DNA en un instante
dado. El anlisis de estas imgenes revel que el proceso de replicacin es bidireccional: dos
horquillas de replicacin avanzan simultneamente en direcciones opuestas partiendo de un
nico origen.
Aos ms tarde, usando las mismas tcnicas, se pudo comprobar que en los
cromosomas eucariotas la replicacin se atiene a los mismos principios que en los
procariotas, con la excepcin de que en aqullos existen varios orgenes de replicacin que
dan lugar a varios ojos de replicacin por cromosoma. Estos ojos de replicacin crecen de
manera bidireccional hasta que se funden con sus vecinos completando el proceso.
4.3.-

SNTESIS ENZIMTICA DEL DNA.

El proceso de replicacin del DNA implica la adicin de nucletidos a una cadena

polinucleotdica en crecimiento complementaria de la que le sirve como molde. Los
sucesivos nucletidos deben establecer enlaces fosfodister con los restos precedentes y la
formacin de estos enlaces requiere energa. Debido a ello, los nuevos nucletidos que se
incorporan al proceso no pueden ser nucletidos monofosfato sino que las clulas deben
recurrir a nucletidos trifosfato, mucho ms energticos, cuya escisin pirofosforoltica
proporciona la energa necesaria para la formacin de dichos enlaces. La incorporacin de un
resto nucleotdico a la cadena en crecimiento supone pues la siguiente reaccin qumica:

DNA (n) + dNTP DNA (n+1) + PPi

Es conveniente resaltar que esta reaccin qumica, como la mayora de las que
ocurren en las clulas vivas, es reversible, por lo que altas concentraciones de pirofosfato

23
inorgnico podran hacer revertir esta reaccin hacia la degradacin (pirofosforlisis) del
DNA celular, con la consiguiente muerte de la clula. Por ello, las clulas vivas disponen de
un enzima de gran eficacia y ubicuidad, llamado pirofosfatasa inorgnica, que degrada
rpidamente el pirofosfato (PPi) a ortofosfato (2 Pi) con el objeto de preservar la integridad de
los cidos nucleicos celulares a pesar del considerable gasto energtico que esta degradacin
supone.
La reaccin de polimerizacin del DNA, como
todas las reacciones qumicas celulares requiere de la
actuacin de enzimas especficos que catalicen y
controlen este proceso. A mediados de los aos 50 del
S.XX, en paralelo con los estudios realizados acerca del
mecanismo de la replicacin, el equipo Arthur
Kornberg (Figura 19.21) inici sus investigaciones
acerca de la sntesis enzimtica del DNA en la bacteria
E. coli. Pronto consigui identificar y aislar un enzima
capaz de catalizar la reaccin de polimerizacin que fue
denominado DNA polimerasa I. Estudios posteriores
pusieron de manifiesto que el proceso de replicacin
presentaba una gran complejidad y que era necesaria la
concurrencia de toda una batera de enzimas y otras
protenas no enzimtitcas para que culminase con xito.
Hoy, tras 50 aos de estudios, se tiene un amplio
conocimiento acerca de todo este complejo proceso y de los enzimas implicados, tanto en lo
tocante a las clulas procariotas como, aunque en menor medida, a las eucariotas.
A continuacin se describe el equipo de enzimas y protenas no enzimticas
implicados en la sntesis del DNA con sus caractersticas ms relevantes:
Protenas DNA A (producto del gen del mismo nombre).- Relajan la doble hlice en
la zona donde ha de iniciarse la replicacin preparndola para la accin de las
siguientes protenas.
Helicasas.- Son de varios tipos (protenas B, C, J, K). Su actividad consiste en
desenrollar las dos cadenas de la doble hlice hacindolas girar alrededor del eje
central. En el inicio del proceso dan lugar a la llamada burbuja u ojal de
replicacin. A partir del origen dos equipos de helicasas se desplazan en sentidos
opuestos haciendo avanzar las dos horquillas de replicacin.
Protenas SSB (single strand binding).- Molculas que se unen en gran nmero a las
cadenas sencillas de DNA y las estabilizan con el objeto de evitar que vuelvan a
asociarse y que se cierre as la burbuja de replicacin.
Girasas y topoisomerasas.- El desenrollamiento de la doble hlice por accin de las
helicasas genera tensiones en la molcula de DNA que tiende a formar
superenrollamientos del tipo de los que aparecen en el cable de un auricular
telefnico cuando inadvertidamente lo hacemos girar sobre s mismo. Para relajar
estas tensiones unos enzimas llamados topoisomerasas cortan de trecho en trecho
algn enlace fosfodister de la cadena molde y lo vuelven a soldar despus de que
otras protenas, las girasas, liberan la tensin mediante el giro del extremo que queda
temporalmente libre.
Exonucleasas.- Enzimas que escinden nucletidos a partir del extremo de una cadena
polinucleotdica. Unas actan en direccin 53 y otras lo hacen en direccin
35. Su funcin es eliminar fragmentos de cadenas polinucleotdicas en algunas
fases del proceso de replicacin.

24
DNA Polimerasas.- Enzimas que aaden nucletidos a una cadena de DNA en
crecimiento que es complementaria de otra que utilizan como molde. Existen varios
tipos de DNA polimerasas que difieren en sus caractersticas y actividades. En clulas
procariotas se han identificado 3 DNA polimerasas (I, II y III) mientras que en clulas
eucariotas se han identificado varias (, , , , ). Todas las DNA polimerasas
conocidas aaden nucletidos a una cadena que crece en direccin 53 recorriendo
el molde en direccin 35, es decir, catalizan la condensacin del grupo 3 OH
libre del ltimo nucletido de la cadena con el grupo -5fosfato del nucletido que se
aade. Por otra parte, todas necesitan de una cadena que acte como molde, es decir,
no pueden aadir nucletidos sin ms a una cadena polinucleotdica simple. Otro
rasgo importante de todas las DNA polimerasas es que todas ellas pueden prolongar
una cadena polinucleotdica pero ninguna de ellas puede iniciarlas, es decir, no
pueden colocar el primer nucletido de la cadena sino que precisan de un tramo
preexistente, que en lo sucesivo llamaremos primer o cebador, al que aadir nuevos
nucletidos.
Primasas.- Enzimas capaces de sintetizar una cadena corta de RNA utilizando un
molde de DNA (en realidad son RNA polimerasas-DNA dirigidas). A diferencia de las
DNA polimerasas, las primasas s pueden iniciar cadenas. Son las encargadas de
crear los cebadores de RNA sobre los que despus han de actuar las DNA
polimerasas.
DNA Ligasas.- Enzimas que establecen puentes fosfodister entre nucletidos
adyacentes que se encuentran en fragmentos diferentes de cadena polinucleotdica.
Son necesarias en distintos momentos del proceso replicativo para soldar los
fragmentos sueltos.
Adems de los descritos existen algunos enzimas mixtos, que en una sola molcula
presentan ms de una actividad. Por ejemplo, las DNA polimerasas presentan en general
actividad de exonucleasa en una o en ambas direcciones de la cadena.
A continuacin analizaremos el proceso de replicacin del DNA detenindonos en el
papel que desempea cada uno de los distintos tipos de enzimas y protenas no enzimticas
implicadas y en la secuencia temporal de su actuacin. Por ser el ms estudiado, adoptaremos
como modelo el proceso de replicacin en la bacteria E. coli, que con muy pequeas
modificaciones es extensible a todas las clulas procariotas. Seguidamente se analizarn
algunas particularidades que presenta el proceso replicativo en las clulas eucariotas.
Distinguiremos en el proceso tres fases: iniciacin, elongacin y terminacin.
FASE DE INICIACIN.
La replicacin del DNA se inicia en un lugar concreto del cromosoma denominado
origen de replicacin. Existe un nico origen por cromosoma en todas las especies
bacterianas conocidas. El origen de replicacin consiste en un tramo de 245 pares de base de
longitud, conocido como oriC, que contiene varias repeticiones en serie de secuencias
especficas de nucletidos que han podido ser identificadas. Estas secuencias son ricas en
pares A-T, lo que facilita la apertura de la doble hlice, y son reconocibles por protenas
especficas que se fijan a ellas.
Un ciclo de replicacin comienza cuando varias unidades monomricas de la protena
especfica DNA A se fijan sobre las correspondientes secuencias especficas repetidas de 9
pares de bases de longitud dentro del tramo oriC (Figura 19.22). A continuacin se van
aadiendo nuevas unidades monomricas de DNA A que forman un complejo nucleoproteico
con unas veinte de estas unidades y el tramo oriC de la doble hlice de DNA que se dispone

25
formando un bucle alrededor de ellas. Algunos de los monmeros de DNA A quedan as
situados sobre las secuencias especficas repetitivas de 13 pares de bases de longitud que se
encuentran en el otro extremo de oriC, provocando en ellas una desestabilizacin de la doble
hlice y la consiguiente apertura de la burbuja de replicacin. La protena DNA A tiene la
funcin de reconocer el origen de replicacin, provocar la apertura de la burbuja y facilitar la
entrada de las dems protenas que forman parte del complejo de iniciacin.

Una vez abierta la burbuja de replicacin se introducen en ella las protenas

denominadas DNA B y DNA C. La primera de ellas tiene actividad helicasa y acta
agrandando la burbuja de replicacin (dos molculas de DNA B actan en direcciones
opuestas haciendo avanzar las recin creadas horquillas). La presencia de DNA C se requiere
nicamente para que DNA B inicie su actuacin, abandonando el complejo inmediatamente
despus. Por el contrario, la helicasa DNA B, a la que posteriormente se unen las helicasas
DNA J y DNA K, permanece en su lugar y sigue actuando tambin durante la fase de
elongacin.
A medida que la burbuja de replicacin se va haciendo mayor van quedando
expuestos tramos cada vez mayores de DNA de cadena sencilla. A estos tramos se unen las
protenas SSB con el objeto de protegerlos del ataque de nucleasas que podran degradarlos y
de evitar que se reconstruya la doble hlice cerrndose con ello la propia burbuja de
replicacin.
Dado que no existe ninguna DNA polimerasa capaz de iniciar cadenas
polinucleotdicas se hace necesaria ahora la concurrencia de una primasa (protena DNA G)
que inicia una cadena corta de RNA (unos 12 nucletidos de longitud) que actuar como
cebador al que la DNA polimerasa podr aadir nucletidos en la fase de elongacin. La
primasa DNA G junto con la helicasa DNA B forman una unidad funcional denominada
primosoma cuya integridad es necesaria para que la iniciacin tenga lugar.
FASE DE ELONGACIN.
La fase de elongacin comienza con la progresin en ambas direcciones de las

