Você está na página 1de 9

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II

Citometria de uxo - Funcionalidade celular on-line em


bioprocessos
Teresa Lopes da Silva1, Alberto Reis1, Christopher Hewitt2 e Jos Carlos Roseiro1
1 Instituto Nacional e Engenharia e Tecnologia Industrial - Departamento de Biotecnologia, Estrada do Pao do
Lumiar, 1649-038, Lisboa Codex - Portugal, E-mail: teresa.lopesilva@ineti.pt
2 Biochemial Engineering - School of Engineering (Chemical Engineering), The University of Birmingham,
Edgbaston, B15 2TT, UK.

Introduo
A necessidade de se obter informao no decorrer dos
bioprocessos, tem contribudo para o aparecimento e utilizao de uma grande diversidade de tcnicas e ferramentas
concebidas para o efeito. Os dados obtidos no s tm permitido aprofundar o conhecimento dos processos, como
tambm o desenvolvimento de novas estratgias.
Um citmetro de fluxo um sistema constitudo por 5
elementos: fonte(s) de radiao, (lmpada de mercrio
ou laser), uma cmara de fluxo, unidades de filtros pticos
para seleco de um intervalo de comprimento de onda
especfico a partir duma gama espectral mais vasta, fotododos ou fotomultiplicadores para a deteco sensvel e
processamento dos sinais com interesse e uma unidade que
processa os dados recolhidos (Figura 1). A suspenso celular injectada e atravessa a cmara onde se d a passagem
clula a clula atravs do feixe de radiao, perpendicular
ao fluxo. A passagem individual das clulas obtida atravs
da focagem hidrodinmica do fluxo de amostra, sendo esta
injectada no seio de uma soluo salina (sheath fluid) que
tambm atravessa a cmara (Figura 2).
A diferena de velocidades entre os dois fluidos faz com
que o fluxo se processe em regime laminar. A velocidade
de escoamento da soluo de revestimento (sheath fluid)
superior da amostra, e ajustvel, o que permite reduzir e
controlar a espessura da soluo da amostra de forma a que
possa passar uma clula de cada vez. Desta forma, podem
detectar-se at 10000 clulas (eventos) por segundo.
O feixe de radiao de excitao ao interceptar a partcula
(clula) na cmara, sofre disperso quer na direco frontal
(forward scattering), quer lateral (side scattering). A radiao assim dispersa detectada directamente por fotododos
(disperso frontal) ou pode ser desviada a 90 por lentes,
espelhos dicricos e filtros pticos e focada em fotomultiplicadores. A combinao destes tipos de radiao dispersa
revela informaes importantes tais como a dimenso
celular, a granularidade/complexidade e a morfologia.
Compostos intracelulares com fluorescncia intrnseca (ex:
clorofilas, ficobiliprotenas, NAD(P)H, etc.) ou passveis de
se ligarem a corantes fluorescentes (fluorocromos), permitem a diferenciao selectiva de subpopulaes com base
na combinao de vrios fluorocromos. A fluorescncia
destes compostos tambm detectada por fotomultiplica-

Boletim de Biotecnologia

dores, atravs de um sistema de lentes, espelhos dicricos e


filtros pticos.
Os citmetros actuais mais sofisticados podem possuir at
16 detectores em simultneo (radiao dispersa e fluorescente), o que permite analizar mltiplas possibilidades de
caractersticas celulares e/ou componentes celulares de um
elevado nmero de clulas de forma individual (Rieseberg
el al., 2001). Esta versatilidade designa-se por anlise multiparamtrica.
Crte-Real et al. (2002) publicaram um extenso artigo de
divulgao sobre a citologia analtica (citometria de fluxo)
em estudos de leveduras.
A presente publicao abordar a mesma tcnica, mas
aplicada a estudos de organismos procariticos (bactrias),
em bioprocessos.

1. Deteco e contagem de Microrganismos


Classicamente a viabilidade em bactrias definida pela
capacidade destas formarem colnias em meios de cultura
slidos ou de proliferarem em meios de cultura lquidos.
Estes ensaios so morosos, principalmente se o organismo
em estudo apresenta uma baixa taxa de crescimento,
reflectindo-se em longos tempos de incubao (horas
ou dias). Por outro lado, estes sistemas de deteco da
viabilidade celular esto dependentes do crescimento
das bactrias em ambientes artificiais. Este facto limita a
interpretao dos resultados obtidos por estes mtodos,
uma vez que a escolha de um meio de cultura inadequado
pode resultar numa contagem de colnias imprecisa.
Alm disso, algumas clulas crescem apenas em condies
anaerbias, outras em condies aerbias e, outras em
ambas as condies. Portanto, a contagem realmente
representativa de todos os microrganismos de uma
determinada populao apenas poder ser feita atravs de
mtodos pticos.
Devido ao coeficiente de variao (erro estatstico) associado contagem (n0.5), necessrio examinar mais de 100
eventos para se obter um coeficiente de variao inferior a
10%. Com 1000 eventos, este coeficiente atinge 3% e acima
de 5000, inferior a 1%. Por este motivo, e tambm devido

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


rapidez da anlise, a Citometria de Fluxo prefervel
Citometria de Imagem , a menos que seja necessria informao espacial das clulas.
Fotomultiplicadores
Fluorescncias

FL3

FL2

FL4

FL1

Fotomultiplicador
Radiao dispersa a 90

Laser

seu equipamento, pelo que este mtodo, pela sua rapidez e


simplicidade, se tornou vastamente utilizado (Application
note, BD Biosciences). Acresce que a regio delineada pelas
esferas nos grficos de radiao dispersa pode ser utilizada
como controlo de alinhamento do laser on-line.

