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PRACTICA DE LABORATORIO

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN UN ALIMENTO


FERMENTATIVO
I.

INTRODUCCION
Desde los tiempos histricos ms remotos se han utilizado
microorganismo para producir alimentos. Los procesos microbianos dan
lugar a alteraciones en los mismos que les confieren ms resistencia al
deterioro o unas caractersticas organolpticas (sabor, textura, etc.) ms
deseables.
Los microorganismos necesitan para su supervivencia un ambiente que
les proporcione las caractersticas necesarias para sobrevivir. Algunas de
estas caractersticas son de vitalidad como lo es el aporte de nutrientes
adecuados para alimentacin de los mismos, humedad necesaria como
fuente de agua, una temperatura adecuada que les permita su mayor
desarrollo, un pH optimo que les proporciones caractersticas de
comportamiento y adaptaciones. Existen diversas formas de obtener
dichos ambientes para los microorganismos que son conocidos como
medios de cultivos, los cuales son utilizados como herramientas para la
identificacin, clasificacin y estudio de los microrganismos, en busca de
conocimientos de su comportamiento, su morfologa y sobre todo de su
existencia en producciones que quieren evitar su presencia por efectos
sanitarios y especialmente por efectos que puedan tener en los
productos alimenticios para seres humanos.
La mayora de los procesos de fabricacin de alimentos en los que
intervienen microorganismos se basan en la produccin de procesos
fermentativos, principalmente de fermentacin lctica, de los materiales
de partida. Esta fermentacin suele ser llevada a cabo por bacterias del
grupo lctico. Como consecuencia de ella, se produce un descenso del
pH, lo que reduce la capacidad de supervivencia de especies bacterianas
indeseables (principalmente bacterias entricas), se acumulan en el
alimento cidos orgnicos de cadena corta que, adems de su efecto
antibacteriano, le confieren caractersticas de sabor agradable, y, en
cuiertos casos, se acumulan compuestos antibacterianos que reducen la
carga microbiana del alimento incrementando su vida media o impiden
la germinacin de esporas de bacterias Gram-positivas posibles
causantes de intoxicaciones alimentarias (por ejemplo: la nisina,
bacteriocina producida por ciertas bacterias lcticas, es capaz de inhibir
la germinacin de esporas de Clostridiumbotulinum reduciendo el riesgo
de intoxicacin por la toxina de esta bacteria).

Los alimentos fermentados comprenden productos lcteos, crnicos,


vegetales fermentados, pan y similares y productos alcohlicos.

II.

OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo para el recuento de microorganismos
( Agar MRS).
Realizar la dilucin de un alimento fermentado.
Sembrar la muestra para el aislamiento de lactobacillus y
levaduras de aceituna.

III.

MARCO TEORICO
Los medios de cultivo son el alimento que utilizan los microrganismos
mientras el crecimiento en colonias de hongos, bacterias y otros es
conocido como cultivo. Es as que se conoce que el medio de cultivo es
un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de
microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un
cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras
en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar
colonias.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Segn su origen los medios de cultivo se pueden clasificar en:
NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de
origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y
cuya composicin qumica no se conoce exactamente.
SINTTICOS:
Son los medios que contienen una composicin qumica definida
cualitativamente y cuantitativamente. Se utilizan para obtener
resultados reproducibles. SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se
les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto
orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
Segn su consistencia LQUIDOS: se denominan caldos y contienen los
nutrientes en solucin acuosa. SLIDOS: se preparan aadiendo un agar
a un medio lquido (caldo) a razn de 15g/litro. El agar es una sustancia
inerte polisacrida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como
esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningn
elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede
ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la
posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran
posibles en medio lquido". SEMISLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro
de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en

estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el


agregado de agar.
Segn su composicin: A causa de los requerimientos qumicos del
mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar
componentes qumicos del medio.
COMUNES O UNIVERSALES:
Su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos
poco existentes. Es el medio ms frecuentemente utilizado para
mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar comn o caldo comn.

ENRIQUECIDOS:
Estn compuestos de un medio bsico como apoyo del crecimiento al
cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como
suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, lquido asctico, etc.
Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias
nutricionales.
SELECTIVOS:
Son slidos en los que la selectividad se consigue alterando las
condiciones fsicas del medio o aadiendo o suprimiendo componentes
qumicos especficos con el fin de inhibir el crecimiento de especies
qumicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio slo permite
el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros.
Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de
poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman
(permite el crecimiento de ciertos estafilococos). En los Laboratorios de
Microbiologa se utiliza una gran variedad de medios de cultivos para
mantener las cepas, aislar o identificar microorganismos con varias
finalidades: determinar la existencia de contaminacin de alimentos,
medicamentos o cosmticos; diagnosticar alguna enfermedad,
elaboracin de vacunas bacterianas, etc.
CONSTITUYENTES BSICOS DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Fuentes de energa Esta puede ser una fuente de tipo orgnico


como los carbohidratos, protenas, polisacridos, grasas, cidos
orgnicos, entre otros; de tipo inorgnico como el amonio, nitritos,
azufre; y luz como fuente primordial de energa.

