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Cultivo de Linfocitos de sangre perifrica para Cariotipo utilizando

Tcnica de Bandas G.

Reactivos .
Medio de cultivo PB- MAX
karyotyping con
fitohemaglutinina, penicilina
G, estreptomicina y suero
bovino fetal.

Colcemid 10 mcg/ml
Heparina.
Fitohemaglutinina

Materiales Biolgicos.
Obtener por puncin de 0.5 a 2ml de sangre en vena o arteria con
jeringa estril heparinizada.
Solo se podr realizar en el hospital de toma de muestra para
cariotipo los das lunes, martes y viernes de 7:00am a 9:00pm., debido
a las 72 horas de incubacin que requiere la muestra.

Tcnica.
Colocar 8 a 10 gotas de sangre en 5ml. de Medio de cultivo de
Cariomax ( con glutamina, bicarbonato de sodio, fitohemaglutinina,
suero fetal de bovino y antibiticos),, en ambiente esteril ( campana
de siembra), y frascos de vidrio previamente esterilizados.
A dicho medios se le adiciono 0.3 ml de fitohemaglutinina.

SIEMBRA
Incubacin a 37C durante 72 hrs.
Colocar en estufa de cultivo a 37C por 72 horas.
Pasado este tiempo, colocar 0.3ml, de colcemid o colchicina a
cada frasco de cultivo con jeringa de insulina y dejarlos en la estufa
a 37C una hora.

COSECHA./Reactivos
Solucin hipotnica de cloruro de potasio 0.75 M, pesar 1.125gr de
cloruro de potasio y disolver en 200 ml de agua destilada.
Fijador de metanol- acido tico, mezclar 90 ml de metanol con 30 ml
de acido actico glcial.

Tcnica.
Pasar el contenido de los frascos en u tubo de 15 x 100 con pipeta
Pasteur. ( es muy importante la remocin de material antes de
colocarla en los tubos para evitar que las clulas que crecieron en el
fondo se pierdan), y que no quede absolutamente nada de material
en los frascos y pipetas.
Colocar los tubos Pasteur, desechar el sobrenadante ( con mucho
cuidado de no remover las clulas).
Con una pipeta Pasteur, desechar el sobrenadante ( con mucho
cuidado de no remover las clulas).
Re suspender las clulas con mucho cuidado y agregar 8ml de
solucin hipotnica de KCL 0.075M a 37C

COSECHA.
Adicin de solucin hipotnica ( Cloruro de potasio)
Incubacin a bao Maria durante 40 min
Incubar a bao Mara a 37C por 30-40 minutos.
Centrifugar a 3000r.p.m por 10 minutos.
Desechar el sobrenadante con cuidado de no levarse el botn y
adicionar 8ml de fijador.
Dejar en reposos a temperatura ambiental por 20 min y centrifugar.
Desechar el sobrenadante con cuidado de no llevar el botn y
adicionar 5 ml de fijador proceder a centrifugar a 300 rpm por 10 min.
DE centrifugar a 3000 rpm durante 10min.

Lavar de 2 a 3 veces mas el botn con 5ml de fijador ( recin


preparado)
Quitar el sobrenadante y dejar por los menos 1cm de fijador y re
suspender con una pipeta Pasteur antes de hacer las laminillas.
Adicin del fijador metanol- acido actico.
Se realizan 3 lavados con fijador metanol- acido actico.

LAMINILLA.
Mnimo de un da antes de preparar las laminillas para su bandeo, se
hace una solucin de metanol y agua al 50% y se deja en una caja
de Koplin en refrigeracin.
Se lavan las laminillas suavemente con una gasa y agua destilada, se
agregan solucin de metanol al 50% para que permanezcan en
refrigerador por lo menos 24 horas antes de ser usadas.
Dependiendo de la concentracin del botn, se dejan caer a cada
laminilla de 4 a 6 gotas de material celular, fijarlo por un segundo al
mechero y observar la dispersin en el microscopio.
Si las clulas quedaron bien dispersas al romperse la membrana, se
observan los cromosomas separados.
La altura utilizada al dejar caer las gotas es buena, se puede seguir
utilizando como patrn, pero si estn muy cerradas, dejar mas altura,
y si estn muy dispersas, disminuirlas.
Se clasifican las laminillas de acuerdo a su calidad, si la laminilla esta
esmerilada se le ponen smbolos que nos indiquen la calidad de la
mismas, las laminillas que no tienen esmerilado hay que ponerles una
etiqueta para clasificarlas con clave y la calidad de las metafases de
la siguiente forma (una palomita si esta bien la metafase, una R si esta
regular o una tachita si no hay metafase)
Colocar las laminillas calificadas con una palomita o con una R en un
porta laminillas del metal en la estufa de incubacin a 37C, por los
10 das antes de bandear.
Realizacion de laminillas a diferentes alturas.
Incubacion de las laminillas durante 37C durante 10 dias.