Lentes de Convergncia
Fotododo
Detector de disperso frontal

Cmara de Fluxo

Figura 1 - Congurao de um citmetro de uxo (BD Biosciences/


Enzifarma)

H vrios mtodos de contagem de clulas. O mais utilizado o mtodo de contagem raciomtrico baseado
na adio de uma determinada concentrao de partculas
de referncia (esferas que emitem fluorescncia) amostra.
O volume da amostra analisado pode ser determinado a
partir do nmero de esferas contadas enquanto a amostra
est a passar no citmetro; a contagem das clulas ento
determinada dividindo o nmero de clulas contadas por
este volume. A utilizao do mtodo raciomtrico permite
corrigir tempos mortos e variaes de fluxo que eventualmente possam ocorrer num equipamento que funcione
com diferenas de presso no processamento da amostra.
A maioria dos fabricantes de citmetros de fluxo produz
esferas de contagem de concentrao conhecida para o
Amostra
Sheat Fluid

Cmara de Fluxo

Figura 2 - (Adaptao de slide disponvel em Berkeley University/Flow


Cytometry Facility, ver endereo da internet nas Referncias).
Representao esquemtica de uma cmara de uxo. A passagem individual das clulas (eventos) conseguida por focagem hidrodinmica do
uxo de amostra no seio de uma soluo salina (sheat uid).

A contagem precisa e rigorosa de clulas exige suspenses


de clulas individuais, no agregadas. Os agregados de
clulas quando inoculados em meio slido, do origem a
uma nica colnia, ou a um nico evento no citmetro.
Por exemplo, se uma clula num tripleto positiva para
um marcador de morte celular, todo o agregado celular
ser contabilizado como uma clula morta, mas as outras
duas clulas viveis iro produzir uma colnia, quando
inoculadas em placas de agar. Situaes como esta
introduzem um erro significativo na contagem de clulas
por citometria de fluxo.
Os agregados de clulas podem ser dispersos atravs de
mtodos qumicos ou mecnicos. Os mtodos mecnicos
tm uma vasta aplicao, mas podem surgir problemas
quando aplicados a microrganismos filamentosos ou
leveduras. O tratamento com ultra-sons o mtodo mais
adequado na desagregao de clulas, mas importante
optimizar os nveis de energia a utilizar, bem como os
tempos de aplicao desses nveis, e garantir que essas
condies sejam aplicadas de forma reprodutvel (Nebevon-Caron et al., 2000).

2. O conceito de viabilidade celular do


ponto de vista da Citometria de Fluxo
A informao que se pode retirar dos ensaios de viabilidade1 sobre os estados fisiolgicos das clulas limitada a dois
nveis extremos de actividade metablica: o saudvel, presente em clulas viveis com capacidade para se dividirem,
e o correspondente morte celular. Contudo, a sensibilidade dos microrganismos ao ambiente em que se desenvolvem pe em causa a informao obtida atravs dos ensaios
de viabilidade, pois clulas que se encontrem num estado
fisiolgico intermdio entre o metabolicamente activo e a
morte celular podem no ser contabilizadas. A vantagem
da citometria de fluxo em analisar clulas individualmente
consiste na deteco de uma variedade de estados fisiolgicos celulares intermdios que realmente existem numa
determinada populao, descobrindo assim uma heterogeneidade nunca antes revelada (Nebe-von Caron et al., 1995,
2000). Alm disso, os dados obtidos atravs das tcnicas da
microbiologia clssica so relativos cultura como um todo,
ou seja, uma amostra representativa da cultura microbiana
apresenta um nico valor, referente mdia dos valores de
um determinado parmetro, de todas as clulas. Contudo,
numa populao microbiana, as clulas no se encontram
todas no mesmo estado metablico e fisiolgico, pelo que
1

Diluies seriadas da amostra e posterior inoculao das diluies


correspondentes a concentraes adequadas de microrganismo, de
modo a obter-se um nmero de colnias contveis em placas de
Petri.

Boletim de Biotecnologia 33

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


capacidade para se dividirem),
vitais, intactas e permeabilizadas (Tabela 1). Pensa-se que
quando uma clula se encontra
Flurocromo
sob stresse, alguns dos sistemas
Carbocianinas (Corante
Lipoflico catinico) DiO
de transporte activo so afectados
(clulas vitais), seguindo-se
Brometo de Etdeo (BE)
a despolarizao da membrana
Brometo de Etdio (BE)
citoplasmtica (clulas intactas) e,
Bis-oxonol (BOX)
DiO
mais tarde, a sua permeabilizao
Brometo de Etdio (BE)
(mortas). Clulas sem a membrana
Bis-oxonol (BOX)
citoplasmtica intacta no conseIodeto de Propdio
guem manter ou gerar o gradiente
de potencial electroqumico que
origina o potencial de membrana.
Alm disso, a sua estrutura interna, no estando protegida
por uma membrana citoplasmtica intacta, encontra-se
livremente exposta ao meio ambiente, pelo que estas clulas
acabaro por se decompor. Todas estas etapas conduzem
morte celular (Nebe-von-Caron e Badley, 1995, Hewitt e
Nebe-Von-Caron, 2001).

Tabela 1. Classicao da funcionalidade celular baseada na actividade

metablica da clula (Nebe-von-Caron et al., 2000)


