TEHNOLOGII MODERNE PENTRU IDENTIFICAREA PATOGENILOR

Tehnicile de biologie molecular s-au dovedit utile pentru diagnosticul de laborator i promit
a fi extrem de utile pentru diagnosticul, terapia i investigaiile epidemiologice i controlul
infeciilor.
Sistemele actuale au o acuratee i sensibilitate ce le permit utilizarea pe scar larg n
monitorizarea pacienilor n ambulator, n programe ample de screening n rile n curs de
dezvoltare precum i n serviciile de asisten medical n ambulator. n urma acestui proces
continuu de dezvoltare tehnicile bazate pe analiza de acizi nucleici promit s devin noul standard
de aur n detecia, identificarea i caracterizarea agenilor patogeni microbieni.
Dintre aceste noi tehnologii, diversele variante ale Real-Time PCR i tehnicilor nrudite sunt
cele mai potrivite pentru utilizarea n laboratorul de diagnostic clinic datorit maturitii lor ca
metode verificate. Tehnicile de microarray i flowcitometrie se anun drept viitoare candidate la
adoptarea pe scar larg deoarece permit procesarea unui volum mare de date n acelai experiment
(Tabelul 1).
Tehnicile bazate pe analiza acizilor nucleici tind s devin noul standard n detecia agenilor
patogeni microbieni deoarece tehnicile consacrate cum sunt culturile necesit prea mult timp sau
sunt insuficient de sensibile n special dac pacientul a primit antibiotice sau medicul are de-a face
cu organisme cu necesiti nutriionale deosebite. Mai mult, tehnicile bazate pe acizi nucleici permit
mai mult dect simpla detecie i identificare. Se pot obtine informaii asupra chimiorezistenei,
prezenei factorilor de virulen i tipului molecular, tehnicile fiind ncununate de succes n grade
diferite avnd n vedere intrarea lor recent n uz.
Datorit numrului mare de aplicaii i posibilitii permanente de dezvoltare a unor noi
aplicaii adiionale, tehnicile bazate pe acizi nucleici nlocuiesc n prezent strategiile convenionale
de identificare a microorganismelor patogene, fie c sunt folosite n analiza coloniilor suspecte
identificate prin metode curente, fie pentru detecia direct n probe biologice.
Aceste tehnici rapide continu s evolueze alert de la utilizarea n cercetare la detecia
clinic a agenilor patogeni ncepnd de la nivelul laboratoarelor de referin i continund spre
sistemele bazate pe servicii de ngrijire n ambulator. Volumul de date procesat crete n paralel cu
aceast tendin pe msur ce detecia unei singure inte este nlocuit de detecia unor inte
multiple i accentul se mut pe folosirea unor metode mai puin invazive pentru obinerea de probe.

TABEL 1 Comparaie ntre diferite sisteme de analiz

Sistem de

Sensibilitat Specificita Volumul

evaluare

te

Timp

Costul relativ

informaiei

Comple
e

generate
Culturi sau

nalt

nalt

Moderat-sczut

Zile

Moderat-sczut

Modera

sczut

alte teste
convenionale

RealTime PCR

nalt

nalt

Moderat-sczut

Minute -

Mare

Modera

Foarte mare

Modera

ore

Microarray

nalt

nalt

Mare

Ore

mare

Flow-citometrie

nalt

nalt

Mare

Minute

Mare- foarte mare

Modera
mare

Dezvoltarea sistemelor bazate pe acizi nucleici e supus unor sisteme de evaluare

interrelaionate: cantitative i calitative. Parametrii cei mai importani aparinnd primei categorii
sunt sensibilitatea, specificitatea i valorile predictive pozitive i negative. Cu ct o tehnic este mai
sensibil i mai specific cu att este mai valoroas. Similar, mai muli parametri calitativi
influeneaz o tehnic, printre acetia numrndu-se uurina utilizrii, antrenamentul necesar,
sensibilitatea la contaminani i interfereni, varietatea probelor care pot fi analizate i, cel mai
important, avantajele asupra metodelor standard. n cursul procesului de dezvoltare tehnicile trebuie
optimizate pentru a obine niveluri de performan acceptabile pe baza acestor parametri. Odat
puse n aplicare, tehnicile trebuie constant monitorizate, urmrindu-se rezultatele fals pozitive i fals
negative.
2