Bandeo Cromosmico
Reactivos.
Solucin isotnica 0.9%
Tripsina al 5%
Suero bovino fetal
Sol. Buffer al 7.384
Colorante de Giemsa: pesar un gramo de colorante de giemsa y
disolver 33ml de metanol y 33ml de glicerina.
Agua destilada.

Tcnica de Bandas G.
Se colocan 5 vasos de Koplin:
El primer vaso debe estar desde el dia anterior a 37C con solucin
salina en el bao maria, agregar 10 ml de trpsina al 5% y mezclar
bien, regular el pH de esta solucin a 6.0 con potencimetro o con
tira de pH.
En el segundo vaso de koplin: colocar 80ml de Cloruro de sodio
(0.9%), agregarle 2 ml de suero fetal de bovino.
En el tercer vaso de koplin: Colocar solucin salina isotnica.
En el cuarto vaso de koplin: Colocar colorante de Giemsa. Preparado
de la siguiente manera: 4 ml de colorante 4 ml de buffer con pH:
7.384 y 40ml de agua destilada.
El quinto vaso: Solucin de buffer de pH: 7
Se observo una metafase con cromosomas de buen tamao y
dispersos en el microscopio
Se coloca la laminilla en el primer frasco (a bao maria de 37C que
contiene tripsina), por 30 segundos.

Se lava primero en el frasco 2, despus en el 3, para quitar el exceso


de tripsina y se coloca en el siguiente frasco que contien el colorante.
Se deja reposar por 8min.
Se lava suavemente en el siguiente frasco ( el que contiene buffer),
para quitar el exceso de colorante y despus en agua sola ( puede
ser agua destilada o en el chorro de agua).
Se observan al microscopio las bandas. Pueden modificarse el tiempo
o tripsina hasta obtener un excelente bandeo cromosmico.
Lectura Observar 20 metafases si estas son normales.

LECTURA
Se comienza con las de mejor calidad empezando a leer de lado
izquierdo hacia el derecho en forma de zigzag hasta el final de la
misma.
En cada metafase se van agrupando mentalmente los cromosomas
por grupos despus de haberlos contado en total, observar sus
bandas, lo observado se anota.
Despus de haber ledo un buen numero de metafases (20) claras y
con el numero de caractersticas optimas, se procede a la toma de
la fotografa.
Las metafases deben tener buena coloracin y contraste, se toman
las fotos en blanco y negro o bien con cmara digital a color
imprimindola en la computadora con filtro de color verde.
Esta no se realizo ya que no se contaba con los medios necesarios
para dicha realizacin.

Resultado
Despus de obtener las fotografas en papel de las metafases
representativas se recortan los cromosomas, se van pegando en una
cinta diurex y se pega en la hoja de cariotipos, en parejas. La hoja
debe estar membretada en una forma que sean agrupados los
cromosomas por su grupo ( A a G).
El patron de bandeo debe ser claro para darnos una mejor
apreciacin de cada cromosoma y por lo tanto, un mejor
diagnostico.

Se coloca una metafase sin armar en la parte superior del cariotipo


armado para poder observar los cromosomas antes y despus de
recolectarlos.
Esta no se realizo ya que no se contaba con los medios necesarios
para dicha realizacin.

REPORTE.
El reporte se hace en hojas membretadas del hospital. (hoja anexo)y se
realiza en un periodo aproximadamente de 40 das hbiles.
Resultado del cariotipo

CARIOTIPO EN SANGRE PERIFERICA


NOMBRE DEL PACIENTE: AIDA JOSEFINA LOPEZ GOMEZ

cc

Conclusin:
En esta practica aprendimos al manejocorrecto en medicin de los reactivos y
manera de usarlos de igual manera aprendi al manejo de equipos para la lectura
de cariotipo y realizar dicho procedimiento para llegar a la lectura con cada uno
de pasos que se nos fue otorgados por nuestra maestra.