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nlisis microbiolgico en la
industria agroalimentaria.
Ponente: Jos Luis Parra Montoya
Responsable Tcnico del Departamento de Microbiologa y Fitopatologa de Laboratorios Fitosoil

Ponencia incluida en el Curso: Determinacin de parmetros de inters microbiolgico y fisico-qumico

en la industria agroalimentaria. Consideraciones medioambientales (5,6,7,8,12,13,14 y 15 de mayo de
2014)

Cdigo: FC14064MT0001

CENTRO INTEGRADO DE FORMACIN Y EXPERIENCIAS AGRARIAS

(C.I.F.E.A.) DE MOLINA DE SEGURA

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

Introducin.
El temario especfico de microbiologa gira en torno a tres pilares bsicos:
-

La legislacin y necesidades de autocontrol que determinan los parmetros a analizar, su

frecuencia, tipo de muestreo en la industria alimentaria.
La respuesta tradicional a estas necesidades por parte de la microbiologa, a travs de una
explicacin justificada de los mtodos tradicionales.
La modificacin de estos mtodos tradicionales a tcnicas ms rpidas, fundamentalmente por
la incorporacin de medios cromognicos y tcnicas moleculares, como la PCR.

Adicionalmente, a los laboratorios actuales se les exige que trabajen dentro de esquemas de
normalizacin. Por ello, los aspectos tratados en el curso se ligarn directamente con las normas
internacionales ms importantes para el desarrollo de la actividad analtica en microbiologa.
De modo general, los conceptos se han expuesto de un modo eminentemente prctico, orientado a las
situaciones reales ms frecuentes en laboratorio.

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ndice.
1. Tipos de microorganismos controlados por legislacin .......................................................................... 4
1.1. Organismos mencionados en la legislacin. ..................................................................................... 4
1.2. Legislacin en la industria alimentaria. ............................................................................................ 5
2. Tcnicas bsicas en microbiologa clsica. .............................................................................................. 7
2.1. Descubriendo las bacterias. ............................................................................................................. 7
2.2. Medios de cultivo. ............................................................................................................................ 7
2.3. Flujo de trabajo en el laboratorio de microbiologa. ........................................................................ 9
2.4. Mtodos normalizados y alternativos. ........................................................................................... 12
2.5. Tipos de tcnicas en microbiologa tradicional. ............................................................................. 13
2.6. Algunas tcnicas normalizadas. ..................................................................................................... 15
3. Microbiologa rpida. ............................................................................................................................ 16
3.1. Mejora del flujo de trabajo. ........................................................................................................... 16
3.2. Galeras de identificacin. .............................................................................................................. 17
3.3. Nmero ms probable miniaturizado. ........................................................................................... 18
3.4. Medios cromognicos. ................................................................................................................... 18
4. Tcnicas moleculares. ........................................................................................................................... 20
4.1. ELISA. ............................................................................................................................................. 20
4.2. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). .................................................................................. 21
5. Matrices con inters analtico en la industria agroalimentaria. ............................................................ 25
6. Muestreo segn legislacin .................................................................................................................. 26
7. Ejemplos de informes de laboratorio de matrices de inters ............................................................... 29
8. Visita a las instalacionesde Fitosoil. ...................................................................................................... 30

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1. Tipos de microorganismos controlados por legislacin

1.1. Organismos mencionados en la legislacin.
Los organismos mencionados en legislacin pertenecen a una de las siguientes categoras:
-

Virus.
Bacterias.
Hongos.
Helmintos.

De los cuatro grupos mencionados, las bacterias ocupan un lugar preponderante.

Si nos atenemos nicamente a sus efectos sobre la salud, los organismos mencionados pueden dividirse
en 2 grandes grupos:
-

Organismos indicadores.
Organismos patgenos.

Los organismos patgenos causan enfermedad por s mismos. Por ello, no se tolera su presencia
(ausencia en la matriz -alimento, agua...- analizada).
Respecto a los organismos indicadores, no causan enfermedad por s mismos, pero si se encuentran
presentes indican una matriz contaminada y, por tanto, un riesgo potencial. En ciertas matrices pueden
indicar contaminacin mientras que en otras pueden ser de origen ambiental. La legislacin suele
marcar lmites numricos (recuentos) para ellos, del tipo <100 bacterias por gramo de producto.
Pero, por qu se analizan unos microorganismos y no otros? Los organismos analizados en el
laboratorio renen las siguientes caractersticas:

Importancia sanitaria

Presencia de
legislacin

Autocontrol
Sistemas de
calidad
definidos
interna o
externamente

Lmites
microbiolgicos
posibles
Presencia de
puntos crticos

Disponibilidad de la tcnica
Coste relativamente bajo
Diana factible

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Dnde se analiza la presencia de microorganismos?

-

En aquellas matrices que se ingieren, y sirven de va de transmisin de microorganismos:

alimentos.
En aquellas matrices que entran en contacto con los alimentos y pueden contaminarlos: agua,
fertilizantes de origen orgnico, sustratos, superficies y ambiente.
Adicionalmente, se realizan controles por razones de salud pblica (sistemas de refrigeracin).