Agenii patogeni microbieni i Real-Time PCR

ncepnd cu sfritul anului 2001, numrul tehnicilor Real-Time PCR destinate agenilor
infecioi descrise n literatur a crescut spectaculos n paralel cu varietatea agenilor pentru care au
fost dezvoltate aceste tehnici. Din nefericire, utilizarea unei tehnici folosite n cercetare n contextul
diagnosticului clinic nu este simpl i este supus unor constrngeri de ordin practic.
Dup cum s-a explicat mai sus, pe lnga evaluarea comparativ cu tehnica standard, trebuie
determinai un numr mare de parametri ncepnd cu sensibilitatea i specificitatea analitic i
clinic i mergnd pn la efectele substanelor potenial inhibitoare i la indicatori statistici
compleci cum ar fi valorile predictive pozitive i negative. Prin urmare, puine dintre aceste tehnici
au fost comercializate i un numr i mai mic au fost certificate formal pentru utilizarea de rutin n
laborator. Acest fapt a limitat ntr-un oarecare grad acceptarea Real-Time PCR n context clinic i
rmne cea mai mare provocare n adoptarea de ctre clinicieni a metodelor bazate pe acizi nucleici.
Virusurile
n ciuda acestor obstacole, abundena tehnicilor Real-Time PCR i a agenilor pentru care au
fost dezvoltate sunt uimitoare. Dintre subspecializarile microbiologiei, Real-Time PCR a jucat cel
mai semnificativ rol n virusologie, dezvluind relaiile dintre ageni i manifestrile clinice. RealTime PCR a fost folosit pentru confirmarea unor multiple genotipuri virale i pentru discriminarea
ntre ageni n co-infecii.
Studiile ce au utilizat Real-Time PCR ca mijloc de investigaie au dezvluit detalii asupra
unor relaii puin nelese ntre agenii virali specifici i boli cronice cum sunt malignitile i
sindroamele imune.
Spre exemplu, grupul lui Sidransky a folosit Real-Time PCR pentru a demonstra c prezena
ADN aparinnd papillomavirusului uman n serul pacienilor cu carcinoame scuamoase de cap i
gt poate servi ca marker util precoce al bolii metastatice. ntr-un alt studiu recurgnd la Real-Time
PCR, MacKenzie i colaboratorii au putut exclude implicarea virusului herpetic n leucemia acuta
limfoblastica.
Alte studii au determinat ncrctura viral n diferite stadii ale infeciei, demonstrnd c
Real-Time PCR poate fi utilizat pentru a stabili dac o infecie este activ, cronic sau n remisiune,
eficacitatea terapiilor antivirale i interaciunile gazd-patogen, toate avnd implicaii practice
asupra tratamentului clinic.
Real-Time PCR a jucat de asemenea un rol major n investigarea izbucnirii epidemiilor i
supravegherea virusurilor nou descoperite cum sunt Virusurile Hendra, West Nile i Ebola.
Cercetri susinute de sensibilitatea i puterea acestor tehnici au demonstrat sau susinut legturi
epidemiologice ntre secvenele virale i manifestrile clinice.
O gam vast de tehnici cu diverse grade de acuratee au fost descrise pentru diveri
patogeni transmii prin alimente sau ap cum sunt virusurile hepatitice A i E; pentru ageni cu
tropism respirator cum sunt adenovirusurile, rinovirusurile, virusul sinciial respirator i virusul
influenza i cei exotici, cum sunt virusul variolei i febrei hemoragice.
Bacteriile
Real-Time PCR a avut un impact aproape la fel de remarcabil n bacteriologie. Ca i n cazul
virusologiei, aceast tehnic, alturi de cele de hibridizare este cea mai folosit. Printre numeroasele
3

aplicaii ale acestei tehnici se numr identificarea patogenilor, detecia unor gene specifice de
virulena i a altor markeri i estimarea chimiorezistenei. Asemenea aplicaii au beneficii imediate
pentru pacieni deoarece pot determina agenii infectani i nivelul de infecie i de asemenea
atitudinea terapeutic de urmat ducnd la reducerea perioadelor de spitalizare i a numrului de
tulpini rezistente ce ptrund n circulaie.
Eucariotele
Spre deosebire de organismele anterioare, eucariotele au beneficiat de un numr mai mic de
tehnici. n ciuda acestui fapt, respectivele tehnici, n principal de Real-Time PCR au produs un
impact semnificativ asupra studiului fungilor, paraziilor i protozoarelor cu caracter patogen,
definind relaii ntre agenii patogeni i patologie, chimiorezistena i permind simpla detecie i
identificare a patogenilor.
Tehnologii n curs de dezvoltare
Dou tehnologii recent aprute ce prezint un interes deosebit pentru identificarea
patogenilor pornind de la acizi nucleici sunt microarray i flowcitometria. Ambelor li s-a demonstrat
utilitatea la nivel conceptual, dar nu au ajuns s fie nc utilizate n context clinic. O a treia
tehnologie, numita analiza profilului gazdei se bazeaz pe Real-Time PCR pentru a detecta
modificri la nivelul gazdei care semnalizeaz infecia i manifestrile clinice. Poate fi de asemenea
adaptat pentru utilizare alturi de microarray i flowcitometrie. Totui, dei promitoare la nivel
teoretic, realizarea profilului gazdei va trebui se depeasc nite obstacole importante (dar nu
insurmontabile) nainte de fi aplicat pe scar larg n laborator pentru identificarea patogenilor.