Estado Fisiolgico

Propriedade Observada

Clulas Saudveis

a) Membranas citoplasmticas intactas polarizadas


b) Presena do sistema de trasnsporte activo

Clulas Vitais

a) Ausncia do sistema de transporte activo que exclu o BE

Clulas Intactas

a) Ausncia de transporte activo que exclu o BE


b) Membrana citoplasmtica despolarizada

Clulas Mortas

a) Ausncia do sistema de transporte activo que exclu o BE


b) Membrana citoplasmtica despolarizada permeabilizada

se torna necessrio detectar e descrever as vrias subpopulaes de forma diferenciada. A citometria de fluxo permite
a avaliao da heterogeneidade de culturas microbianas,
escala da clula individual, no ignorando outras ferramentas importantes tais como a microscopia de varrimento
confocal e a anlise de imagem (Porter et al., 1996). Desta
forma, dados discretos representando subpopulaes
diferentes podem fornecer uma imagem mais detalhada
e real da complexidade e heterogeneidade que ocorre num
determinado bioprocesso (Porter et al., 1996; Rieseberg et
al., 2001). Por estes motivos, esta tcnica tem tido cada vez
mais impacto na comunidade cientfica.
A combinao de vrios fluorocromos em citometria de
fluxo permite a diferenciao de diferentes subpopulaes
numa determinada populao, correspondentes a diferentes nveis de funcionalidade das clulas. Esta diferenciao
levou introduo do termo vivel, mas no culturvel,
aplicado a clulas que no estando metabolicamente
activas, tambm no esto mortas e, evidentemente, no
so reveladas atravs dos ensaios de viabilidade celular. A
utilizao de critrios do funcionamento celular tais como
o potencial da membrana citoplasmtica e a integridade da
mesma, os quais sero descritos adiante em detalhe, permitem caracterizar estes estados metablicos (Nebe-von
Caron et al. 2000).
As clulas de bactrias saudveis so delimitadas por uma
membrana citoplasmtica que lhes permite comunicar
selectivamente com o ambiente que as rodeia. Os sistemas
de transporte activo geram um gradiente electroqumico
que fundamental para o perfeito funcionamento de uma
clula saudvel. O corante fluorescente brometo de etdio
(BE) consegue atravessar uma membrana polarizada, mas
s se liga s cadeias do ADN quando a clula no possui
um sistema de transporte activo no especfico proto/
antiporte. Este sistema quando se encontra activo, expulsa
este fluorocromo da clula (Midgley, 1987). O iodeto de
propdio (IP) tambm se liga s cadeias do ADN, mas
no consegue atravessar uma membrana citoplasmtica
saudvel. Bis-oxonol um corante lipoflico e aninico que
acumula intracelularmente desde que a clula se encontre
despolarizada, como se ver adiante. A utilizao da mistura destes corantes permite a diferenciao dos seguintes
estados metablicos funcionais: clulas saudveis (com

Boletim de Biotecnologia

assim possvel diferenciar o estado fisiolgico de uma


clula individual, para alm do clssico e estrito conceito
de viabilidade, baseado no funcionamento de alguns
sistemas de transporte activo, ou na presena ou ausncia
da membrana citoplasmtica intacta e polarizada. A
capacidade das clulas vitais e intactas de se dividirem
pode ser demonstrada em separado, atravs da tcnica
cell sorting (Hewitt et al., 1999a, Nebe-von-Caron et al.,
2000).
A citometria de fluxo surge assim como uma tcnica
consistente e fivel na deteco das verdadeiras
percentagens de clulas viveis e mortas, numa
determinada populao de microrganismos e, por vezes,
em situaes em que a microbiologia clssica no consegue
dar qualquer resposta. A deteco de actividade metablica,
reveladora de crescimento associado diviso celular de
fcil execuo, mas pode haver metabolismo mesmo na
ausncia de crescimento, e que produza efeitos indesejveis
tais como a degradao de alimentos, a acumulao de
toxinas ou a transferncia de genes. Em caso de leses,
dormncia (estado fisiolgico intermdio entre a morte
e o metabolicamente activo) ou privao extrema de
nutrientes nas clulas, a actividade metablica pode no
ser facilmente detectvel. Nestas circunstncias, possvel
determinar a integridade da membrana atravs da reteno
ou excluso de corantes.
2.1 Estimativa do potencial de membrana
O potencial de membrana o parmetro de viabilidade
actividade metablica mais utilizado em citometria de
fluxo aplicada a microrganismos. gerado pela diferena
de concentraes de ies no interior e no exterior da
membrana citoplasmtica e, como componente do
gradiente electroqumico, est intimamente relacionado
coma formao de ATP na clula (Shapiro, 2000)

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


Em bactrias metabolicamente activas com membranas
citoplasmticas intactas, a diferena de potencial ,
situa-se geralmente entre 100 e 200 mV, encontrando-se
o interior da membrana carregado negativamente. A despolarizao da membrana ocorre quando o valor de se
desloca para valores menos negativos, portanto, mais prximos de zero e, a hiperpolarizao ocorre quando a alterao dos valores de se d na direco oposta, ou seja,
para valores mais negativos. O valor de nulo quando
a membrana apresenta danos estruturais tais que permite
a livre passagem de ies, o que pode suceder quando a
clula sofre, por exemplo, um tratamento trmico, ou um
tratamento com antibiticos da famlia das beta-lactamas,
entre outros. O tratamento das clulas com ionforos, tais
como a cianina carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP),
tambm anula o potencial de membrana, por destruio do
gradiente de protes que existe na membrana citoplasmtica (Novo et al., 1999, 2000; Wu et al., 1995), denominado,
por isso, protonforo.
O potencial de membrana pode ser medido directamente
atravs de microelctrodos, mas esta tcnica torna-se tanto
mais difcil de aplicar quanto menor for o tamanho da
clula. A medio de atravs da citometria de fluxo
normalmente realizada utilizando corantes lipoflicos de
distribuio/partio. Estes, devido sua natureza lipoflica, conseguem atravessar facilmente a membrana e ali acumulam de
acordo com a sua carga. Assim, o
a)
gradiente de concentrao de um
catio lipoflico C+ atravs de uma
membrana citoplasmtica intacta
determinado pela diferena de
potencial transmembranar, de
acordo com a lei de Nernst:
[C+]i/[C+]=e (-F/RT)
Onde [C+]i corresponde concentrao de ies de C+ no interior
da membrana, [C+]o a concentrao de ies de C+ no exterior
da membrana, o potencial
de membrana, R a constante dos
gases, T a temperatura em graus
Kelvin e F a constante de Faraday.
Uma vez atingido o equilbrio entre
as clulas e o catio do corante,
este ir acumular-se no interior
da membrana se esta estiver polarizada (ou hiperpolarizada), pois
nesta situao o interior daquela
encontra-se carregado negativamente, favorecendo a interaco
electrosttica entre essas cargas
negativas e as cargas positivas do
corante (Figura 3 a). Quando a
clula se encontra despolarizada,
ocorre precisamente o mecanismo

