Você está na página 1de 28

1

APLICAES DE ESTUDOS BIOQUMICOS QUANTITATIVOS EM CINCIAS


BIOLGICAS E DA SADE
Marcus Vincius Paiva de Oliveira1
1.

Bacharel e Licenciado em Biologia; Mestre em Biologia rea de concentrao Biologia Celular e


Molecular; docente do curso de Cincias Biolgicas da Faculdade Araguaia Goinia GO.
mvpogen@gmail.com

RESUMO
A colorimetria e a espectrofotometria podem ser conceituadas como um
procedimento analtico atravs do qual se determina as concentraes de
espcimes qumicas mediante a absoro de luz. Uma soluo quando iluminada
por luz branca, apresenta uma cor que resultante da absoro relativa dos vrios
comprimentos de onda que a compem. Esta absoro, em cada comprimento de
onda, depende da natureza da substncia, de sua concentrao e da espessura da
mesma que atravessada pela luz. A espectrofotometria amplamente utilizada nas
anlises bioqumicas para a determinao de biomolculas das quais permitem
chegar a um resultado analtico cientfico ou a um diagnstico. Neste contexto, o
presente artigo trata-se de uma reviso bibliogrfica sobre a aplicao desta tcnica
quantitativa nas anlises bioqumicas.
Palavras-chave: biomolculas, espectrofotometria, pesquisa, sade.
INTRODUO
Os conhecimentos adquiridos com estudos bioqumicos aliados aos
conhecimentos das reas exatas como a qumica e a fsica permitiram o
desenvolvimento de inmeras tcnicas e metodologias analticas que se difundiram
a todos os laboratrios, sendo eles de pesquisas ou clnicos. Segundo Cisternas et
al. (2005, p.5), o emprego de tcnicas fsico-qumicas serve tanto qumica quanto
biologia e tem permitido reduzir a maioria dos fenmenos celulares a termos
moleculares.

Assim,

pode-se

dizer

que

qualquer

evento

descrito

macroscopicamente, descrito pela anatomia e fisiologia, existe uma razo


microscpica, ao nvel celular, que por sua vez relaciona-se intimamente com os
mecanismos moleculares. Por sua vez, muitos desses mecanismos foram descritos
graas a pesquisas que fizeram o uso de metodologias laboratoriais.
Estas idias valem tanto para o normal como para o anormal, ou seja, as
patologias, que a muito foram descritas macro e microscopicamente tm sempre,
como causas, alteraes do funcionamento celular e seu mecanismo metablico.
Ento, por meio do uso de tcnicas fsico-qumicas, as anlises clnicas foram

beneficiadas enormemente com os mtodos quantitativos de anlises que utilizam,


por exemplo, a espectrofotometria (CISTERNAS, et al. 2005).
Por exemplo, por meio da espectrofotometria aplicada s anlises clnicas e
por outras tecnologias, diretrizes da rea mdica foram sendo estabelecidas e
delineadas para a conduo de um diagnstico mais consistente e assertivo,
possibilitando assim um encaminhamento teraputico eficaz. Segundo Cerri et al.,
(2004, p.2), responsveis pelo Projeto Diretrizes da Associao Mdica Brasileira e
Conselho Federal de Medicina, tais condutas possuem o intuito de auxiliar nas
decises mdicas e, conseqentemente, otimizar o cuidado aos pacientes.
O presente estudo tem por objetivo discorrer a respeito dos fundamentos da
tcnica de espectrofotometria e sua aplicao nas anlises clnicas. Adicionalmente,
o mesmo apresenta e discute metodologias analticas padro, seus princpios e
interpretaes em patolgicas que acometem o ser humano.

1. Fundamentos da Espectrofotometria
Segundo Motta (2009, p.15), a fotometria e a espectrofotometria estudam a
medio das grandezas relativas emisso, recepo e absoro da luz. Em
bioqumica clnica, tais medies so essenciais para a compreenso de disfunes
metablicas desencadeadas por alguma patologia. Ainda de acordo o autor, as
medies so analisadas quantitativamente baseadas na absoro de luz por
solues, como por exemplo, urina, plasma ou soro.
Os fotocolormetros e espectrofotmetros so os instrumentos que efetuam as
medies. Aliadas a esses instrumentos, esto s reaes de identificao e
caracterizao de biomolculas como carboidratos, protenas, lipdios, colesterol
entre outras, que no passado foram elucidadas e desenvolvidas por qumicos e
bioqumicos (HIRANTO et al., 2001, p.25). Neste contexto, a indstria farmacutica
construiu kits comerciais de anlises que possibilitam chegar a resultados
quantitativos com certa rapidez e segurana. Hoje, esto disponveis no mercado
inmeros kits para diagnsticos de diversas patologias, das mais diferentes marcas,
que se baseiam nos princpios da espectrofotometria e bioqumica.
O princpio da espectrofotometria baseia-se na absoro da luz por molculas
dispersas em uma soluo. As radiaes eletromagnticas, que compem a luz,
com comprimento (). de onda entre 380 e 750 nm so visveis ao olho humano,
constituindo numa pequena parcela do espectro eletromagntico. A zona do

espectro cujas radiaes possuem um comprimento de onda abaixo de 380 nm


denominada ultravioleta (UV), j aquelas que possuem comprimento de onda acima
de 750 nm correspondem zona infravermelha (MOTTA, 2009, p.16)
A luz branca, quando passa por um prisma, decomposta em raios de luz
com distintos comprimentos de onda, que so projetados em faixas que vo do
vermelho ao violeta, sendo ento chamado de espectro de emisso. Assim, cada
espectro luminoso possui um intervalo de comprimento de onda em nanmetros
(tabela 01).
Tabela 01. Intervalos de comprimento de onda no espectro eletromagntico
Intervalos de (nm)

Cores
Ultravioleta (no visvel)

< 380

Violeta

380 - 450

Azul

450 500

Verde

500 570

Amarela

570 590

Alaranjada

590 620

Vermelha

620 750

Infravermelha

750 a 2.000

Segundo princpios da Fsica, um objeto ou substncia absorve toda a luz


incidente exceto a do intervalo de comprimento de onda observado pela viso.
Assim, uma soluo de cor azul apresenta esta cor pelo fato de ter absorvido as
demais cores que constituem o espectro luminoso terem sido absorvidas. Assim, a
cor de uma soluo complementar luz absorvida (MOTTA, 2009, p.16).
Dependendo a natureza da soluo que ser examinada, obtm-se os
espectros de absoro da luz, de modo que a imagem espectral pode servir para a
identificao e quantificao de uma determinada substncia.

1.1. Leis da Espectrofotometria


Segundo Cisternas et al. (2005, p.7), quando um raio de energia radiante
atravessa uma soluo colorida, a energia incidente (I0) ser sempre mais intensa
que a energia emergente (I). Isso quer dizer que parte da energia radiante foi
absorvida pela soluo. Outro motivo para esta atenuao pode ser atribuda ao

material que constitui o recipiente que se deposita a soluo teste chamado de


cubeta.
Para Motta (2009, p.16), o quociente I / I0 denominado Transmitncia (T). Se
I0 for igual a 100%, a intensidade de luz emergente poder ser medida
matematicamente como porcentagem de transmitncia (%T) expressa pela equao:
%T = T x 100. Mede-se a intensidade de luz absorvida por uma soluo corada pela
reduo da medida da intensidade de luz transmitida, a isso d se o nome de
Absorbncia (A). Assim, a absorbncia igual quantidade de luz absorvida e
transmitncia a frao total de luz transmitida. Desse modo, A e T so grandezas
inversamente relacionadas. A absoro de luz trata-se de uma funo logartmica,
assim, a relao bsica entre A e T expressa pela equao: A = - log%T/100.
Desenvolvendo esta equao matematicamente tem-se: A = - (log %T log 100); A
= - (log%T + 2); A = - log%T + 2; A = 2 log%T
Os cientistas Bouger e em seguida Lambert investigaram a relao entre a
diminuio da intensidade de luz e a espessura do meio absorvente. Ao incidir-se
um raio de luz sobre diversas camadas opticamente homogneas e de espessuras
conhecidas, observa-se uma proporo direta entre a espessura das camadas e o
logaritmo da transmisso: - logo T = b x k, onde b a espessura da camada e k uma
constante. Ou seja, a transmisso da luz decresce logaritmicamente com o aumento
linear da espessura da camada (MOTTA, 2009, p.17).
Tem-se, ento, uma relao direta entre absorbncia e a espessura da
camada. Quanto maior a espessura da camada (b), maior a absorbncia. Ento, de
acordo com a Lei de Bouguer-Lambert, pode-se expressar a equao: A = b x k.
Outra lei rege os princpios da espectrofotometria a Lei de Lambert-Beer, a
qual afirma que a concentrao de uma substncia diretamente proporcional
quantidade de luz absorvida ou inversamente proporcional quantidade de luz
absorvida ou inversamente proporcional ao logaritmo da luz transmitida. A relao
matemtica radiante, a concentrao de uma soluo e o percurso da luz na soluo
mostrada pela lei de Beer: A = abc, onde A a Absorbncia; a, a absortividade; b,
o percurso da luz em soluo em cm; e c, a concentrao da substncia de
interesse (NEPOMUCENO e RUGGIERO, 2004, p.99).
Quando c expresso em mol por litro e b em cm, o smbolo , chamado
absortividade molar (a frao de um comprimento de onda especfico de luz

