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Curso de Mestrado Integrado em

Medicina
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

Mdulo II.I
rea disciplinar de Bioqumica

DE ALMEIDA MORAIS, AFONSO, ALEXANDRA CASTANHO


SOARES, IVNIA, AND MANUEL LEAL MILHEIRO, JOAQUIM
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, Avenida Professor
Egas Moniz, 1649-028 Lisboa
PALAVRAS CHAVE
Hemoglobina, Metoxihemoglobina, Oxihemoglobina,
Desoxihemoglobina, Absorvncia.

RESUMO
O objetivo desta atividade baseou-se em perceber a relao entre o
efeito de Bohr e a absoro de radiao visvel dos diferentes
estados de oxidao, estrutura e funo da hemoglobina, bem como
em perceber a influncia dos nitritos nesta protena. Recorreu-se a
diversos mtodos e tcnicas, tais como a espetrofotometria e o
mtodo de Drabkin, que consiste na oxidao do tomo de ferro da
molcula de hemoglobina atravs da adio de ferricianeto de
potssio, que forma metahemoglobina. Por sua vez, esta
convertida em cianometahemoglobina, aps reagir com cianeto de
potssio. Isto possibilita a determinao do valor de absorvncia
desta, sendo depois possvel calcular a sua concentrao (uma vez
que o aumento do valor da absorvncia medido proporcional a
concentrao de hemoglobina presente na amostra).
Partindo dos resultados obtidos, foi possvel concluir que ocorreram
alguns problemas a nveis experimentais, nomeadamente com os
resultados da desoxihemoglobina e metahemoglobina, bem como,
no pH em que os resultados obtidos no confirmaram o efeito de
Bohr. Verificou-se que a hemoglobina com nitritos forma
metahemoglobina, sendo que o aumento desta causa hipxia
celular.

INTRODUO
A hemoglobina a protena responsvel pelo transporte de oxignio
(e com pouca expressividade, dixido de carbono) no organismo
ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

humano, e consequentemente, permite a oxigenao dos tecidos


aps a hematose pulmonar. A hemoglobina encontra-se presente
nos eritrcitos e a sua estrutura proteica constituda por 4 cadeias
polipeptdicas, duas e duas , cujas ligaes entre si permitem
estabelecer a estrutura quaternria da protena como uma estrutura
tetramtrica reunida atravs de dois dmeros. Ligadas a cada uma
das cadeias e liga-se um grupo heme, ao qual se liga um tomo
de ferro que permite a ligao ao oxignio. Estando o eritrcito
desprovido de mitocndrias, fica impossibilitado de realizar
fosforilao oxidativa para obteno de energia. Assim, apenas
consegue realizar a gliclise e a via das fosfopentoses. A realizao
destas vias permite ao eritrcito acesso a energia e a NADH, que se
torna fundamental para reduo da hemoglobina, atravs da
metahemoglobina-redutase, de modo a manter a hemoglobina
funcional. A ao desta enzima permite que a forma no funcional
da hemoglobina, em que o tomo de ferro est oxidado (Fe+3)
retorne ao estado inicial, em que o tomo de ferro do grupo heme
esteja reduzido Fe2+. A ausncia desta enzima comprometer ento
a funo e a sobrevivncia destas clulas. A afinidade do oxignio
para hemoglobina modulada por vrios agentes. Um destes
fatores regulatrios o pH, atravs do efeito de Bohr (Zheng,
Schaefer, & Karplus, Hemoglobin Bohr Effects: Atomic Origin of the
Histidine Residue Contributions, 2013), que permite dar um sentido

