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RCC Vol. 8 N 6
Noviembre/Diciembre 2000

CARDIOLOGIA DEL ADULTO - TRABAJOS LIBRES

Formacin de biocapas por Enterococcus faecalis y

Enterococcus faecium sobre catteres intravasculares
JACQUELINE MAYORGA, MSC; MARCELA GMEZ, MSC; FREDY GAMBOA, PH.D, MILAY LEN, BACT; CLARA
SISA, BACT; CATALINA OJEDA, BACT; CAROLINA OCAMPO, BACT.

Santaf de Bogot, D. C., Colombia.

La formacin de biocapas por bacterias en la superficie

de los catteres intravasculares es un evento muy importante en la patognesis y evolucin de infecciones
asociadas con el uso de estos dispositivos mdicos. Los
objetivos de este estudio fueron desarrollar biocapas y
evaluar los eventos de adhesin y colonizacin in vitro
de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium sobre
catteres intravasculares de tefln, poliuretano y vialn.
Con este fin se utilizaron dos cepas, una de Enterococcus
faecalis y una Enterococus faecium, en las que se determin la susceptibilidad a antibiticos y la produccin de
-lactamasas. Para la formacin de biocapas se hicieron cortes de los catteres y se pusieron en contacto con
inculos independientes de 3 x 10 8 UFC/ml de
Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium, y se
incubaron a 370C durante diferentes tiempos. Los resultados muestran que las dos cepas objeto de estudio
presentaron resistencia a ampicilina, baja resistencia a
gentamicina y sensibilidad a vancomicina; adems de
ser productoras de -lactamasas de amplio espectro. El
Enterococcus faecalis se adhiere mucho mejor que
Enterococcus faecium a los catteres intravasculares
evaluados en este estudio. La mejor adherencia y formacin de biocapas tanto de Enterococcus faecalis
como de Enterococcus faecium se dio sobre el catter
intravascular de tefln. En conclusin se sugiere que a
la hora de escoger un catter intravascular, deber ser
de material de vialn ya que en l es donde los dos
enterococos se adhieren muy mal, lo que conducira a
una deficiente formacin de biocapas que evitara complicaciones como endocarditis.

Bacterial biofilm formation on surfaces of the

intravascular catheters is a very important event in the
pathogenesis and evolution of infections associated
with the use of these medical devices. The purposes of
this study was to develop biofilms and evaluate the
adhesion and colonization events in vitro of
Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium on
intravascular catheters of teflon, polyurethane and
vialon. With this in mind, two strains were utilized, one
of the Enterococcus faecalis and another of Enterococcus
faecium in which the susceptibility to antibiotics and
the production of beta-lactamases were determined.
Bacterial suspensions (3x108 UFC/ml) in brain heart
infusion broth containing 0.5 cm segments from each
type of catheter were incubated at 37 0C for 30 days.
The two strains presented resistance to ampicilline,
low resistance to gentamicine and sensitivity to
vancomicin. Moreover they were producers of extended spectrum beta-lactamases. Enterococcus faecalis
adheres to the intravascular catheters much better
than the Enterococcus faecium. Best adherence and
formation of biofilms of Enterococcus faecalis as well as
of the Enterococcus faecium was on the teflon
intravascular catheter. In conclusion this study suggests
that at the moment we choose an intravascular catheter,
it should be of vialon given that adherence to this
material is not good. In consequence this would result
in a lesser formation of biofilms and would avoid
complications such as endocarditis.

Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiologa, Facultad de

Ciencias, Santaf de Bogot, D. C., Colombia.
Correspondencia: Marcela Gmez, MD, Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Carrera 7 No. 43-82, E-mail:
mgomez1-2000@yahoo.com, Santaf de Bogot, D.C., Colombia.

(Rev. Col. Cardiol. 2000; 8: 282-286)