1.2. Legislacin en la industria alimentaria.

De dnde vienen los microorganismos presentes en el agua, los alimentos?
Obviamente, muchos estn presentes de modo natural (son ambientales). Otros sin embargo, son
extraos en esa matriz (son contaminantes), la mayora de las veces por contaminacin fecal
(transmisin fecal-oral de enfermedades).
De un modo u otro, algunos de ellos pueden ocasionar enfermedad en humanos si se ingieren
directamente en el agua o los alimentos (infecciones). Algunos pueden producir enfermedades aunque
ya hayan desaparecido, pues producen toxinas que permanecen tras su muerte (causan
toxicoinfecciones).
Qu microorganismos se buscan?
La idea ms obvia es que se deberan buscar (analizar) solo los microorganismos que son peligrosos, es
decir, que causan enfermedades (patgenos).
Sin embargo, su distribucin en una matriz es heterognea, su nmero suele ser bajo Se requerira
analizar una gran cantidad de muestras para poder determinar su presencia en un alimento
contaminado.
Para solventar este problema, se usan microorganismos indicadores, organismos que no causan
enfermedad por s mismos, pero que proporcionan informacin porque:
-

Tienen un origen comn al de los patgenos asociados y/o necesitan las mismas condiciones
(humedad, temperatura) para su supervivencia o proliferacin.
Al contrario que los patgenos, su nmero es elevado ( son ms fciles de detectar).

La legislacin ms importante a nivel agroalimentario es la que sigue:

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Matriz

Legislacin / Comentarios

Fertilizantes

Real Decreto 506/2013, de 28 de junio, sobre productos

fertilizantes, y sus modificaciones

Sustratos de cultivo

Real Decreto 865/2010, de 2 de julio, sobre sustratos de cultivo y

sus modificaciones

Agua de riego

Real Decreto 1620/2007, de 7 de diciembre, por el que se

establece el rgimen jurdico de la reutilizacin de las aguas
depuradas.

Agua de proceso (agua

que entre en contacto
directo con los
alimentos)

Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el que se establecen

los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo humano.

Alimentos (materia
prima y producto
terminado)

Reglamento (CE) n 2073/2005 de la Comisin de 15 de noviembre

de 2005 relativo a los criterios microbiolgicos aplicables a los
productos alimenticios, y sus modificaciones

Superficies de trabajo

No legislado. Control recogido en sistemas de calidad

Ambiente
(contaminacin
ambiental)

No legislado. Control recogido en sistemas de calidad

A lo largo de toda la legislacin pueden observarse una serie de pautas comunes:

-

Los microorganismos mencionados son mayoritariamente indicadores de contaminacin fecal.

Mencin aparte merece Listeria monocytogenes, patgeno de origen ambiental al que la ltima
legislacin europea (Reglamento 2073 y modificaciones) ha revestido de gran importancia.
En los organismos indicadores, se fija un lmite numrico (su anlisis en laboratorio implica
procedimientos de recuento), mientras que en aquellos microorganismos patgenos se fija
ausencia en una cantidad de muestra concreta (procedimientos de investigacin).

Estas pautas generales se ven matizadas por los siguientes aspectos.

-

Las limitaciones de los mtodos de laboratorio (como en el caso de Bacillus cereus).

Las caractersticas intrnsecas de una matriz, como la poblacin a la que va destinada (como los
diferentes lmites establecidos para L. monocytogenes en alimentos infantiles), o si es un agua
de consumo o destinada a riego.

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El contexto en el que se interpreta un microorganismo indicador, pudiendo ser indicador de

contaminacin fecal o estar presente de forma natural (como las Enterobacterias en las
hortalizas).

2. Tcnicas bsicas en microbiologa clsica.

2.1. Descubriendo las bacterias.
A pesar de que las bacterias como organismos presentes en la naturaleza fueron descubiertas a
mediados del siglo XVII, su importancia para la vida (responsables de procesos industriales de
inters fermentacin de vino, cerveza, vinagre- causas de enfermedades), no fue puesta de
manifiesto hasta el siglo XIX.
Esto idea debe sealar la importancia del paradigma de la poca en la interpretacin de las
observaciones y, desde un punto de vista de inters para el curso, la indisoluble unin entre la
tcnica de deteccin de un microorganismo y su definicin (bacteria como elemento que crece
sobre medios de cultivo, que emplea azcares virus como reaccin positiva ELISA, PCR).
Desde esta perspectiva, los elementos ms importantes en la deteccin de un microorganismo en el
laboratorio son:

Medio de
cultivo

Tiempo de
incubacin

Temperatura
de
incubacin

2.2. Medios de cultivo.

Los medios de cultivo son parte fundamental en el trabajo de laboratorio. Por ello, existen normas
especficas que fijan tanto su preparacin como su control de calidad:
-

UNE-CEN ISO/TS 11133-1:2009. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para
el aseguramiento de la calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio.
UNE-CEN ISO/TS 11133-2:2006. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 2: Gua prctica para las
pruebas de rendimiento de medios de cultivo

Los controles suelen consistir en:

- Control fsico: aspecto antes y despus de su preparacin y pH del medio preparado.
- Control de esterilidad.
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- Crecimiento de la cepa diana (productividad).