inverso: o potencial da membrana diminui (deslocando-se,


portanto, para valores menos negativos), levando a que haja
uma menor distribuio de cargas negativas no interior da
membrana e, nestas circunstncias, o corante ter tendncia para acumular no exterior da membrana, onde haver
uma menor distribuio de cargas positivas (Figura 3 b).
Todo este processo ocorre de forma inversa quando se est
perante a interaco entre um corante lipoflico aninico
e a membrana, devido s interaces electrostticas que se
estabelecem entre o anio C- e a distribuio de cargas no
interior da membrana.
Estes fluorocromos so denominados sondas de resposta
lenta (demoram entre poucos segundos a vrios minutos
at atingirem o equilbrio na partio) e so adequados
para medir variaes de potencial de membrana em clulas. Existem outros fluorocromos, designados de resposta
rpida, adequados para respostas de variao de potencial
mais rpidas que ocorrem em nervos e msculos (Haugland, 2002)
A emisso de fluorescncia s ocorre significativamente
quando o corante se encontra acumulado no interior da
membrana. O sinal emitido depende de alteraes que
ocorram nos locais de ligao entre a membrana o corante,
bem como do volume da clula. Com o objectivo de elimi-

Espao Extracelular
Hiperpolarizao

Membrana
Despolarizao

Espao Intracelular

Fluorocromos de Resposta Rpida

Fluorocromos de Resposta Lenta

b)

Espao Extracelular
Hiperpolarizao

Membrana
Despolarizao

Espao Intracelular

Fluorocromos de Resposta Rpida

Fluorocromos de Resposta Lenta

Figura 3 - (Adptao de Haugland, 2002) Mecanismo da resposta dos uorocromos sensveis ao


potencial de membrana dos microrganismos. Os ourocromos (sondas) de resposta lenta so anies
ou caties lipoflicos que so translocados atravs da membrana por um mecanismo electrofortico.
As alteraes de uorescncia derivam da resposta da sonda ao campo elctrico que se estabelece no
interior e no exterior da membrana. Os uorocromos de resposta rpida so adequados a respostas de
variaes de potencial muito rpidas, como as que ocorrem em clulas de msculos.
(a) Mecanismo de resposta de uma sonda catinica de potencial de membrana, de resposta lenta.
Uma vez atingido o equilbrio entre entre as clulas e o catio, este acumula-se no interior da membrana se esta estiver polarizada ou hiperpolarizada , pois nesta situao, o interior daquela encontrase carregado mais negativamente.
(b) - Mecanismo de resposta de uma sonda aninica de potencial de membrana, de resposta lenta.
Uma vez atingido o equilbrio entre entre as clulas e o anio, este acumula-se no interior da membrana se esta estiver despolarizada , pois nesta situao, o interior daquela encontra-se carregado menos
negativamente.

Boletim de Biotecnologia 35

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


nar esta dependncia, que fonte de erro da determinao
de , tm sido realizadas medies raciomtricas de
potencial de membrana, por serem prticamente independentes do volume celular (Novo et al, 1999). Na tabela 2
encontram-se alguns dos corantes utilizados na determinao do potencial de membrana.
2.2 Avaliao da integridade da membrana
A integridade da membrana pode ser detectada por reteno ou excluso dos corantes. No mtodo de reteno do
corante, as clulas so incubadas com um substrato no
fluorescente, o qual clivado por enzimas intracelulares,
resultando da aco enzimtica um produto fluorescente
que retido nas clulas apenas quando a membrana citoplasmtica est intacta. Este mtodo poder no ser rigoroso devido a uma eventual perda de actividade enzimtica,
ao transporte ineficiente do substrato no fluorescente, e
expulso do corante atravs do sistema de bombas de
efluxo.
Tabela 2. A notao de Sims (DiYCn+1)(2m+1) permite

descrever a estrutura das cianinas simtricas, pela


qual Y pode ser substitudo por O (oxi-oxonis), S (tiooxonis), I (indo-oxonis) ; n o nmero de grupos
CH2 e m o nmero de grupos CH=CH-CHFamlia

Grupo

Corante

Referncias

Aninicos

Bis-oxonol

DiBAC4(3)
DiSBAC2(3)
DiBAC4(5)

Suller and Lloyd, 1999

Catinicos

Rodamina

Rh 123

Diaper e Edwards, 1994

Carbocianinas

DiOC2(3)
DiOC5(3)
DiOC6(3)
DiIC1(5)

Novo et al, 1999


Novo et al, 1999
Monfort et al, 1996
Novo et al, 1999

TO-PRO-3, um corante de excitao no vermelho,


considerado por vrios autores como marcador de excluso
de corantes, pode corar clulas intactas, tal como o brometo
de etdio (Nebe-von-Caron, et al, 2000). A excluso do
iodeto de propdio assim o mtodo de eleio e o mais
utilizado na deteco da integridade da membrana, pois
evita problemas associados actividade enzimtica do
corante. Portanto, devem ser tomadas precaues na
interpretao da reteno e excluso dos corantes. A
melhor forma de entender o mecanismo da excluso dos
corantes a utilizao de corantes em misturas. A prxima
seco descrever duas aplicaes de misturas de corantes
fluorescentes em bactrias (uma gram-negativa e uma
gram-positiva), e, nalguns casos, os cuidados que devem
ser tomados na interpretao dos resultados.
2.3 Marcao com mistura de uorocromos
1. Clulas de Escherichia coli W3110 (bactria gramnegativa) coradas com a mistura BOX+BE+IP
A figura 4 mostra a utilizao de uma combinao de trs
corantes fluorescentes: o cido bis-(1,3-dibutilbarbitrico),