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Introduccin
Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium son
actualmente importantes patgenos responsables de un
gran nmero de infecciones especialmente las de origen
nosocomial, entre las que se encuentran endocarditis (1),
infecciones de heridas quirrgicas, del tracto urinario y
en el torrente sanguneo. Es preocupante la elevada
prevalencia de endocarditis infecciosa asociada con el
uso de catteres, sondas urinarias y vlvulas cardacas
protsicas. Estas tasas de infeccin se relacionan ntimamente con el tiempo de uso y la naturaleza qumica de los
biomateriales usados en la fabricacin de estos dispositivos mdicos (2, 3, 4).
Las biocapas o biofilms, agrupaciones de bacterias
unidas a superficies inertes o tejido blando que forman
una matriz protectora constituida por exopolisacridos,
tienen una arquitectura estructural y funcional que conducen a cambios en procesos metablicos, respuestas a
nutrientes, resistencia a agentes antimicrobianos y otros
factores relacionados con los microorganismos que se
encuentran dentro de ellas. La forma de crecimiento de
las bacterias en las biocapas es muy similar a la que hacen
las bacterias dentro de las vegetaciones en la endocarditis
(5, 6), por lo cual el estudio de estas biocapas se acerca
al suceso in vivo de la endocarditis.
Se ha demostrado en diferentes estudios in vitro
que la colonizacin y formacin de biocapas por bacterias en la superficie de los catteres intravasculares y
urinarios es un evento muy importante en la patognesis
y evolucin de infecciones asociadas con el uso de estos
dispositivos mdicos.
Los objetivos de este estudio fueron desarrollar biocapas
y evaluar los eventos de adhesin y colonizacin in vitro
de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium sobre
catteres intravasculares de tefln, poliuretano y vialn.

Mtodos
Cepas bacterianas
En este estudio se utilizaron dos cepas, una de
Enterococcus faecalis y otra de Enterococcus faecium,
de procedencia clnica y debidamente identificadas en el
Instituto Nacional de Salud de Colombia. Las cepas en
estado de pureza fueron mantenidas en agar chocolate y
agar Todd Hewitt para los respectivos estudios.

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Caractersticas de las cepas

Produccin de hemlisis alfa y gelatinasa
Para la deteccin de hemlisis alfa las dos cepas se sembraron en agar Todd Hewitt, suplementado con 5% de
sangre humana, y se incubaron a 37C durante 24 horas.
Para la prueba de la gelatinasa las bacterias se sembraron
por puncin en tubos con gelatina, se incubaron durante
cinco das a 37C y luego se llevaron durante 4 horas a 4C;
la licuefaccin de la gelatina, resultado positiva de la
prueba, indica la produccin de la enzima gelatinasa (7).
Susceptibilidad antimicrobiana
Se evalu de acuerdo a la tcnica de Bauer Kirby,
utilizando los siguientes sensidiscos: ampicilina 10 ug/
ml, nitrofurantona 300 ug/ml, norfloxacina 10 ug/ml,
tetraciclina 30 ug/ml, eritromicina 15 ug/ml, gentamicina
10 ug/ml, vancomicina 30 ug/ml y oxacilina 1 ug/ml.
Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria
(CMI)
Sobre placas multipozos se hicieron microdiluciones
seriadas para ampicilina, gentamicina y vancomicina
usando como diluyente caldo BHI. Slo se determin la
CMI con estos tres antibiticos por ser stos los ms
utilizados en la antibioticoterapia para enterococos (8).
Deteccin de -lactamasas
Se determin por medio de la prueba Dry slide lactamasa (Difco Laboratories, Detroit, MI). Una vez
conocida la produccin de -lactamasas, se determin
tambin la produccin de -lactamasas de amplio espectro mediante el panel de ATB BLSE (Antibiogram
extended spectrum beta-lactamases; Biomerieux) (9).
Desarrollo de la biocapa
Se hicieron cortes de 0.5 cm de largo de catteres
intravasculares de tefln (Abbocatch R-T, Abbott
Laboratories, USA), poliuretano (Cavafix Certo; B.
Braun Mekgusen AG Germany) y vialn (Viacatch,
Becton Dickinson, USA), y fueron puestos en cajas de
petri en contacto con suspensiones bacterianas de
Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium a una
concentracin de 3 x 108 UFC/ml y llevados a incubacin
hasta los 30 das (2).

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Estudio de la adherencia y formacin de biocapas

- Adherencia inespecfica o reversible. Segmentos de
cada catter incubados al da 1, 2, 3, 4 y 5 fueron lavados
en buffer fosfato salino (PBS) a 4C para eliminar
bacterias no adheridas, y posteriormente sonicados durante 1 minuto a 45 KHz en un aparato Branson Sonicator
1510 y pasados por vortex durante 15 segundos. Las
bacterias desprendidas de los catteres se resuspendieron
en PBS y se sembraron en cajas de agar Todd Hewitt con
el fin de hacer el recuento de unidades formadoras de
colonia (UFC) a las 24 y 48 horas de incubacin a 37C
en atmsfera de 5% de CO2 (2)
-Formacin de biocapas. En otro grupo de catteres
se observ la formacin de biocapas, por lo que stos no
fueron sometidos a sonicacin y se colorearon por inmersin en Giemsa para observarlos al microscopio ptico
(10 x) y al estereoscopio.