Clasificarea virusurilor animale

Pilonii ciclului biologic al unui virus sunt tipurile de acizi nucleici formai n timpul
replicrii sale i calea de sinteza a ARNm. Relaia dintre ARNm viral i acidul nucleic al particulei
infectante st la baza unei metode simple de clasificare a virusurilor. n acest sistem, ARNm viral
este denumit catena plus, iar secvena sa complementar, care nu poate funciona ca ARNm
reprezint catena minus. O caten ADN complementar unui ARNm viral reprezint de asemenea
o caten minus. Generarea unei catene plus de ARNm necesit ca matria o caten minus de ARN
sau ADN.
Folosind acest sistem, se identific ase clase de virusuri animale. Bacteriofagii i virusurile
ce afecteaz plantele pot fi clasificate de asemenea n acest mod, dar sistemul a fost utilizat n
special n virusologia animal, unde au fost identificai reprezentani ai tuturor celor ase clase.
Alctuirea genomului viral i relaia dintre acesta i ARNm viral sunt prezentate n Figura 1 pentru
fiecare dintre cele ase clase. Tabelul 2 rezum proprietile importante ale virusurilor animale
comune n fiecare clas i domeniile de cercetare n care au fost amplu utilizate.

Tabelul 2. Proprietatile importante ale virusurilor animale comune n fiecare clasa

Clasa/Virus

Gazde
Dimensiune Cap Alte proprietati
cunoscut a genomului sula
e
(kb)

Domenii de cercetar

CLASA I (ADN)
Adenovirusuri
(clasa Ia)

Vertebrate

36

Nu

Se replic n nucleul celulei gazd; folosete Sinteza i modularea sint

enzimele gazdei pentru sinteza ARNm viral.
terapia genic (vectori).

Herpesvirusuri
(clasa Ia)

Vertebrate

150

Da

Se replic n nucleul celulei gazd; folosete Sinteza i modularea sint

enzimele gazdei pentru sinteza ARNm viral.
terapia genic (vectori).

SV40
(clasa Ia)

Primate

5.5

Nu

Se replic n nucleul celulei gazd; folosete Sinteza i modularea sint

enzimele gazdei pentru sinteza ARNm viral.
terapia genic (vectori).

200

Da

Se replic n citoplasma celulei gazd folosind Structura genomului; sint

enzime virale.

Vertebrate

Nu

Au un genom ADNss

Vertebrate

1.2-4.00

Nu

Au un genom compus din 10 segmente ARNds; Sinteza ARNm folosind e

folosesc pentru replicare enzime virale.

Nu

Sintetizeaz o singur molecul de ARNm care Replicarea ARN viral; n

este translatat ntr-o poliprotein clivat pentru poliproteic.
a genera proteine funcionale

10

Da

Sintetizeaz cel puin 2 molecule ARNm, fiecare Formarea membranei; bio

dintre ele fiind translatat ntr-o poliprotein
care va fi clivat n proteine funcionale.

Virusul Stomatitei Vertebrate

veziculoase (clasa
Va)

12

Da

Deine o ARN polimeraz virus-specific ce Formarea membranei; bio

produce cteva molecule ARNm din genomul s
nesegmentat

Virusul
(clasa Vb)

1.03.3

Da

Prezint un genom cu 8 segmente ARNss; Formarea membranei; b

folosete o ARN polimeraz virus-specific prevenia bolilor.
pentru a moleculele de ARNm

5-8

Da

Copiaza ARN-ul genomic n ADN folosind o Transformarea celular; f

revers-transcriptaz viral; integreaz ADN-ul
viral n genomul gazdei

Vaccinia
(clasa Ib)

virus Vertebrate

CLASA II (ADN)
Parvovirusurile

Replicarea ADN; terapia

CLASA III (ARN)

Reovirusurile
CLASA IV (ARN)
Poliovirus
IVa)

(clasa Primate

Virusul
Sindbis Vertebrate,
(clasa IVb)
insecte
CLASA V (ARN)

gripal Mamifere,
psri

CLASA VI (ARN)
Retrovirusurile

Vertebrate,
insecte,
levuri

Figura 1. Clasificarea virusurilor animale n funcie de genom i calea de sinteza a ARNm.