Y en medios selectivos y diferenciales:
- Inhibicin de microorganismos no diana (selectividad).
- Diferenciacin (aspecto de colonias diferentes) de microorganismos capaces de crecer en el
medio pero diferentes a la diana (especificidad).
La norma UNE-CEN ISO/TS 11133-2:2006 establece qu microorganismos concretos deben ser
empleados y a qu concentracin para cada prueba. Las colecciones de cultivo son la fuente directa
de microorganismos. Por ejemplo, la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT: www.cect.org/).
Los controles segn las ISO mencionadas se clasifican del siguiente modo:

Cuantitativos
Se evala de modo numrico la respuesta de un medio al crecimiento de una o varias cepas (por
ejemplo, nmero de colonias que aparecen sobre l respecto al valor de referencia asignado a la cepa
inoculada)

Semicuantitivos
Evaluacin del crecimiento (o de su inhibicin) en un medio dado para una determinada cepa o cepas
a partir de una escala de valor cualitativa predeterminada (por ejemplo para un caldo de cultivo, turbidez nula, media o elevada-, o numrica pero no referenciada a ufc).

Cualitativos
Evaluacin del crecimiento o alguna propiedad asociada a l de una o varias cepas sobre un medio
respecto a un valor esperado (morfologa de las colonias, expresin de determinada caracterstica
bioqumica, presencia de gas o turbidez)

Y los parmetros a evaluar:

Productividad
Cantidad de un microorganismo que crece sobre un medio respecto al valor de referencia o a un valor
esperado

Selectividad
Capacidad de un medio para inhibir el crecimiento de un microorganismo no diana

Especificidad
Capacidad de un medio para discernir entre el crecimiento del microorganismo diana y otros

Esterilidad
Ausencia de Crecimiento Microbiano (ACM) tras determinadas condiciones de incubacin (tiempo,
temperatura definidos)

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2.3. Flujo de trabajo en el laboratorio de microbiologa.

El trabajo en laboratorio implica una serie de atapas, de cuyo diseo depende la eficiencia de su
ejecucin:

Muestreo

Recepcin y
conservacin

Anlisis

Emisin de
resultados

Envase apropiado
Condiciones de transporte

Asignacin de n de laboratorio
Conservacin adecuada (ej. 4-8 C)

Anlisis de muestras
Controles de calidad asociados a los ensayos

Control de resultados
Emisin y comunicacin de informe
Gestin de residuos

Todas las etapas deben disearse teniendo en cuenta tanto la legislacin vigente como las normas
a las que sta con frecuencia hacen referencia.
El muestreo, aunque no se considera estrictamente una actividad intralaboratorio, es una de las
etapas que ms incertidumbre aporta al proceso de medida y, por ello, la legislacin suele hacer
referencia a que se realice de acuerdo a normas internacionales, como normas ISO (www.iso.org).
As por ejemplo para alimentos:
-

Norma EN-UNE ISO/IEC 6887-1: Microbiologa de los alimentos para consumo humano y
animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales
para examen microbiolgico. Parte 1: Reglas generales para la preparacin de la suspensin
inicial y las diluciones decimales.
Norma EN-UNE ISO/IEC 6887-1: Microbiologa de los alimentos para consumo humano y
animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales
para examen microbiolgico. Parte 2: Reglas especficas para la preparacin de carnes y
productos crnicos.
Norma EN-UNE ISO/IEC 6887-1: Microbiologa de los alimentos para consumo humano y
animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales
para examen microbiolgico. Parte 3: Reglas especficas para la preparacin de pescados y
productos de la pesca.
Norma EN-UNE ISO/IEC 6887-1: Microbiologa de los alimentos para consumo humano y
animal. Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales
para examen microbiolgico. Parte 4: Reglas especficas para la preparacin de productos

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distintos a la leche y productos lcteos, carne y productos crnicos y pescados y productos

de la pesca.
Norma UNE-EN ISO 8261:2002. Leche y productos lcteos. Directrices generales para la
preparacin de muestras para anlisis, suspensiones iniciales y diluciones decimales para el
anlisis microbiolgico.

Y en el caso de aguas:
-

ISO 5667-1:2006. Water quality -- Sampling -- Part 1: Guidance on the design of sampling
programmes and sampling techniques.
ISO 5667-4:1987. Water quality -- Sampling -- Part 4: Guidance on sampling from lakes,
natural and man-made.
ISO 5667-9:1992. Water quality -- Sampling -- Part 9: Guidance on sampling from marine
waters.
ISO 5667-10:1992. Water quality -- Sampling -- Part 10: Guidance on sampling of waste
waters.
ISO 5667-5:2006. Water quality -- Sampling -- Part 5: Guidance on sampling of drinking
water from treatment works and piped distribution systems.

Una vez dentro del laboratorio, el flujo de trabajo habitual para muestras habituales es:

Pesada de muestras y preparacin de

medios

Granatarios y cuchillos, pinzas bolsas de homogeneizacin

Autoclaves y agitadores magnticos con calefaccin para
preparacin de medios

Ph-metros

Confirmaciones,
resiembras

Siembra de diluciones madre y

muestras lquidas

Material volumtrico y micropipetas

Placas Petri vacas, medios de cultivo, frigorficos
Homogeneizadores y diluidores automticos (gravimtricos
para muestra inicial)

Incubacin de las placas

Recuento y lectura de placas, tubos

incubados

Estufas
Baos termostatizados

Contadores de colonias
Otros (cmaras oscuras)

Los puestos administrativos deberan quedar separados de las zonas de trabajo. Sobre esta
organizacin se solapan todas las actividades anexas de control de calidad, tanto aquellos
controles transversales:
-

Registro de actividades (operador, equipos y reactivos empleados, fecha de realizacin).