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

fisiolgico (Forlani & Marini, 1993 ) a hemoglobina, proporcionando


a capacidade de regular mais eficientemente a sua afinidade para o
oxignio. O efeito de Bohr determina na hemoglobina uma menor
afinidade ao oxignio a um pH mais baixo e, portanto, mostra-se
importante na sequncia de, pelo consumo de oxignio e
metabolismo geral nos vasos sistmicos levar ao aumento da
concentrao de cidos (tanto pela presena de dixido de carbono
em equilbrio com cido carbnico, como por cido pirvico, ureia e
outros), o pH nesse ponto ser menor, levando a uma menor
afinidade com o oxignio. Da mesma maneira, a diminuio da
presso de dixido de carbono no sangue a nvel dos pulmes leva a
uma diminuio da concentrao do cido carbnico e leva ao
aumento do pH do sangue nesse ponto. Portanto, a libertao do
oxignio nos vasos sistmicos e a ligao ao mesmo so
seguramente mais eficientes ao estarem acentuados por este efeito.
A estrutura da hemoglobina varia consoante nos estejamos a referir
a oxihemoglobina, desoxihemoglobina ou metahemoglobina. Estas
alteraes a nvel molecular vo ditar uma diferente organizao
das orbitais moleculares que, por sua vez, vo ditar uma absoro
diferente (em intensidade e comprimento de onda) de radiao
luminosa, de um tipo de molcula para outro. Estas diferenas vo
permitir a avaliao da presena de cada uma das molculas numa
soluo, por espectrofotometria.

MATERIAL
Para a anlise espectrofotomtrica foram utilizados dois
espectrofotmetros, um deles associado a um computador com um
programa que revela os dados analticos e permite acesso direto aos
espetros baseados nesses dados.
Para a anlise espetrofotomtrica foram ainda utilizadas cuvetes de
plstico (1 cm). Para a preparao das amostras, tubos Falcon 15
ml. Tubos Eppendorf 1,5ml e 2 ml, pipetas automticas (P20,P200,
P1000), pipetas graduadas (vidro) 5ml e pompete.
Para as amostras foi utilizado sangue humano colhido da regio do
sangradouro com anticoagulante.
Como reagentes foram utilizados: Reagente de Drabkin (1 g
NaHCO3, 50 mg de KCN e 200 mg de K 3Fe(CN)6 por litro de soluo),
Ditionito de sdio 10% (w/v), Ferrocianeto de potssio (K 3Fe(CN)6)
0,3M, Nitrito de sdio 0,1M e Tampo PBS 0,01 M pH 6.0 e 8.0.

MTODOS
Na primeira parte do procedimento experimental realiza-se a
determinao da concentrao de hemoglobina no sangue, usando
o Mtodo de Drabkin.
ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

o de CO2 na afinidade da hemoglobina para com o oxignio (Berg, Stryer, & Tymoczko

Figura 2: Espectro de absoro da oxihemoglobina e desoxihemoglobina (Man

Neste mtodo faz-se reagir a amostra de sangue total com


ferricianeto de potssio (Reagente de Drabkin), a pH francamente
alcalino. Desta reao resulta uma oxidao do tomo de ferro II a
ferro
III
da
molcula
de
Hemoglobina,
formando-se
metahemoglobina que convertida em cianometahemoglobina
aps reao com o cianeto de potssio. Desta maneira todas as
formas de hemoglobina so convertidas em cianometahemoglobina.
Por espetrofotometria, a cerca de 540 nm, ento lida a
absorvncia da cianometahemoglobina formada.
O aumento do valor da absorvncia da cianometahemoglobina
ento proporcional a concentrao de hemoglobina na mostra de
sangue.
Desta forma, procede-se a pipetagem de 1500 L de soluo de
Drabkin para um Eppendorf de 2 mL. De seguida adiciona-se 6 L
ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