absorvida por um dado tipo de molcula sob condies especficas de pH e


temperatura), usado em lugar de a (NEPOMUCENO e RUGGIERO, 2004).
Na prtica laboratorial, a aplicao quantitativa da lei de Beer realizada pelo
emprego de espectrofotmetros, onde so lidas as absorvncias de uma soluoteste de uma soluo padro de concentrao conhecida, aps submetida a reaes
apropriadas, e aplicada a seguinte relao:
Concentrao do padro = concentrao do teste
Absorbncia do padro

Absorbncia do teste

Ento, a concentrao do teste calculada:


Concentrao do teste = Concentrao do padro x Abs. do teste
Absorbncia do teste
Deve-se perceber que neste clculo, considera-se que a espessura das
cubetas que contm as solues lidas constante. Esta relao s aplicada
quando a reao colorimtrica segue a lei de Beer e tanto o desconhecido como o
padro so lidos na mesma clula.

1.2. Medidas da Transmitncia e da Absorbncia:


A transmitncia e a absorbncia das solues coloridas so medidas por meio
de instrumentos chamados de fotmetros. Estes instrumentos empregam como fonte
luminosa uma lmpada incandescente produtora de luz branca. Potencialmente,
pode-se empregar qualquer comprimento de onda da regio visvel. Para a
resoluo da luz em determinado comprimento de onda desejado, so utilizados
monocromadores que consistem de filtros interferentes ou de absoro, prismas ou
retculos de difrao (espectrofotmetros) (PETKOWICZ, et al., 2007, p.93).
A luz atravessa uma soluo colorida presente em uma cubeta; parte
absorvida, que depende da intensidade da cor da soluo. A luz transmitida,
detectada por uma fotoclula, tem intensidade menor que a luz incidente. A
fotoclula converte a energia eltrica, emitindo um sinal que pode ser lido na escala
de um galvanmetro, em percentagem de transmitncia ou em absorvncia.
A determinao da absorbncia ou transmitncia de uma soluo torna
indispensvel o conhecimento da intensidade de da luz incidente e emergente. So
vrias as dificuldades de ordem tcnica para a medida absoluta da luz incidente.
Considera-se ento, por aproximao, a luz incidente igual em intensidade quela

emergente de uma cubeta do fotmetro contendo somente o solvente, aqui chamado


de branco (PETKOWICZ, et al., 2007, p.93).
Desse modo, so superadas as dificuldades da determinao direta da luz
incidente, assim, como ficam eliminadas a absoro e a disperso de luz introduzida
pelas paredes das cubetas, pelo solvente e algumas impurezas.
Portanto, para proceder medida da absorbncia, introduz-se uma cubeta na
cmara de leitura contendo o solvente (branco) e acerta-se o aparelho para que a
absorbncia seja zero, ou 100% de transmitncia. Substitui-se o branco pela cubeta
contendo a soluo teste ou padro e l-se a absorbncia da mesma.

1.3. Curva de Calibrao:


Para diminuir a possibilidade de erro por tomar uma nica concentrao da
soluo padro, recomendado adotar a construo da curva de calibrao ou
tambm chamada de curva padro, da qual feita em grfico (REMIO et al., 2003).
Neste contexto, prepara-se uma srie de solues com concentraes
conhecidas e de forma crescente de uma determinada substncia a ser dosada por
dado mtodo e mede-se as respectivas densidades ticas (D.O.) ao fim do processo
(HIRANO et al., 2001, p.37).
Anotam-se no eixo da abcissa as concentraes e no eixo da ordenada as
respectivas D.O. obtidas. Deve-se preparar um tubo contendo todos os reativos
exceto a substncia a ser dosada, sendo ento chamada de branco. Nesta soluo
a concentrao ento zero. As D.O. do branco devero ser descontadas das
demais para se obter, unicamente, as D.O. da substncia nas vrias concentraes.
Uma alternativa , quando possvel, regular o fotmetro de modo que a D.O. do
branco coincida com o valor zero (REMIO, et al., 2003, p. 99).
Quando uma substncia segue a lei de Beer, a curva padro pode ser
construda com um pequeno nmero de pontos, como, por exemplo, utilizar apenas
5 concentraes conhecidas. No entanto, quando uma substncia no segue tal lei,
a curva deve ter 10 (dez) ou mais pontos.
Segundo Hirano et al., (2001, p.37) no caso de substncia que seguem a lei
de Beer, os eventuais erros podem ainda ser reduzidos pela correo da curva
padro, calculando-se o fator da reta (F) que resulta da diviso do somatrio das
concentraes (C) pelo somatrio das D.O., conforme a frmula: F = Cq / D.O.

Ainda, segundo Remio et al., (2003, p.99), os procedimentos fotomtricos


devem ser realizados em regies do espectro em que as diferenas de concentrao
ocasionem as maiores diferenas possveis nas respectivas D.O. Para isso,
necessrio preparar duas solues da substncia a ser analisada de modo que uma
seja o dobro da concentrao da outra e determinar a transmitncia com diversos
filtros de um fotocolormetro ou em diversos comprimentos de onda () de um
espectrofotmetro, para estas duas solues. Assim, registra-se num grfico T
contra e escolhe-se a melhor regio. Em outras palavras, determina-se o espectro
de absoro da substncia a ser analisada, em duas concentraes conhecidas.

1.4. Espectrofotmetro:
O espectrofotmetro um instrumento compacto e de fcil operao. Ele
pode ser aplicado em medio de transmitncia, absorbncia e leitura direta de
concentrao de material transparente. So amplamente empregados no campo da
higiene e medicina, exames clnicos, bioqumica, engenharia qumica de
combustveis, monitoramento e inspeo do meio ambiente, controle de qualidade
para anlises qualitativas e quantitativas em relao a amostras (HIRANO, et al.,
2001, p.37).
Os espectros podem ser obtidos com aparelhos do tipo esquematizado na
figura 01, cujos componentes principais so:

Figura 01. Esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As letras


representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d) fenda seletora de
X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo soluo, (f) clula foteltrica, (g)
amplificador. Fonte HIRANO et al., 2001)

a) Fonte de luz policromtica depende do comprimento de onda desejado. Podem


ser de lmpada de tungstnio (luz branca) e para visvel de hidrognio (ultravioleta).
b) Colimador que reflete um feixe de raios paralelos sobre o monocromador.

c) Monocromador que pode ser um prisma ou uma grade de difrao para


dispersar a luz.
d) Fenda que deixa passar um feixe monocromtico cujo comprimento de onda
depende da posio do prisma.
e) Luz incidente o feixe monocromtico que passou pela fenda.
f) Clula fotoeltrica que um detector sensvel radiao luminosa.
g) Amplificador que recebe e amplifica o sinal detectado.