Control de medios de cultivo.
Control del material volumtrico (medicin del volumen y esterilidad).
Control de filtros (capacidad de retencin).
Control de incubacin: tiempo y temperatura.

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Control de condiciones ambientales: contaminacin y t ambiental.

Control de cepas empleadas en los controles (cultivos puros, viables y con caractersticas
fenotpicas de inters correctas).
Control de equipos anexos: granatarios (pesada), frigorficos (t)
Control de material anexos: envases (esterilidad), filtros (capacidad de retencin y
esterilidad)

Como aquellos realizados sobre el propio ensayo:

-

Blancos (control de esterilidad)

Muestras fortificadas (adicin de cepas) a concentracin conocida (recuperacin).
Anlisis de muestras por duplicado por el mismo operador (repetibilidad) o por diferentes
operadores (reproducibilidad)

De modo anlogo, en el caso de realizar ensayos mediante el uso de PCR reaccin en cadena de
polimerasa- el flujo de trabajo ha de estar definido (UNE-EN ISO 22174:2005. Microbiologa de los
alimentos para consumo humano y animal. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la
deteccin de patgenos en los alimentos. Requisitos generales y definiciones):

Extraccin de ADN

Preparacin de la mezcla
maestra (master mix)

Adicin de ADN a la
mezcla maestra

Amplificacin

Balanzas
Centrfugas
Micropipetas
Termobloques

Micropipetas
Frigorficos y congeladores
Material fungible PCR: Tubos, tiras y placas

Micropipetas

Termociclador
Tiempo real: Lectura directa en el aparato o en
ordenador; Punto final: cubetas de
electroforesis, transiluminador

Y, como en el caso anterior, se definen una serie de controles:

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Control
negativo
del
proceso

Control
positivo
del
proceso

Control
negativo de
la extraccin

Control de la
amplificacin
externo / interno

Control
positivo
de PCR

Control
negativo
de PCR

Tratamiento de
la muestra

Extraccin del
cido nucleco

Amplificacin

Deteccin

12

Etapas del proceso cubiertas por el control

2.4. Mtodos normalizados y alternativos.

Desde que el objetivo de un ensayo en laboratorio es obtener un resultado comprensible y
reproducible, el uso de mtodos normalizados o de alternativas validadas frente a estos parece la
va natural de trabajo.
La Entidad Nacional de Acreditacin y Certificacin, ENAC (www.enac.es) establece en su Nota
Tcnica 32 (Nota Tcnica ENAC 32 (NT-32). Anlisis microbiolgicos. Documento aclaratorio sobre
la validacin de mtodos) una clasificacin de los mtodos basndose en su proximidad o relacin
con normas reconocidas:

Tipo I: Mtodos
normalizados (publicados
como norma)

Tipo II: Mtodos

alternativos, validados en
comparacin con los
anteriores

Tipo III: Mtodos

basados en normas,
basados claramente en
mtodos normalizados,
con variaciones menores

Tipo IV: Mtodos

desarrollados
ntegramente por el
laboratorio o por un
fabricante

El uso de un tipo u otro de mtodos presenta ventajas e inconvenientes, ponderables solo en la

aplicacin concreta de un laboratorio (nmero de muestras, matrices a ensayar, equipamiento
disponible e incluso precio de mercado de la determinacin en cuestin).

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En cualquier caso, los mtodos alternativos han de ser ensayados frente a los de referencia,
generalmente siguiendo directrices preestablecidas, por ejemplo:
-

UNE-EN ISO 16140:2003. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
Protocolo de validacin de mtodos alternativos (ISO 16140:2003).
ISO/TR 13843:2000. Water quality -- Guidance on validation of microbiological methods.
ISO 17994:2014. Water quality -- Requirements for the comparison of the relative recovery.

2.5. Tipos de tcnicas en microbiologa tradicional.

Los procedimientos en microbiologa pueden clasificarse del siguiente modo:
Objetivo del
procedimiento

Investigacin
(presencia / ausencia
en la muestra)

Recuento (propgulos
por muestra)

En medio slido:
Unidades formadoras
de colonias (ufc)

En medio lquido:
Nmero ms probable
(nmp)

Desde el punto de vista normativo, las siguientes normas recogen los aspectos esenciales en
alimentos y en aguas:
-

Norma UNE-EN ISO 8199:2008. Calidad del agua. Orientaciones generales para el recuento
de microorganismos en cultivo.
Norma UNE-EN ISO 7218:2008. Microbiologa de los alimentos para consumo humano y
alimentacin animal. Requisitos generales y gua para el examen microbiolgico.

De modo resumido, los mtodos para recuento sobre medios slidos son:
-

Reparto en placa.
Incorporacin en placa.
Filtracin en membrana.