de sangue a este tubo e homogeneiza-se por inverso. O tubo deve


ser incubado, ao abrigo da luz, a temperatura ambiente e durante o
tempo de 15 minutos. Quando a incubao termina, homogeneizase novamente o tubo por inverso.
No passo seguinte, realiza-se um branco, pipetando 1000 L de
soluo de Drabkin para um tubo Eppendorf de 1,5 ml previamente
identificado como Branco.
Seguidamente, o Branco colocado numa cuvette de plstico
para se traar a linha de base no espetrofotmetro.
Por fim, realiza-se a leitura da absorvncia da amostra contra o
Branco ao comprimento de onda de 540nm.
Na segunda parte do trabalho experimental procede-se ao estudo
da hemoglobina e seus derivados por espetrofotometria.
Primeiro prepara-se os diferentes derivados de hemoglobina e
respetivos brancos.
Na preparao de oxihemoglobina deve-se identificar claramente,
dois tubos Eppendorf de 1,5 mL com Branco 1 e OxiHb.
No tubo Branco 1 adiciona-se 1000 L de gua destilada e no tubo
OxiHb pipeta-se, 998 L de gua destilada e 2 L de sangue (pela
ordem indicada). De seguida, homogeneizar por inverso.
Para preparar a desoxihemoglobina necessrio identificar dois
tubos Eppendorf 1,5 ml com Branco 2 e DesoxiHb.
No Branco 2 adicionar primeiro 900 L de gua destilada e por
ltimo 100 L de Ditionito de sdio 10 % (w/v).
No tubo DesoxiHb adicionar pela seguinte ordem: 898 L de gua
destilada, 2 L de sangue e por ltimo 100 L de Didionito de sdio
10% (w/v).
Quanto a preparao da metahemoglobina identifica-se um tubo
falcon de 15 mL com MetHb_1.
De seguida, pipetar 4,65ml de gua destilada com auxlio de uma
pipeta graduada de 5 ml para pipetar 4ml e o 0,65 ml usando uma
pipeta automtica P1000 para um maior rigor na medio. Depois
adiciona-se 200 L de sangue a este tubo e homogeneiza-se por
inverso.
Adicionar lentamente 150 l de ferrocianeto de potssio 0.3M,
homogeneizar por inverso e observar a mudana de cor da
soluo.
A seguir rotular 2 tubos Eppendorf de 2 mL com Branco 3 e
MetHb_2 .
No Branco 3 adiciona-se 1998 L de gua destilada e 2 L de
Ferrocianeto de potssio 0.3M (pela ordem referida).
No tubo MetHb_2# pipeta-se pela seguinte ordem: 967 L de gua
destilada e 33 L de soluo Methb_1 (preparada anteriormente).
Por fim homogeneizar por inverso.

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

Na anlise por espetrofotometria dos derivados de hemoglobina,


primeiro, faz-se a linha de base com as solues Branco 1,
Branco 2 e Branco 3 e de seguida traa-se os espetros de
absorvncia na gama espetral entre 370 e 700nm para cada uma
das solues OxiHb DesoxiHb e MetHb_2, respetivamente.
Na terceira parte do procedimento experimental realiza-se o estudo
da oxihemoglobina a diferentes valores de pH. Para o estudo
necessrio, identificar quatro tubos Eppendorf de 1,5 mL com
Branco pH 6.0, OxiHb pH 6.0,Branco pH 8.0 e OxiHb pH 8.0.
No tubo Branco pH 6.0 adiciona-se 950 L de Tampo PBS pH 6.0.
No tubo OxiHb ph 6.0 pipeta-se 948 L Tampo PBS pH 6.0 e de
seguida adiciona-se 2 L de sangue.
No tubo Branco pH 8.0 pipeta-se 950 L de Tampo PBS pH 8.0 e
no tubo OxiHb pH 8.0, adicionado primeiro 948 L de Tampo
PBS pH 8.0 e de seguida 2 L de sangue.
Homogeneizar os tubos por inverso.
Posteriormente procede-se ao traar da linha de base com uma
cuvette com a soluo Branco pH 6.0 (entre 370 e 700 nm). Colocar
a soluo OxiHb pH 6.0 noutra cuvette e traar o espetro na gama
de comprimentos de onda entre 370 e 700 nm. De seguida repetir o
mesmo procedimento para traar o espetro da soluo OxiHb ph
8.0 usando o branco respetivo (Branco pH 8.0) para traar a linha
de base na mesma gama espetral.
Na quarta parte do procedimento experimental efetua-se o estudo
do efeito dos nitritos na hemoglobina.
Comea-se por rotular 2 tubos eppendorf de 1,5 mL com
Branco_Nit e Hb_Nit.
Ao tubo Branco_Nit adicionar 950 L de gua destilada, e no tubo
Hb_Nit pipetar primeiramente 948 L de gua destilada e depois
pipetar 2 L de sangue, homogeneizar o tubo por inverso.
Seguidamente, fazer a linha de base no espetrofotmetro com a
soluo Branco_ Nit numa cuvette na gama espetral entre 370700 nm, e depois traar o espetro de absoro da soluo Hb_Nit
na mesma gama de comprimentos de onda.
Por fim as cuvettes contendo as solues Branco_ Nit e Hb_Nit,
adiciona-se 50 l de soluo de nitrito de sdio 0,1 M e
homogeneizam-se recorrendo a uma pipeta automtica P1000.
Realizar novamente a linha de base com a cuvette contendo o
Branco_Nit + 50 l de soluo de nitrito de sdio 0,1 M na mesma
gama espetral usada anteriormente (370-700nm), e traar o espetro
de absoro da soluo Hb_Ni + 50 l de soluo de nitrito de sdio
0,1 M.