2. Reaes Colorimtricas e suas correlaes


Com alguma freqncia necessrio quantificar substncias em misturas
complexas, ou que no absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento
de onda, assim, utiliza-se os chamados mtodos colorimtricos. Neles uma
determinada substncia entra em contato com um reagente especfico produzindo
ento uma cor, cuja intensidade, diretamente proporcional concentrao da
substncia na mistura original (GORDON, 1995, p.324).
Neste contexto, ao longo das pesquisas na rea da Bioqumica, vrias
reaes foram desenvolvidas das quais detectam, especificamente, a presena de
biomolculas em solues desenvolvendo cores variadas. Assim, tais reaes
puderam ser utilizadas para a determinao qualitativa e quantitativa de
biomolculas em diversas amostras, sendo ento aplicadas s anlises clnicas para
diagnsticos de diabetes, lipidemias, colesterolemias, proteinrias e produtos
nitrogenados como cido rico, uria e amnia, enzimas como amilase, lpase,
fosfatase alcalina, fosfatase cida, aminotransferases, lactato desidrogenas entre
outras, alm de ons como clcio, sdio e potssio.

2.1. Determinao de glicose pelo mtodo da O-toluidina


Nesse mtodo a glicose reage com a o-toluidina (orto-toluil) em meio cido e
a quente, resultando glicosamina e base de Schiff correspondentes. Esta reao
desenvolve cor azul que proporcional quantidade de glicose at 200 mg/dL
presente na amostra que pode ser soro, plasma, urina ou liquor. Os valores normais
do soro ou plasma de 75 a 110mg/dL, sangue total de 80 a 120 mg/dL e urina zero
(ausente) e a leitura espectrofotomtrica feita entre 600 a 650 nm. (CISTERNAS et
al., 2005, p. 13).

A dosagem de glicose amplamente utilizada na determinao da glicemia.


Esta dosagem torna-se extremamente importante no diagnstico de doenas como a
diabetes mellitus (tipo 1 e tipo 2), diabetes mellitus gestacional, diabetes tipo MODY
(do ingls, Maturity onset diabetes of the young) (SBEM, 2004, p.3).
Para o diagnstico do diabetes, devem ser seguidos mtodos e critrios
especficos dos quais iro determinar glicemia casual, glicemia de jejum, glicemia
ps-prandial, glicosria entre outros sinais clnicos.

2.2. Determinao de Lipdios Totais


Os lipdios totais incluem os triacilgliceris, colesterol e seus steres, cidos
graxos no

esterificados,

fosfolipdeos, hormnios esteroidais e

vitaminas

lipossolveis (CHAMPE et al., 2006, p. 171). O material que utilizado o soro do


qual aquecido em banho-maria fervente em presena de cido sulfrico
concentrado. O reativo de fosfo-vanilina reage com uma frao de solua sulfrica,
para formar um composto de colorao rsea, cuja intensidade de cor proporcional
concentrao de lipdios totais da amostra, sendo os valores normais de referncia
de 20 a 30 anos de idade de 400 a 700 mg/dL e acima dos 30 at 900 mg/dL e a
leitura espectrofotomtrica deve ser feita entre 500 a 550 nm. (CISTERNAS et al.,
2005, p.15).

2.3. Determinao de Colesterol Total


O mtodo de Huang e colaboradores modificado tem como o princpio a
precipitao de protenas pelo anidro actico, retirando a gua de solvatao das
mesmas e, ao mesmo tempo, contribuindo para a formao de um complexo. Com a
adio de cido sulfrico, o mesmo dissolve o precipitado, pois baixa o pH alm do
pI (ponto isoeltrico) das protenas. Pela desidratao que ocorre no nvel insaturado
do ncleo do colesterol, forma-se um derivado sulfnico de colorao verde, cuja
intensidade diretamente proporcional concentrao de colesterol existente na
amostra (MOTTA, 2000, p.261).

2.4. Determinao de Protenas Totais pelo Mtodo do Biureto


A reao do biureto caracterstica para identificao de protenas, sendo
positiva quando h no mnimo 3 ligaes peptdicas (NEPOMUCENO e RUGGIERO,

10

2004, p.99). O biureto formado pelo aquecimento da uria a 180C, havendo a


liberao de uma molcula de amnia. Solues fortemente alcalinas de biureto, em
presena de sulfato de cobre diludo, desenvolvendo uma colorao violeta. A
colorao desenvolvida deve-se formao de um complexo entre o on cprico
(Cu++) e 4 tomos de nitrognio. As protenas do positiva a reao pela existncia
das vrias ligaes peptdicas, formando-se o complexo entre duas cadeias
adjacentes (HIRANO et al., 2001, p.81).
O complexo formado entre o on cprico e as mltiplas ligaes peptdicas
das protenas apresenta um ponto mximo de absorbncia em 545nm (filtro verde
do equipamento) (CISTERNAS et al., 2005, p. 16).

2.5. Determinao de Albumina Srica pelo Mtodo do Verde de Bromocresol


A albumina uma protena plasmtica que tema funo de transportar
diversas biomolculas, como por exemplo, clcio, hormnios entre outras
(RHOADES E TANNER, 2005, p. 601). Segundo Cisterinas et al., (2005, p.16), a
albumina possui a propriedade de se ligar a certos corantes, os quais mudam de cor
ligados a ela, em meio tamponado. O verde de bromocresol, em pH 4.2, apresenta
cor amarela e quando combinado albumina adquire colorao verde, cuja
intensidade diretamente proporcional concentrao de albumina existente na
amostra. Os valores normais so de 3,8 a 5,1 g/dL e a leitura espectrofotomtrica
feita entre 600 a 650 nm.

2.6. Determinao de Creatinina pelo mtodo de Jaff


A creatinina produzida a partir da creatina no msculo. A creatina, por sua
vez, sintetizada no fgado, rim e pncreas e transportada para as clulas
musculares e crebro, onde fosforilada a creatina-fosfato que atua como
reservatrio de energia (GARCIA E KANAAN, 2008, p.37) Tanto a creatina-fosfato
como a creatina, em condies fisiolgicas, espontaneamente perdem o cido
fosfrico ou gua, respectivamente, para formar seu anidro, a creatinina. A
creatinina difunde do msculo para o plasma de onde removida, quase
exclusivamente, pela filtrao glomerular e excretada na urina. Em presena de
teores marcadamente elevados de creatinina no plasma, parte da mesma tambm
excretada pelos tbulos renais. A quantidade de creatinina excretada diariamente
uma funo da massa muscular e no afetada pela dieta pela dieta, idade ou

11

exerccio e corresponde a 2% das reservas corpreas da creatina-fosfato. A mulher


excreta menos creatinina do que o homem devido a menor massa muscular
(MOTTA, 2000, p. 125).
A creatinina reage com o cido pcrico em meio alcalino (pH 12,4, reao de
Jaff) produzindo o picrato de creatinina, tautmero de cor vermelha, proporcional
concentrao de creatinina existente na amostra. A leitura espectrofotomtrica
feita entre 450 a 510 nm.

2.7. Determinao de Uria


A uria constitui 45% do nitrognio no-protico no sangue. sintetizada no
fgado a partir do dixido de carbono e amnia, sendo esta proveniente da
desaminao dos aminocidos, em todos os tecidos, como produto final do
catabolismo protico (MOTTA, 2000, p. 119). Aps sua sntese heptica, a uria
transportada pelo plasma at os rins, onde rapidamente filtrada pelos glomrulos,
excretada na urina, embora mais de 40% seja reabsorvida por difuso passiva
durante a passagem do filtrado pelos tbulos. O nvel no plasma notadamente
afetado pela funo renal, pelo contedo protico da dieta e pelo teor de protelise.
O fundamento da determinao da uria basea-se na hidrlise cida da
diacetilmonoxima diacetil, a qual reage diretamente com a uria na presena de
tiosemicarbazida (que intensifica a cor) e ons de cdmio (que estabiliza a cor).
Assim, forma um derivado diazdico de colorao rsea, cuja intensidade
diretamente proporcional concentrao de uria presente na amostra. Os valores
normais para soro ou plasma de 15 a 40 mg/dL e na urina at 50mg/dL (LABTEST,
1999, p.2).