Mientras que en medio lquido se refieren a recuentos mediante el uso de nmero ms probable.
En el caso de recuento sobre medios slidos, gran parte de las normas mencionadas se centran en
los aspectos relativos a la expresin del resultado. As, se fijan los siguientes rangos de contaje:
Recuento sobre agares genricos
Tcnica
Rango de contaje (ufc/placa)
Tcnica de siembra en masa
10-300
Tcnica de siembra en extensin
10-150
Tcnica de filtracin en membrana
10-100

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Recuento sobre agares diferenciales

Tcnica
Rango de contaje
N mximo de tpicas +
(ufc/placa)
atpicas por placa (ufc/placa)
Tcnica de siembra en masa
10-150
300
Tcnica de siembra en extensin
10-150
200
Tcnica de filtracin en membrana
10-100
200

El clculo del resultado para el caso general es una media ponderada donde los valores
provenientes de las placas de menor dilucin tienen ms peso:

CS

Z
PS
Ptot

CS = Nmero estimado de ufc en el peso o volumen de referencia de la

muestra PS (es decir, ufc en el peso o volumen en el que se expresan las
unidades: ufc en 1 gramo, en 1 ml en alimentos lquidos.)
Z = Suma de todas las colonias contadas sobre las placas derivadas de las
diluciones d1, d2, , di
Ps = Peso o volumen de referencia seleccionado para expresar la
concentracin de microorganismos en la muestra.
Ptot = Peso o volumen total calculado de la muestra de origen inoculado
en las placas enumeradas

Ptot se obtiene a su vez de la siguiente ecuacin:

Ptot n1V1d1 n2V2 d 2 ... niVi d i

Ptot = Peso o volumen total calculado de la

muestra de origen inoculado en las placas
enumeradas
n1, n2, , ni = Nmero de placas contadas para
las diluciones d1, d2, , di
V1, V2, , Vi = Volumen de ensayo utilizado en
las diluciones d1, d2, , di
d1, d2, , di = Dilucin utilizada para el volumen
de ensayo V1, V2, , Vi (d = 0,1 para la
suspensin inicial, d = 0,01 para la siguiente
dilucin decimal)

Como se ha mencionado, las normas ISO establecen gran cantidad de casos y excepciones. Por su
frecuencia e implicacin a la hora de establecer el cumplimiento o no de un valor legislado, merece
la pena mencionar la expresin del resultado para recuentos donde el nmero total de colonias
contadas es menor de 10:

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14

Nmero de ufc entre

todas las placas
analizadas

Expresin del resultado

Explicacin

1-3

Hay microorganismos presentes, pero a

La precisin del anlisis es tan

baja que se considera una simple
deteccin del microorganismo
(presencia/ausencia)

P
4 s
V1d1
un nivel inferior a
ufc en el
peso (g) o volumen (ml) analizado
4-9

10 o mayor

El resultado se calcula como en el caso

general, pero se indica que es un
nmero estimado

La incertidumbre disminuye lo
suficiente como para dar un valor
numrico, pero an es alta

Clculo como en el caso general

Incertidumbre aceptable

Respecto al nmero ms probable (NMP), el clculo del resultado se basa en la distribucin

estadstica que modela el modo en el que los organismos se distribuyen en una suspensin y en sus
diluciones (distribucin de Poisson).
Existen varias aproximaciones matemticas para, a partir de la combinacin de tubos obtenida,
calcular el nmp, pero, de modo prctico, los laboratorios trabajan con tablas o programas
informticos que les permiten obtener un valor central y el intervalo de confianza. Las normas ISO
7218 y 8199 recogen tablas aceptadas.
Por ltimo, pueden mencionarse dada la importancia de los controles de superficie y ambientales
en el control de los procesos de fabricacin las siguientes tcnicas:
-

Muestreo de superficies mediante hisopos y placas de contacto.

Muestreo de ambiente mediante sedimentacin y muestreadores de impactacin.

2.6. Algunas tcnicas normalizadas.

Como tcnicas para el anlisis rutinario como las expuestas en el apartado anterior, pueden
mencionarse en alimentos:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

15

Norma

Ttulo

UNE-EN ISO 68881/A1:2004

Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. Mtodo

horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa-positivos
(Staphylococcus aureus y otras especies). Parte 1: Tcnica que utiliza el
medio agar de Baird-Parker. Modificacin 1: Incorporacin de los datos de
precisin.(ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003)
Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the
enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli -- Part 2: Colonycount technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-Dglucuronide
Microbiologa de los alimentos para consumo humano y para animales.
Mtodo horizontal para la deteccin y el recuento de Listeria
monocytogenes. Parte 1: Mtodo de deteccin. (ISO 11290-1:1996).
Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal.
Mtodo horizontal para la deteccin de Salmonela spp. (ISO 6579:2002

ISO 16649-2:2001

UNE-EN ISO 112901:1997

UNE-EN ISO 6579:2003

Y en aguas:
Norma

Ttulo

UNE-EN ISO 93081:2001

UNE-EN ISO 78992:2001
UNE-EN ISO 6222:1999

Calidad del agua. Deteccin y recuento de Escherichia coli y de bacterias

coliformes. Parte 1: Mtodo de filtracin en membrana. (ISO 9308-1:2000)
Calidad del agua. Deteccin y recuento de enterococos intestinales. Parte 2:
Mtodo de filtracin de membrana. (ISO 7899-2:2000)
Calidad del agua. Enumeracin de microorganismos cultivables. Recuento de
colonias por siembre en medio de cultivo de agar nutritivo. (ISO 6222:1999)