RESULTADOS
ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

Doseamento da hemoglobina no sangue pelo Mtodo de


Drabkin
Atravs do fator de diluio dos padres de A, B e C, que
calculado a partir do quociente entre o volume da soluo padro
de Hb respectiva e o volume total da soluo (1000 L),
multiplicando-se o valor da concentrao da soluo incial de
hemoglobina (20g/dl) obtemos em g/dl o valor das concentraes
dos padres A,B e C.
[Hb] (g/dL)
0
A
B
C
20,
0
Soluao de Drabkin 100 750
500
250
0
(L)
0
Soluo padro de
0
250
500
750 100
Hb (L)
0
Abs
0,0
0,1 0,175 0,2
0,4
00
09
62
03
Soluo Padro A
Cinicial x VInicial = CFinal x CFinal
20,0 x 0,00250 = CFinal x 0,01000
CFinal = 5,0 g/dL
Soluo padro A corresponde a uma concentrao de hemoglobina
de 5,0 g/dL.
Soluo Padro B
Cinicial x VInicial = CFinal x CFinal
20,0 x 0,00500 = CFinal x 0,01000
CFinal = 10,0 g/dL
Soluo padro B corresponde a uma concentrao de hemoglobina
de 10,0 g/dL.
Soluo Padro C
Cinicial x VInicial = CFinal x CFinal
20,0 x 0,00750 = CFinal x 0,01000
CFinal = 15,0 g/dL
Soluo padro C corresponde a uma concentrao de hemoglobina
de 15,0 g/dL.
Com estes valores podemos assim traar uma curva de calibrao
de valores de Absorvncia versus [Hb] de cada padro. Esta curva
est
representada
de
seguida:

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

Grfico 1: Curva de calibrao dos valores de absorvncia


versus [Hb]
Efetuando agora a linearizao desta curva de calibrao, obtemos
uma reta de equao y=0,0192x 0,002 (reta de cor vermelha em
baixo).

Grfico 2: Curva de calibrao dos valores de absorvncia


versus [Hb] com a respectiva regresso linear
Tendo assim a equao da reta resultante da linearizao dos
valores obtidos, conseguimos calcular a concentrao de
hemoglobina na nossa amostra (Reagente de Drabkin + Amostra de
sangue), que apresentou uma absorvncia de 0,159 para os 540
nm:

x = 8,385

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

y = 0,00192x 0,002

0,159 = 0,0192x 0,002

g/dL
A nossa amostra tinha assim uma concentrao de hemoglobina de
8,385 g/dL.
Estudo
da
hemoglobina
e
seus
derivados
espetrofotometria
Tabela 1: Estudo da absorvncia dos derivados da
Comprimen
tos de
onda (nm)
370
385
400
420
435
450
476
490
496
500
510
520
530
538
542
550
554
560
568
576
580
590
600
632
650
660
685
700