26
horquillas de replicacin mediante la accin de las helicasas, que van desenrollando la
doble hlice. La accin combinada de girasa y topoisomerasa en ambas horquillas va
relajando las tensiones asociadas al superenrollamiento. Mientras tanto, las protenas SSB van
estabilizando los tramos de cadena sencilla que quedan temporalmente expuestos. Todas estas
actuaciones se prolongan durante toda la fase de elongacin.
Es ahora cuando se pone de manifiesto un
problema tcnico que afecta a todo el proceso de
replicacin y que las clulas vivas, en el transcurso
de su evolucin, se han visto obligadas a solucionar.
Dado que las dos cadenas polinucleotdicas de una
doble hlice son antiparalelas, cuando una horquilla
de replicacin avanza, lo hace en la direccin 53
para una de las cadenas y en direccin 35 para
la otra. Por otra parte, se ha comentado ya que todas
las DNA polimerasas conocidas aaden nucletidos
a una cadena que crece en direccin 53 mientras
que recorren el molde en la direccin opuesta. Por
todo ello, la sntesis de DNA slo puede acompaar
al avance de una horquilla de replicacin en una de
las cadenas (la que la DNA polimerasa recorre como
molde en direccin 35). Qu ocurre entonces
con la otra cadena? El investigador japons R.
Okazaki (Figura 19.23) demostr en 1968,
utilizando el marcaje radiactivo con timina tritiada, que la sntesis en esta otra cadena es
discontinua: las DNA polimerasas incorporan nuevos nucletidos en direccin contraria a la
de avance de la horquilla generando unos fragmentos de DNA de 1.000 a 2.000 nucletidos
de longitud, denominados fragmentos
de Okazaki (Figura 19.24). La cadena
en la que la sntesis es continua se
denomina hebra conductora (leader
strand) y aquella en la que la sntesis es
discontinua se denomina hebra
rezagada (lagging strand). Como
resulta evidente, el inicio de cada
fragmento debe aguardar a que la
horquilla
avance
la
longitud
correspondiente para luego ir creciendo
en direccin contraria a dicho avance.
Okazaki y sus colaboradores demostraron en 1972 que cada fragmento recin formado lleva
unido su correspondiente cebador que deber ser despus eliminado.
En E. coli se han descubierto tres DNA polimerasas diferentes que poseen distintas
combinaciones de actividad polimerasa y exonucleasa (Tabla 19.1). La actividad exonucleasa
35 tiene una funcin correctora: cuando se introduce un nucletido incorrecto esta
actividad lo elimina y el enzima se desplaza un lugar hacia atrs para introducir el correcto.
Se ha podido comprobar que entre estos enzimas es la DNA polimerasa III la responsable
principal del proceso replicativo, aunque la DNA polimerasa I tambin desempea una
importante funcin en el mismo. La DNA polimerasa II tiene una actividad relacionada con la
reparacin del DNA ms que con la replicacin.

27

Actividad
polimerasa

DNA pol I

DNA pol II

DNA pol III

SI

SI

SI

SI

SI

NO

SI

NO

NO

Reparacin DNA

Replicacin DNA

Actividad
Exonucleasa
35

Actividad
Exonucleasa
53

Replicacin DNA

Funcin biolgica
Eliminacin cebadores
Tabla 19.1

Una vez colocados los dos primeros

cebadores por la primasa, la DNA polimerasa III
comienza a aadirles nucletidos en direccin
53 iniciando as las hebras conductoras de
ambas horquillas de replicacin. Nos referiremos
en lo sucesivo a lo que ocurre en una de estas
horquillas, considerando que los procesos que
ocurren en la otra son anlogos. Cuando la hebra
conductora ha avanzado entre 1.000 y 2.000
nucletidos la primasa coloca el cebador del
primer fragmento de Okazaki, que a continuacin
es prolongado por la DNA polimerasa III hasta
que se encuentra con el cebador de la hebra
conductora de la otra horquilla de replicacin y
ah se desprende. Este proceso se repite cuantas
veces sea necesario, a medida que el equipo de
helicasas, girasa y topoisomerasa va abriendo la
doble hlice, hasta completar la replicacin del
cromosoma. Un fragmento de Okazaki es
colocado en la hebra rezagada en cada ciclo
mientras que la hebra conductora se sintetiza sin
interrupcin; cada fragmento finaliza cuando la

28
DNA polimerasa III se encuentra con el cebador del fragmento precedente, momento en
que se disocia del DNA. En realidad la DNA polimerasa III es una protena oligomrica
formada por mltiples subunidades que se coloca en la horquilla de replicacin de manera
que se encarga simultneamente de la sntesis en las dos hebras merced a un complejo
mecanismo que implica la formacin temporal de un lazo en la hebra rezagada a medida que
se va formando cada fragmento de Okazaki (Figura 19.25); este lazo desaparece cuando las
subunidades del enzima responsables de la sntesis del fragmento se disocian del DNA y se
vuelve a formar cuando dichas subunidades se vuelven a incorporar para sintetizar el
fragmento siguiente.
Del modo que se ha descrito
hasta ahora, cuando las horquillas de
replicacin en su avance recorran
todo el cromosoma bacteriano se
habr completado la replicacin en
las hebras conductoras mientras que
las hebras rezagadas habrn quedado
sembradas de fragmentos de Okazaki
cada uno de ellos con su
correspondiente cebador de RNA.
Las tareas pendientes del equipo
enzimtico de la replicacin
consistirn ahora en eliminar los
cebadores y sellar la unin de los
sucesivos fragmentos de Okazaki. La
eliminacin de los cebadores es
llevada a cabo por la DNA
polimerasa I, enzima que, merced a
la actividad exonucleasa 53 que
lleva incorporada, puede alargar un
fragmento dado y al tiempo ir
degradando el cebador del fragmento
precedente escindiendo uno a uno los
ribonucletidos que lo forman. Este
proceso, conocido como corrimiento
de mella (nick translation), sustituye
el cebador por un tramo de DNA
recin sintetizado de manera que la
hebra rezagada consiste ahora en una
sucesin de fragmentos de Okazaki
formados
exclusivamente
por
desoxirribonucletidos (Figura 19.26). As se eliminan todos los cebadores incluidos los de
ambas hebras conductoras, que se ven afectados por la prolongacin del primer fragmento de
Okazaki sintetizado en las respectivas hebras rezagadas. Para completar la replicacin slo
falta unir estos fragmentos y de ello se encarga un enzima especfico, la DNA ligasa, que
sella las uniones pendientes entre el ltimo nucletido de cada fragmento y el primero del
siguiente, consumiendo para ello energa de la hidrlisis del ATP. Es conveniente resaltar
que, si bien se han descrito como fenmenos separados en el tiempo para facilitar su
comprensin, la eliminacin de los cebadores y el sellado de los fragmentos de Okazaki
discurren en realidad en paralelo con el avance de las horquillas de replicacin.

29
FASE DE TERMINACIN.
Puesto que la replicacin del cromosoma bacteriano comienza en un nico origen y es
bidireccional, las dos horquillas de replicacin avanzando a velocidad constante se
encontrarn en el lugar del cromosoma diametralmente opuesto al origen (oriC) (Figura
19.27). All, las hebras conductoras de una y otra horquilla de replicacin se detendrn al
encontrarse con el cebador del ltimo fragmento de Okazaki sintetizado en la hebra rezagada
respectiva, que seguidamente ser eliminado por la DNA polimerasa I y la mella resultante
sellada por la DNA ligasa (Figura 19.27). No obstante lo dicho, se ha podido comprobar que
el lugar de terminacin de la replicacin est sealizado por una secuencia especfica de
nucletidos (el lugar Ter) a la que se fija una protena especfica que bloquea el avance de las
helicasas cuando llegan a ella. Cuando se bloquea el avance de una de las horquillas en un
lugar alejado del de terminacin la otra horquilla se detiene al llegar a ste de todas maneras.

4.4.-

REPLICACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS.

La descripcin hasta aqu realizada del proceso replicativo en la bacteria E. coli es

aplicable en lneas generales a todas las clulas procariotas y en muchos aspectos tambin a

30
las clulas eucariotas. En ellas la replicacin tambin es semiconservativa, secuencial,
bidireccional, continua en la hebra conductora y discontinua en la rezagada, y es llevada a
cabo por un equipo de enzimas y protenas no enzimticas que, si bien se les ha asignado
denominaciones diferentes a las de sus anlogas bacterianas, actan de manera muy similar a
ellas. La replicacin del DNA eucariota, sin embargo, presenta una serie de particularidades
que es conveniente poner de manifiesto:

Los cromosomas eucariotas presentan mltiples orgenes de replicacin que se

alternan con las correspondientes secuencias de terminacin, de manera que en el
proceso replicativo varias burbujas de replicacin estn activas simultneamente y
van creciendo en ambos sentidos hasta que se funden con sus vecinas. Cada unidad
replicativa, incluyendo su origen de replicacin y delimitada por las correspondientes
secuencias de terminacin, recibe el nombre de replicn (Figura 19.28).
Las DNA polimerasas eucariotas son sensiblemente ms lentas que las bacterianas
(algunas decenas de nucletidos por segundo frente a unos 1.000 nucletidos por
segundo). Tal lentitud se compensa con la existencia de orgenes mltiples de
replicacin.
Los fragmentos de Okazaki son ms cortos que los de las clulas procariotas.
La eliminacin de los cebadores es realizada por una exonucleasa 53 que es
independiente de la polimerasa. No existe un enzima anlogo a la DNA polimerasa I
de E. coli. La sustitucin de los cebadores por DNA, una vez eliminados stos, es
realizada por las mismas DNA polimerasas responsables de la sntesis de los
fragmentos.
Mencin aparte merece el problema del final de la replicacin en los extremos de los
cromosomas eucariotas denominados telmeros. Este problema no se da en las clulas
procariotas por presentar stas cromosomas circulares y por lo tanto carentes de extremos. En
los telmeros la replicacin de la hebra conductora finaliza sin complicaciones ya que las
DNA polimerasas finalizan la sntesis en el lugar exacto en el que finaliza el molde. Por el
contrario, en la hebra rezagada el cebador del ltimo fragmento de Okazaki es colocado
exactamente en el extremo 5, emparejado con la cadena molde; cuando la exonucleasa
53 elimina este cebador ninguna DNA polimerasa podr rellenar el hueco que deja
(Figura 19.29). De este modo, la replicacin queda inconclusa en el extremo 5 y cuando en
el siguiente ciclo replicativo la cadena as acortada sirva de molde para la sntesis de su
complementaria se habr perdido definitivamente un tramo de la cadena polinucleotdica.