ADN este colorat n albastru; ARN n rou. ARNm viral este considerat avnd catena plus, fiind
sintetizat dintr-o caten minus de ARN sau ADN. Virusurile din Clasa VI de virusuri
(retrovirusuri) au 2 catene plus de ARN genomic identice RNA, din motive nc neelucidate.
Adaptat dup Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira,
Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. Molecular Cell Biology. New York: W. H.
Freeman & Co. ; 1999

Metode PCR cantitative n detecia i monitorizarea molecular a virusului

hepatitei C
Exista mai multe metode de masurare a nivelului de virus din ser, aceasta fiind o cale
indirecta de evaluare a incarcaturii virale. Printre acestea se numara o varianta de PCR cantitativ
si un test branched DNA (ADNb). Din nefericire, aceste tehnici nu sunt standardizate, si testele
efectuate in diferite laboratoare pot oferi rezultate diferite pornind de la aceeasi proba. Mai mult,
nivelurile de ARN viral pot varia de-a lungul timpului la valori de 3 pana la 10 ori mai mari. Cu
toate acestea, in conditiile unor teste efectuate cu grija metodele cantitative pot aduce date
importante asupra naturii hepatitei de tip C. Majoritatea pacientilor cu infectie cronica prezinta
niveluri de ARN viral (incarcaturi virale) intre 100,000 (10 5) si 10,000,000 (107) copii pe mL.
Exprimate ca UI, acestea corespund unor valori medii intre 50,000 si 5 milioane de UI.
Incarcaturile virale nu se coreleaza cu severitatea infectiei sau cu un prognostic sumbru (ca
in infectia cu HIV); in schimb, ele sunt corelate cu probabilitatea raspunsului la terapia antivirala.
Ratele de raspuns la un tratament complet cu peginterferon si ribavirina sunt mai mari la pacientii
cu niveluri mici de ARN viral. Exista mai multe definitii ale termenului de ''nivel scazut'' de ARN
viral, dar definitia uzuala este a unui nivel sub 800,000 UI (~ 2 milioane de copii) per mL.
9

Pe langa aceasta, monitorizarea nivelurilor ARN viral in fazele precoce ale tratamentului
poate aduce informatii utile asupra probabilitatii de raspuns. Dar datorita neajunsurilor actualelor
tehnici de detectie a incarcaturii virale, aceste teste nu pot sta intotdeauna la baza deciziilor
terapeutice.
Cuantificarea virusului hepatitic C prin Real-Time PCR
Pentru evaluarea viremiei prin metoda Real-Time PCR cantitativa (qRT-PCR - quantitative
Real Time Polymerase Chain Reaction) se utilizeaza kit-ul RoboGene HCV quantitative
RNA purification and detection module.
Sistemul SuperScript III One-Step RT-PCR System cu Platinum Taq ADN polimeraz
(Invitrogen) este destinat detectrii i analizei moleculelor ARN prin RT-PCR. Utilizarea formulei
ntr-un singur pas este posibil sinteza ADNc i amplificare pri PCR ntr-un singur tub folosind
primeri specifici intei.
Metode PCR pentru detectia si cuantificarea virusului hepatitei B
Cea mai eficienta si directa metoda, cu valoare prognostica in evolutia infectiilor acute sau
cronice, este detectarea cantitativa a ADN-ului HBV din plasma, prin tehnologia PCR. In plus,
aceasta metoda permite depistarea ADN-HBV in cazurile de hepatita cronica B cu markeri
serologici negativi.
Determinarea viremiei este utila de asemenea pentru monitorizarea eficientei terapiei
antivirale. Studiile au demonstrat ca o scadere rapida si sustinuta a nivelului ADN-HBV la pacientii
aflati sub tratament cu -interferon, lamivudina, adefovir sau dipivoxil reprezinta un factor predictiv
pentru un raspuns terapeutic favorabil. Pe de alta parte, monitorizarea viremiei poate avea valoare
predictiva in ceea ce priveste dezvoltarea rezistentei la lamivudina.
Metode PCR pentru detectia HPV
Infectia persistenta cu Human papillomavirus (HPV) este principala cauza de cancer
de col uterin la femei, HPV fiind implicat in mai mult de 99% din cancerele cervicale la nivel
mondial. Din peste 118 genotipuri diferite de HPV, intre 13-16 tipuri sunt asociate cu un risc crescut
de cancer cervical si leziuni premaligne. Genotipurile 16 si 18 au fost identificate ca fiind asociate
cu cel mai mare risc, fiind detectate la aproximativ 70% din pacientele cu cancer de col uterin.
Detectarea acidului nucleic viral (ADN) este o metoda sensibila si non-invaziva pentru
determinarea prezentei infectiei cu HPV.
Testul Cobas 4800 HPV
Acest test este singurul care detecteaza simultan 12 genotipuri HPV asociate cu riscul de
cancer de col uterin (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 si 68), precum si individual
genotipurile 16 si 18. In unele tari din Europa este utilizat pentru screening-ul primar al cancerului
de col uterin.

10

11