Absorvnci
a da OxiHb

Absorvncia
da DesoxiHb

por

Absorvncia
da MetaHb

0,805
0,69
0,367
1,054
0,715
0,56
1,611
0,693
1,074
1,695
0,531
0,532
1,08
0,369
0,156
0,578
0,288
0,092
0,326
0,232
0,074
0,279
0,22
0,08
0,266
0,217
0,083
0,261
0,215
0,084
0,249
0,211
0,082
0,279
0,206
0,074
0,392
0,199
0,065
0,476
0,194
0,06
0,484
0,191
0,058
0,408
0,185
0,05
0,363
0,18
0,046
0,333
0,173
0,041
0,387
0,164
0,039
0,489
0,157
0,038
0,442
0,154
0,038
0,185
0,147
0,035
0,107
0,142
0,032
0,075
0,13
0,04
0,069
0,12
0,026
0,065
0,111
0,017
0,059
0,091
0,01
0,056
0,085
0,009
hemoglobina
(NOTA: Os resultados apresentados pertencem ao grupo 2,
uma vez que os nossos no eram adequados)

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

Grfico 3: Representao dos vrios espectros de absoro


dos derivados da hemoglobina dos 370 aos 700 nm

Grfico 4: Representao do espectro de absoro da


oxihemoglobina dos 370 aos 700 nm

Grfico 5: Representao do espectro de absoro da


desoxihemoglobina dos 370 aos 700 nm

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

10

Grfico 6: Representao do espectro de absoro da


metahemoglobina dos 370 aos 700 nm
Estudo da oxihemoglobina a diferentes valores de pH
Comprimento de onda
(nm)
370
385
400
420
435
450
476
490
496
500
510
520
530
538
542
550
554
560
568
576
580
590
600
632

OxiHb pH
6.0
0,565
0,762
1,604
2,718
0,98
0,438
0,2
0,159
0,149
0,143
0,135
0,154
0,252
0,331
0,352
0,312
0,265
0,226
0,25
0,352
0,36
0,135
0,041
0,017

OxiHb pH
8.0
0,556
0,758
1,624
2,827
0,99
0,435
0,192
0,151
0,141
0,135
0,127
0,147
0,252
0,334
0,356
0,312
0,263
0,222
0,249
0,357
0,365
0,126
0,033
0,009

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

11

650
0,015
0,008
660
0,015
0,008
685
0,014
0,007
700
0,013
0,007
Tabela 2: Esudo da absorvncia da oxihemoglobina a
difentes valores de pH (NOTA: Os resultados apresentados
pertencem ao grupo 3, uma vez que o nosso grupo no se
ocupou deste trabalho experimental)

Grfico 7: Representao do espectro de absoro da


oxihemoglobina a um pH de 6.0 dos 370 aos 700 nm

Grfico 8: Representao do espectro de absoro da


oxihemoglobina a um pH de 8.0 dos 370 aos 700 nm

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

12

Grfico 9: Representao do espectro de absoro da


oxihemoglobina a pHs de 6.0 dos 370 aos 700 nm
Estudo dos efeitos dos nitritos na hemoglobina
Comprimentos de onda
(nm)
370
385
400
420
435
450
476
490
496
500
510
520
530
538
542
550
554
560
568
576
580
590
600
632
650
660

Absorvncia da
Hb_Nit+nitrito
0,308
0,408
0,756
0,841
0,251
0,133
0,081
0,077
0,077
0,077
0,077
0,08
0,085
0,087
0,086
0,08
0,075
0,071
0,068
0,065
0,061
0,049
0,038
0,033
0,02
0,015