31
El acortamiento de los telmeros en
cada ciclo de divisin celular a causa del
fenmeno descrito puede suponer la prdida
de informacin gentica importante y con ello
el deterioro y la muerte de la clula. Para
paliar este grave problema los organismos
eucariontes se han dotado de un enzima, la
telomerasa, que tiene la funcin de reparar los
telmeros en cada ciclo de divisin celular
evitando as su acortamiento. La telomerasa
es un enzima con actividad de DNA
polimerasa que lleva incorporado como grupo
prosttico un oligonucletido de RNA que
sirve de molde para sintetizar una cadena
complementaria de DNA. Los telmeros
poseen unas secuencias repetitivas de DNA
parcialmente complementarias con el molde
de RNA interno de la telomerasa. Cuando
estas secuencias se aparean, dicho molde
interno es utilizado para alargar el extremo 3
sobresaliente del telmero. Se producen varios
ciclos de alargamiento y a continuacin la maquinaria replicativa ordinaria coloca un
fragmento de Okazaki adicional en el extremo 5 defectuoso, de manera que, aunque
posteriormente se eliminar el cebador de este fragmento, el tramo de DNA as sintetizado
compensa el acortamiento del telmero (Figura 19.30).
Gracias a la accin de la
telomerasa la longitud de los telmeros
permanece aproximadamente constante a
lo largo de las sucesivas generaciones
celulares. Sin embargo, se ha comprobado
que la actividad de este enzima vara
considerablemente entre distintos tipos de
clulas
eucariotas.
Se
muestra
particularmente activa en los organismos
eucariontes unicelulares y en las clulas
germinales de los pluricelulares (clulas
en las que la conservacin de la integridad
del genoma es inexcusable), pero esta
actividad decae considerablemente en las
clulas somticas de estos ltimos. As,
cuando estas clulas se dividen
sucesivamente sus telmeros se van
acortando hasta que su informacin
gentica resulta afectada con el
consiguiente deterioro y muerte celular.
Se ha especulado mucho con la
idea de que el acortamiento de los
telmeros en las clulas somticas pueda
estar relacionado con los procesos de

32
envejecimiento general del organismo y de que una potenciacin de la actividad de la
telomerasa en estas clulas pudiera resultar til para retrasarlo. Existe un grave
inconveniente: la actividad de la telomerasa es particularmente alta en la mayora de las
clulas tumorales. En realidad, la desactivacin de este enzima en las clulas somticas
podra funcionar como un eficaz mecanismo de prevencin del cncer, ya que el acortamiento
de los telmeros actuara como una especie de reloj biolgico que conducira a la muerte
celular antes de que una clula pueda acumular las mutaciones necesarias para convertirse en
tumoral. Por el contrario, las clulas portadoras de una mutacin que reactive la telomerasa
seran candidatas a convertirse en cancergenas. El bloqueo selectivo de la actividad de la
telomerasa en estas clulas podra constituir una va para el tratamiento de esta enfermedad.

5.-

EXPRESIN GNICA.

Una de los interrogantes que ya se planteaban

los genetistas clsicos acerca de la funcin del gen
mendeliano era el cmo dicho gen era capaz de
determinar el carcter hereditario del que era
responsable. En otras palabras: de qu manera el
genotipo determina el fenotipo? Los primeros pasos en
la resolucin de esta cuestin se dieron mucho antes de
que se elucidara la naturaleza del gen; en realidad casi
al mismo tiempo que se redescubran los trabajos de
Mendel a comienzos del siglo XX.
En 1902 el mdico ingls Archibald Garrod
(Figura 19.31) estudi los antecedentes familiares de
algunos de sus pacientes de alcaptonuria (afeccin
artrtica cuyo principal sntoma es la excrecin de
orina de color vino) y lleg a la conclusin de que se
trataba de una enfermedad hereditaria. Garrod dedujo
asimismo que la alcaptonuria consista en una
alteracin del metabolismo del nitrgeno que daba
lugar a la excrecin de una sustancia de color oscuro
en lugar de la urea, que es el componente normal de la orina. Su hiptesis, que result ser
acertada, era que estos pacientes eran
homocigotos para el alelo recesivo de
un gen que controla una reaccin
metablica enzimticamente catalizada.
Este alelo determinaba la aparicin de
un fallo en dicha reaccin metablica
de modo que se produca la
acumulacin de la sustancia que en
condiciones
normales
sera
transformada en la reaccin.
Garrod acu en 1908 la frase
errores congnitos del metabolismo
para referirse a las alteraciones de los
genes que controlaban las reacciones
metablicas
enzimticamente
catalizadas, siendo la suya la primera

33
referencia a la relacin entre genes y enzimas. Unos treinta aos ms tarde G. W. Beadle y
E.L. Tatum realizaron una serie experimentos que pusieron de manifiesto esta relacin.
Beadle y Tatum (Figura 19.32) utilizaron para sus experiencias el hongo Neurospora
crassa (moho del pan), que por su facilidad de cultivo y manipulacin en el laboratorio se
haba revelado como una gran herramienta en la investigacin gentica. En primer lugar
aislaron una serie de mutantes del hongo incapaces de crecer en un medio de cultivo mnimo
(medio con las sustancias imprescindibles para permitir el crecimiento del moho) en el que s
crecan los ejemplares salvajes. Estos mutantes, denominados mutantes auxotrofos deban su
incapacidad a un fallo en su metabolismo que les impeda sintetizar algn metabolito
concreto (normalmente alguno de los veinte aminocidos o alguna vitamina). Beadle y Tatum
identificaron a continuacin cual era la sustancia que necesitaba cada mutante suplementando
diferentes muestras del medio de cultivo mnimo con una amplia variedad de metabolitos
candidatos. El medio suplementado con la sustancia buscada permita el crecimiento del
mutante en cuestin. Perseverando con esta estrategia Beadle y Tatum consiguieron
identificar no slo el metabolito imprescindible para cada mutante, sino la reaccin
metablica enzimticamente catalizada que se encontraba bloqueada en la ruta que conduca
a su sntesis.
Los resultados obtenidos condujeron a Beadle y Tatum a la formulacin de la teora
un gen un enzima, que viene a afirmar que la funcin primaria de un gen consiste en
dirigir la formacin de un (y slo un) enzima. Esta teora representa el primer avance en el
conocimiento del complejo camino que conduce desde el genotipo al fenotipo. A partir de su
formulacin el concepto de gen dej de depender de la existencia de dos o ms variantes
allicas que permitiesen detectar su existencia para convertirse en algo mucho ms
tangible, aunque todava se ignorase su naturaleza fsico-qumica. La funcin de los genes
pareca ser la de dirigir el metabolismo celular a travs del control de la sntesis de los
enzimas responsables del mismo.
A medida que avanzaba el conocimiento de la estructura de las protenas y se
estableca que era la secuencia de aminocidos la que determinaba la conformacin
tridimensional de estas macromolculas y, a travs de ella, su funcin biolgica, surgi la
idea de que la funcin del gen no poda ser otra que la de dirigir en ensamblaje ordenado de
los distintos aminocidos durante el proceso de sntesis de la protena correspondiente. Dicho
de otro modo, la informacin gentica almacenada en el gen se expresaba en forma de
secuencia de aminocidos de una protena, que a su vez especificaba su conformacin
tridimensional y con ello su funcin biolgica. Adems, el efecto de las mutaciones
consistira en producir alteraciones en la secuencia de aminocidos que daran lugar a
conformaciones tridimensionales alteradas afectando as a la funcin biolgica de la protena.
Diversos experimentos realizados a finales de la dcada de aos 40 del siglo XX pusieron de
manifiesto la veracidad de estas aseveraciones. En particular, el descubrimiento de que la
anemia falciforme (una enfermedad hereditaria frecuente en algunas poblaciones africanas) se
deba a la sustitucin de un solo aminocido en una de las cadenas polipeptdicas de la
hemoglobina de los pacientes afectados, constituy la primera prueba directa acerca de la
relacin entre genes y protenas en el ser humano.
En su versin actual, a la vista de que muchos enzimas y protenas no enzimticas
estn formadas por varias subunidades, la teora un gen un enzima se ha reformulado
como teora un gen una cadena polipeptdica. Es necesario resaltar que esta teora
pertenece al campo de lo que se ha dado en llamar gentica clsica: el gen, que segn la
teora informa para la sntesis de un enzima sigue siendo una entidad casi tan abstracta como
el gen mendeliano. La teora no proporciona respuestas a la pregunta de qu manera el gen
controla la sntesis de un enzima? Estas repuestas habran de venir de la mano de una nueva

34
rea del conocimiento: la gentica molecular.
5.1.- EL DOGMA CENTRAL.
El descubrimiento de la naturaleza del material gentico arroj nueva luz sobre la
relacin entre genes y protenas. En efecto, si la informacin gentica se encontraba cifrada
en forma de la secuencia de nucletidos del DNA, resultaba claro, a la luz de la teora un
gen un enzima, que la expresin de esta informacin debera consistir en una traduccin
de la secuencia de nucletidos de un gen a la secuencia de aminocidos de una protena.
Ahora bien, cmo se lleva a cabo este proceso?
Como ya se ha comentado con anterioridad, los primeros estudios acerca del RNA
sugeran que este cido nucleico guardaba cierta relacin con la sntesis de protenas y que
pronto se estableci que unas partculas citoplasmticas ricas en RNA, los ribosomas, eran el
lugar en donde tena lugar dicha sntesis. Resultaba evidente que el DNA, en su sede nuclear,
no poda presidir directamente el ensamblaje de los aminocidos que tena lugar en el
citoplasma. As surgi la idea de que la expresin gnica era un proceso en dos etapas: la
primera, que tendra lugar en el ncleo, sera una transcripcin de la informacin gentica
almacenada en el DNA a un intermediario de RNA; la segunda, que tendra lugar en los
ribosomas, sera una traduccin de dicha informacin a la secuencia de aminocidos de una
protena. No est claro quin fue el primer investigador en formular estas ideas, aunque
parece claro que formaban parte del pensamiento de Watson y Crick muy poco despus del
descubrimiento de la doble hlice.
El primer intento de explicacin para el mecanismo de la expresin gnica postulaba
que el DNA se transcriba dando lugar al componente de RNA de los ribosomas, de manera
que cada gen produca as un ribosoma especfico que se encargaba de sintetizar una protena
(y slo una). Tal mecanismo, conocido como la hiptesis un gen un ribosoma una
protena, tuvo que ser muy pronto revisado a la luz de los experimentos realizados al efecto.
Cuando un bacterifago infecta una clula bacteriana la maquinaria bioqumica de sta es
inmediatamente secuestrada por el virus y se desva hacia la sntesis de las protenas de la
progenie viral. Es de esperar, por lo tanto, que, de ser correcta la hiptesis un gen un
ribosoma una protena, la infeccin vrica dispare la produccin de nuevos ribosomas que
se encargarn de sintetizar las protenas del virus. Los experimentos llevados a cabo
utilizando el marcaje con istopos radiactivos en clulas de E. coli infectadas por el
bacterifago T4 indicaban que, por el contrario, la infeccin detena la produccin de nuevos
ribosomas y que, por lo tanto, las protenas de la progenie viral eran sintetizadas por
ribosomas ya presentes en la clula antes de la infeccin. Adems, el nico tipo de RNA que
apareca en las bacterias infectadas no era el componente habitual de los ribosomas, sino un
nuevo tipo de RNA muy inestable y que se encontraba dbilmente asociado a stos.
Estos resultados experimentales
condujeron a F. Jacob y J. Monod (Figura
19.33) a formular en 1961 un mecanismo
alternativo para el proceso de expresin de
la informacin gentica. El RNA ribosmico
no es el patrn directo que dirige el
ensamblaje de los aminocidos y, por lo
tanto, los ribosomas no estn especializados
en la sntesis de determinadas cadenas
polipeptdicas. En lugar de ello, la secuencia
de nucletidos del DNA se transcribe a
molculas de un tipo diferente de RNA, el

35
RNA mensajero, que emigran posteriormente al citoplasma para all entrar temporalmente
en combinacin con los ribosomas. El complejo formado por los ribosomas y el RNA
mensajero sera el encargado de dirigir el ensamblaje de los aminocidos de una cadena
polipeptdica, siendo el ribosoma el lugar de ensamblaje y el RNA mensajero la plantilla
que contiene la informacin necesaria para hacerlo. El mRNA se degrada rpidamente
despus de haber dirigido la sntesis de unas pocas molculas de protena, lo que explicara
la gran inestabilidad que presentaba en los experimentos.