3. Microbiologa rpida.
3.1. Mejora del flujo de trabajo.
Tal y como se adelant en el apartado 2.4. Mtodos normalizados y alternativos, el empleo de
normas ISO, standard methods, mtodos AOAC.. no es la nica opcin posible.
Los laboratorios emplean a menudo mtodos alternativos completos o automatizaciones a lo largo
del flujo de trabajo que les permiten disminuir costes, acortar plazos de entrega de resultados y/o
procesar mayor nmero de muestras.
Los cuellos de botella ms habituales son:

Preparacin
de la muestra

Siembra

Incubacin

Lectura de las
placas

Pesada y dilucin madre

Homogeneizacin difcil

Necesidad de gran cantidad de diluciones

Elevado consumo de tiempo
Necesidad de gran cantidad de estufas, baos para cubrir un amplio rango de t
Tiempos de anlisis largos (por ejemplo L. monocytogenes segn ISO, 5 das para un negativo, L.
pneumophila, 10 das, mohos y levaduras, 5 das)
Medios de cultivo de difcil interpretacin
Necesidad de confirmaciones con gran n de pruebas

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

16

Ante esta problemtica, diferentes enfoques han sido empleados:

Mejora del flujo de

trabajo
Diluidores
automticos
Bombas de
dispensacin
Contadores
automticos de
colonias

Introduccin de medios
de cultivo
cromognicos
Sobre mtodos
existentes (sustitucin
de medios)
En nuevos mtodos

Automatizacin de las
identificaciones

Automatizacin de
mtodos clsicos

Galeras de
identificacin (API,
BBL Crystal, Microgen
ID)
Identificacin de perfil
de cidos grasos de
membrana
Patrones de empleo
de sustratos
(BIOLOG)

Siembra por
agotamiento:
Sembradores en
espiral
Nmero ms probable
miniaturizado
(TEMPO, COLILERT)

Empleo de nuevas
tcnicas
Impedancia
Tcnicas basadas en
inmunologa (ELISA,
VIDAS)
Deteccin de ADN
(PCR a punto final y a
tiempo real,
inmunoblotting, DNA
chips, digital PCR,
viable PCR)

De todas las soluciones planteadas, dos destacan sobre las dems: el uso de medios cromognicos
y la PCR. Ambos adems estn siendo incorporados en las normas internacionales (AFNOR, ISO)
por lo que estn dejando en muchos casos de ser mtodos alternativos para convertirse en los
mtodos de referencia.
Adems de eso, los laboratorio dedican gran parte de sus esfuerzos a la mejora del flujo de trabajo,
de modo que sean capaces de procesar un mayor nmero de muestras en menor plazo y espacio.
Para ello, existen en el mercado gran cantidad de aparatos. Podemos destacar:
-

Diluidores automticos.
Bombas de dispensacin.
Sembradores en espiral.
Contadores automticos.

3.2. Galeras de identificacin.

Las galeras de identificacin son usadas con gran frecuencia en la prctica como sustitutas de
varias pruebas bioqumicas descritas en las ISO para la confirmacin de organismos comunes como
Salmonella spp, Listeria monocytogenes o Shigella.
Como ejemplos de este tipo de productos:
-

Galerias API (el standard gold).

Galerias BBL: Crystal BBL y BBL Enterotube .
Microgen ID .

Por lo general, son tarjetas con pocillos que contienen, en cada uno de ellos, una prueba
bioqumica en miniatura (miniaturizada).
Tras inocular los pocillos con una suspensin del microorganismo problema e incubar la tarjeta, la
tarjeta se lee comparando el aspecto de cada pocillo con el resultado prefijado.
La combinacin de pocillos positivos y negativos da un cdigo numrico. Este cdigo es buscado
(manualmente, en libros que contienen las combinaciones definidas para cada organismo tipo,
mediante software especfico..), obtenindose la identificacin del organismo.
J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
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17

Para establecer la correspondencia entre un perfil bioqumico concreto y un microorganismo, los

datos obtenidos en aislados conocidos son tratados mediante un sistema de clster (agrupacin por
homologa). El proceso es complejo, existiendo diferentes aproximaciones matemticas.
El diseo de las pruebas que contienen vara de unos fabricantes a otros pero, en general, las
pruebas son de 2 tipos:
-

Pruebas bioqumicas (indol, Voges-Proskauer, reduccin de nitratos a nitritos).

Pruebas de utilizacin de sustratos (mayoritariamente azcares).

3.3. Nmero ms probable miniaturizado.

Otra de las miniaturizaciones presentes en el anlisis microbiolgico, aunque obviamente no tan
frecuente como las galeras de identificacin bioqumica, es la adaptacin de los mtodos
tradiciones de nmero ms probable.
Aunque de base estadstica slida, el nmero ms probable implica una gran cantidad de mano de
obra (diseos de 3 tubos dilucin por ejemplo se consideran meramente informativos de la dilucin
en la que se encuentra la muestra). No obstante, si se emplea un gran nmero de tubos o pruebas
por dilucin, la precisin del mtodo aumenta enormemente.
Esto, aunado a que al trabajarse con suspensiones lquidas en vez de medios slidos es posible el
llenado de tarjetas de modo bastante rpido, si no automtico, ha dado lugar a diversos sistemas
comerciales de automatizacin del recuento de microorganismos basado en nmero ms probable.
Como ejemplos de estos sistemas:
-

En alimentos, el sistema TEMPO , de Biomerieux.

En aguas, el sistema COLILERT de Iddex.