Boletim de Biotecnologia

BOX ou Bis-oxonol, para detectar o potencial de membrana,


o brometo de etdio (BE) para detectar clulas cujo sistema
de transporte que exclui este corante se encontra afectado
e o iodeto de propdio (IP) para deteco da integridade
da membrana. Esta mistura foi utilizada em clulas de
E. coli W3110 em fase de crescimento exponencial, que
foram aquecidas a 60C, durante 30 segundos. sabido
que este tratamento trmico induz nesta bactria no s
a perda do potencial da membrana citoplasmtica como
tambm a permeabilizao da mesma (Nebe-von-Caron
e Badley, 1995; Boswell et al., 1998, Hewitt et al., 1998,
1999b). A fluorescncia emitida pelas clulas de E. coli
coradas com a mistura BOX+BE+IP (Figura 4 a) permitiu
diferenciar 4 subpopulaes, correspondentes a (A) clulas
saudveis, no coradas; (B) clulas vitais, sem o sistema de
transporte activo que exclui o BE e, so, portanto, coradas
por este corante; (C), clulas intactas, sem o sistema de
transporte activo que exlcui o BE, mas com potencial de
membrana, coradas por EB/BOX; e (D) clulas mortas com
as membranas citoplasmticas permeabilizadas, coradas
por EB/BOX/PI.
Outros organismos testados (Citrobacter sp., Actinobacter
sp., Pseudomonas sp., e Bacillus sp.) revelaram resultados
semelhantes. No entanto, a excluso dos corantes no
foi verificada em todas as espcies. Quando clulas de
Rhodococcus sp., foram tratadas e coradas da mesma
forma com a mistura BOX+BE+IP , apenas trs populaes
foram diferenciadas (Figura 4 b). Quando estes resultados
foram comparados com os resultados obtidos pela E.
coli, verificou-se que a populao composta por clulas
saudveis (Figura 4 a, populao A) no estava presente
e que todas as clulas de Rhodococcus sp. foram coradas
pelo BE. Neste caso, as clulas deste microrganismo. podem
ter perdido o sistema de transporte activo no especfico
proto/antiporte, que requerido para excluir o BE das
clulas.
2. Clulas de Bacillus licheniformis CCMI2 1034 (bactria gram-positiva) coradas com a mistura DiOC6(3)+IP
A mistura de DiOC6(3) e PI pode tambm ser utilizada para
diferenciar clulas metabolicamente activas, clulas com as
membranas citoplasmticas despolarizadas e clulas com
membranas citoplasmticas permeabilizadas. A utilizao
do DiOC6(3) na diferenciao de bactrias gram-positivas
com alteraes do potencial de membrana prefervel
a outros tipos de corantes, pois estas clulas, quando se
encontram em fase exponencial, geram um potencial de
membrana tal que excluem os corantes aninicos, tal como
o Bis-oxonol, no permitindo a diferenciao destas clulas
(Hewitt e Nebe-von-caron, 2004).
A Figura 5 mostra a diminuio da intensidade da
fluorescncia do DiOC6(3) em clulas de Bacillus
licheniformis CCMI 1034 recolhidas em estado estacionrio
(D=0,27 h-1), incubadas durante 10 minutos com CCCP,
2

Coleco de Culturas de Microrganismos Industriais, localizada no


Laboratrio de Microbiologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Instituto Nacional de Engenharia e Tecnologia Industrial.

comprovando que a emisso de fluorescncia deste corante


mais intensa quando as clulas esto metabolicamente
activas, com as membranas citoplasmticas polarizadas. Este
comportamento foi igualmente observado em clulas de
Staphylococcus aureus, quando tratadas com gramicidina,
outro ionforo tambm utilizado na reduo do potencial
de membrana (Diaper et al., 1992), e em clulas de outra
estirpe de Staphylococcus aureus tratadas com CCCP, mas
coradas com DiOC2(3) (Novo et al., 1999).

Nmero de Eventos

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II

Clulas em estado estacionrio (0.27h-1 )+ CCCP (10 min)

Clulas em estado estacionrio (0.27h-1)

DiOC6(3)

Figura 5 - (Retirada de Reis et al., 2004) Efeito da adio de cianina


carbonil m-clorofenilhidrazona (CCCP) no potencial de membrana de
clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034, em estado estacionrio
(D=0,27 h-1), quando coradas com DiOC6(3).

Figura 4 - (Retirada de Hewitt e Nebe-Von-Caron, 2001) (a) Fluorescncia emitida por clulas de E.coli 3110 em fase exponencial, submetidas
a um tratamento trmico (60C durante 30 s), coradas com a mistura
brometo de etdio + bis-oxonol + iodeto de propdio (BEP) e (b) uorescncia emitida por clulas de Rhodococcus sp. coradas com a mesma
mistura. Quatro subpopulaes foram difrenciadas, correspondentes a
(A) clulas saudveis, no coradas; (B) clulas vitais, sem o sistema de
transporte activo que exclui o BE e, so, portanto, coradas por este corante; (C), clulas intactas, sem o sistema de transporte activo que exlcui o
BE, mas com potencial de membrana, coradas por EB/BOX; e (D) clulas mortas com as membranas citoplasmticas permeabilizadas, coradas
por EB/BOX/PI. As medies no citmetro de uxo foram realizadas
num Coulter Epics Elite com excitao a 488 nm, proveniente de um
laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP, BE e BOX foram medidas a 635, 575 e 525 nm, respectivamente. Devido elevada sobreposio
dos espectros de emisso do BE e do IP, o sistema foi compensado de
forma a eliminar a uorescncia emitida pelo IP no detector de emisso
de uorescncia do BE.