Los puntos de vista de Jacob y Monod fueron confirmados en experimentos de

hibridacin DNA-RNA. El RNA inestable que apareca en el citoplasma bacteriano tras la
infeccin fgica fue extrado y se comprob que hibridaba con el DNA del virus una vez
desnaturalizado. Ello demostraba que la secuencia de nucletidos de RNA era ciertamente
complementaria con la correspondiente del DNA vrico, que es lo que el modelo de Jacob y
Monod predeca para la molcula que haban denominado RNA mensajero. Hay que resaltar
que en los hbridos DNA-RNA que se obtenan en estos experimentos los pares de bases A-T
se ven sustituidos por pares A-U, que forman igualmente dos puentes de hidrgeno entre s.
Experimentos posteriores del mismo tenor arrojaron resultados similares para el mRNA
bacteriano en relacin con los genes bacterianos. Por otra parte, tambin se comprob que no
slo el mRNA sino todos los tipos de RNA se sintetizan a partir de moldes de DNA mediante
un proceso de transcripcin.
Las ideas hasta aqu expuestas acerca del mecanismo de la expresin gnica
constituyen el ncleo de lo que se ha dado en llamar el dogma central de la biologa
molecular, que viene a afirmar que la informacin gentica fluye unidireccionalmente desde
el DNA hacia las protenas a travs de un intermediario de RNA. El dogma, as formulado
por Francis Crick, hubo de ser revisado a consecuencia del descubrimiento de enzimas
capaces de sintetizar DNA a partir de moldes de DNA, en un proceso que se denomin
transcripcin inversa (Figura 19.34).
5.2.-

TRANSCRIPCIN.
Los aspectos qumicos de la sntesis del RNA son muy similares a los de la

36
replicacin del DNA. La adicin de nucletidos a una cadena de RNA en crecimiento
necesita tambin de nucletidos trifosfato que se incorporan segn la siguiente reaccin:

RNA (n) + NTP RNA (n+1) + PPi

La reaccin es catalizada por el
enzima RNA polimerasa (Figura 19.35),
descubierto en 1960 por S. Weiss en
extractos de E. coli. Desde entonces se han
encontrado RNA polimerasas en todo tipo de
clulas, compartiendo todas ellas una serie
de caractersticas. Las RNA polimerasas
necesitan un molde de DNA sin el cual son
incapaces de polimerizar nucletidos; a
diferencia de las DNA polimerasas, pueden
iniciar cadenas polinucleotdicas colocando
un primer nucletido y aadiendo a ste los
siguientes; todas llevan a cabo la sntesis en
direccin 53 recorriendo el molde en la
direccin opuesta. Las RNA polimerasas son
enzimas multimricos formados por varias
subunidades entre las que destaca la llamada factor , responsable de reconocer el lugar de
inicio de la transcripcin.
Otro rasgo importante del proceso de transcripcin es su asimetra. En una secuencia
dada de DNA slo una de las cadenas polinucleotdicas, la llamada hebra codificadora o
hebra con sentido, se transcribe a RNA; la otra cadena, llamada hebra estabilizadora o hebra
sin sentido no contiene informacin para la sntesis de protenas, aunque es imprescindible
para, en el proceso de replicacin, servir de molde para la sntesis de otra hebra codificadora.
En general, en las clulas procariotas la hebra codificadora es la misma en toda la extensin
del cromosoma. Por el contrario, en las clulas eucariotas la hebra codificadora cambia de
unos genes a otros.
En el proceso de transcripcin podemos distinguir tres fases: iniciacin, elongacin y
terminacin:
FASE DE INICIACIN.
La transcripcin se inicia para cada gen o grupo de genes en una secuencia especfica
de DNA denominada promotor (Figura 19.41). Se han identificado varias secuencias
promotoras, siendo su caracterstica comn ms apreciable su riqueza en pares A-T. La RNA
polimerasa con su factor incorporado reconoce al promotor y provoca en l el
desenrollamiento local de la doble hlice y la consiguiente apertura de una burbuja de
transcripcin. A continuacin coloca el primer nucletido a una distancia de 10 pares de
bases del final del promotor. Una vez iniciada la sntesis, el factor ya no es necesario y se
desprende.
FASE DE ELONGACIN.
La RNA polimerasa va aadiendo nucletidos en direccin 53. El mismo enzima
presenta una actividad helicasa que va abriendo la burbuja de transcripcin a medida que

37
avanza. La colocacin de los sucesivos nucletidos se atiene a las reglas de apareamiento
de bases nitrogenadas, con la salvedad conocida de que el par A-T es sustituido por A-U. De
manera similar a lo que ocurre en la replicacin del DNA, la cadena en crecimiento forma
una doble hlice con la cadena molde (Figura 19.36). Sin embargo, a diferencia de la
replicacin, este dplex es transitorio: la cadena de RNA se va desprendiendo de su molde de
DNA a medida que se va sintetizando; en un instante dado durante la transcripcin el dplex
hbrido DNA-RNA apenas ocupa una vuelta de hlice (entre ocho y doce nucletidos). A
medida que se va desprendiendo el RNA recin sintetizado la burbuja de transcripcin se va
cerrando tras la RNA polimerasa.

FASE DE TERMINACIN.
La RNA polimerasa reconoce determinadas secuencias de nucletidos en el DNA,
llamadas terminadores, que constituyen una seal para la interrupcin de la sntesis de RNA
y el desprendimiento del enzima con el consiguiente cierre de la burbuja de transcripcin. En
muchos casos los terminadores son secuencias palindrmicas (se leen igual en uno y otro

38
sentido) que propician la formacin de un bucle interno en el RNA. La formacin de este
bucle induce el desprendimiento del enzima.
Los procesos de transcripcin hasta aqu descritos son bsicamente iguales en las
clulas procariotas y eucariotas. Sin embargo, existen algunas diferencias entre ambos tipos
celulares en lo que se refiere al destino inmediato de los RNAs producto de la transcripcin.
En las clulas procariotas los mRNA sintetizados son directamente utilizados en los
ribosomas para la sntesis de protenas sin necesidad de ninguna transformacin previa. Los
mRNA procariotas son policistrnicos, es decir, una sola molcula de RNA es el resultado de
la transcripcin de varios genes contiguos y su traduccin por los ribosomas origina varias
protenas diferentes. Asimismo, las secuencias que codifican los tRNA y las que codifican los
rRNA son transcritas en una sola molcula, el transcrito primario, que despus es cortada por
la accin de nucleasas especficas, dando lugar a las correspondientes molculas de RNA
biolgicamente activas. Por otra parte, los procesos de transcripcin y traduccin en las
clulas procariotas no estn separados en el tiempo: la traduccin comienza por el extremo 5
antes de que la RNA polimerasa haya finalizado la sntesis del mensajero.
En las clulas eucariotas los procesos de transcripcin y traduccin estn
necesariamente separados en el tiempo, ya que el primero ocurre en el ncleo y el segundo en
el citoplasma celular, debiendo los RNA sintetizados atravesar los poros nucleares para
incorporarse a sus respectivas misiones en la sntesis de protenas. Los productos de la
transcripcin en las clulas eucariotas sufren una serie de complejos procesos de maduracin
que pasaremos a discutir a continuacin.
5.3.-

GENES FRAGMENTADOS Y MADURACIN DEL RNA.

Los estudios realizados acerca del

mecanismo de expresin de la informacin
gentica durante las dcadas de los aos 60 y 70
del siglo XX indicaban que para cada gen una
secuencia continua de nucletidos del DNA
codificaba la correspondiente secuencia de
aminocidos de la protena correspondiente. En
1977 P.A. Sharp y R. J. Roberts (Figura 19.37)
obtuvieron unos resultados experimentales
desconcertantes que venan a poner en cuestin
tales ideas. En determinadas condiciones
experimentales es posible obtener hbridos
estables entre mRNAs y las secuencias de DNA
que los codifican. Sharp y Roberts obtuvieron este tipo de hbridos con cidos nucleicos de
un adenovirus y los observaron al microscopio electrnico, comprobando que el mRNA y el
DNA codificante no hibridaban en toda su longitud, sino que aparecan lazos formados por
tramos de DNA de cadena sencilla. Ello demostraba que haba segmentos del DNA que no
estaban representados en el correspondiente mRNA y que por lo tanto los genes del virus
estaban fragmentados en tramos codificantes, a los que se denomin exones y tramos no
codificantes, a los que se denomin intrones.
En los aos que siguieron se realizaron experimentos similares con otros organismos
y se pudo comprobar que los genes fragmentados estn ampliamente difundidos en la
naturaleza. Por ejemplo, el gen que codifica la ovoalbmina de gallina, uno de los primeros
en ser analizado respecto a su fragmentacin, presenta 7 intrones a lo largo de sus 7700 pares

39
de bases, con longitudes que van desde los 251 a los 1.600 pares de bases (Figura 19.38).