Absorvncia da
Hb_Nit
0,222
0,297
0,616
1,064
0,383
0,175
0,083
0,067
0,063
0,061
0,058
0,065
0,102
0,131
0,139
0,124
0,105
0,09
0,1
0,139
0,141
0,056
0,021
0,011
0,009
0,009

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

13

685
0,011
0
700
0,01
0
Tabela 3: Estudo de absorvncia da hemoglobina com e sem
nitritos

Grfico 10: Espectro de absoro da oxihemoglobina quando


presente numa soluo com e sem nitritos

Grfico 11: Espectro de absoro da oxihemoglobina numa


soluo com nitritos

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

14

Grfico 12: Espectro de absoro da oxihemoglobina numa


soluo sem nitritos

DISCUSSO DOS RESULTADOS E CONCLUSO

A concentrao de hemoglobina no sangue varia entre: 13,518,0g/dL no homem; 12 - 16.5g/dL na mulher; 11.5 - 14.8g/dL em
crianas e 11.5 - 16 g/dL em grvidas.
Obteve-se um valor de hemoglobina na amostra de sangue de
8,385g/dL, valor este que bastante inferior aos valores mnimos
indicados para os diferentes grupos.
Desta forma podemos inferir que a amostra de sangue analisada
provm de algum com anemia. Outra hiptese para este valor
afastado do real prende-se com a ocorrncia de erros de pipetagem,
uma vez que o erro associado a uma pipeta automtica superior
ao de uma pipeta volumtrica ou graduada, ou, possivelmente, a
reao entre o reagente de Drabkin e os derivados de hemoglobina
no foi completa. Mais ainda, deveriam-se ter efetuado diluies em
todas as amostras em que se obtiveram valores de absorvncia
superiores a 0,8, j que no respeitam a lei de Beer-Lambert. Isto ,
a partir deste valores no existe uma proporcionalidade linear entre
a concentrao da protena e a absorvncia lida.
Consultando os espetros de absoro dos derivados de hemoglobina
de uma das referncias bibliogrficas, na gama espetral entre 450700nm :

ESTRUTURA E FUNO DA HEMOGLOBINA

15

Figura 3: Espetros de absoro dos derivados comuns de


hemoglobina humana e bovina obtidos do artigo
(Zijlstra & Buursma, 1997)
Pode-se, por comparao com os espetros de absoro do grfico 4,
inferir acerca da concordncia dos resultados obtidos para a
oxihemoglobina, dado que se verificam igualmente dois picos no
espetro de absoro desse derivado prximos dos 540nm e um
maior perto dos 580nm;
Relativamente ao espetro de absoro da desoxihemoglobina
(grfico 5) quando comparado com o espetro de referncia da
figura, verifica-se que na gama espetral de referncia (450-700nm)
no se verifica o devido pico de absoro que se deveria observar a
cerca de 560 nm, o que poder levar a crer que erros de pipetagem
tero levado a estes resultados.
No espetro de referncia de absoro da metahemoglobina (grfico
6) verifica-se um pico a cerca de 500 nm o qual no est em
concordncia com os resultados obtidos experimentalmente uma
vez que dentro da gama de comprimentos de onda de 450-700 nm
no se verificam picos de abosoro bem evidenciados, mas sim um
ligeiro pico aos 500 nm o que sugere possveis erros de pipetagem
ou a no correta homogeneizao da soluo analisada.
Na anlise dos espetros de absoro da hemoglobina com e sem
nitritos (grficos 10,11 e 12): verifica-se uma grande semelhana
entre o espetro na ausncia de nitritos quando comparado ao
espetro de absoro da oxihemoglobina e tambm a forma do
espetro de absoro da amostra de sangue com os nitritos
assemelha-se ao espetro de absoro da metahemoglobina. Ora,
sabendo que este derivado incapaz de transportar oxignio podese inferir que a ingesto de nitritos em excesso poder levar a um
aumento prejudicial da metahemoglobina e portanto poder resultar
num deficiente transporte de oxignio para os tecidos e possvel
necrose.
Quanto a influncia do pH na oxihemoglobina (grficos 7, 8 e 9)
temos que os espetros de absoro da oxihemoglobina a pH 6 e a
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pH 8 so bastante semelhantes. No entanto o espectro de absoro