3.4. Medios cromognicos.

Los medios cromognicos han ido asentndose como una alternativa fiable a los medios de cultivo
tradicionales. Algunos han sido incorporados a normas de referencia como es el caso de:
-

Medio ALOA, incorporado en la ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004. Modification of the

isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data.
.

Muchos de ellos han sido empleados as mismos por los fabricantes para la validacin de mtodos
alternativos. Por ejemplo:
-

Medio RapidStaph para le enumeracin de estafilococos (Biorad)

Medio cromognico para la deteccin de coliformes (ACC), recogido en la Orden
SCO/778/2009, de 17 de marzo, sobre mtodos alternativos para el anlisis microbiolgico
del agua de consumo humano.

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R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

18

19

Tomado de BIORAD (http://www.bio-rad.com)

Por lo general, las ventajas de medios cromognicos son:

identificacin ms
fcil del organismo
diana

Ausencia o menor
nmero de
confirmaciones
necesarias

Reduccin de
tiempos de
incubacin

Identificacin de
varios organismos al
tiempo (por ejemplo
coliformes y E. coli)

Como puede colegirse, algunas de estas ventajas se encuentran relacionadas (una mayor facilidad
de identificacin de colonias diana implica un menor nmero de confirmaciones, aun cuando stas
sigan requirindose).

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4. Tcnicas moleculares.
4.1. ELISA.
Aunque los mtodos de inmunoensayo de ms amplia difusin, los ELISA, no tienen actualmente el
mismo predicamento ni proyeccin que la PCR, hay tres motivos por los que merece la pena
dedicar un espacio a estas tcnicas:

Importancia histrica
Hasta la difusin de la PCR, muchos laboratorio optaron por las tcnicas de ELISA para procesar
gran cantidad de muestras

Presencia en los laboratorio actuales

Muchos laboratorio siguen empleando tcnicas ELISA para diversos analitos.
Una tcnica automatizada derivada del uso de la reaccin antgeno-anticuerpo sigue siendo
empleada en algunos laboratorios (VIDAS , de Biomerieux)

Objetivos diferentes a los de PCR

Mientras que la PCR detecta ADN, las tcnicas basadas en la reaccin Anticuerpo-Antgeno suelen
ir dirigidas a protenas o glicoprotenas.
La deteccin de protenas es la nica solucin posible en algunos anlisis, por ejemplo en el anlisis
de algunos alrgenos, como el gluten (por diversas razones: es la protena la que desencadena la
reaccin alrgica, no el ADN que lo codifica, en algunos alimentos tratados trmicamente,
fermentados... el ADN no es detectable pero la protena sigue presente siendo un riesgo para la
poblacin de riesgo...).

Por todo ello, las tcnicas ELISA siguen estando vigentes y pueden en muchas ocasiones ser
alternativas vlidas y fiables al anlisis tradicional, cuando no la solucin mejor adaptada, como en
el caso del gluten, deteccin de protenas de la leche
La tcnica quizs ms frecuente de ELISA, de doble sndwich (DAS-ELISA) puede esquematizarse del
siguiente modo:

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R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

20

Recubrimiento o tapizado de la placa

El anticuerpo (Ab) especfico es colocado en el pocillo, de modo que recubre la superficie interna de ste

Lavado
Eliminacin de los restos de Ab

Adicin de la muestra problema

Una suspensin de la muestra problema es aadida al pocillo e incubada. Si el analito diana (Ag) est presente, se unir al Ab

Lavado
Eliminacin de los restos de muestra del pocillo.

Adicin del Ab conjugado

Un segundo Ab, dirigido contra la misma diana, es aadido al pocillo. En este caso, el Ab se encuentra conjugado con un enzim a.

Lavado
Eliiminacin del Ab conjugado no unido al Ag

Revelado
Adicin de un sustrato. Si el analito estaba presente, habr quedado unido al Ab de tapizado y, posteriormente, al Ab conjugado, que porta el enzima, de modo
que sta cataliza una reaccin desde el sustrato que da lugar a un producto coloreado detectable a por espectrofotometra

La cantidad de producto formada en la reaccin final es detectada mediante espectrofotometra. La

seal de la muestra problema puede compararse con valores conocidos para realizar cuantificacin
del analito diana, si es necesario.
El inmunoensayo fue empleado por Biomerieux para el desarrollo del sistema VIDAS . Este sistema
permite analizar una muestra para Salmonella o Listeria monocytogenes en dos das frente a los 3 o
5 das que se requieren para un negativo mediante el uso de tcnicas tradicionales.

4.2. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

La reaccin en cadena de la polimerasa (acrnimo, PCR, por sus siglas en ingls, polymerase chain
reaction) es la tcnica molecular de mayor proyeccin en el laboratorio de anlisis rutinario.
Como prueba de ello, basta citar que en los ltimos dos aos han sido publicadas, entre otras, las
siguientes ISO basadas en PCR:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
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21

Norma

Ttulo

ISO/TS 13136:2012

Microbiology of food and animal feed -- Real-time polymerase chain reaction

(PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens -- Horizontal
method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and
the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
Microbiology of food and animal feed -- Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR -- Part 1:
Method for quantification
Microbiology of the food chain -- Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens -- Detection of botulinum type A, B, E and
F neurotoxin-producing clostridia

ISO/TS 15216-1:2013

ISO/TS 17919:2013

Otras normas se encuentran en desarrollo actualmente.

