Isolamento e Cultura de Protoplastos

C u r s o T c n i c o e m B i o t ec n o l o g i a
C u l t u r a de T e c i do s V e g e t a i s
(Prof. Ana Lcia Toledo de Carvalho)

Protoplastos so clulas vegetais desprovidas de parede celular. Foram isolados pela

primeira vez por Klecker (1892), mecanicamente, a partir de tecido foliar. Depois de 1960,
comearam a ser utilizadas enzimas pectocelulolticas (extradas de fungos) com o propsito de
obter protoplastos isolados. Em 1970, Nagata e Takebe conseguiram isolar protoplastos de fumo
(Nicotiana tabacum), a partir de mesfilo foliar, utilizando pectinase e celulase.
Os protoplastos so um estado transitrio, ou seja, rapidamente h formao de nova
parede. Nesta fase, estes tendem a estourar uma vez que deixa de no existir a presso
exercida pela parede celular. Assim, a manuteno dos protoplastos s possvel atravs de
controle osmtico do meio em que esto.

1. Isolamento de protoplastos
Atualmente a obteno de protoplastos feita atravs de digesto enzimtica da parede
celular e existem vrios protocolos diferentes, adequados s diversas espcies vegetais
trabalhadas. A metodologia de isolamento de protoplastos compreende duas fases principais:
digesto da parede e purificao da mistura obtida.

1.1. Explante inicial

in vivo: folhas, pecolos, frutos, rgos de armazenamento, cotildones, razes, plen etc.
A desinfestao padro;
in vitro: brotos, calos, suspenses celulares, embriides. Material j assptico dispensa
desinfestao.
O estado fisiolgico da planta matriz (in vivo) ou das culturas in vitro vai influenciar a
eficincia do processo.
A utilizao de tecidos in vitro pode aumentar a eficincia de isolamento de protoplastos
uma vez que o controle das condies ambientais prvias mais fcil, alm de que os tecidos j
esto condicionados ao crescimento in vitro. Por outro lado, dependendo do tipo de explante
utilizado para o isolamento (por exemplo, calos) a ocorrncia de aneuploidia grande devido
sua instabilidade gentica.

1.2. Pr-plasmlise
A induo de certo nvel de plasmlise das clulas comum antes do tratamento
enzimtico, como forma de minimizar o efeito desse tratamento sobre o protoplasto,
principalmente por diminuir o choque osmtico e a entrada de enzimas. A pr-plasmlise
conseguida incubando-se os explantes iniciais em soluo hipertnica em relao s clulas.
A pr-plasmlise possibilita a recuperao de maior nmero de protoplastos viveis e
tambm mais estveis.

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1.3. Digesto da parede celular
Meio de isolamento de protoplastos:

nutrientes, enzimas, estabilizantes osmticos;

o pH vai ter papel fundamental na ao das enzimas (utilizado normalmente: 5,4 a
6,2);

em alguns casos a adio de CaCl2 benfica para os protoplastos, aumentando a
estabilidade das membranas.
Enzimas:

celulases, pectinases e hemicelulases extradas de microorganismos (simbiontes,
parasitas, saprfitas) (Tabela 1);

utilizadas em misturas na soluo de isolamento, com composio varivel,
dependendo principalmente da espcie e do explante inicial
Agentes osmticos mais utilizados: manitol, sorbitol, sacarose, em concentraes de 0,3 a
0,8 M.
Condies de incubao:

temperatura e luz podem influenciar a eficincia do isolamento. Normalmente -
temperatura tempo de incubao;

incubao sob baixa luminosidade ou no escuro

comum utilizar agitao leve para melhorar o acesso das enzimas s clulas
Tabela 1. Exemplos de enzimas utilizadas para o isolamento de protoplastos.

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1.4. Purificao da soluo de isolamento
O objetivo desta etapa a remoo de clulas rompidas ou quebradas e clulas no
digeridas, assim como remover as enzimas residuais da digesto (Tabela 2)

Tabela 2. Tipos de protocolos para purificao de protoplastos.