da oxihemoglobina a pH 6 apresenta valores de absorvncia, na sua
generalidade superiores aos apresentados no espectro de absoro
a pH 8 (tabela 2). Observa-se um pico de absorvncia aos 420 nm e
dois picos mais pequenos a 540 e 580 nm. No se verificam por isso
alteraes qualitativas no espetro de absoro da hemoglobina
quando alterados os parmetros de pH. Esta forma espetral mostra
que a oxihemoglobina continua a ser a forma predominante e,
portanto, aquela que maioritariamente detetada.
Pelo efeito de Bohr seria de esperar que a pH 6 o espectro de
absoro refletisse valores mais baixos de absorvncia que seriam
concordantes com o efeito relatado, pois tratar-se-ia da
transformao da oxihemoglobina para a desoxihemoglobina em
que a pH mais cido ocorre uma alterao da estrutura da
hemoglobina, que resulta numa diminuio da afinidade para o
oxignio logo a concentrao deste derivado de hemoglobina
(desoxihemoglobina)a pH cido aumentaria, ou seja, os valores de
absorvncia no espetro de absoro da oxihemoglobina a pH 6
diminuiriam. Este efeito poder estar presente mas em pequena
extenso da alguns dos valores de absorvncia da oxihemoglobina
a pH 6 sejam ligeiramente inferiores aos de pH 8. O facto de no se
verificar com clareza o efeito de Bohr poder dever-se a erros de
pipetagem ou ao uso de solues com valores de pH alterados que
se desviam do pH 6 e pH 8.
O envenenamento por cianeto deve-se a forte reaco de oxidao
que despoleta em todas as formas hemoglobnicas originando
cianometahemoglobina, molcula incapaz de transportar oxignio
levando a deficiente oxigenao dos tecidos e possvel necrose e,
principalmente, devido ao facto de ao nvel da mitocndria, se ligar
a citocromo c oxidase que possui um io ferro cujo nmero de
oxidao varia entre +2 e +3. Dado que o cianeto tem uma grande
afinidade pelo Fe+3, ele liga-se rapidamente ao io frrico da
citocromo c oxidase, impedindo que retorne ao estado ferroso.
Isto bloqueia toda a cadeia respiratria e, por conseguinte, bloqueia
tambm a sntese acoplada de ATP.
O monxido de carbono, por processo semelhante ao de ligao
entre a hemoglobina e oxignio, tambm reage com a protena,
formando carboxi-hemoglobina (HbCO). Assim, quando existe
envenenamento com CO ocorre uma competio entre o oxignio e
o CO pela hemoglobina, mas devido ao facto de o CO apresentar
maior afinidade para os ies Fe2+ da protena, estes acabam por se
ligar mais fortemente e a hemoglobina perde a sua funo

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transportadora de oxignio, o que leva a um quadro de hipxia e


consequente morte do indivduo.
Pelo Mtodo de Drabkin a concentrao de hemoglobina calculada
na amostra de sangue foi de cerca de 8,385 g/dl, valor este abaixo
dos valores de referncia e, portanto, ou se deve a erros acidentais
e sistemticos ou se deve ao facto de o individuo ser anmico.
A diminuio do pH promove a diminuio da afinidade do oxignio
pela hemoglobina levando a sua libertao e formao da
oxihemoglobina. Este facto tem grande importncia fisiolgica, j
que este o mecanismo que permite a oxigenao dos tecidos.
Um envenenamento por cianeto e monxido de carbono leva a
reao destes compostos com a hemoglobina o que conduz a uma
diminuio da concentrao de hemoglobina livre para a
distribuio de oxignio, o que poder levar a asfixia do indivduo
(hipxia).

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