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partir de este momento disminuye su adherencia (Figura

1). Sobre los tres catteres intravasculares evaluados el
Enterococcus faecium se adhiere inespecficamente, en
muy bajo ndice lo que conlleva a la formacin de una
biocapa muy pequea (Figura 2).

Figura 1. Adherencia inespecfica de Enterococcus faecalis en FC/

ml sobre los tres catteres intravasculares evaluados.

Resultados
Caractersticas de las bacterias formadoras de biocapa
Las dos cepas utilizadas en este estudio Enterococcus
faecalis y Enterococcus faecium no fueron productoras
de gelatinasa pero si de hemlisis alfa. En cuanto a su
susceptibilidad antibitica por el mtodo de Bauer Kirby
las dos cepas fueron sensibles a la nitrofurantona,
norfloxacina, gentamicina y vancomicina y resistentes a
ampicilina, tetraciclina, eritromicina y oxacilina. Ambas
cepas produjeron -lactamasas y por el mtodo de ATB
BLSE se determinaron que eran -lactamasas de amplio
espectro. Las CMIs para ambas especies fueron > 2000
g/ml, 125 g/ml y 128 g/ml, respectivamente, para
ampicilina, gentamicina y vancomicina.

Figura 2. Adherencia inespecfica de Enterococcus faecium en UFC/ml

sobre los tres catteres intravasculares evaluados.

Adherencia inespecfica de Enterococcus faecalis y

Enterococcus faecium

Adherencia especfica o consolidacin de la biocapa

Sobre el catter intravascular de tefln, el Enterococcus

faecalis se adhiere inespecficamente al primer da, y del
da dos hasta el da cinco la adherencia inespecfica
disminuye debido a que la bacteria se adhiere especficamente al sustrato, generando una buena biocapa. Con
relacin al catter de poliuretano, el Enterococcus faecalis
se adhiere inespecficamente solo a partir del da tres. En
el catter de vialn el Enterococcus faecalis se adhiere
inespecficamente los das uno y dos de incubacin y a

Durante los 30 das de incubacin para la formacin de

biocapas, diariamente se revisaron los catteres con el fin
de determinar los sucesos que se presentaron en el
crecimiento de la biocapa. Los principales eventos ocurrieron durante los primeros cinco das de incubacin, de
este perodo de tiempo en adelante slo hubo un lento
crecimiento de las biocapas a lo alto de los catteres que
condujo a deformacin y porosidad de stos. En los
segmentos de catteres teidos con la coloracin de

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Giemsa y observados por microscopa ptica se determin, para las dos especies, que sobre tefln se formaron
biocapas en forma de aglomerados e hilos, sobre
poliuretano menos aglomerados y ms hilos y sobre
vialn pequeos aglomerados, estas formaciones corresponden a adherencia de tipo especfico (Figura 3). En
resumen, la formacin de la biocapa por parte de
Enterococcus faecalis en los catteres de poliuretano es
buena pero no tan buena como la observada en el catter
de tefln, mientras que en vialn no hay buena formacin
de biocapa. Con Enterococcus faecium la adhesin en
los tres biomateriales es mucho menor, quedando una
gran parte del catter sin colonizar.

Figura 3. Forma de crecimiento en biocapa de Enterococcus faecalis

sobre los tres tipos de biomateriales de los catteres intravasculares.

Discusin
Algunos autores (10-12) informan que la produccin de
hemolisina alfa y enzima gelatinasa son factores de
virulencia de los enterococos involucrados en la
patofisiologa de la endocarditis. Por lo que se observ en
este estudio, realizado in vitro sobre catteres
intravasculares, la no produccin de la enzima gelatinasa
por parte de las cepas involucradas en este trabajo parece
no tener ninguna implicacin en la adherencia y formacin de la biocapa.
Algo muy importante de sealar es que las dos cepas
utilizadas en este experimento son clnica y epidemiolgicamente relevantes ya que poseen amplia resistencia a
ampicilina, una baja resistencia a gentamicina y slo

