Você está na página 1de 21

Tcnica Bsicas para

Anlises de Clulas e
Tecidos

Viso panormica da clula


Algumas grandezas...
1km

1.000m

1m

100 cm

1cm

10 mm

1mm

1000 m

1 m

1000 nm

1 (Angstron)

10-10m

Viso panormica da clula


Aumento e Poder de Resoluo

Resoluo: menor distncia para que duas partculas apaream


como objetos separados.
O limite de resoluo da Microscopia ptica de 0,2 m

Viso panormica
da clula

Desenvolvimento da Microscopia
-Microscpio ptico (luz)
-Microscpio Eletrnico (eltrons)

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico utiliza feixes de luz

Sistemas de lentes (condensador, objetiva e


ocular)
O limite de resoluo do MO de 0,2 m e
depende essencialmente da objetiva.

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico de campo claro

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico de fluorescncia

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico de fluorescncia

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio ptico confocal

Desenvolvimento da Microscopia
Outros tipos de microscpios pticos

Iluminao direta (sem colorao)

Contraste de fase (refrao da luz)

Contraste diferencial de interferncia (refrao


da luz)

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio eletrnico
-utiliza feixes de eltrons
-lentes eletromagnticas

Alta resoluo, abaixo de 0,3 nm.


Material biolgico impregnado com metais pesados
como smio, chumbo e urnio

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio eletrnico de transmisso:

Alta resoluo
Necessita de cortes muito finos
(0,02 a 0,1 m)
Material biolgico impregnado
com metais pesados como smio,
chumbo e urnio
Imagem eltron-densa (escura) e
eltron-lcida (clara)

Estrutura e funcionamento

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio eletrnico de transmisso

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio eletrnico de varredura

Alta resoluo
Fragmentos maiores ou tecidos inteiros
Material biolgico recoberto com metais
como ouro ou platina
Estrutura tridimensional (3D)

Desenvolvimento da Microscopia
Microscpio eletrnico de varredura

MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA

Microscpio eletrnico de
varredura

Centro de Microscopia
Eletrnica
UNESP - Botucatu

MEV

MET

10

Preparao de material para


anlise ao microscpio

As clulas e tecidos precisam estar perfeitamente


preservados, apresentando a mesma estrutura e
composio qumica que possuam quando vivas.

Preparao de material para anlise ao microscpio

Fixao Preserva a morfologia e composio do tecido. Fixador mais utilizado


Formaldedo. Para microscopia eletrnica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos
especiais em solues de aldedo glutrico e tetrxido de smio.

11

Preparao de material para anlise ao microscpio

Lavagem

Preparao de material para anlise ao microscpio

Desidratao Retirada da gua presente nos tecidos atravs de


sucessivos banhos em uma srie de etanol (70%80%90%100%).

12

Preparao de material para anlise ao microscpio

Diafanizao ou clareamento Substituio do etanol por lquido miscvel


(geralmente xilol) com o meio de impregnao e retirada de lipdios.

Preparao de material para anlise ao microscpio

Meio de impregnao Substituio do lquido


(xilol) por parafina ou resina sinttica. A resina
sinttica possibilita cortes mais finos (1 a 2 m). O
ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 m)
e por isso utiliza se resinas mais duras. Neste caso
os cortes so feitos com navalhas de vidro ou
diamante.

13

Preparao de material para anlise ao microscpio

Meio de incluso Suporte para o tecido impregnado.

Preparao de material para anlise ao microscpio

Tecido preparado para anlise ao Microscpio Eletrnico

14

Preparao de material para anlise ao microscpio

Micrtomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura).

Preparao de material para anlise ao microscpio

Micrtomo automatizado Permite a obteno rpida de cortes sem


passar pelas etapas descritas antes.

15

Preparao de material para anlise ao microscpio

Micrtomo
Realizando cortes do material

Preparao de material para anlise ao microscpio

Micrtomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1m de espessura).

16

Preparao de material para anlise ao microscpio

Estufa 60 oC
Derreter e eliminar a parafina

Preparao de material para anlise ao microscpio

Xilol
Retirada da parafina

Srie alcolica - Rehidratao.

Hidratao completa

17

Preparao de material para anlise ao microscpio

Colorao

Preparao de material para anlise ao microscpio


Colorao A maioria dos corantes utilizados se comportam como cido ou base.
Estrutura celular basfila, liga-se a corantes bsicos.
Estrutura celular acidfila, liga-se a corantes cidos.

Corantes bsicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...


Corantes cidos: eosina, orange G, fucsina cida...

Hematoxilina/Eosina (HE)
Colorao freqentemente utilizada

Alm destes corantes freqentemente utilizados, utiliza se tambm outros


tipos de colorao, como a impregnao com sais de prata e ouro.

18

Preparao de material para anlise ao microscpio

Alm destas coloraes frequentemente utilizadas, outros mtodos baseados


em reaes qumicas (citoqumica), imunolgicas (imunocitoqumica), entre
outras, tambm podem ser empregados.

...outras tcnicas que podem ser empregadas na Biologia


Celular e Molecular
: Radioautografia
: Imunocitoqumica
: Cromatografia
: Eletroforese
: Cristalografia e difrao de raio-X
: Hibridao de cidos nuclicos

19

Preparao de material para anlise ao microscpio

Montagem das lminas

Preparao de material para anlise ao microscpio

Anlise do Material

20

Preparao de material para anlise ao microscpio

Resultados

Plano de corte

21