A Figura 6 a) mostra o grfico de densidades correspondente a clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 quando submetidas a um tratamento trmico a 100C, durante
10 minutos, e posteriormente coradas com uma mistura de
DiOC6(3) +PI. possvel diferenciar duas subpopulaes
(B) e (D), que correspondem respectivamentes a clulas
com membranas polarizadas (B), que no so coradas por
nenhum dos corantes e, uma outra sub-populao (D),
composta por clulas coradas por ambos os flurocromos.
A interpretao desta ltima sub-populao, baseada na
colorao destas clulas por ambos os corantes, levaria
a concluir que estas clulas possuem membranas polarizadas (coradas pelo DiOC6(3) ), mas permeabilizadas
(coradas pelo IP), o que contraditrio. Mason et al., 1995,
observaram que clulas de E.coli, quando submetidas ao
mesmo tratamento trmico e coradas com DiOC6(3), apresentavam uma fluorescncia superior s clulas saudveis
(possuidoras de membranas citoplasmticas polarizadas).
Teoricamente, clulas que so coradas por este composto
possuem membranas polarizadas, pelo que a fluorescncia
do DiOC6(3) emitida por clulas submetidas ao tratamento
trmico (que induz a despolarizao e permeabilizao da
membrana) deveria ser baixa ou ausente. Os autores explicaram esta discrepncia baseando-se no carcter lipoflico
do DiOC6(3). A estrutura das cadeias dos fosfolpidos das
membranas citoplasmticas das clulas, quando expostas a
elevadas temperaturas colapsa, ficando as regies hidrofbicas da membrana expostas e acessveis ao DiOC6(3)
que ir ligar-se a esses centros, devido sua elevada
afinidade por aquelas regies. Nesta situao, a emisso
da florescncia do DiOC6(3) detectada em clulas mortas
no dependente do potencial de membrana, mas sim da
afinidade daquele composto pelas regies hidrofbicas da
membrana expostas.
Clulas recolhidas de uma cultura contnua em estado estacionrio taxa de diluio de 0.27 h-1 (max>1h -1), quando
coradas com a mistura de DiOC6(3) e PI apresentam o
grfico de densidades mostrado na figura 6 b), onde posBoletim de Biotecnologia 37

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


svel diferenciar quatro subpopulaes, correspondentes
a clulas polarizadas (A), coradas pelo DiOC6(3); clulas
despolarizadas (B), no coradas; clulas despolarizadas e
permeabilizadas (C), coradas pelo PI; e clulas despolarizadas e permeabilizadas com a membrana citoplasmtica
danificada (possvelmente clulas fantasmas), coradas
pelo DiOC6(3) e PI.

A existncia de clulas fantasmas foi posteriormente


confirmada pela anlise destas quatro subpopulaes por
microscopia de transmisso electrnica. A Figura 7 mostra
uma seco de uma amostra de clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034, quando privadas de nutrientes, por
um perodo de trs horas. Foi possvel identificar dois tipos
distintos de clulas: umas com estruturas do tipo clula
fantasma, com pouco ou nenhum material citoplasmtico
no interior do envelope da clula, que contrastam com
clulas consideradas normais, cujo contedo citoplasmtico no interior de clula se apresenta denso. Pensa-se
que as estruturas que perderam o contedo celular se
encontram num estado avanado de lise celular, podendo
ser responsveis pela intensa fluorescncia do DiOC6(3),
conforme se observou em clulas submetidas ao tratamento trmico a 100 C. assim suposto que a sub-populao
(D) corresponde a clulas com um elevado grau de leso
nas suas membranas, equiparado aos danos que ocorrem
na membrana citoplasmtica quando sujeita a um tratamento trmico drstico (100C, durante 10 minutos).

II

Figura 6 - (Retirada de Reis et al., 2004) (a) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 submtidas a um tratamento trmico (banho de gua a
100, durante 10 minutos), coradas com a mistura de DiOC6(3)+IP. Duas
subpopulaes foram diferenciadas, correspondentes a (B) clulas com
a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas por nenhum dos
corantes; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica permeabilizada,
coradas por ambos os corantes DiOC6(3)+IP. (b)
(b) Clulas de Bacillus licheniformis CCMI 1034 em estado estacionrio
(D=0.27 h-1), coradas com a mistura DiOC6(3)+IP. Quatro subpopulaes foram diferenciadas, correspndentes a (A) clulas saudveis, coradas
pelo DiOC6(3); (B) clulas com a membrana citoplasmtica despolarizada, no coradas; (C) clulas com a membrana despolarizada e permeabilizada, coradas pelo IP; e (D) clulas com a membrana citoplasmtica
despolarizada, permeabilizada e danicada. As medies no citmetro
de uxo foram realizadas num Coulter Epics Elite com excitao a 488
nm, proveniente de um laser de argon (15 mW). As uorescncias do IP
e do DiOC6(3) foram medidas a 635 e 525 nm, respectivamente.

Boletim de Biotecnologia

Figura 7 - (Retirada de Reis et al., 2004) Fotograa de transmisso electrnica (x 25000) de clulas do Bacillus licheniformis CCMI 1034 em
carncia de nutrientes por um perodo de 3 horas. possvel visualisar
clulas fantasma que apresentam um reduzido contedo material citoplasmtico no interior do envelope da clula. Estas estruturas (I), contrastam com as estruturas do tipo II, relativas a clulas normais, cujo
contedo citoplasmtico denso.

Com base na explicao destas quatro subpopulaes, foi


ento sugerida a seguinte dinmica entre elas: Quando
as clulas saudveis (sub-populao A) so submetidas a
um determinado tipo de stresse, alguns dos seus sistemas
de transporte activo podero ser afectados, o que induz a
despolarizao da membrana citoplasmtica (sub-populao B). Este estado metablico poder evoluir para a
permeabilizao da membrana, indicando morte celular
(sub-populao C) e, mais tarde, a membrana poder
colapsar (sub-populao D). Porm, ensaios posteriores

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


confirmaram que as clulas com membranas despolarizadas que compem a sub-populao (B), em presena de
uma fonte fresca de energia, conseguem repolarizar as suas
membranas, evoluindo para a sub-populao (A), composta por clulas saudveis (Reis et al., 2004, submetido para
publicao).

3. Citometria de Fluxo on-line nos processos biotecnolgicos, num futuro prximo

associado diviso celular. O mtodo das viabilidades tem


por base a diluio da amostra e posterior inoculao em
meios no selectivos, pelo que necessrio esperar pelo
menos 12 horas at se obterem resultados, mais uma vez
demasiado tarde para se poderem fazer alteraes durante
o controlo de processo. importante realar uma vez mais
que estados fisiolgicos em que as clulas se encontrem sob
stresse ou danificadas, correspondentes a clulas viveis
mas no cultivveis, no so detectados por estes mtodos.
As tcnicas de colorao utilizadas em microscopia
tambm sofrem das mesmas limitaes da contagem
manual de clulas.