Filtrao e Centrifugao:

Flutuao:

processo mais utilizado

utilizado para protoplastos mais sensveis

suspenso de isolamento

filtrao (peneiras de nylon ou metal, 30 a

100m

suspenso (protos e fragmentos celulares)

centrifugao (50 a 100 g, 5 min.)

 sobrenadante
ressuspenso do pelete em soluo de
isolamento (sem enzimas)

novas lavagens (centrif.-ressusp.)

(normalmente 3)

protoplastos

suspenso de isolamento

centrifugao (50 a 100 g, 5 min.)

protoplastos flutuam

novas lavagens
(normalmente 3)

protoplastos

Soluo de lavagem: baixa viscosidade; Soluo de lavagem: alta viscosidade

podem ser diferentes da soluo de isolamento (sacarose, manitol a 0,3 a 0,6 M)
(por exemplo, KCl 2,5% + CaCl2 0,2%)
alto nmero de protoplastos rompidos

menor nmero de protoplastos rompidos

Para centrifugao dos protoplastos outros gradientes podem ser utilizados:

Ficol (poli-sacarose) - foi obtido anel de protoplastos de cenoura na superfcie do tubo
utilizando gradiente em dois estgios (6% superior; 9% inferior) em meio MS com
sorbitol a 7%, centrifugados a 150 g por 5 min.
Gradientes descontnuos:

na purificao de protoplastos de Hyoscyamus muticus, foi adicionado soluo de
isolamento Percol (peso molecular) a 20%, alm de manitol a 0,25 M e CaCl2 a 0,1 M,
resultando na recuperao desses protoplastos num anel acima do percol;

para cevada foi utilizado gradiente de sacarose + sorbitol, obtendo-se dois anis de
protoplastos, acima da sacarose a 0,5 M e de sacarose 0,14 M + sorbitol 0,36 M.

1.5. Anlise da viabilidade dos protoplastos isolados

Nos primeiros estudos sobre protoplastos a eficincia do isolamento, ou seja, a recuperao
de protoplastos viveis (vivos) era medida atravs de observao da corrente citoplasmtica, da
mudana do tamanho da clula (em funo da mudana de presso osmtica), da medio da
atividade fotossinttica e respiratria, e da excluso por Evans Blue (isto , as clulas coradas
em azul esto mortas).

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Atualmente so mais usados corantes como:
fenosafranina (0,01%) - cora os protoplastos mortos de vermelho;
FDA (diacetato de fluorescena; 0,01%) - acumula-se na membrana, corando os
protoplastos vivos de verde/branco; a fluorescncia visvel aps 5 min. e dura de 5 a 10
min., quando o FDA comea a se dissociar da membrana;
CFW (calco-fluor white; 0,1%) - detecta a formao de parede atravs de um anel de
fluorescncia ao redor do protoplasto.
Diferenciados os protoplastos viveis, estes so contados em hemocitmetros (como cmara
de Neubauer), com cerca de 0,1 a 0,2 mm de profundidade ou contadores eletrnicos iguais aos
usados para contagem de bactrias, fungos ou clulas animais.

1.6. Exemplo de protocolo de isolamento de protoplastos

I. Material
1. Material vegetal:
Plantas de batata-doce (Ipomoea batatas) oriundas de razes tuberosas mantidas em casa
de vegetao.
2. Solues:
a) CPW
mg/L
1480
27,2
101
246
0,025
0,16

CaCl2.2H2O
KH2PO4
KNO3
MgSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
KI

b) Soluo de pr-plasmlise: CPW + manitol 13% (~0,7 M)

c) Soluo enzimtica (ou soluo de digesto)
Concentraes
CPW
Manitol
MS
Celulase
Pectolyase
d) Solues de purificao:
CPW + manitol 13%
CPW + sacarose 22%
e) Azul de Evans a 1%

13%
0,05%
1%
0,1%

Para 100 mL
100 mL
13 g
0,05 g
1g
0,1 g

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3. Material para manipulao:
pinas e bisturis
placas de Petri
membranas de nylon de 0,45 m
suporte para membrana (tipo Millipore ou similar)
tubos de centrfuga com tampa (15 mL)
tubo de ensaio contendo lcool puro, para flambagem
pipetas pasteur
lamparina
filme de PVC ou parafilme
hemocitmetro
centrfuga de bancada de ngulo mvel