Los genes fragmentados abundan mucho ms entre los organismos eucariontes que
entre los procariontes. En los vertebrados la inmensa mayora del genoma est salpicada de
intrones de longitud y distribucin muy variables. Slo unos pocos genes de estos
organismos (los que codifican protenas histnicas) carecen de ellos. En el extremo opuesto
se encuentran algunas levaduras como Saccharomyces cerevisiae en las que los intrones
apenas existen. En el mundo procariota los genes fragmentados son muy escasos, estando su
presencia prcticamente limitada a un grupo reducido denominado arqueobacterias. Tambin
se han detectado intrones en algunos grupos de virus.
La correcta expresin de la
informacin
de
los
genes
fragmentados requiere la eliminacin
de las secuencias no codificantes en
algn momento del proceso (Figura
19.39). Esta eliminacin se lleva a
cabo sobre las molculas de RNA
recin sintetizadas, los transcritos
primarios, en un proceso denominado
corte y empalme (splicing en ingls).
Existen varios tipos de
intrones en relacin con el
mecanismo de corte y empalme que
acta sobre ellos. El grupo ms
numeroso es el que incluye a los intrones presentes en los transcritos primarios precursores
de los mRNA eucariotas. En ellos el mecanismo de corte y empalme requiere la participacin
de unas ribonucleoprotenas con actividad enzimtica de la clase denominada
ribonucleoprotena nuclear pequea (snRNP). Estas protenas llevan incorporado como
grupo prosttico una molcula de RNA del tipo denominado RNA nuclear pequeo (snRNA),
estando presentes en el ncleo de las clulas eucariotas. Varias de estas ribonucleoprotenas
se agrupan para formar un complejo denominado espliceosoma, que es el encargado del
proceso de corte y empalme. Los espliceosomas catalizan una reaccin qumica consistente
en el intercambio de un enlace fosfodister por otro con la consiguiente eliminacin del
intrn y el enlace de los dos exones situados a ambos lados de ste (Figura 19.40). Por medio
de un apareamiento especfico de bases con su componente snRNA los espliceosomas
reconocen secuencias especficas del transcrito primario que sealan el comienzo y final de
los distintos intrones. El corte y empalme debe realizarse con una gran precisin, ya que

40
cualquier error, aunque slo afecte a un nico nucletido, se traducira en un error que
afectara a toda la cadena polipeptdica codificada.
La maduracin de los transcritos
primarios precursores de los mRNAs
eucariotas incluye, adems de la
eliminacin de los intrones, otros
procesos destinados a proporcionar una
mayor estabilidad qumica a la molcula
resultante y evitar que sea rpidamente
degradada por las nucleasas celulares.
Uno de ellos es la adicin en el extremo
5 de una caperuza consistente en un
nucletido cuya base nitrogenada es la
7-metil-guanina. Otro es la adicin en el
extremo de una cola de poli-A (una
secuencia repetitiva de entre 20 y 250
nucletidos cuya base es la adenina). El
poli-A se aade a partir de una posicin
concreta del transcrito primario despus
de haber eliminado una secuencia no
codificante del extremo 3 por accin de
una nucleasa. La adicin la realiza un
enzima
denominado
poliadenilato
polimerasa, que no necesita molde para
sintetizar el poliadenilato.
Existen, adems del tipo descrito,
otros tres tipos de intrones presentes en
molculas de rRNA, tRNA y precursores
de mensajeros de mitocondrias y
cloroplastos que no necesitan de la
concurrencia de ribonucleoprotenas
especficas para ser eliminados. Los
intentos de identificar los enzimas responsables del proceso de corte y empalme en estos
intrones produjeron resultados sorprendentes cuando en 1982
T. Cech (Figura 19.41) encontr que eran las propias
molculas de RNA las que catalizaban la eliminacin de sus
propios intrones, en un proceso conocido como autosplicing. El descubrimiento de molculas de RNA con
actividad cataltica supuso un duro golpe al dogma de la
naturaleza proteica de los enzimas y sirvi para alumbrar
nuevos puntos de vista acerca del origen de la vida sobre la
Tierra que cristalizaron en la hiptesis del mundo de RNA.
Se han descrito unos cuantos casos de procesos de
maduracin alternativos en los que un nico transcrito
primario puede dar lugar a dos o ms mRNA diferentes y, en
consecuencia, a polipptidos diferentes. En tales casos es el
nmero de exones que se incorporan al mensajero y la
ordenacin de los mismos lo que determina qu protena se
sintetizar finalmente. Un ejemplo de ello lo constituye un

41
transcrito primario que si se procesa en la glndula tiroides da lugar a la hormona
calcitonina y si se procesa en el hipotlamo da lugar al pptido CGRP (Figura 19.42).

5.4.-

EL CDIGO GENTICO.

Muy poco despus de que Watson y Crick propusieran su modelo para la estructura
del DNA, asentado ya el convencimiento de que este cido nucleico era ciertamente la base
qumica de la informacin gentica, muchos investigadores comenzaron a plantearse el
problema del cdigo gentico. La nueva visin de la teora un gen un enzima,
reformulada a la luz de los nuevos descubrimientos, incorporaba la idea de que la secuencia
de aminocidos del DNA contiene informacin que especifica la secuencia de aminocidos
de las protenas. Deba existir, por lo tanto, una clave que relacionase ambos tipos de
secuencia, un cdigo que, a modo de diccionario, permitiese a las clulas vivas traducir la
informacin escrita en el idioma de los nucletidos al idioma de los aminocidos.
Las primeras formulaciones generales acerca del cdigo gentico surgieron del
simposio anual de Cold Spring Harbor celebrado en el verano de 1953, al que asistieron entre
otros Watson y Crick. Resultaba evidente que el cdigo no poda consistir en una
correspondencia biunvoca entre bases nitrogenadas y aminocidos, ya que en el DNA slo
hay cuatro bases mientras que hay veinte aminocidos en las protenas. Las palabras del
cdigo deban, pues, estar formadas por grupos de letras representando cada una a una base
nitrogenada. Un sencillo clculo combinatorio eliminaba la posibilidad de que se tratase de
grupos de dos bases, pues de este modo slo se podran formar 42 = 16 grupos que seguan
siendo insuficientes para codificar los veinte aminocidos. El mismo clculo realizado para
grupos de tres bases indicaba que se podran formar 43 = 64 grupos diferentes. As pues, a la
vista de que tres era el nmero mnimo de letras por palabra que permita codificar la

42
totalidad de los aminocidos, se lleg a la conclusin de que el cdigo gentico constaba
de tripletes de bases que especificaban los distintos aminocidos. La posibilidad de que se
tratase de grupos de cuatro o ms bases se descart pues introduca una complejidad
innecesaria y ajena a la lgica molecular de las clulas vivas. Estas conclusiones, obtenidas
sobre la base de razonamientos tericos, fueron confirmadas experimentalmente algunos aos
despus por Francis Crick y Sydney Brenner.
Un primer intento de
elaboracin de un esquema del
cdigo gentico, asumiendo que
constaba de tripletes de bases
nitrogenadas, fue acometido por
el fsico cosmlogo G. Gamow,
quien propuso en 1954 que los
diferentes tripletes de bases
generaban en la superficie de la
molcula
de
DNA
unas
cavidades en las que encajaran
las cadenas laterales de los
distintos
aminocidos,
proporcionndoles as un molde
sobre el que alinearse antes del ensamblaje. Tal esquema no pareca muy plausible y adems
pronto se acumularon pruebas de que el DNA no diriga directamente el ensamblaje de los
aminocidos, sino a travs de un intermediario de RNA. Gamow volvi a abordar el
problema y elabor un nuevo esquema en el que, prescindiendo del mecanismo responsable
de la traduccin, propona un cdigo que contena tripletes sinnimos (varios tripletes
codifican el mismo aminocido) que adems se encontraban solapados (cada triplete
interviene en la codificacin de tres aminocidos sucesivos) (Figura 19.43). El cdigo de
Gamow presentaba la ventaja de la economa: eran necesarios menos nucletidos para
codificar el mismo nmero de aminocidos que en uno con tripletes no solapados. Sin
embargo, presentaba un serio inconveniente: la falta de flexibilidad. Un cdigo con tripletes
solapados conllevara severas restricciones sobre las secuencias de aminocidos posibles. Por
ejemplo (Figura 19.49), al aminocido codificado por el triplete AUU slo podra seguirle
uno codificado por un triplete UUX (siendo X cualquier base nitrogenada). Estudios sobre la
secuencia de aminocidos de algunas protenas realizados por S. Brenner en 1957 pusieron de
manifiesto que en la naturaleza no existan tales restricciones, por lo que el esquema de
Gamow hubo de ser definitivamente descartado.
Un esquema alternativo para el cdigo gentico fue propuesto por F. Crick y sus
colaboradores. Se trataba de un cdigo sin solapamientos (cada triplete estaba implicado en la
codificacin de un solo aminocido) y que proporcionaba una solucin brillante al problema,
no abordado por Gamow, de la necesidad e smbolos espaciadores entre los tripletes. Tal
problema se ilustra en el siguiente ejemplo: Sea la secuencia .TCGTGGGCAATT;
podemos suponer que se traducir de manera que los tripletes TCG, TGG, GCA, ATT
codificarn unos determinados aminocidos. Sin embargo, si la pauta de lectura de los
tripletes se desplazase una sola base nitrogenada tendramos T, CGT, GGG, CAA, TT.,
que evidentemente codificaran unos aminocidos diferentes. Cmo reconocen las clulas
vivas cul es la pauta de lectura correcta? Existen smbolos espaciadores que delimitan los
tripletes correctos evitando cualquier lectura alternativa? En el esquema de Crick este
problema se solucionaba con un diccionario de palabras con sentido. Slo un nmero
limitado de tripletes del cdigo codificaran aminocidos; el resto seran tripletes sin

43
sentido o no codificantes que tendran el papel de evitar las lecturas incorrectas. En
nuestro ejemplo, si TCG y TGG son codificantes, necesariamente CGT y GTG debern ser
sin sentido. Los clculos de Crick demostraron que era perfectamente posible un cdigo de
estas caractersticas, en el que 20 de los tripletes codificaran a los 20 aminocidos de las
protenas (no habra pues tripletes sinnimos) mientras que los 44 restantes seran sin
sentido. El esquema de Crick explicaba adems el sentido biolgico del exceso de tripletes
con respecto al de aminocidos.
El cdigo propuesto por Crick, sin duda de una gran elegancia, no es el que en
realidad funciona en las clulas vivas. El curso de la evolucin biolgica parece haber optado
por un esquema menos sofisticado y quizs ms imperfecto. Las investigaciones que en los
aos 60 del siglo XX condujeron al descifrado del cdigo revelaron tambin que el
diccionario de palabras sin sentido no era necesario; los tripletes se leen simplemente de
corrido, sin smbolos espaciadores, a partir de un triplete concreto que funciona como
smbolo de iniciacin. Hay adems muchos tripletes sinnimos (que codifican el mismo
aminocido).
En efecto, el definitivo conocimiento de las caractersticas del cdigo gentico hubo
de esperar a que se pudiese descifrar uno a uno el significado de cada uno de los 64 tripletes
que lo integran. Esta investigacin, que constituye una de las etapas ms apasionantes de la
biologa molecular, se realiz en los primeros aos 60 por tres grupos de investigacin
dirigidos por M. W. Nirenberg, S. Ochoa y H. G. Khorana (Figura 19.44).