No decurso de qualquer bioprocesso, essencial a monitorizao da proliferao celular, bem como da viabilidade.
As informaes da concentrao de biomassa so cruciais
na tomada de decises, durante o controlo do processo.
Estas informaes podem permitir a recolha do produto na
concentrao adequada, de forma a obterem-se produtividades mximas, ou ainda a activao de sistemas indutveis
no tempo correcto, de modo a optimizar-se a eficincia
global do processo. A existncia de uma fraco significativa de clulas mortas ou dormentes durante qualquer parte
da evoluo do bioprocesso reflectir-se- negativamente no
rendimento global do processo, uma vez que estas clulas
no contribuem para a formao do produto. Portanto,
importante a obteno de informao rigorosa e precisa
sobre os estados fisiolgicos das clulas presentes numa
determinada populao. Tal como foi referido atrs, a marcao com misturas de corantes permite obter esta informao com um elevado grau de preciso num intervalo de
tempo reduzido e com tempo de resposta quase em tempo
real, mostrando numerosas vantagens relativamente aos
mtodos tradicionalmente utilizados na determinao da
viabilidade celular.

Os modelos matemticos utilizados para prever a evoluo


da biomassa ao longo de uma fermentao so muitas vezes
imprecisos porque assentam no pressuposto de que uma
determinada populao de bactrias homognea do ponto de vista fisiolgico e da sua capacidade de diviso celular,
o que, como se viu atrs, no corresponde realidade.

As tcnicas de microbiologia clssica utilizadas para


monitorizar a proliferao e a viabilidade celular
apresentam vrios inconvenientes. Como j foi referido,
a densidade ptica, o peso seco e a contagem manual de
colnias do uma indicao do crescimento associado
diviso celular, mas no do qualquer informao sobre o
estado fisiolgico das clulas. Alm disso, os resultados da
evoluo da concentrao da biomassa (peso seco) de uma
determinada fermentao s esto disponveis aps um
perodo de tempo relativamente prolongado, na maioria
dos casos demasiado tarde para se poder fazer qualquer
alterao no controlo do processo. Por outro lado, este tipo
de medies realizados nas fases iniciais das fermentaes,
quando as concentraes de biomassa so geralmente
baixas, impreciso, pois tem associado um elevado
erro experimental. Acresce que as leituras de densidade
ptica raramente do conta de alteraes na dimenso
das clulas. Por seu lado, a contagem manual de clulas
morosa e, em termos estatsticos, assenta no princpio de
uma distribuio igualitria na cmara de contagem, uma
situao altamente improvvel.

As anlises que fornecem informaes sobre a evoluo


do bioprocesso, quando realizadas on-line (o equipamento
est em contacto directo com a cultura atravs de uma
sonda, por exemplo), tero um acrescido benefcio
relativamente aos mtodos de monitorizao at-line e offline, uma vez que permitiro obter informao no tempo
real da fermentao, e a tempo de se tomarem decises na
estratgia do processo (Alison et al, 2002).

Do ponto de vista da microbiologia clssica, uma clula


considerada vivel quando se comprova o seu crescimento

A presena de uma elevada percentagem de clulas


permeabilizadas, consideradas mortas, ter um impacto
negativo na sntese de qualquer produto desejado ou na
degradao de agentes poluentes. Da que a monitorizao
da concentrao do produto, da biomassa, dos nutrientes
e de outros substratos deva ser acompanhada pela
monitorizao do desenvolvimento das subpopulaes de
uma cultura microbiana, no decorrer do processo.
Hewitt et al. (1999b), atravs da utilizao da tcnica
de misturas de corantes fluorescentes em citometria de
fluxo at-line, demonstraram que ocorria uma reduo de
20% na viabilidade de clulas de E.coli na ltima fase da
fermentao em regime semi-contnuo, devido severa
limitao de carbono que se verificou nas timas etapas da
fermentao (Figura 8).

A montagem da Citometria de Fluxo on-line em unidades


de fermentao garantir, num futuro prximo, um
significativo aumento da produtividade do processo. Este
sistema, em associao com uma estratgia do controlo
do processo baseada na adio de uma fonte de energia
que seja dependente do nmero de clulas com um baixo
potencial de membrana (subpopulao de clulas com
as membranas despolarizadas que capaz de evoluir
para a repolarizao da membrana em presena de uma
fonte fresca de energia, confrome se viu atrs) permitir
reduzir o nmero de clulas que no contribuam para a
sntese do produto desejado, e, por conseguinte, aumentar
a produtividade global do processo (Nebe-von-Caron et
al., 2000).

