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GD2 BIOLOGIA MOLECULAR CURSO FARMCIA E BIOMEDICINA

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA E IMUNOLOGIA


PROFESSORA RAFAELA FERREIRA
GD2 - Traduo e modificaes ps-traducionais; Controle da expresso gnica em procariotos e eucariotos;
Clonagem gnica, expresso e purificao de protenas recombinantes
1. Atravs de um desenho esquemtico, indique os principais elementos de um tRNA e de que forma o tRNA
est ligado ao aminocido.
2. O que seqncia de Shine-Delgarno e qual a sua importncia?
3. Explique o que fenmeno de oscilao no pareamento cdon anticdon. Quais so as consequncias
deste processo em termos do nmero de tRNAs que so necessrios para a traduo? E para as consequncias
de mutaes?
4. Descreva (ou esquematize) o alongamento em procariotos no processo de traduo, indicando os fatores
de alongamentos e o stios de ligaes.
5. Quais as diferenas entre o processo de iniciao da traduo em procariotos e eucariotos?
6. Baseando-se na lista de cdons e amino cidos abaixo, quais das seguintes afirmaes so corretas?
AGU = serina
AGC = serina
AAG = lisina
AAA = lisina
AUG = metionina
AUA = isoleucina
a) O cdigo gentico degenerado
b) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons poderia levar substituio
de uma isoleucina por uma lisina no polipeptdeo.
c) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons necessariamente levaria
substituio de um aminocido no polipeptdeo codificado.
7. Compare a preciso de (a) replicao do DNA, (b) sntese de RNA e (c) sntese de protenas. Quais os
mecanismos utilizados para assegurar a fidelidade de cada um desses processos?
8. Nos procariotos, a ausncia de compartimentalizao do genoma permite que os processos de transcrio
e traduo sejam acoplados. Em eucariotos, esses processos esto temporal e espacialmente isolados. Quais
as consequncias dessa diferena entre procariotos e eucariotos?

9.
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.

Explique a importncia de cada uma das seguintes modificaes ps-traducionais:


Enovelamento
Formao de ligaes dissulfeto
Clivagem da cadeia polipeptdica
Glicosilao
Fosforilao
Metilao, acetilao
Adio de ncoras lipdicas
Degradao

10. Qual a importncia do fator sigma para a atividade da enzima RNA polimerase? Como a existncia de
diversos fatores sigma contribui para a regulao da transcrio?
11. Os perons lac e triptofano so regulados de acordo com a concentrao de lactose e de triptofano.
a. De modo geral, quais as vantagens de organizao de genes em perons?
b. Em ambos perons a ligao de uma protena repressora ao promotor regulada por molculas
sinalizadoras. No entanto, em um caso esta ligao favorecida, enquanto no outro desfavorecida.
Justifique essa diferena considerando as protenas codificadas por cada peron.
c. Como a concentrao de glicose influi na transcrio gnica para o peron lac (e de modo geral, para
diversos perons relacionados ao metabolismo de carboidratos)?
d. Quatro regies contidas na sequncia lder do peron triptofano (sequncia localizada entre o promotor e
as sequncias codificadoras de protenas) so importantes para o mecanismo de atenuao. Explique o papel
de cada uma dessas regies para a regulao deste peron, descrevendo o processo que ocorre em altas e em
baixas concentraes de triptofano.
12. Algumas diferenas entre eucariotos e procariotos, como presena de cromatina e de membrana nuclear,
implicam em diferenas de regulao da expresso gnica entre esses organismos.
a. Explique o que o cdigo de histonas, que tipo de alteraes ocorrem na cromatina e, de modo geral, qual
a sua importncia para a regulao da expresso gnica.
b. Diz-se que em eucariotos o estado basal de transcrio restritivo. Explique esta afirmativa comparando a
regulao em procariotos e eucariotos.
c. Em eucariotos no h organizao em perons. Cite mecanismos permitem a regulao conjunta de genes
relacionados (por exemplo, de diversos genes que codificam protenas que participam de uma mesma via
metablica).
d. Qual a funo dos complexos SAGA e SWI/SNF?
13. A tcnica de RNAi apresenta diversas aplicaes na rea teraputica.
a. Descreva o mecanismo de RNAi desde a introduo de um dsRNA longo (RNA longo de dupla fita) at a
degradao de um mRNA especfico.
b. Explique como esta tcnica pode ser empregada na validao de alvos teraputicos
c. Explique como esta tcnica pode ser empregada no desenvolvimento de terapias

14. A maior parte de nossos genes podem sofrer splicing alternativo. Esse processo pode ser regulado de
diversas maneiras, inclusive por modificaes em histonas. O gene FGFR2 um exemplo. Em clulas epiteliais
de prstata (PNT2, indicada em vermelho nas figuras) ocorre incorporao do exon IIIb, enquanto em clulas
tronco mesenquimais (hMSC, indicada em preto nas figuras) o exon IIIc incorporado (Figura A). Observa-se
que estes tipos celulares diferem quanto ao padro de metilao das histonas H3. Nas clulas mesenquimais,
em que IIIc incorporado, observa-se uma proporo muito maior de histonas H3 metiladas na lisina 36
(K36me3) do que nas clulas PNT2 (Figura B).
Para investigar se existe relao de causa e efeito entre estas duas observaes, foi alterada em ambos tipos
celulares a concentrao da enzima SET2, responsvel pela metilao de H3K36. Foram realizados dois
experimentos: a superexpresso dessa protena; a reduo da concentrao da mesma atravs de RNAi.
Experimentos controle indicaram a eficincia das alteraes das concentraes de SET2 e da alterao na taxa
de metilao esperada para cada caso. Aps estes experimentos foi verificada a razo entre os mRNAs que
continham o exon IIIb e as que continham o exon IIIc em cada caso. Os resultados aps superexpresso de
SET2 esto representados na Figura C, tendo como controle o gene EGFP. A Figura D representa os resultados
aps RNAi para SET2 (siSETD2) e para uma sequncia silenciadora de uma protena no relacionada (siCycB,
que constitui um controle neste experimento).

a. A partir dos resultados obtidos em C e D, possvel concluir que h relao de causa e efeito entre a
metilao de H3K36 e o splicing alternativo? Justifique.
b. Por que esta concluso no pode ser obtida apenas a partir dos resultados indicados em A e B?
15. No processo de clonagem necessrio amplificar o DNA de interesse e inseri-lo em um vetor.
a. Como o DNA pode ser amplificado?
b. Qual o papel das enzimas de restrio neste processo?

16. Explique porque importante que um vetor contenha uma regio com mltiplos stios de reconhecimento
para enzimas de restrio.
17. Explique como a presena de ntrons em genes eucariticos complica a gerao dos produtos proticos
que eles codificam quando a expresso feita em bactrias. Como possvel resolver este problema?
18. Se um plasmdeo com um gene de interesse clonado fosse amplificado biologicamente por insero em
uma bactria, quais caractersticas o plasmdeo deveria ter para se multiplicar na bactria e ser possvel
selecionar aquelas que contm o plasmdeo?
19. Os plasmdeos so vetores muito teis, mas nem sempre so adequados. Cite uma limitao desses
vetores e um vetor que no possua a mesma limitao.
20. Uma etapa importante da clonagem de um gene em uma bactria verificar se o vetor recombinante
(contendo o gene de interesse) foi inserido no microorganismo.
a. Como o sucesso da insero do vetor pode ser verificado?
b. Como verificar se o vetor de incorporado por uma bactria contem o gene de interesse?