2.8. Determinao de cido rico


No homem o cido rico o principal produto do catabolismo das purinas,
bases nitrogenadas adenina e guanosina, sendo formado principalmente no fgado,
a partir da xantina pela ao da enzima xantina oxidase (GARCIA E KANAAN, 2008,
p. 165).
O teor de urato encontrado no plasma, que est ao redor de 6m/dL,
representa o equilbrio entre a produo (700 mg/dia) e a excreo pela urina (500
mg/dia) e fezes (200 mg/dia). O cido rico transportado pelo plasma at os rins,
onde filtrado pelos glomrulos. Quase todo o cido rico reabsorvido pelos

12

tbulos proximais e pequenas quantidades so secretadas pelos tbulos distais e


excretadas na urina. Os triglicerdeos, os corpos cetnicos e o lactato competem
com o urato na excreo renal. Parte do urato excretado pelo trato gastrointestinal
e degradado pelas enzimas bacterianas (MOTTA, 2009, p. 258).
pequena a contribuio dos cidos nuclicos da dieta nos nveis de cido
rico circulante, pois aqueles so degradados no intestino pela xantina oxidase da
mucosa e somente, em quantidades mnimas, so absorvidos e canalizados para os
processos metablicos intracelulares (CHAMPE, et al., 2006, p. 297).
O fundamento da determinao de cido rico basea-se na oxidao do cido
alantona e dixido de carbono pela ao do cido fosfotngstico em meio alcalino.
Ao mesmo tempo, o cido fosfotngstico reduzido a azul de tungstnio, produzindo
uma colorao cuja intensidade diretamente proporcional concentrao do cido
rico presente na amostra. A leitura espectrofotomtrica de 680 a 730 nm e os
valores normais para o homem 2,5 a 7 mg/dL de soro ou plasma e para a mulher
1,5 a 6 mg/dL (MOTTA, 2009, p. 258).

2.9. Determinao de Amnia


A amnia produzida pela desaminao oxidativa dos aminocidos
provenientes do catabolismo protico. Entretanto, a maior parte a amnia
absorvida do trato gastrointestinal, onde formada pela degradao bacteriana das
protenas da dieta e desdobramento da uria presente nas secrees intestinais.
Embora a amnia, em baixas concentraes, seja um metablito normal no sangue,
em teores elevados torna-se neurotxica. A maior parte da mesma detoxificada
pelas clulas hepticas em uria, e nesta forma, excretada. Parte da amnia
incorporada, temporariamente, glutamina, que nos rins sofre ao da glutaminase,
sendo ento excretada tambm na urina (RHOADES E TANNE, 2005, p. 508)
Segundo Motta (2009, p. 218), em enfermidades hepticas severas, a amnia
no removida da circulao e os nveis sanguneos se elevam. Diferentemente de
outras substncias nitrogenadas no proticas, os teores plasmticos da amnia
no dependem do funcionamento dos rins, mas da funo heptica, assim, no
servindo de parmetro para a funo renal.
O mtodo enzimtico um dos vrios mtodos que permite determinar a
concentrao de amnia no plasma. Este mtodo emprega a enzima glutamato
desidrogenase na reao da amnia com o alfa-cetoglutarato, na presena de

13

NADPH. Sob condies apropriadas, a reduo da absorbncia em 340 nm


proporcional concentrao da amnia. Em adultos normais, o nitrognio amoniacal
varia de 35 a 120 g/dL ou 43 a 146 g/dL de amnia (MOTTA, 2000, p. 139).

2.10. Determinao da Amilase


A amilase uma enzima da classe das hidrolases que catalisa o
desdobramento do amido e glicognio ingeridos na dieta. A amilase srica
secretada, fundamentalmente, pelas glndulas salivares e pancreticas. A medida
desta enzima no soro e urina empregada no diagnstico de pancreatite aguda
(CHAMPE et al., 2006 p. 86).
Existem aproximadamente 200 mtodos de anlise de atividade da amilase
srica, sempre derivados da mistura de uma amostra do soro com um polissacardeo
com condies controladas de pH (entre 6,9 e 7,0) e na presena de ons clcio e
cloreto. No Brasil, a tcnica mais utilizada a iodomtrica, que monitora o
desaparecimento do amido aps certo tempo de hidrlise, atravs da reao deste
com o iodo. A absorbncia medida aps o perodo de reao em 660 nm
inversamente proporcional atividade da amilase da amostra. a dificuldade de
estabilizao do reagente do amido a principal desvantagem deste mtodo. Suas
principais vantagens so o baixo custo, a facilidade de obteno de substratos, a
simplicidade e rapidez da tcnica e sua boa sensibilidade (MILLER, 1991, p. 80).
O fundamento do mtodo para determinao da amilase pancretica srica
(Caraway modificado) baseia-se na adio do reativo de cor, no caso o iodo a dois
tubos, sendo o padro, contendo amido e o outro sendo o teste, tambm contendo
amido, mas com a adio de amilase. A extenso da hidrlise do substrato do amido
pela amilase, no teste, nas condies padro de 37C, medida pela perda da cor
azul no teste aps a adio do reativo de cor, comparado com o padro, na qual a
hidrlise enzimtica no ocorre. Os valores de referncia no soro vo de 60 a 160
unidades/Dl. J na urina so excretados de 40 a 260 unidades/hora ou at 2.000
unidades/ 24 horas (MILLER, 1991, p.80).
2.11. Determinao da Fosfatase Alcalina
A fosfatase alcalina pertence a um grupo de enzimas relativamente
inespecficas, que catalisam a hidrlise do grupo fosfato terminal de vrios
fosfomonosteres em pH alcalino, portanto, capaz de reagir com diferentes
substratos. O pH timo da reao in vitro est ao redor de 10, mas depende da

14

natureza e concentrao do substrato empregado (GARCIA E KANAAN, 2008, p.


98).
O significado clnico dos nveis da fosfatase alcalina srica importante para
a investigao das desordens hepatobiliares e sseas. Nas enfermidades
hepatobiliares, as elevaes so encontradas, predominantemente, na obstruo
extra-heptica, visto em clculo ou cncer de cabea de pncreas (MOTTA, 2000, p.
160).
O mtodo de Bowers e McComb o mtodo mais utilizado para determinar as
concentraes sricas de fosfatase alcalina. O princpio consiste na hidrlise do 4nitrofenilfosfato (incolor) a on 4-nitrofenxido (amarelo) e fosfato. A reao
acompanhada por monitoramento contnuo do aumento na absorbncia em 404 nm.
Os valores de referncia para adultos vo de 20 a 105 U/L, crianas de 0 a 3 meses
vo de 60 a 150 U/L e jovens de 10 a 15 anos de 60 a 260 U/L (GARCIA E
KANAAN, 2008, p. 98).

2.12. Determinao da Fosfatase cida


Segundo Garcia & Kanaan (2008, p. 30), a fosfatase cida designa um grupo
de fosfatases que exibem atividade mxima ao redor do pH 5 e catalisam a hidrlise
de monoster ortofosfrico, produzindo um lcool e um grupo fosfato. A atividade da
fosfatase cida encontrada na prstata, ossos, fgado, bao, rins, eritrcitos e
plaquetas. Em homens adultos normais, a prstata contribui com quase a metade da
enzima presente no soro.
Os nveis de fosfatase cida no soro apresentam grande importncia clnica
no diagnstico e monitoramento do cncer prosttico. Os mtodos empregados
nesta determinao devem diferenciar os aumentos provenientes da fosfatase
prosttica da fosfatase no-prosttica. Para isso so utilizados vrios inibidores
qumicos como, por exemplo, o tartarato e formaldedo, substratos especficos como
timolftalena monofosfato, alfa-naftil fosfato e tcnicas imunolgicas (MOTTA, 2000,
p. 167).
A determinao da atividade da fosfatase cida no soro tem como principal
findalidade o diagnstico e o monitoramento do cncer prosttico, particularmente,
da forma metastisada.
Vrios mtodos foram desenvolvidos para avaliar a atividade de fosfatase
cida. No mtodo de Roy, Brower e Hauden modificado, a timolftalena monofosfato

15

um substrato auto-indicador com alto grau de especificidade para a fosfatase cida


prosttica. A timolftalena liberada aps a ao da fosfatase, desenvolve cor em
meio alcalino. Fosfatases cidas provenientes de outros tecidos, reagem em grau
bem menor com este substrato.
O princpio da reao baseia-se na hidrlise da timolftalena pela fosfatase
cida timolftalena e fosfato em pH 5,4 a 37C. Os produtos so incolores em pH
cido, entretanto, a timolftalena atua como cromognio autoindicador quando a
reao interrompida pela adio de soluo alcalina de carbonato de sdiohidrxido de sdio. A timolftalena liberada desenvolve cor medida em 595 nm e os
valores de referncia variam entre 0,5 e 1,9 U/L (MOTTA, 2000, p. 167).