Boletim de Biotecnologia 39

Mtodos em Biotecnologia - Citometria de Fluxo II


Boswell, C.D., Hewitt, C.J., Macaskie, L.E., 1998. An application of bacterial ow
cytometry: Evaluation of toxic eects of four heavy metals on Acinetobacter sp.
with potential for bioremediation of contaminated wastewaters. Biotechnol. Lett.,
20, 857-863.
Crte-Real, M., Sansonetty, F., Ludovico, P., Prudncio, C., Rodrigues, F., Fortuna,
M., Sousa M.J., Teixeira da Silva, M., Leo, C., 2002. Contributos da citologia analtica para estudos de biologia de leveduras. Boletim de Biotecnologia, 71, 19-33.
Deer, D., Porter, J., Edwards, C. and Pickup, R., 1996. Evaluation of the suitability
of bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol (DiBAC4(3)) for the ow
cytometry assessment of bacterial viability. FEMS Microbiol. Lett., 130, 165-169.
Diaper, J.P., Tither, K. and Edwards, C., 1992. Rapid assessment of bacterial viability
by ow cytometry. Appl. Microbiol. Biotechnol., 38, 268-272.
Haugland, R.P., 2002. Handbook of Fluoresecent Probes and Research Products,
Molecular Probes 9th Eddition, ISBN 0-9710636-1-3, 966 pp
Hercher, M., Mueller, W., Shapiro, H.M., 1979. Detection and Discrimination of
Individual Viruses by Flow Cytometry, J. Histochem. and Cytochem., 27(1), 350352.
Hewitt, C.J., Boon, L.A., McFarlane, C.M., Nienow, A.W., 1998. The use of ow
cytometry to study the impact of uid mechanical stresse on E.coli during continuous cultivation in an agitated bioreactor. Biotechnol. Bioeng., 59, 612-620.
Hewitt, C.J., Nebe-Von-Caron, G., and Nienow, A.W., 1999a. Use of multi-staining
ow cytometry to characterize the physiological state of Escherichia coli W3110 in
high cell density fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng., 63, 705-711.
Hewitt, C.J., Nebe-Von-Varon, G., Nienow, A.W., and McFarlane, C., 1999b. The
use of multi-parameter ow cytometry to compare the physiological responses of
Escherichia coli W3110 to glucose limitation during batch, fed-batch and continuous culture cultivations. J. Biotechnol., 75, 251-264.
Hewitt C. J. and Nebe-von-Caron, G. 2001. An industrial application of multiparameter ow cytometry: Assessment of cell physiological state and its application to the study of microbial fermentations. Cytometry, 44, 179-187.
Hewitt C. J. and Nebe-von-Caron G., 2004. The Application of Multi-Parameter
Flow Cytometry to Monitor Individual Microbial Cell Physiological State. In:
Enfors SO, ed. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Special
volume Physiological Stress Responses in Bioprocesses. Springer (em impresso)
Mason, D.J., Lopz-Amors, R., Allman, R., Stark, J.M. and Lloyd, D., 1995. The
ability of membrane potential dyes and calcauor white to distinguish between
viable and non viable bacteria. J. Appl. Bacteriol., 78, 309-315.
Midgley, M., 1987. An eux system for cationic dyes and related compounds in
E.coli. Microbiol. Sci., 4, 125-128.
Monfort, P.and Baleux, B., 1996. Cell cycle characteristics and changes in membrane potential during growth of Escherichia coli as determined by cyanine uorescent dye and ow cytometry. J. Microbiol. Methods, 25, 79-86.
Nebe-von-Caron, G. and Badley, R.A., 1995. Viability assessment of bacteria in
mixed populations using ow cytometry. J. Microsc., 179, 55-66.

Figura 8 - (Retirada de Hewitt et al., 1999b) Clulas de E. coli W3110


colhidas 5 h (a), 16 h (b) e 36 h (c) aps o incio de uma fermentao
de alta densidade, em regime semi-contnuo, coradas com a mistura de
BOX+IP. Trs subpopulaes foram diferenciadas, correspondentes a
(A) clulas saudveis, no coradas; clulas sem potencial de membrana
(B), coradas com BOX ; e (C) clulas com membranas despolarizadas,
coradas pelo BOX e pelo IP.

Agradecimentos
O trabalho realizado pelos autores na Universidade de
Birmingham (Reino Unido) foi financiado pelo projecto
Europeu do Quinto Programa quadro (QLK3-1999-0004)
Enhanced, Intelligent Processing of Food and Related
Wastes using Thermophilic Populations. Teresa Lopes da
Silva e Alberto Reis agradecem Fundao para a Cincia
e a Tecnologia o apoio financeiro atravs das bolsas de
Doutoramento BD/5453/2001 e Ps-Doutoramento BPD/
8039/2002, respectivamente.
Referncias Bibliogrcas
Alison, S., Gaensakoo, R., Harvey, L.M. and Mcneil, B., 2002. Use of at-line and
in-situ near-infrared spectroscopy to monitor biomass in an industrial fed-batch
Escherichia coli process. Biotechnol. Bioeng., 80, 4, 405-413.

Boletim de Biotecnologia

Nebe-von-Caron, G., Stephens, P.J., Hewitt, C.J., Powell, J.R. and Badley, R.A., 2000.
Analysis of bacterial function by multi-colour uorescence ow cytometry and
single cell sorting. J. Microbiol. Methods, 42, 97-114
Novo, D., Perlmutter, N.G., Hunt, R.H., and Shapiro, H.M., 1999. Accurate ow
cytometry membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and ratiometric technique. Cytometry, 35, 55-63.
Novo, D., Perlmutter, N.G., Hunt, R.H., and Shapiro, H.M., 2000. Multiparameter
ow cytometry analysis of antibiotic eects on membrane potential, membrane
permeability and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus
luteus. Antimicrob. Agents and Chemother., 44, 827-833.
Pore, R.S., 1994. Antibiotic susceptibility testing by ow cytometry. J. Antimicrob.
Chemother., 34, 613-627.
Porter, J., Deere, D., Pickup, R., Edwards, C. 1996. Fluorescent Probes and Flow
Cytometry: New Insights Into Environmental Bacteriology. Cytometry, 23:91-96.
Reis, A., Lopes da Silva, T., Kent, C.A., Kosseva, M., Roseiro, J,C: e Hewitt, C.J., 2004.
Monitoring populations dynamics of thermophilic Bacillus licheniformis CCMI
1034 in continuous cultures using multi-parameter ow cytometry. (submetido
para publicao).
Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K.F., Scheper, T. 2001. Flow cytometry in biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol., 56, 350-260.
Shapiro, H.M., 2000. Membrane potential estimation by ow cytometry. Methods,
21, 271-279.
Suller, M.T.E., Lloyd, D., 1999. Fluorescence monitoring of antibiotic-induced
bacterial damage using ow cytometry. Cytometry, 35, 235-241.
Wu, Q., Knowles, R., Niven, D.F., 1995. Eect of ionophores on denitrication in
Flexibacter canadensis. Can. J. Microbiol., 41, 227-234.