En 1955 S. Ochoa y M. Grunberg-Manago haban descubierto un enzima, la

polinucletido fosforilasa, capaz de sintetizar RNA in vitro a partir de mezclas de
ribonucletidos difosfato sin necesidad de ningn tipo de molde segn la reaccin:

RNA (n) + NDP RNA (n+1) + Pi

El enzima polimerizaba ribonucletidos en secuencias al azar que dependan de la
composicin nucleotdica de la mezcla de reaccin inicial. Es probable que la funcin
biolgica de este enzima est relacionada ms con la degradacin del RNA a travs de la
reaccin inversa que con su sntesis; sin embargo, la importancia de este descubrimiento
resida en que la polinucletido fosforilasa proporcionaba la posibilidad de obtener in vitro
RNA mensajeros cuyas secuencias podan ser al menos parcialmente controladas.
Marshall Nirenberg consigui en 1961 desarrollar sistemas libres de clulas que

44
realizaban la sntesis de protenas in vitro. En estos sistemas introdujo mRNA sintetizado
por la polinucletido fosforilasa y, una vez traducidos estos mensajeros artificiales, procedi
a secuenciar los polipptidos obtenidos. El primer ensayo consisti en aadir al sistema de
traduccin un mensajero constituido exclusivamente por nucletidos de uracilo (poli-U). El
resultado fue un polipptido montono del aminocido fenilalanina. Evidentemente este
aminocido estaba codificado por el triplete UUU, que se convirti as en la primera
palabra del cdigo en ser descifrada. Ensayos anlogos permitieron descifrar el significado
de los tripletes AAA (lisina), GGG (glicina) y CCC (prolina).
La siguiente etapa en el descifrado del cdigo pas por la obtencin de mensajeros
artificiales a partir de mezclas de dos ribonucletidos. Por ejemplo, un mensajero sintetizado
al azar a partir de nucletidos de uracilo y citosina contendr los tripletes UUU, UUC, UCC,
UCU, CUU, CCU y CCC. El anlisis de la secuencia de los polipptidos obtenidos
proporcionaba los primeros indicios de cules eran los aminocidos codificados. A
continuacin, haciendo variar las proporciones entre los dos nucletidos de la mezcla inicial y
combinando la informacin procedente de ensayos con parejas de nucletidos diferentes, se
iba afinando el anlisis hasta determinar qu triplete codificaba cada aminocido. El
procedimiento era extremadamente laborioso, y, adems, la existencia de tripletes sinnimos
daba lugar a algunas ambigedades que el mtodo empleado no permita resolver. Sin
embargo, la colaboracin entre los equipos de Nirenberg y Ochoa permiti, en poco ms de
un ao, conocer el significado de un buen nmero de tripletes.
El descifrado de las ltimas
palabras
del
cdigo
result
especialmente
complejo.
Khorana
consigui fabricar mensajeros con dos
nucletidos que se alternaban y ms
tarde
con tripletes de secuencia
conocida que se repetan, lo que
proporcion
bastantes
claves
adicionales. Los esfuerzos culminaron
con el descubrimiento por Nirenberg de
que
trinucletidos
sintticos
de
secuencia conocida podan entrar en el
ribosoma, haciendo el papel del
mensajero, y fijar selectivamente al
tRNA correspondiente unido a su
aminocido especfico. Ello permiti
descifrar los tripletes restantes y
completar el diccionario del cdigo
(Figura 19.45). Por convenio, el cdigo gentico se expresa en forma de tripletes del mRNA
ledos en direccin 53.
Las investigaciones que se han descrito fueron realizadas en la bacteria E. coli. Toda
la experimentacin posterior sustenta la idea de que el cdigo gentico es universal: los
tripletes del cdigo tienen el mismo significado en todas las clulas vivas tanto procariotas
como eucariotas. Incluso se ha podido comprobar que sistemas de traduccin in vitro
obtenidos de una determinada especie son capaces de traducir mensajeros procedentes de
especies diferentes. De todos modos, se han descrito algunas excepciones a la regla de
universalidad del cdigo, excepciones que afectan al significado de unos pocos tripletes en
los genes de mitocondrias y cloroplastos.
Del conocimiento detallado del cdigo se pudieron extraer como corolario algunas de

45
sus caractersticas, lo que permiti corregir los modelos tericos previamente elaborados
por Crick:
El cdigo gentico:
No presenta solapamientos: cada triplete de bases est implicado en la codificacin de
un solo aminocido.
Presenta tripletes sinnimos. Se suele aludir a esta propiedad diciendo que es un
cdigo degenerado.
Es un cdigo sin comas: no presenta smbolos espaciadores. La lectura se realiza de
corrido partiendo de un triplete de iniciacin, que en la mayor parte de los casos es
AUG. Este triplete codifica adems el aminocido metionina o alguno de sus
derivados.
Es universal, aunque presenta un reducido nmero de excepciones.
5.5.-

TRADUCCIN.

Como se ha comentado con anterioridad, el dogma central de la biologa molecular

afirma que la expresin gnica es un proceso en dos etapas: transcripcin y traduccin.
Analizado el primero de estos procesos y los pormenores del cdigo que permite llevar a
cabo el segundo, deberemos ahora analizar ste ltimo detalladamente.
La primera cuestin que cabe plantearse acerca de la sntesis de las protenas es el
orden de ensamblaje de los aminocidos. El procedimiento ms sencillo para ensamblar un
cierto nmero de aminocidos consistira en iniciar la cadena por uno de sus extremos e ir
aadiendo aminocidos secuencialmente hasta el extremo opuesto. Se ha podido comprobar,
mediante experimentos con aminocidos marcados radiactivamente, que la sntesis comienza
por el extremo amino-terminal y finaliza por el extremo carboxi-terminal.
En segundo lugar cabe preguntarse acerca del tipo de interaccin que se ha de
establecer entre los ribosomas y el mRNA a la hora de llevar a cabo la sntesis. Dado que el
ensamblaje de los aminocidos es secuencial, no hay necesidad de que toda la cadena
polinucleotdica del mensajero est en contacto con el ribosoma en un momento dado, sino
slo la parte que codifica el aminocido que se va a incorporar; es decir, el mensajero puede
correr a travs del ribosoma y ser leda su informacin de manera similar a una cinta
magnetofnica que discurre por un cabezal de lectura. Por otra parte, no parece haber
inconveniente para que el mensajero discurra simultneamente a travs de varios ribosomas
que, concomitantemente, iran sintetizando varias cadenas polipeptdicas. Los primeros
experimentos realizados acerca de la sntesis de protenas confirmaron la correccin de estas
ideas. Incluso se pudieron obtener, por medio de la microscopa electrnica, imgenes de
grupos de ribosomas, los polirribosomas, unidos por una nica molcula de mRNA que
estaba siendo traducida por ellos.
Aclaradas estas cuestiones iniciales, quedaba por resolver el autntico ncleo del
problema, a saber, qu mecanismo molecular es el responsable de que el ensamblaje de los
aminocidos se lleve a cabo en el orden dictado por los tripletes del mRNA?
Ya en 1958, antes por tanto de que se reconociese el papel del mRNA en el proceso,
Francis Crick formul algunas ideas acerca del mecanismo de la traduccin que resultaron
capitales para el desarrollo de la investigacin posterior. En primer lugar, Crick rechaz, por
considerarla poco plausible en trminos fsico-qumicos, la idea de que la molcula patrn de
RNA presentase unas cavidades en las que pudieran encajar las cadenas laterales de los
distintos aminocidos. Por el contrario, argument que la capacidad del RNA para servir
como patrn deba residir en su capacidad para formar puentes de hidrgeno y que, por ello,
deba existir una molcula adaptadora capaz de formar puentes de hidrgeno especficos con

46
el RNA patrn, siendo esta molcula la encargada de llevar a los distintos aminocidos a
su posicin correcta dentro de la cadena. An desconociendo la naturaleza de tal molcula
adaptadora Crick pronostic que debera contener nucletidos e incluso aventur que podra
ser necesaria una serie de enzimas especficos que uniran cada aminocido con su adaptador
correspondiente. Una vez asumido que el cdigo gentico constaba de tripletes (o codones)
de nucletidos del mRNA, la hiptesis de Crick se complement con la idea de que las
molculas adaptadoras deban presentar tripletes complementarios (anticodones) a travs de
los cuales interactuaran con el mRNA.
Las predicciones formuladas por Crick en su hiptesis del adaptador se cumplieron
punto por punto. La bsqueda del adaptador en extractos de E. coli condujo al hallazgo del
tRNA, cuyas caractersticas se han glosado con anterioridad en este captulo. Pronto se
constat que existan tantas especies moleculares de tRNA como tripletes con sentido integran
el cdigo gentico y que una serie de enzimas, denominadas aminoacil-tRNA sintetasas,
catalizan la unin especfica de cada aminocido con su molcula de tRNA. El papel de estos
enzimas en el proceso de expresin gnica es de especial importancia ya que constituyen el
agente que conoce el cdigo gentico (el intrprete que domina el idioma de los
nucletidos y el de los aminocidos). Hay que resaltar, sin embargo, que las propiedades de
las aminoacil-tRNA sintetasas, como las de las dems enzimas, residen en su propia
secuencia de aminocidos, que en ltima instancia est tambin cifrada en el DNA, siendo
este cido nucleico el depositario ltimo de la esencia del cdigo.
En la actualidad se tiene un amplio conocimiento acerca del proceso de ensamblaje de
los aminocidos que integran una cadena polipeptdica, aunque en sus aspectos esenciales
haba sido ya elucidado alrededor de 1964. La secuencia de acontecimientos implicados es de
una complejidad considerable y en ella participan agentes de naturaleza muy diversa, a saber,
RNA mensajero, ribosomas, tRNAs, aminocidos, molculas energticas, enzimas y una serie
de factores de naturaleza proteica que intervienen en diferentes momentos. Distinguiremos en
este proceso las siguientes fases: activacin de los aminocidos, iniciacin de la cadena
polipeptdica, elongacin y terminacin.
ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS.

47
La activacin de los aminocidos consiste en su acoplamiento con su tRNA
especfico mediante una reaccin catalizada por la correspondiente aminoacil-tRNA sintetasa.
La unin se produce entre el grupo carboxilo del aminocido y el grupo hidroxilo 3 del
nucletido de adenina que se encuentra en el extremo 3 del tRNA (Figura 19.46). La reaccin
requiere energa que es aportada por una molcula de ATP con liberacin de un grupo
pirofosfato.
INICIACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA.
La traduccin de la secuencia de nucletidos del mRNA a la correspondiente
secuencia de aminocidos comienza en el triplete de bases AUG, llamado codn de
iniciacin, que al mismo tiempo codifica el aminocido metionina. En las clulas procariotas
existen dos tRNA diferentes que se unen a este aminocido, uno de ellos es el que interviene
en la iniciacin y en lugar de metionina transporta su derivado formil-metionina, el otro
transporta metionina e interviene cuando este aminocido se ha de incorporar en cualquier
posicin de la cadena polipetdica distinta de la inicial. Por el contrario, en las clulas
eucariotas se incorpora metionina en ambos casos. As pues, la sntesis de cualquier cadena
polipeptdica empieza siempre por la metionina o por su derivado formilado, aunque en
muchos casos estos aminocidos son eliminados de la cadena en el llamado procesamiento
post-traduccin.