2.13. Determinao de Aminotransferases


As enzimas aspartato aminotransferase (AST), transaminase glutmicaoxalactica (GOT) e alanina aminotransferase (ALT) e transaminase glutmicapirvica (GPT) catalisam a transferncia reversvel dos grupos amino de um
aminocido para o alfa-cetoglutarato, formando cetocido e cido glutmico. Estas
enzimas exercem papis centrais tanto para a sntese como para a degradao de
aminocidos. Alm disso, como estas reaes envolvem a interconverso dos
aminocidos a piruvato ou cidos dicarboxlicos, atuam como uma ponte entre o
metabolismo dos aminocidos e carboidratos (MOTTA, 2009, p. 100).
Estas enzimas esto amplamente distribudas nos tecidos humanos. As
atividades mais elevadas de AST (GOT) encontram-se no tecido cardaco, fgado,
msculo esqueltico, com pequenas quantidades encontradas nos rins, pncreas,
bao e eritrcitos. Especificamente, a ALT (GPT) apresenta-se em elevados nveis
no fgado (MOTTA, 2009, p. 101).
As desordens hepatocelulares aguda apresentam um aumento significativo na
atividade das aminotransferases (AST e ALT). Na hepatite virtica, os nveis podem
atingir at 100 vezes os limites superiores dos valores de referncia, apesar de
valores entre 20 e 50 vezes estes limites, serem mais frequentemente encontrados.
Na cirrose heptica so detectados nveis at 5 vezes os limites superiores de
referncia,

dependendo

das

condies

do

progresso

cirrtico.

Aumentos

semelhantes so encontrados tambm no carcinoma de heptico, aps ingesto de


lcool, durante o delirium tremens e aps administrao de certas drogas, tais como,
opiatos, salicilatos ou ampicilina (MOTTA, 2000, p. 171).

16

No infarto do miocrdio, ao redor de 6 a 8 horas do ocorrido, a atividade


srica da AST (GOT) comea a elevar-se, atingindo o mximo entre 18 e 24 horas,
diminuindo depois, progressivamente, retornando aos valores de referncia ao redor
do 5 dia.
Elevaes da AST (GOT) e, ocasionalmente, da ALT (GPT), so encontradas
nas desordens do msculo esqueltico, como a distrofia muscular progressiva e na
dermatomiosite (aumentos de 4 a 8 vezes). Na insuficincia cardaca congestiva, os
nveis de AST podem, tambm, estar aumentados, provalvelmente, refletindo o
envolvimento heptico devido ao suprimento sanguneo inadequado deste rgo. A
AST (GOT) apresenta pequenos aumentos na embolia pulmonar, pancreatite aguda,
gangrena, esmagamento muscular e enfermidade hemoltica (MOTTA, 2009, p.
101).
Existem dois mtodos bsicos para a determinao das aminotransferases: o
mtodo baseado no princpio proposto por Karmen e pelo mtodo proposto por
Reitman e Frankel. No primeiro, o soro incubado com excesso de alfacetoglutarato que se transforma em oxaloacetato ou piruvato pela ao da AST
(GOT) ou ALT (GTP), respectivamente. Os cetocidos formados so medidos
indiretamente por reao de reduo catalisada por desidrogenases especficas e
monitorada pela modificao da absorvncia a 340 nm dos nveis de NADH. A
diminuio da absorbncia proporcional converso dos cetocidos nos
correspondentes

hidroxicidos.

Estes

mtodos

necessitam

emprego

de

espectrofotmetro de boa qualidade com exatido no comprimento de onda e boa


resoluo a 340 nm (MOTTA, 2000, p. 171).
J no mtodo colorimtrico de Reitman e Frankel os produtos formados pela
ao das aminotransferases (oxalato e piruvato) so medidos pela reao com a
2,4-dinitrofenilhidrazina para produzir dinitrofenil-hidrozonas. Estes compostos
desenvolve cor marrom em soluo alcalina. Entretanto, a dinitrofenilhidrazina pode
formar hidraxona tambm com o cido alfa-cetoglutarato provocando assim, uma
interferncia. Mesmo assim, este mtodo relativamente simples apresentando
bons resultados com exatido aceitveis alm de empregar aparelhagem comum a
todos os laboratrios. A leitura espectrofotomtrica feita em 340 nm e os valores
de referncias para adultos normais para AST (GOT) vai de 8 a 40 unidade/mL e
ALT (GPT) de 5 a 35 unidades/mL (MOTTA, 2000, p. 171).

17

2.14. Determinao da Lactato Desidrogenase


A lactato desidrogenase (LD) catalisa a converso reversvel do lactato a
piruvato, em reaes de oxidorreduo na presena da coenzima NAD+ que atua
como doador ou aceptor de hidrognio. A LD est presente no citoplasma de todas
as clulas do organismo, onde as atividades mais elevadas so encontradas no
corao, fgado, msculo esqueltico, rim e eritrcitos. (MARZZOCO E TORRES,
1999, p. 126).
Devido ampla distribuio em numerosos tecidos do organismo, a LD est
aumentada em vrias condies patolgicas, tais como cardacas, hepticas, renais,
hematolgicas e outras doenas. Aproximadamente, 8 a 12 horas aps o infarto do
miocrdio, os nveis sricos de LD comeam a elevar-se, atingindo o pico mximo
entre 24-48 horas e estes valores permanecem aumentados por 7 a 12 dias
(GARCIA E KANAAN, 2008, p. 37).
Desordens hepticas como hepatite virtica, cirrose e ictercia obstrutiva
mostram elevaes de duas a 3 vezes os limites superiores dos valores de
referncia. As anemias hemolticas agudas e crnicas apresentam aumentos
acentuados da LD. Esta elevao devida a altas concentraes da enzima nos
eritrcitos. Desordens no msculo esqueltico e algumas leucemias contribuem para
o aumento da atividade srica de LD (MOTTA, 2009, p. 105).
O mtodo de Kieding o mtodo amplamente utilizado que consiste na
reduo do piruvato lactato em pH 7,4 a 37C na presena da enzima. A oxidao
do NADH a NAD+ monitorada continuadamente pelo decrescimento da
absorbncia em 340 nm e os valores de referncia em adultos normais varia entre
200 e 380 U/L (GARCIA E KANAAN, 2008, p. 37).

2.15. Determinao da Glutamiltransferase


A enzima gama-glutamiltransferase (GGT) encontrada, prediminantemente,
no fgado, rim, prstata e pncreas. Catalisa a transferncia do grupo gama-glutamil
de peptdeos e outros compostos para outros peptdeos, aminocidos e gua. A
funo fisiolgica especfica da GGT no est claramente estabelecida, a membrana
das clulas sua principal localizao e, provavelmente, atua no transporte de
aminocidos e peptdeos para as clulas, na sntese protica e na regulao dos
nveis de glutationa tecidual (SALAWAY, 2009, p. 84).

18

No fgado, a GGT est localizada nos canalculos das clulas hepticas e,


particularmente, nas clulas epiteliais que revestem os ductos biliares. Deste modo,
a atividade desta enzima est elevada em todas as formas de desordens
hepatobiliares. Os maiores aumentos (5-30 vezes os limites superiores dos valores
de referncia) so observados nos casos de obstruo biliar intra ou ps-heptica. A
GGT mais sensvel do que a fosfatase alcalina na deteco de ictercia obstrutiva,
colangite e colecistite. A GGT tambm importante para a avaliao do
envolvimento hepatobiliar em adolescentes. Elevados nveis esto tambm
presentes no cncer prosttico e moderados aumentos em hepatite infecciosa e em
pacientes com fgado gorduroso (SALAWAY, 2009, p. 84).
Os mtodos usuais empregam a L-gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida
como substrato-doador mantendo a glicilglicina como aceptor. Este substrato-doador
rapidamente solvel em gua e no detectada a hidrlise e espontnea do
mesmo. O mtodo consiste pela ao da enzima GGT, o resduo gama-glutamil do
substrato gama-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida transferido para a glicilglicina. A
absorvncia do produto de hidrlise, o cido 2-nitro-5-aminobenzico, medida em
410 nm e os valores de referncia so para o homem 5 a 25 U/L e mulheres 8 a 40
U/L (MOTTA, 2009, p. 105).