II. Procedimento:
a) Pesar 1 g de folhas (somente o limbo foliar);
b) Colocar o explante sobre placa de petri contendo 10 mL de soluo de pr-plasmlise;
c) Usando pina e bisturi, cortar o limbo foliar em segmentos de cerca de 5 mm2;
d) Envolver a placa de petri com papel alumnio e incub-la por 1 hora sob agitao lenta
(50 rpm);
e) Com o auxlio de pipeta pasteur, substituir a soluo de pr-plasmlise por 10 mL de
soluo enzimtica (de digesto).
f) Fechar a placa com parafilme, envolv-la com papel alumnio e incub-la por cerca de 4
horas a 25oC sob agitao lenta;
g) Usando pipeta pasteur, transferir a mistura de protoplastos e soluo enzimtica para
tubos de centrfuga de 15 mL;
h) Centrifugar a 100 g por 3 minutos.
i)

Descartar o sobrenadante e ressuspender o pelete em 10 mL de CPW + manitol 13%;

j) Centrifugar a 100 g por 3 minutos.

k) Descartar o sobrenadante e ressuspender o pelete em 10 mL de CPW + sacarose 22%;
l)

Centrifugar a 100 g por 4 minutos.

m) Recolher os protoplastos que se encontram sobre a superfcie da soluo de lavagem (no

anel) e transferir para tubo de microcentrfuga de 1,5 mL;
n) Em outro tubo de microcentrfuga, misturar 50 L da suspenso de protoplastos com 50
L de soluo de azul de Evans a 1%
o) Analisar a mistura em hemocitmetro e anotar:
Nmero (cada amostra)
protoplastos totais
protoplastos viveis

Protoplastos / mL

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1.7. Densidade mnima de plaqueamento
A avaliao do nmero de protoplastos viveis isolados a medida de eficincia do processo
de isolamento, mas tambm importante para determinar se h protoplastos suficientes para
se iniciar uma cultura. Isto porque existe um nmero mnimo de protoplastos necessrios para
que haja crescimento da cultura, conhecido como densidade mnima de plaqueamento (ex.:
fumo - 5 x 103 a 1x105 protos/cm3). A eficincia de plaqueamento (no de clulas divididas/no de
clulas cultivadas) pode ser considerada a melhor medida de que os protoplastos isolados so
viveis (inclusive do ponto de vista de proliferarem em cultura).

2. Cultura de protoplastos
Protoplastos

colnias microcalos calos

regenerao da parede diviso celular

(CFW)

2.1. Meio de cultura

O meio de cultura no caso dos protoplastos deve ser otimizado, pois estes so muito mais
eficientes na absoro de nutrientes do que clulas, calos, segmentos de tecidos e outros
explantes. As formulaes bsicas utilizadas so as mesmas de outras tcnicas; MS e B5 so as
mais comuns, alm de outras como KM (Kao e Michayluk, 1975). Algumas vezes so
necessrias alteraes do meio bsico no sentido de adequ-lo s exigncias especficas dos
protoplastos:
N - o balano NO3/NH4 de algumas frmulas parece ser prejudicial para os protoplastos,
tendo sido desenvolvidos meios sem NH4 para algumas espcies (ex.: batata, tomate e
fumo);
Ca - crtico para a estabilidade da membrana plasmtica e, portanto para sobrevivncia
dos protoplastos;
acares - mais usados so sacarose e glicose. J foram testados outros, como galactose,
celobiose e misturas de diferentes acares;
alm do acar a ser metabolizado pode ser necessrio outro, inerte, para controle
osmtico (geralmente o mesmo utilizado no meio de isolamento);
nutrientes orgnicos - a maioria das culturas de protoplastos usa as vitaminas descritas
nas frmulas bsicas, mas h variaes que favorecem o crescimento; exs.: cido flico
(ervilha), L-glutamina (vrias espcies);
reguladores de crescimento - essenciais, principalmente auxinas. O mais usado o 2,4-D,
mas h relatos de aumento da taxa de diviso celular utilizando NAA (fumo). As
citocininas podem ser dispensveis (ex.: fumo) ou no (BA foi benfico em culturas de
protoplastos de plantas dos gneros Atropa, Nicotiana e Petunia)
O pH do meio normalmente est na faixa de 5,5 a 5,8.