Puesto que es posible que en un mRNA haya ms de un triplete AUG cabe preguntarse
acerca del mecanismo que garantiza que la lectura comience en el triplete correcto. Se ha
comprobado que en las clulas procariotas el mRNA presenta, entre el extremo 5 y el primer
triplete AUG, unas secuencias de bases que se aparean con otras complementarias de extremo
3 de una molcula de rRNA que forma parte de la subunidad pequea del ribosoma (Figura
19.47). Tales secuencias, denominadas secuencias Shine-Dalgarno aparecen conservadas
en diferentes especies bacterianas y en bacterifagos y su papel parece ser el de fijar al
ribosoma en una posicin prxima al triplete de iniciacin antes de comenzar la lectura. En
clulas eucariotas no se han detectado secuencias anlogas y en ellas la traduccin comienza
simplemente en el triplete AUG ms prximo al extremo 5 del mensajero.
En la fase de iniciacin se suceden los siguientes acontecimientos (Figura 19.48):
El mRNA se une a la subunidad pequea del ribosoma con la intervencin del factor
IF3.
El tRNA iniciador previamente unido a su aminocido especfico (metionina o su
derivado formilado) junto con el factor IF2 y una molcula de GTP se colocan de
manera que el anticodn UAC del tRNA se aparea con el codn de iniciacin del
mensajero (AUG). El conjunto formado se denomina complejo de iniciacin.
La subunidad mayor del ribosoma se une al complejo de iniciacin. Se produce la
hidrlisis del GTP a GDP + Pi y se liberan los factores de iniciacin IF2 e IF3.

48
En el seno de la subunidad mayor del ribosoma se distinguen dos espacios
destinados a acoger molculas de tRNA: la sede P (peptidil) y la sede A (aminoacil). El tRNA
de iniciacin unido a formil-metionina queda situado en la sede P. Es posible que la
formilacin del grupo amino de la metionina tenga la misin de facilitar la entrada del tRNA
de iniciacin en la sede P simulando un enlace peptdico inexistente, pues en las sucesivas
etapas de la traduccin esta sede estar siempre ocupada por un tRNA unido a un pptido y no
a un aminocido.

ELONGACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA.

En esta fase se precisa la concurrencia de varios factores proteicos de elongacin (EF)
y energa aportada por la hidrlisis del GTP. Se suceden los siguientes acontecimientos

49
(Figura 19.48):
Un aminocido activado entra en la sede A del ribosoma de manera que el anticodn
del tRNA se aparea con el correspondiente codn del mensajero. Intervienen en el
proceso el GTP y dos factores de elongacin.
La formil-metionina unida al tRNA de iniciacin se libera de ste y forma enlace
peptdico a travs de su grupo carboxilo libre con el grupo amino del aminocido
activado entrante que se encuentra en la sede A. La transferencia es catalizada por el
enzima peptidil-transferasa. De este modo queda el tRNA de iniciacin libre en la
sede P y el tRNA del segundo aminocido unido a un dipptido en la sede A.
Se produce la traslocacin del ribosoma, que se desplaza un triplete de bases del
mensajero en direccin 53. As, el tRNA unido a dipptido queda situado en la
sede P, quedando libre la sede A para la entrada de un nuevo aminocido activado
mientras que el tRNA de iniciacin se libera del ribosoma. En el proceso interviene
otro factor de elongacin y se consume GTP.
Los pasos descritos se repiten tantas veces como aminocidos haya que incorporar a
la cadena polipeptdica, con la nica diferencia de que en cada nuevo ciclo lo que
transfiere la peptidil-transferasa en el segundo paso es ya un verdadero pptido (no
formil-metionina como en la primera ocasin). El pptido transferido tendr un
aminocido ms de longitud en cada ciclo.

TERMINACIN DE LA CADENA POLIPEPTDICA.

La terminacin de la cadena polipeptdica (Figura 19.48) se produce cuando el
ribosoma llega a alguno de los tres codones sin sentido (UAA, UAG y UGA), que, por no
corresponderse con ningn aminocido, se interpretan como seal de fin de sntesis.
Intervienen adems varios factores proteicos de terminacin (RF), los cuales, al no existir
ningn tRNA que reconozca el codn de terminacin, ocupan su lugar en la sede A,
provocando la liberacin por hidrlisis de la cadena polipeptdica finalizada, la disociacin de
las dos subunidades del ribosoma y la liberacin del tRNA que quedaba en la sede P.
A la cadena polipeptdica as sintetizada slo le resta adquirir su conformacin
tridimensional nativa para ser una protena plenamente funcional e incorporarse a su destino
en la maquinaria celular.
5.6.-

REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA.

La alta eficacia que exhiben las clulas vivas en la manipulacin de la materia y la

energa se debe, entre otras cosas, a que funcionan atendiendo a un principio de economa
molecular segn el cual cualquier proceso que no sea necesario en un momento dado debe ser
interrumpido. En un captulo anterior ya hemos comprobado cmo las clulas llevan a la
prctica este principio por medio de la regulacin de su metabolismo a travs de la actuacin
de distintos tipos de enzimas reguladores. Existe, sin embargo, un nivel superior de control de
la actividad celular que es el de la sntesis de los propios enzimas implicados en el
metabolismo y, en general, de todas las protenas celulares. Resultara un despilfarro,
contrario al citado principio de economa, que una clula viva estuviese sintetizando
continuamente todas las protenas codificadas en su genoma con independencia de que estas
fuesen necesarias o no en cada momento. La clula debe disponer de algn mecanismo que le
permita reaccionar a las condiciones cambiantes del medio en que vive modificando la
expresin de su informacin gentica de la manera ms adecuada.

50
Los primeros indicios de que las clulas controlan la sntesis de sus propios
enzimas se tuvieron a comienzos del siglo XX cuando se comprob que en las levaduras la
presencia o ausencia de determinados azcares en el medio de cultivo induca la aparicin o
desaparicin respectiva de los enzimas responsables de su metabolismo en el citoplasma
celular. Pronto pudo comprobarse que los enzimas celulares podan dividirse en dos grandes
clases: los enzimas constitutivos, presentes siempre en la clula pues son responsables de
reacciones bsicas que deben estar siempre en funcionamiento, y los enzimas adaptativos,
que aparecen o desaparecen como respuesta a las condiciones cambiantes del medio.
Las investigaciones acerca de los
mecanismos de regulacin de la expresin
gnica corrieron paralelas a las que
condujeron a la comprensin del propio
mecanismo de la expresin y se deben en
gran medida al trabajo de Franois Jacob y
Jacques Monod (Figuras 19.33). Ambos
cientficos presentaron en 1961 un modelo,
conocido como el modelo del opern, que
permita comprender dichos mecanismos
reguladores. El modelo fue elaborado sobre
la base del anlisis de un sistema enzimtico
inducible, presente en la bacteria E. coli, del
que forman parte los enzimas responsables
de metabolizar el azcar lactosa.
Un opern est constituido por los
siguientes elementos:
Genes estructurales.- Son los genes
sometidos a regulacin. Codifican los
polipptidos funcionales que forman parte
del sistema inducible. En general, los
operones bacterianos incluyen varios genes
estructurales (son policistrnicos)
Promotor.- Es una secuencia de
DNA que es reconocida por la RNA
polimerasa para iniciar la transcripcin. Se
encuentra
adyacente
a
los
genes
estructurales, que comparten un nico
promotor.
Operador.- Es una secuencia de
DNA situada entre el promotor y los genes
estructurales. Se trata de un elemento
regulador que determinar si se permite o no
la transcripcin de los genes estructurales.
Gen regulador.- Es un gen que
codifica una protena, denominada represor,
con capacidad de permitir o bloquear la
expresin de los genes estructurales. El gen regulador se encuentra cerca de los genes
estructurales pero no necesariamente contiguo a ellos.
Represor.- Protena codificada por el gen regulador. Interacta de manera especfica
con el operador. Cuando se fija a ste bloquea la expresin de los genes estructurales

51
impidiendo el avance de la RNA polimerasa. Cuando se disocia permite la
transcripcin del RNA mensajero correspondiente a los genes estructurales para su
posterior traduccin a polipptidos.
Inductor/co-represor.- Metabolito que interacta con el represor provocando,
mediante cambios conformacionales, su disociacin o su fijacin al operador segn
los casos. Es la sustancia sobre la que acta el sistema enzimtico inducible o bien el
producto final de la actividad de ste.
A continuacin se describirn, a modo de ejemplo, los elementos que integran el
opern lac, que fue el estudiado por Jacob y Monod, y los que integran el opern trp.
El opern lac (Figura 19.49) incluye
tres genes estructurales: el gen Z, que codifica
en enzima -galactosidasa, que cataliza la
hidrlisis de la lactosa a glucosa y galactosa; el
gen Y, que codifica la galactsido permeasa,
una protena de membrana que facilita el acceso
de la lactosa al interior celular; y el gen A,
codifica la galactsido transacetilasa, enzima
cuyo papel en el metabolismo de la lactosa no
est del todo aclarado. El gen regulador i
codifica una protena represora que, en ausencia
de lactosa, se fija de manera especfica sobre el
operador bloqueando la expresin de los genes
estructurales. Cuando la lactosa est presente
funciona como inductor, interactuando con el
represor y provocando su disociacin del
operador y desbloqueando as la expresin.
Un modelo alternativo al del opern lac
es el del opern trp (Figura 19.50), integrado
por un grupo de genes estructurales (genes E, D,
C, B y A) que codifican los enzimas
responsables de la sntesis intracelular del
aminocido triptfano. En este caso el represor
libre resulta inactivo y no puede unirse al
operador, quedando desbloqueada la expresin
de los genes estructurales. Cuando el triptfano
est presente en el medio intracelular acta
como co-represor, provocado en el represor un
cambio conformacional que le permite unirse al
operador y bloquear as la expresin de dichos
genes.
En general, los sistemas inducibles,
como el opern lac, son propios de las rutas
catablicas mientras que los represibles, como
el opern trp, son propios de las rutas
anablicas.
Los sistemas de control hasta aqu descritos comparten la caracterstica de que su
accin se basa en una protena represora que bloquea la expresin gnica. Se han descrito
tambin en clulas procariotas sistemas de control basados en la accin de protenas
activadoras que se denominan sistemas de control positivo. Las protenas activadoras,

52
tambin llamadas CAP (protena activadora por catabolito) se unen al DNA en un lugar
adyacente al promotor, el sitio CAP, de manera que favorecen la fijacin de la RNA
polimerasa facilitando as el inicio de la transcripcin (Figura 19.51). Para que se pueda
producir la unin al DNA de la protena CAP sta debe interactuar, a travs de un centro
alostrico, con el nucletido cAMP (AMP cclico), presente en el citoplasma celular. Los
niveles intracelulares de cAMP estn a su vez modulados, de manera todava no bien
conocida, por la presencia de determinados catabolitos.