2.16. Determinao de Creatina Quinase


A enzima creatina quinase (CK) catalisa a fosforilao reversvel da creatina
pela adenosina trifosfato (ATP) com a formao de creatina fosfato. A CK est
associada com a gerao de ATP nos sistemas contrteis ou de transporte. A
funo fisiolgica predominante desta enzima ocorre nas clulas musculares, onde
est envolvida no armazenamento de creatina fosfato. Cada ciclo de contrao
muscular, promove o consumo de ATP, com formao de ADP, a enzima CK
catalisa a transformao de ADP em ATP, a partir da creatina fosfato. A CK est
amplamente distribuda nos tecidos, com atividades mais elevadas no msculo
esqueltico, crebro e tecido cardaco. Quantidades menores so encontradas na
tireide, placenta, bexiga, trato gastrointestinal, tero, rim, pulmo, prstata, bao,
fgado e pncreas (CHAMPE, et al., 2006, p. 285).
Como a principal localizao da creatina quinase o msculo esqueltico e
cardaco, os nveis sricos esto frequentemente elevados nas leses destes
tecidos. De fato, a atividade da CK srica um indicador sensvel no infarto do

19

miocrdio e distrofia muscular, particularmente a de Duchenne. Nesta ltima, os


teores atingem 50 a 100 vezes os limites superiores dos valores de referncia.
Apesar a CK total apresentar grande utilidade nestas desordens, no uma
avaliao inteiramente especfica j que as elevaes so encontradas em outras
anormalidades do msculo cardaco e esqueltico. Atividades aumentadas de CK
so tambm encontradas, ocasionalmente, nas desordens do sistema nervoso
central (SNC), como no acidente vascular cerebral (AVC), degenerao nervosa e
choque do SNC. A liberao da enzima para a circulao perifrica, ocorre por leso
da barreira hematoenceflica. Outras condies patofisiolgicas tambm elevam os
nveis de CK, tais como, o hipotiroidismo, hiperpirexia maligna e sndrome de Reye
(MOTTA, 2000, p. 188).
A determinao da atividade da creatina quinase emprega os produtos
formados na reao direta (creatina fosfato + ADP) ou inversa (creatina + ATP) tanto
o ATP como o ADP so facilmente medidos por reaes especficas. Os mtodos
mais utilizados empregam a reao inversa, que em condies timas se
desenvolve 6 vezes mais rapidamente que a reao direta. Oliver descreveu uma
sequncia de reaes onde a transformao de creatina fosfato em creatina e ATP,
catalisada pela creatina quinase, acoplada ao sistema hexoquinase/glicose-6fosfato desidrogena/NADH. A variao da absorbncia em 340 nm medida na
avaliao de CK. Rosalki incluiu um tiol ao reagente para aumentar a atividade da
CK mantendo os grupos sulfidrlicos na forma reduzida. A modificao proposta por
Szasz sensvel e apresenta boa preciso e est livre da interferncia exercida pela
adenilado quinase. Entretanto, estes mtodos utilizam reagentes complexos, o que
obriga a maioria dos laboratrio a comprar os reagentes prontos em lugar de
prepar-los (MOTTA, 2009, p. 107).
O princpio da reao consiste na transformao da creatina fosfato em
creatina para a produo de ATP pela CK que acomplada ao sistema
hexoquinase/glicose-6-fosfato desidrogenase/NADH. A adio de N-acetilcistena
evita a oxidao dos grupos sulfidrila da CK. O EDTA includo no reagente para
ligar o clcio e aumenta a estabilidade da reao. A diadenosina pentafosfato e o
AMP so adicionados para inibir a adenilato quinase. A diferena de absorbncia em
340 nm proporcional atividade da CK e os valores de referncia 37C varia nos
homens 15 a 160 U/L e nas mulheres 15 a 130 U/L (LABTEST, 2004, p.4)

20

2.17. Determinao do Clcio


Aproximadamente, 99% de clcio do organismo est localizado no esqueleto.
O restante desempenha numerosas e significativas funes como a participao na
transmisso do impulso nervoso, no mecanismo da coagulao, na modulao da
ao de vrios hormnios, nas atividades de vrios sistemas enzimticos, na
contrao muscular etc (MOLINA, 2007, p. 95).
A determinao das concentraes de clcio importante para o diagnstico
de distrbios relacionados como a hipercalcemia e hipocalcemia. A hipercalcemia
causada por hiperparatireoidismo, imobilizaes de carter agudo, doenas
neoplsicas, intoxicaes por vitamina D, sarcoidose, sndrome leite-lcalis,
hipertireoidismo e insuficincia supra-renal aguda, tirotoxicose, acromegalia,
diurticos tiazdicos e fase diurtica de necrose tubular aguda.
A hipocalcemia deve ser examinada em relao a concentrao de protenas
plasmticas e pH sanguneo antes de avaliar sua importncia. O clcio total est
reduzido nos casos de hipoalbuminemia e acidoses crnicas, devido a uma
diminuio do clcio ligado a protenas. Nestes casos a frao ionizada do clcio
permanece normal.
As causas comuns de hipocalcemia verdadeira incluem a hipoavitaminose D,
hipoparatireoidismo,

pseudo-hipoparatireidismo,

hiperfosfatemia,

desordens

neoplsicas, tetania neonatal, pancreatite aguda, deficincia de magnsio, acidose


tubular

renal

excesso

de

corticoesterides

terapia

prolongada

com

anticonvulsivantes (MOLINA, 2007, p. 95).


O mtodo de espectrofotometria de absoro atmica o mtodo de escolha
por ser seguro, preciso e sensvel, no entanto, os equipamentos so pouco
acessveis aos laboratrios. O princpio da reao baseia-se na formao de um
complexo de cor prpura entre o clcio e a o-cresolftalena complexona, em meio
alcalino (pH 11,7) de tampo dietanolamina. O reagente contm 8-hidroquinolina
que reduz a interferncia de ctions, como o magnsio, a uria para diminuir a
turvao das amostras lipmidcas e aumentar a formaop do complexo metalcorante. O etanol inibe o desenolvimento de cor no branco. Aps a medida de cor, a
adio de excesso de EDTA (um quelador de clcio) corrige a hemlise. Esse
tratamento dissocia o complexo clcio-cromognio sem modificar o complexo
hemoglobina-cromognio. A absorbncia devida ao complexo hemoglobinacromognio subtrada da absorvncia total. A leitura feita em 578 nm e os

21

valores de referncias para os adultos normais est entre 8,8 a 10,2 mg/dL, j
recm-nascidos de 7 a 12 mg/dL e criana de 8,8 a 11 mg/dL (GARCIA E KANAAN,
2008, p. 71).

2.18. Determinao do Fsforo


O organismo de um adulto contm 500 a 600g de fsforo medido como
fosfato inorgnico. um nion importante tanto intra como extracelularmente. No
lquido extracelular e em pH fisiolgico, a maior parte do fsforo existe nas formas
inorgnicas monovalentes (diidrogenofosfato) e divalentes (hidrogenofosfato). Nas
clulas, predomina o fosfato orgnico, onde encontrado como componente dos
cidos nuclicos, fosfolipdios e fosfoprotenas, alm de participar do metabolismo
intermedirio. Extracelularmente, o fosfato est intimamente associado ao clcio.
Juntos formam cristais de hidroxiapatita presentes nos ossos. Ocasionalmente,
cristais de fosfato de clcio precipitam em outras reas do corpo. Nveis de clcio
anormalmente elevados muitas vezes provocam a formao de clculos nos rins ou
bexiga. (GARCIA E KANAAN, 2008, p. 71).
A determinao do fosfato importante para o diagnstico de hiperfosfatemia
e hipofosfatemia. A primeira encontrada no hipoparatireoidismo, hipervitaminose
D, fraturas sseas em consolidao, obstruo pilrica, doena de Addison,
tratamento citotxico de certas leucemias e linfomas, tumores sseos metastticos e
cetoacidade diabtica. J a hipofosfatemia est presente nas deficincias de
vitamina

D,

como

por

exemplo,

raquitismo,

osteomalcia

esteatorrea,

hiperparatireoidismo, sndrome de Fanconi, hiperinsulinismo, uso crnico de


anticidos, alcoolismo crnico, sndromes de m-absoro e, ocasionalmente,
hiperalimentao. O princpio da reao baseia-se no mtodo de Goldenber e
Fernandes do qual o soro desproteinizado com cido tricloroactico contendo on
ferroso e tiouria. Ento, o sobrenadante misturado com o cido molbdico para
formar o fosfomolibdato que reduzido pelo on ferroso produzindo o azul de
molibdnio. A leitura feita em 660 nm e os valores de referncia para adultos varia
de 2,7 a 4,5 mg/dL, recm-nascidos de 3,5 a 8,6 mg/dL e crianas de 4,5 a 5,5
mg/dL (GARCIA E KANAAN, 2008, p. 71).