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2.2. Condies de cultura
Luz - normalmente a cultura mantida no escuro at o incio das primeiras divises e
depois a condio adotada vai depender do gentipo: algumas culturas permanecem sob
baixa luminosidade at a fase de calo, outras crescem bem com fotoperodo de 16 horas
de luz com intensidade de 50 mE/m2/s.
Temperatura - normalmente entre 20 e 300C
Densidade da cultura - a densidade tima varia para cada etapa da cultura; a densidade
inicial muito importante: variaes de 104 protoplastos j afetam significativamente a
eficincia do plaqueamento (ver densidade mnima de plaqueamento). Os protoplastos
absorvem e excretam substncias para o meio; quando h alta densidade de protoplastos
na cultura, a soma das substncias liberadas comea a afetar o conjunto, tanto no caso
de toxinas (causando morte celular) como no caso de substncias benficas (densidade
menor que a mnima: no h diviso, como se faltasse algum fator de adaptao no meio
de cultura). Tem sido tentadas culturas com baixa densidade de protoplastos, o que
contribuiria para concentrao mais baixa no meio de toxinas liberadas pelos protoplastos
e tambm facilitaria a seleo de gentipos de interesse. Nesses casos, obviamente e a
composio do meio diferente da usada para culturas mais densas.
Exemplos de densidades utilizadas com sucesso: fumo e chicria - 105 e 104 protos/ml;
feijo - 2 x 104 protos/ml; batata-doce 3 x 104 protos/ml; Vicia hajastana - <10 protos/ml
(nesse caso s utilizando meio muito complexo)
Subculturas (Repiques) - a primeira feita logo aps as primeiras divises celulares;
normalmente as demais so feitas com intervalos de 2 a 3 semanas

2.3. Tipos de culturas de protoplastos

a) Cultura em meio lquido - trocas de meio so mais fceis
gotas (0,1 a 0,2 ml; 7 gotas/placa de Petri de 6 cm de dimetro)
lmina de meio (fundo da placa: 10 ml/placa de 9 cm de dimetro) - trocas gasosas so
mais eficientes
gotas suspensas (40 a 100 l; placa invertida) *
microcmaras (cobertura com leo) *
* volumes muito pequenos: cuidado com evaporao; pr-cultura com mtodo tradicional pode
aumentar o crescimento
b) Cultura em meio slido - menor difuso de substncias (txicas ou benficas)
Protoplastos includos no meio (suspenso de protoplastos em meio lquido + sol. agarose
0,4 a 0,8%, 37 a 400C). O gar no uma boa escolha, pois freqentemente no puro e
txico para os protoplastos;
Camadas nutritivas (Feeder layers) - as culturas nutritivas so culturas de
protoplastos j adaptados, com alto condicionamento ao meio, capazes de crescer por
certo tempo sem se dividir (normalmente irradiados com raio X - ncleo inativado); estas
so co-cultivadas com outras culturas, mais recalcitrantes. As culturas podem estar uma
sobre a outra, em camadas separadas com papel celofane ou a separao pode ser feita
por fentipos diferentes (por ex. as nutritivas so clulas albinas ou mutantes).
c) Combinao de meio lquido e slido
Fatias de cultura de protoplastos includos em meio slido colocadas em meio lquido sob
agitao;
Gotas de cultura de protoplastos includos em meio slido colocadas em meio lquido em
placa de Petri;
Camadas nutritivas (Feeder layers) - como j descrito, s que uma das camadas de
meio lquido.

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Bibliografia
BENGOCHEA, T. e DODDS, J.H. Plant Protoplasts. A
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Biotechnological

Tool

for

Plant

EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; AMMIRATO, P. V.; YAMADA, Y. Handbook of Plant Cell Culture,
Vol. 1. Techniques for Propagation and Breeding. New York: Macmillan Publishing Co, 1983.
970 p.
REINERT, J. E YEOMAN, M. M. Plant Cell and Tissue Culture. A Laboratory manual. Berlin:
Springer-Verlag, 1982. 83 p.
TORRES, A. C. e CALDAS, L. S. Tcnicas e Aplicaes da Cultura de Tecidos de Plantas. Braslia:
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