Componentes estructurales celulares entre los que se


encuentran:

Componentes principales como el carbono, hidrgeno, oxgeno,


nitrgeno, azufre, fsforo, potasio, magnesio, calcio, hierro y
sodio.
Elementos trazas como Cobalto, zinc, molibdeno, cobre y
manganeso.
Factores de crecimiento as llamado cualquier compuesto
orgnico que un microorganismo requiere como precursor o
constituyente de su material orgnico celular, pero que no
puede sintetizarlo a partir de sus fuentes de carbono ms
simples, por lo que se le debe proporcionar como nutriente. Un
ejemplo son los aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas.
Ciertas bacterias requieren sangre o heme como las bacterias
del Gnero Haemophilus.

Agua

CONDICIONES AMBIENTALES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE


LOS MICROORGANISMOS

TEMPERATURA:
Cada microorganismo tiene una temperatura ptima en la cual su
crecimiento es ms rpido, una temperatura mnima por debajo de
la cual no crece y una temperatura mxima por encima de la cual el
crecimiento no es posible, estas tres temperaturas se denominan
temperaturas
cardinales
y
son
caractersticas
de
cada
microorganismo. El rango de temperaturas entre las que un
microorganismo puede crecer es variable, hay microorganismos con
un rango estrecho llamados este no termales y se encuentran en
hbitat
de
temperatura
relativamente
constante.
Los
microorganismos de rangos ms amplios se encuentran en medios
ambientales donde la temperatura vara considerablemente y stos
son llamados euritermales.
De acuerdo con el rango de temperatura a la que crecen, los
microorganismos se dividen en:
PSICRFILOS: Microorganismos capaces de crecer a bajas
temperaturas. Existen varias definiciones de psicrfilos, en un
inicio se defina como psicrfilo a cualquier microorganismo
que poda crecer a 0 C. Sin embargo, parecen haber dos
grupos diferentes que pueden crecer a esa temperatura. El
primer grupo est constituido por los psicrfilos estrictos o

aquellos microorganismos que pueden crecer a 0 C pero


cuya temperatura ptima es de 15 C. El otro grupo los
constituyen aquellos microorganismos que pueden proliferar a
0 C pero que tienen temperaturas ptimas ms elevadas 20
a 30 C llamados psicrfilos facultativos como lo son los
Pseudomonas.
MESFILOS: Microorganismos cuya temperatura ptima de
crecimiento se encuentra dentro de un rango de 25 40 C.
Dentro de este grupo se encuentran la mayora de los
microorganismos
contaminantes
de
los
productos
farmacuticos, alimentos y cosmticos y los microorganismos
patgenos para el hombre como el Neisseria gonorrhoeae.
TERMFILOS: Microorganismos cuya temperaturas ptima
es de 50 - 60 C, hay algunos con temperaturas ptimas an
ms altas 80 - 121 C, a estos se les denomina
hipertermfilos o termfilos extremos como el Thermus
aquaticus .

ACTIVIDAD DEL AGUA:


Como los microorganismos dependen del agua para la sntesis de
sus componentes celulares, es necesario que sta se encuentre
disponible en el medio de cultivo para que los microorganismos la
puedan utilizar para su crecimiento. La cantidad disponible de agua
para los microorganismos en un medio de cultivo, no depende slo
de la cantidad que se ha aadido, ya que en estos medios se
pueden encontrar sustancias slidas disueltas que disminuyen su
disponibilidad. La actividad del agua es una expresin para la
cantidad de agua disponible en un sustrato dado y se define como la
centsima parte de la humedad relativa del aire que est en
equilibrio con ese sustrato. Este valor nos indica la cantidad de agua
disponible para ser utilizada por los microorganismos.

PH :
La acidez o alcalinidad de un medio de cultivo se expresa por su
pH. Para la mayora de las bacterias el pH ptimo de crecimiento
est entre 6,5 y 7,5 aun cuando algunas pocas especies pueden
crecer en los extremos del rango de pH. Las levaduras y los mohos
pueden crecer a valores de pH ms bajos. Cuando se cultivan los
microorganismos en un medio de cultivo originalmente ajustado a
un pH dado, 7 por ejemplo, es probable que este pH cambie como
resultado del metabolismo de esos microorganismos, el cambio de
pH puede ser tan grande que eventualmente podra inhibir el
crecimiento de esos microorganismos. Para mantener un pH

relativamente constante durante el crecimiento microbiano, se le


aaden sustancias buffer a muchos medios de cultivo.