2.19. Determinao de Magnsio

22

Trata-se do segundo ction mais abundante na clula. Mais da metade do


magnsio no organismo est associado ao clcio e fsforo, no esqueleto. O restante
encontrado no msculo esqueltico e cardaco, rim, fgado e lquido intersticial.
Tem importante papel como co-fator em vrios sistemas enzimticos, no
metabolismo de carboidratos, contrao muscular e coagulao. essencial,
tambm, na manuteno da estrutura macromolecular do RNA, DNA e ribossomos
(RHOADES E TANNER, 2005, p. 620).
A determinao do magnsio importante para o diagnstico de
hipomagnesemia, do qual apresenta sintomas similares ao provocados pela reduo
de clcio, tais como a irritabilidade neuromuscular severa, tetania, convulses e
alteraes eletrocardiogrficas. As concentraes de magnsio srico esto
diminudas nos seguintes casos: desordens associadas com ingesto inadequada
e/ou impedimento na m-nutrio calrica protica, desordens associadas com o
aumento das necessidades de magnsio e reposio inadequada (prolongada ou
severa perda de lquidos, lactao excessiva), distrbios relacionados com o
impedimento renal da conservao do magnsio (hipercalcemia de qualquer causa,
hiperaldosterismo, acidose diabtica, hipertiroidismo, terapia diurtica, secreo
inapropriada do hormnio antidiurtico) (MOTTA, 2009, p. 154).
A hipermagnesemia sintomtica ocorre mais frequentemente em pacientes
com insuficincia renal. Nas outras condies, as manifestaes clnicas esto, em
geral, ausentes. As causas so insuficincia renal aguda ou crnica, diabetes
mellitus no controlada, insuficincia adrenocortical, adrenalectomia, hipotiroidismo
e ingesto excessiva de magnsio. O mtodo de escolha para a determinao do
magnsio a espectrofotometria de absoro atmica. Outro mtodo a reao do
magnsio com o azul de metiltimol formando complexos coloridos medidos em 510 e
600 nm. O mtodo de Abernethy e Fowler consiste na determinao do magnsio no
plasma com a reao com calmagite contendo um detergente anfotrico chamado
Empigen BB e tamponado com 2-amino-2-metil-1-propanol a pH 11,5. A presena
do clcio e ferro minimizada pelo estrncio tamponado pelo EDTA e pela
trietanolamina, respectivamente. A leitura feita em 520 nm e os valores de
referncia para crianas, adolescentes e adultos varia de 0,7 a 1,1 mmols/L e
recm-nascidos de 0,6 a 1,0 mmols/L (MOTTA, 2009, p. 154).

2.20. Determinao de Ferro Srico

23

Segundo Motta (2009, p. 1999), adultos normais contm 3 a 5 g de ferro, dos


quais 70% esto incorporados na hemoglobina eritrocitria, 25% no sistema
retculoendotelial (fgado, bao e medula ssea), armazenado na hemossiderina e
na ferritina. A mioglobina, os citocromos e certas enzimas, constituem 4,9% do ferro
restante. A concentrao plasmtica de ferro corresponde a 0,1% do total.
A determinao do ferro srico e da capacidade total de ligao do ferro
necessria no estabelecimento do diagnstico diferencial de vrias enfermidades. A
reduo dos nveis de ferro provocada pela deficincia de ferro total no organismo,
pela perda aumentada de ferro ou ainda, pela elevao na demanda de ferro dos
estoques do corpo (por exemplo, gravidez). Teores aumentados so encontrados na
ingesto teraputica, incremento na absoro de ferro (hemocromatose e
hemossiderose),

anemia

hemoltica

(destruio

anormal

de

hemcias),

envenenamento pelo chumbo (reduo na utilizao de ferro), anemia perniciona


(defeito no armazenamento do ferro) e hepatite (reduo dos estoques de ferro no
fgado) (GARCIA E KANAAN, 2008, p. 59).
Valores elevados da capacidade total de ligao ao ferro esto associados
com as deficincias crnicas de ferro, necrose heptica e aumento na liberao da
ferritina srica. Os nveis baixos so associados cirrose, hemocromatose,
deficincia de ferritina e nefrose ou proteinria (perda de protenas pelos rins).
Para a determinao do ferro srico, amostras de soro ou plasma
heparinizado isentos de hemlise. Um mtodo utilizado para esta determinao o
de Lewis modificado do qual tem o princpio da dissociao da transferrina,
reduzindo a estado frrico e as protenas sricas precipitadas com um reagente
contendo cido clordrico, cido tiogliclico e cido tricloroactico. Ento, o on
ferroso complexado com o cromognio contendo batofenantrolina em acetato de
sdio. O complexo ferro-cromognio quantificado espectrofotometricamente em
535nm. Os valores de referncia para o ferro srico de 70 a 180 g/dL para
homens, de 60 a 180 g/dL para mulheres, de 95 a 225g/dL recm nascidos (aps
um ms de idade, os valores esto prximos aos dos adultos) (GARCIA E KANAAN,
2008, p. 59).
2.21. Determinao de Bilirrubina
A degradao do grupo hemo provm, em 80 a 85% das hemcias
envelhecidas, destrudas, aps quatro meses, no sistema reticulendotelial, e, em 15
a 20%, de hemoprotenas hepticas assim como de hemcias em maturao na

24

medula ssea. A oxidao do hemo leva sntese de biliverdina e depois da


bilirrubina. (KAMOUN et al., 2006, p. 330).
A bilirrubina transportada para o fgado, onde sofre uma conjugao com
glicuronato, tornando-a solvel. Sua eliminao feita normalmente pelas vias
biliares. No intestino, a bilirrubina sofre, por influncia das bactrias intestinais, uma
srie de transformaes que levam aos pigmentos biliares (STRYER, et al., 2008, p.
708).
O conjugado de bilirrubina pouco absorvido pela mucosa intestinal. No leo
terminal e intestino grosso, o diglicurondeo de bilirrubina hidrolizado para formar
bilirrubina livre e cido glicurnico. Esta bilirrubina livre ento reduzida pela ao
de enzimas provenientes da flora bacteriana intestinal, a tetrapirris lineares
incolores, denominados coletivamente de urobilinognios. Cerca de 20% dos
urobilinognios produzidos diariamente so absorvidos e entram na circulao
enteroheptica. A maior parte do composto reabsorvido captado pelo fgado e
reexcretado na urina. Na poro baixa do trato gastrointestinal, os urobilinognios
oxidam espontaneamente para produzir os pigmentos biliares estercobilina,
mesobilina e urobilina, pigmentos marrom alaranjados responsveis pela cor
caracterstica das fezes (GARCIA E KANAAN, 2008, p. 96).
So formados diariamente 250 a 300 mg de bilirrubina no adulto normal. A
excreo deste composto pelo fgado necessita que a bilirrubina esteja na forma
glicurondeo, solvel em gua. Conforme mencionado, quase toda a bilirrubina
formada eliminada nas fezes e uma pequena quantidade de urobilinognio
removido pela urina. Sob condies normais, somente 0,2 a 1,0 mg/dL encontrado
no plasma, a maior parte da qual, na forma no conjugada. Uma pequena
percentagem (0,2 mg/dL existe no soro normal na forma conjugada) (MOTTA, 2009,
p. 213).
A presena de hiperbilirrubinemia promove a deposio deste pigmento
amarelo na pele, nas membranas mucosas e nas esclerticas. Esta pigmentao
denominada ictercia (KAMOUN et al., 2006, p. 331).
Vrios estados fisiopatolgicos afetam uma ou mais fases envolvidas na
produo, captao, armazenamento, conjugao e excreo da bilirrubina.
Dependendo da desordem, a bilirrubina conjugada e/ou no conjugada, so
responsveis pela hiperbilirrubinemia resultantes destes distrbios, como por
exemplo, anemia hemoltica, sndrome de Gilbert, sndrome de Dubin-Johnson,

25

sndrome de Rotor e sndrome de Crigler-Najjar, entre outras (MOTTA, 2009, p.