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sensibilidad a vancomicina, adems de ser productoras

de -lactamasas de amplio espectro, situacin que se
complicara si estas cepas aumentan su recirculacin
intra y extrahospitalariamente. Por todo esto el modelo de
formacin de biocapas en los tres catteres intravasculares
estudiados es muy interesante porque nos informa de la
gran capacidad que tienen estos microorganismos de
generar biocapas. Estas dos cepas en caso de colonizar
catteres intravasculares in vivo podran complicar un
tratamiento clnico debido al poco recurso de antibioticoterapia que se tiene para utilizar contra stas.
Segn Raad y cols. (13), la aspereza, composicin
qumica e hidrofobicidad de los dispositivos mdicos,
entre los que se encuentran principalmente los catteres
intravasculares aumentan la colonizacin bacteriana; en
parte este hecho es debido a que brindan condiciones
especiales y biocompatibilidad para la adherencia
bacteriana. Se ha propuesto incluso que algunos
microorganismos pueden degradar y metabolizar los
componentes de los catteres plsticos en ausencia de
nutrientes y adems usarlos para mantener su crecimiento sobre las superficies de estos biomateriales (3). En este
estudio se determin tambin, que los tres biomateriales
sufren deformacin a medida que el biofilm va creciendo,
siendo mayor la deformacin en tefln y poliuretano en
relacin con el vialn. Este proceso de deformacin del
catter es de gran importancia, en el mbito clnico, en
cateterizaciones de largos perodos y en infecciones del
borde libre de las vlvulas protsicas, por infeccin del
anillo valvular, si tenemos en cuenta que este anillo est
construido en muchas ocasiones con tefln (14).
A diferencia de los resultados obtenidos por Joyanes
y cols. (2) que no reportan variacin en la adherencia de
enterococos a seis tipos de catteres intravasculares de
composicin diferente, incluidos los de este estudio (tefln,
poliuretano y vialn), nuestros resultados indican que el
tipo de biomaterial de catter es importante en la adherencia inespecfica de la bacteria a ste. Las interacciones
iniciales (adherencia inespecfica) entre las bacterias y
las superficies mediadas principalmente por fuerzas de
atraccin, son reversibles (3). El mayor nmero de
bacterias recuperadas, por sonicacin de las biocapas de
los tres tipos de catteres en estudio, se obtuvo en los
catteres de tefln y poliuretano, lo que indica que estas
fuerzas inespecficas, mayores en tefln y poliuretano en
comparacin al vialn, conllevan a una mejor adherencia
inespecfica.

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Despus de la unin inespecfica, las bacterias pasan

a unirse especficamente (unin irreversible) por la produccin de exopolmeros. En nuestros resultados observamos que la adherencia inespecfica disminuye con el
tiempo, lo que indica que las bacterias se unen
especficamente y quedan incluidas dentro de la biocapa
(15). La mayor adherencia inespecfica que conduce a
una mayor formacin de biocapas, sustentado mediante
los estudios microscpicos, en el catter de tefln y
poliuretano hacen pensar que los enterococos encuentran
en estos dispositivos un excelente sitio para la adhesin,
colonizacin y crecimiento en la formacin de las biocapas.
El biomaterial menos adecuado para la formacin de
biocapas es el vialn donde la adherencia inespecfica
fue buena slo el primer da, con posterior desprendimiento por s misma.
Los resultados de adherencia y formacin de biocapas
por parte de Enterococcus faecalis y Enterococcus
faecium sobre los catteres intravasculares de tefln,
poliuretano y vialn, llaman la atencin sobre estos
microorganismos, que podran provenir de la colonizacin de la piel o de las frecuentes manipulaciones de
dispositivos mdicos intravasculares (16). Venditti y
cols. (17) reportaron lesiones en el corazn de un paciente
asociadas con el uso de catteres durante un trasplante y
creen que fue debido a una prolongada cateterizacin con
presencia de bacterias. Esta hiptesis podra ser verdadera si se tiene en cuenta que la medida de la adherencia
bacteriana a catteres limpios (in vitro) como la
presentada en este trabajo es la reproduccin de los
eventos que ocurren in vivo (3).

Conclusiones
1. La mejor formacin de biocapa tanto de Enterococcus
faecalis como de Enterococcus faecium se dio sobre el
catter intravascular de tefln.
2. Enterococcus faecalis se adhiere mucho mejor a
los catteres intravasculares evaluados en este estudio
que Enterococcus faecium.
3. Este trabajo sugiere que a la hora de escoger un
catter intravascular, deber ser de material vialn ya
que en l es donde los dos microorganismos Enterococcus
faecalis y Enterococcus faecium se adhieren muy mal y
llevan a una deficiente formacin de biocapas, lo cual
evitara complicaciones como la endocarditis.

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