OXGENO:
Segn sus requerimientos de oxgeno los microorganismos pueden
ser:
Aerobios estrictos: requieren oxgeno para crecer como lo es el
Mycobacterium tuberculosis.
Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o en
ausencia de oxgeno como las levaduras y entero bacterias.
Anaerobios estrictos: crecen en ausencia de oxgeno. En
presencia de oxgeno su crecimiento para y algunos mueren
rpidamente as como los Clostridium.
Anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de oxgeno,
pero la presencia de oxgeno no perjudica su crecimiento.
Algunas especies del gnero Lactobacillus tienen dicho
comportamiento

MICROAEROFLICOS:
Requieren pequeas concentraciones de oxgeno para crecer.
Entre estas se encuentran especies del gnero Spirillum.

MTODOS Y TCNICAS ESPECIALES DE CULTIVO PARA ANAEROBIOS


Las bacterias anaerbicas estrictas slo pueden crecer si se les excluye el
oxgeno del medio, lo cual puede hacerse de varias maneras:
1. Utilizando agentes reductores en el medio para disminuir el
contenido de oxgeno. Uno de estos agentes es el tioglicolato de
sodio.
2. Por remocin mecnica de oxgeno y reemplazndolo por otro gas
como lo es el nitrgeno.
3. Mediante reaccin qumica, el oxgeno disponible se convierte en
CO2, esto ocurre si se enciende una vela dentro de un recipiente
cerrado o utilizando jarras Gaspak , en esta ltima la reaccin del
bicarbonato de sodio y el borohidruro de sodio en presencia de
agua, produce la liberacin de hidrgeno y CO2, ese hidrgeno
liberado se combina con el oxgeno atmosfrico para formar agua
en presencia de un catalizador de paladio.

ESTERILIZACIN
La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de
organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente.
Una esterilizacin deficiente o manipulacin incorrecta de materiales y
medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados errneos o
prdida del material biolgico. Por ello, se requieren buenas prcticas de
laboratorio para su adecuado manejo. La esterilizacin por calor seco o
hmedo son los mtodos que se utilizan con mayor frecuencia en el
Laboratorio de Microbiologa. El calor seco destruye a los microorganismos
por oxidacin, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un
mechero o en horno a 150-180C durante 2 horas. Estos mtodos se
aplican en la esterilizacin de asas de inoculacin y para todo tipo de
material de vidrio y quirrgico. Los procesos con calor hmedo afectan la
estabilidad de estructuras celulares y protenas; se aplican para esterilizar
medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y
cultivos bacterianos que se desechan.
IV.

MATERIALES Y METODOS
Matraz de 500 ml.
Agar MRS
Mechero
Alcohol
Placas Petri
Solucin Salina
Tubos de Ensayo
Pipetas Automticas
Puntas Estriles

V.

METODOLOGIA
Dilucin de la muestra

Siembra por incorporacin

Siembra por
diseminacin

VI.

PROCEDIMIENTO

Se pes 23.85gr de Agar MRS

Incubar a 35C por


72 horas.

Se pes de
Salinas Fisiolgicas.

solucin 0.85 gr de Solucin

Se adiciona
de ensayo.

la solucin salina en los tubos

Luego se colocaron en la autoclave.

Con el Agar MRS de


cultivo previamente
preparado se calent y se enfri mediante inmersin en bao
mara.

Se desinfecta la mesa y pipeta con alcohol 96.

Se calibramos la pipeta a 1000 microlitros (1ml) y luego se


saca la muestra de aceituna y colocar en el tubo de ensayo
con Nacl, luego tapar el tubo de ensayo.

Marcamos las
Incorporacin y del

placas del -1 al -7 por


-2 al -5 por diseminacin.

Sembramos hasta -7 por


incorporacin y luego sembramos 3 por diseminacin, se
flamea se echa la muestra y luego el Agar MRS.

Colocamos en la
refrigeradora hasta que cuaje por 2 minutos.

MICROSCOPIO
Placa por diseminacion , se prepara 3 muestras en las cuales
se tuvo que agarrar el porta objetos.
Previamente se echo un poco de agua destilada.
Se agarro laa placa petri que tenian un poco de levadura , se
raspo el porta objetos.
Se echo un par de gotas de crital violeta , despues de los 2
minutos se pasa el agua destiladad .

Luego se echo acetona y se dejo


secar por 2 segundos y luego la
safranina se dejo secar por 1
minuto.
Se pasaron a
secar las
muestras y
se paso a ver al miscroscopio.

VII.

RESULTADOS

PLACA POR DISEMINACION


Placas -2 = 6.8 UFC
PLACA POR INCORPORACION
Placa -1= 3.4 UFC

Por tincin no hay lactobacillus


Solo crecieron levaduras

VIII.

CONCLUSIN

Sembrar la muestra para el aislamiento de lactobacillus y levaduras de


aceituna, nos dimos cuenta que por diseminacin en la placa -2 solo
hubo 6.8 UFC, en cambio en la placa por inmersin solo crecieron las
levaduras.