213).
A bilirrubina foi detectada pela primeira vez em 1883 por Ehrlich, em reao
com o cido sulfanlico diazotado, em amostras de urina. Van den Bergh e Snapper
demonstraram a presena de bilirrubina no soro sanguneo pelo emprego do
diazoto-reagente de Ehrlich e lcool como acelerador. Mallov e Evelyn propuseram o
uso de metanol a 50% para evitar a precipitao das protenas. Em 1938, Jendrassik
e Grof desenvolveram um mtodo com uso de cafena-benzoato-acetato para
acelerar a reao azo acoplada. Na maioria dos laboratrios clnicos so
empregadas algumas modificaes de destes dois mtodos. O mtodo de
Jendrassik e Grof um pouco mais complexa mas apresenta algumas vantagens
sobre o de Malloy e Evelyn (MOTTA, 2000, p. 280).
A anlise da bilirrubina srica tambm realizada por tcnica de
espectrofotometria, pela diluio da amostra com uma soluo tampo. Este mtodo
direto satisfatrio na avaliao de ictercia do recm-nascido cujo soro no contm
ainda, lipocromos amarelos interferentes. A introduo da enzima bilirrubina oxidase
esto sendo amplamente utilizados. Esta enzima promove a oxidao da bilirrubina
incolor. A reao monitorada pela reduo na absorbncia.
Para a determinao da bilirrubina total, pelo mtodo de Jendrassik e Grof, o
soro misturado com uma soluo de cafena levemente cida e benzoato de sdio,
compostos que aceleram a diazotao da bilirrubina no conjugada. O cido
sulfanlico diazoto desdobra as duas formas de bilirrubina e desenvolve um azo com
os dipirris. A adio de tartarato alcalino de sdio em pH 13 converte a
azobilirrubina cuja absorbncia media a 600 nm (MOTTA, 2000, p. 281).
Para a bilirrubina conjugada, o soro misturado com o reagente diazo, em
ausncia de catalisadores, para reagir com a bilirrubina conjugada. Aps cinco
minutos, o cido ascrbico adicionado para decompor o excesso de sal diazo e
interromper a reao. O reagente tartarato alcalino produz um meio alcalino para
formar uma cor mais intensa de azobilirrubina, medida a 600 nm em presena de
cafena. Os valores de referncia de bilirrubina total em adultos vo de 0,2 a 1,1
mg/dL, a conjugada de 0 a 0,2 mg/dL. J para recm-nascidos a bilirrubina total para
0 a 24 horas 1 a 6 mg/dL, 24 a 48 horas de 6 a 8 mg/dL, de 3 a 5 dias de 4 a 6
mg/dL (MOTTA, 2000, p. 281).

26

A bilirrubina tambm pode ser determinada pelo mtodo de White, Haidar e


Reinhold. Neste a bilirrubina total no soro de recm-nascidos determinada
diretamente pela medida da absorbncia a 455 nm. Este teste no pode ser
realizado com soro de adultos que contm carotenos e outros pigmentos e, por
conseguinte, aumentam a absorbncia neste comprimento de onda. Estes
pigmentos no esto presentes no soro dos recm-nascidos, mas a hemlise produz
falsas elevaes na concentrao da bilirrubina devido a absoro de parte da luz
em 455 nm pela oxiemoglobonia. A concentrao da hemoglobina corrigida por
uma segunda leitura a 575 nm (MOTTA, 2000, p. 281).

CONCLUSO
A espectrofotometria considerada qualquer procedimento que utiliza a luz
para medir a concentrao qumica de qualquer espcie. Trata-se de mtodo de
anlise ptico mais usado nas investigaes biolgicas e fsico-qumicas.
Esta tcnica tornou-se fundamental para a determinao de diagnsticos
laboratoriais. Neste contexto, inmeras doenas puderam ser diagnosticadas pelo
uso de tcnicas colorimtricas especficas, possibilitando tambm compreender
melhor

fisiopatologia

dessas

enfermidades.

rotina

laboratorial

de

espectrofotometria possibilitou o desenvolvimento e o aprimoramento de mtodos de


determinao de biomolculas, o que levou as indstrias qumicas e farmacuticas
elaborao de kits comerciais variados de boa especificidade e sensibilidade.
A escolha dos mtodos de anlises deve ser feita de acordo com o material
biolgico

analisado, bem como,

estabilidade

de

molculas que

sero

quantificadas. Adicionalmente, deve-se levar em considerao tambm se o mtodo


exigem equipamentos mais sofisticados ou reagentes de alto custo.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS:

CERRI, G.G., JATENE, F.B.; NOBRE, M.R.; CUCE, BERNARDO, W.M. Introduo.
Projeto Diretrizes. Associao Mdica Brasileira e Conselho Federal de Medicina.
Disponvel

em

<http://www.projetodiretrizes.org.br/projeto_diretrizes/texto_introdutorio.pdf> Acesso
em 20 de abril de 2011.

27

CHAMPE, P.C.; HARVEY, R.A.; FERRIER, D.R. Bioqumica Ilustrada. 3 edio.


Porto Alegre: ArtMed, 2006.
CISTERNAS, J.R.; VARGAS, J.; MONTE, O. Fundamentos de Bioqumica
Experimental. So Paulo: Editora Atheneu, 2005.

GARCIA, M.A.T.; KANAAN, S. Bioqumica Clnica. So Paulo: Editora Atheneu,


Universidade Federal Fluminense, 2008.

GORDON, D.B. Spectroscopic Techniques. in Principles and Tecnhiques in


Pratical Biochemistry. K. Cambridge: Cambridge University Press, 1996.
HIRANO, Z.M.B.; SILVA FILHO, H.H.; MULLER, G.C.K.; SCHMIDT, S.R.
Bioqumica manual prtico. Blumenau: EDIFURB, 2001.
LABTEST Diagnstica. Creatinina instrues de uso. Minas Gerais, 2004.
LABTEST Diagnstica. Uria CE instrues de uso. Minas Gerais, 1999.

MARZZOCO, A.; TORRES, B.B. Bioqumica Bsica. 2 edio. Rio de Janeiro:


Guanabara Koogan, 1999.

MILLER, O. Laboratrio para o Clnico. 7 edio. So Paulo: Atheneu, 1991.

MOLINA, P.E. Fisiologia Endcrina. 2 edio. So Paulo: McGraw Hill, 2007.


MOTTA, V.T. Bioqumica Clnica mtodos e interpretaes. 2 edio. Rio de
Janeiro: Editora Mdica Missau, 2000.
MOTTA, V.T. Bioqumica Clnica para Laboratrio princpios e interpretaes.
5 edio. Rio de Janeiro: MedBook, 2009.
NEPOMUCENO, M.F.; RUGGIERO, A.C. Manual de Bioqumica roteiros de
anlises bioqumicas quantitativas e qualitativas. Ribeiro Preto: Tecmedd,
2004.

28

PETKOWICZ, C.L. Bioqumica: aulas prticas. 7 edio. Curitiba: Editora UFPR,


2007.
REMIO, J.O.R.; SIQUEIRA, A.J.S.; AZEVEDO, A.M.P. Bioqumica guia de
aulas prticas. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2003.

RHOADES, R.A.; TANNER, G.A. Fisiologia Mdica. 2 edio. Rio de Janeiro:


Guanabara Koogan, 2005.
SALAWAY, J.G. Metabolismo passo a passo. 3 edio. So Paulo: Artmed,
2009.

SOCIEDADE BRASILEIRA DE ENDOCRINOLOGIA E METABOLOGIA. Diabetes


Mellitus: classificao e diagnstico. Projeto Diretrizes. Associao Mdica
Brasileira

Conselho

Federal

de

Medicina.

Disponvel

em:

<http://www.projetodiretrizes.org.br/4_volume/06-Diabetes-c.pdf> Acesso em 20 de
abril de 2011.

STRYER, L., BERG, J.M.; TYMOCZKO, J.L. Bioqumica. 6 edio. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2008.