Un caso bien conocido de control positivo por CAP afecta a varios operones
relacionados con el catabolismo de azcares distintos de la glucosa, entre ellos el opern lac.
Cuando E. coli crece en un medio rico en glucosa utiliza este azcar como fuente de energa
con preferencia frente a otros azcares aunque tambin estn presentes en el medio de
cultivo. Para ello la clula bloquea la expresin de los genes estructurales de los operones
relacionados con estos azcares. La presencia de glucosa hace descender los niveles de
cAMP haciendo que CAP no se pueda fijar al DNA, con lo que la eficacia de la transcripcin
disminuye en todos los operones controlados, aun en el caso de que se encuentren
desbloqueados por los respectivos represores. El mecanismo descrito se conoce con el
nombre de represin por catabolito. La manera en que la presencia de glucosa afecta a los
niveles intracelulares de cAMP no se conoce todava con exactitud.
De lo dicho hasta ahora se deduce que la regulacin de la expresin gnica puede
responder a alguno de los siguientes modelos tericos:

53
Tipo 1.- Sistema inducible con control negativo (ej. Opern lac)
Tipo 2.- Sistema inducible con control positivo. (ej. Operones regulados por CAP)
Tipo 3.- Sistema represible con control negativo. (ej. Opern trp)
Tipo 4.- Sistema represible con control positivo. (No hay casos conocidos)
La regulacin de la expresin gnica en clulas procariotas es un fenmeno complejo
en el que multitud de operones se ven sometidos a sistemas de control mixto en los que
intervienen ms de uno de los tipos reseados. Por ejemplo el opern lac responde a los tipos
1 y 2.
Por otra parte, la regulacin de la expresin gnica e las clulas eucariotas y, ms
concretamente, en los eucariontes pluricelulares, es todava, si cabe, ms necesaria que en las
clulas procariotas. En un organismo pluricelular todas las clulas poseen la misma
informacin gentica, pero esta informacin no se expresa por igual en todas ellas. La esencia
de la pluricelularidad es la especializacin: los distintos tipos celulares se van diferenciando a
lo largo del desarrollo y adquiriendo cada uno capacidades y funciones diferentes. Esta
especializacin est basada en una expresin diferencial de la informacin gentica, que se
consigue mediante un sofisticado sistema de regulacin.
Los mecanismos de regulacin de la expresin gnica en las clulas eucariotas se
conocen con menor detalle que los de las clulas procariotas. Los mRNA eucariotas son
monocistrnicos, lo que lleva a la conclusin de que los genes estructurales en estas clulas
no estn integrados en operones como en el caso de las procariotas. Por el contrario, cada gen
eucariota dispone de su propio sistema regulador que no comparte con otros genes. Tales
sistemas se componen de unas secuencias especficas denominadas enhancers, situadas en las
proximidades del gen estructural, que pueden interactuar con varias protenas de las llamadas
factores reguladores de la transcripcin. El nmero y tipo de los factores interactuantes, as
como las secuencias enhancer implicadas determinan en cada caso la intensidad con la que se
llevar a cabo la transcripcin.
Sin duda es mucho lo que queda por investigar en el campo de la regulacin de la
expresin gnica en organismos eucariontes y muchas las aplicaciones que puedan tener los
conocimientos que sobre ello se vayan obteniendo.

6.-

LA MUTACIN A NIVEL MOLECULAR.

Una de las implicaciones del reconocimiento del DNA como el material gentico fue
la comprensin del fenmeno de la mutacin a nivel molecular. Asumido que la informacin
gentica se encontraba cifrada en forma de secuencia de nucletidos se dedujo fcilmente que
la mutacin, al menos la mutacin gnica o puntual, consiste en una alteracin de dicha
secuencia de nucletidos. Las mutaciones ms simples son las que afectan a un nico par de
bases del DNA, que constituye la unidad mnima de mutacin. En relacin con el tipo de
sustitucin que afecta a un determinado par de bases se pueden distinguir dos tipos:
Transiciones.- Cambio de una base prica por otra del mismo tipo o de una base
pirimdica por otra del mismo tipo (ATGC, GCAT, CGTA y TACG).
Transversiones.- Cambio de una base prica por una pirimdica o viceversa
(ATCG, ATTA, GCTA, GCCG, TAGC, TAAT, CGAT y
CGGC).
Ambos tipos de sustitucin se consolidan en el siguiente ciclo replicativo cuando la
base sustituida forma parte del molde y enfrenta una base diferente de la original.
En cuanto a su efecto sobre el fenotipo se distinguen varios tipos de mutaciones
(Figura 19.52), a saber:

54

Mutaciones con cambio de sentido.- Implican la sustitucin de un aminocido

por otro. Su efecto sobre el fenotipo es moderado cuando ambos aminocidos
tienen propiedades qumicas similares (mutacin conservativa o neutra), y ms
drstico cuando sus propiedades difieren en mayor grado (mutacin no
conservativa).
Mutaciones sin sentido.- El cambio de base nitrogenada supone el cambio de
un triplete que codifica un aminocido por un triplete de fin de sntesis, lo que
implica que a partir de este triplete no se insertan ms aminocidos en la
cadena. El resultado, por lo general, es una protena no funcional, por lo que
este tipo de mutaciones suelen tener efectos severos sobre el fenotipo.
Mutaciones silenciosas.- No todas las mutaciones tienen un efecto sobre el
fenotipo. Por el hecho de existir en el cdigo gentico tripletes sinnimos,
algunas mutaciones no suponen un cambio en la secuencia de aminocidos de
la protena codificada.
Por otra parte, algunas mutaciones puntuales pueden consistir no en sustituciones, sino
en inserciones o prdidas (deleciones) de pares de bases individuales. Estas mutaciones
suelen tener efectos drsticos pues suponen uncorrimiento de la pauta de lectura que, a la
hora de sintetizar la protena codificada, afecta a todos los aminocidos que se encuentran
despus de la insercin o delecin.
En la Figura 19.53 se recogen algunas de las mutaciones gnicas relacionadas con
algunas enfermedades frecuentes en nuestra especie.
Podemos considerar, desde el punto de vista de sus causas, dos tipos de mutacin: la
mutacin espontnea, que las clulas sufren en condiciones naturales, sin mediar la
intervencin de agentes externos; y la mutacin inducida por agentes fsicos o qumicos
externos a la clula.

55

6.1.-

MUTACIONES ESPONTNEAS.

Las mutaciones espontneas se producen fundamentalmente a causa de errores en la

replicacin del DNA, aunque tambin pueden obedecer a lesiones de carcter fortuito en
molculas de DNA que no se estn replicando.

Los errores en la replicacin pueden ocurrir mediante alguno de los dos siguientes
mecanismos:
Tautomera.- Las bases nitrogenadas presentan un tipo particular de isomera
denominado tautomera. La forma tautomrica ms estable (forma ceto) coexiste en
equilibrio con pequeas cantidades de la forma menos estable (forma enol). Las
formas inestables de las bases tienen alterada su capacidad para formar puentes de
hidrgeno y dan lugar a apareamientos errneos (A*-C, T*-G, G*-T y C*-A, donde
el asterisco indica las formas inestables). Cuando el desplazamiento hacia la forma
inestable se produce en el instante en que la base est siendo usada como molde en la
replicacin se produce un apareamiento errneo que, si no es reparado, se consolida

56
en el siguiente ciclo replicativo dando lugar a una transversin (Figura 19.54).
Apareamiento deslizado.- En secuencias muy repetitivas es relativamente probable
que se produzcan un fenmeno denominado apareamiento errneo deslizado,
consistente en que alguna base se queda sin aparear formando un pequeo lazo. Si
esto ocurre en la cadena en crecimiento se produce una adicin de base mientras que
si ocurre en la cadena molde se produce una delecin.
Por otra parte, las lesiones de carcter fortuito que puede sufrir el DNA suelen
consistir en alteraciones qumicas de las bases nitrogenadas que dan lugar a apareamientos
errneos los cuales se consolidan como mutaciones. Entre estas alteraciones cabe destacar la
despurinizacin (prdida de bases pricas que rompen su enlace N-glucosdico con la
pentosa), la desaminacin (prdida de grupos amino afectando a la capacidad de formar
puentes de hidrgeno) y daos oxidativos que resultan de la interaccin de las bases con
algunas sustancias como el perxido de hidrgeno.
6.2.-

MUTACIONES INDUCIDAS.

Existen diferentes tipos de agentes fsicos y qumicos con capacidad de producir

mutaciones.
Entre los agentes fsicos cabe destacar las radiaciones ionizantes como los rayos X o
los rayos , algunas radiaciones no ionizantes como lo rayos ultravioleta y las emisiones
radiactivas de partculas (, , neutrones). En general estos agentes actan arrancando
electrones a alguno de los tomos que forman parte del DNA, que al quedar ionizado se torna
mucho ms reactivo ante una amplia gama de sustancias presentes en la clula. Las
reacciones qumicas consiguientes pueden en alteraciones o prdidas de bases nitrogenadas o
incluso en la rotura de la molcula de DNA con prdida de una parte del cromosoma.
Los agentes qumicos con capacidad mutagnica pueden ser de varios tipos:
Anlogos de base.- Sustancias con parecido estructural a las bases nitrogenadas que
pueden sustituirlas en la replicacin y dar lugar a apareamientos errneos.
Modificadores de las bases.- Sustancias que afectan a las bases nitrogenadas
alterndolas qumicamente y modificando su capacidad para formar puentes de
hidrgeno.
Agentes intercalantes.- Sustancias con estructura qumica planar o casi planar que se
intercalan entre los pares de base durante la replicacin dando lugar a adiciones o
deleciones de base.
6.3.-

REPARACIN DE LAS MUTACIONES.

Una parte significativa de las mutaciones que se producen en el DNA son reparadas
mediante diferentes mecanismos de los que disponen las clulas. Durante el proceso
replicativo la funcin correctora de las DNA polimerasas (exonucleasa 35) puede detectar
y eliminar nucletidos que hayan sido insertados de manera incorrecta. Algunas de las
mutaciones no detectadas durante la replicacin pueden ser detectadas ms tarde y reparadas
por un equipo de enzimas que incluye endonucleasas, exonucleasas, DNA polimerasas y
ligasas.