De modo esquemtico, la tcnica PCR solo hace referencia al aumento del nmero de molculas de
ADN presente en una muestra problema (amplificacin) hasta unos niveles que sean detectables.
La PCR se realiza en microtubos colocados sobre termobloques (denominados especficamente en
este caso termocicladores): aparatos que permiten aumentar y disminuir la t de modo controlado.
Los reactivos tpicos en una reaccin de PCR son los que siguen:

ADN molde, que contiene la

secuencia diana que va aser
amplificada

Cebadores (primers).
Pequeos oligonucletidos
que flanquean la secuancia
diana

Solucin tampn, con

presencia de cationes,
donde transcurre la
reaccin

Taq polimerasa. Complejo

multienzimtico que, en
presencia de un ADN molde
de cadena simpe, hace
copias de l

Nucletidos, necesarios
para sintetizar el nuevo
ADN

Los pasos de una PCR son los que siguen:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
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Activacin

Desnaturalizacin

Aliineamiento

Extensin o
elongacin

T = (94-98) C
Activacin de la Taq polmerasa (no siempre necesaria: Taq polimerasas "Hot
Start")

T = 95 C
El ADN molde, de doble cadena, se separa en sus dos hebras

T = (40-68) C
Los cebadores se unen a sus secuencias especficas

T = (70-80) C
Utilizando los cebadores como inicio y el ADN al que se encuentran unidos como
molde, la Taq polimerasa realiza una rplica del ADN molde

Tras el ltimo paso, el proceso vuelve a la etapa de desnaturalizacin, repitindose este proceso
habitualmente entre 30 y 45 veces. En cada ciclo, el nmero de ADN presente aumenta
exponencialmente.

(Tomado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe/doc/TechPCR.shtml)

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
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NOTA: En internet existen numerosos recursos para ver esta reaccin en vivo. Una aplicacin que permite seguir la
reaccin paso a paso puede encontrarse en la web de DNA Learning Center
(http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html).

Estos productos de amplificacin eran (y son) revelados mediante el uso de geles de electroforesis:
El producto de la PCR se colocaba en un gel al que se le hacan pasar una corriente elctrica.
Dependiendo del tamao de la molcula amplificada, sta se desplazaba ms o menos en el gel, de
modo que a partir de un patrn era posible determinar el tamao del fragmento amplificado (PCR a
punto final).
Fue precisamente un cambio en el modo de deteccin de la PCR lo que ha propiciado el salto
cualitativo en el uso de la PCR en los laboratorio de uso rutinario: el desarrollo de colorantes que
permiten seguir la tcnica de PCR a tiempo real (PCR a tiempo real o quantitative PCR, qPCR).
Pueden mencionarse dos tipos de colorantes (o fluorforos, pues emiten fluorescencia cuando son
excitados a una determinada longitud de onda):
-

Inespecficos (por ejemplo SybrGreen). Las molculas de este colorante solo emiten
fluorescencia cuando se intercalan en el interior de ADN de doble cadena. Emitirn siempre
que encuentren esta situacin, sea la hibridacin especfica o no.
Especficos: Estos fluorforos son incorporados a oligonucletidos (sondas) que hibridan
con secuencias intermedias entre los cebadores. Cuando la Taq polimerasa llega hasta su
posicin, los degrada, momento en el que empiezan a emitir fluorescencia. Entre este tipo,
pueden mencionarse las sondas TaqMan (Life Technologies).

Este cambio:
-

Elimina la necesidad de visualizar el producto de la reaccin en geles de agarosa. Los

termocicladores son acoplados a sistemas de lectura (espectrofotmetros), de modo que
tras cada ciclo de PCR el microtubo es excitado con un haz de luz y la seal emitida por el
fluorforo leda.
De este modo, se reduce el tiempo de anlisis y la mano de obra necesaria.
Permite la cuantificacin de las copias de ADN presentes.
En el caso de uso de sondas marcadas, hace ms especfica la reaccin al incorporar una
secuencia ms.

Una reaccin tpica de PCR presenta el siguiente aspecto en su representacin grfica:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

24

25

En esta grfica pueden adems observarse tanto las fases de la reaccin como los valores de
inters:
-

La lnea base (baseline): ciclos iniciales de la PCR en los cuales hay una leve seal de
fluorescencia
Umbral (treshold): seal de fluorescencia a partir de la cual se considera que la
muestra es positiva.
Valor Ct: en una muestra, n de ciclos necesarios para que la seal supere el umbral
(interseccin de la curva con el punto de corte).

5. Matrices con inters analtico en la industria agroalimentaria.

Aunque ha sido mencionado a lo largo de la ponencia, parece conveniente esquematizar las
principales matrices de inters en la industria agroalimentaria desde el punto de vista del anlisis
microbiolgico. La tabla presente en el apartado 1.2. (Legislacin en la industria alimentaria) puede
relacionarse con este flujo de trabajo bsico en productos hortofrutcolas:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

Campo de
cultivo

Abonos y fertilizantes
Agua de riego

Procesado

Agua de lavado (agua

de consumo)
Materia prima y
producto terminado
(antes de abandonar
las instalaciones del
productor)
Superficies de trabajo
y ambiente

Distribucin

Producto terminado
(hasta fin de la vida
til)
Superficies de trabajo
y ambiente

La comprensin de los puntos desarrollados en el mencionado apartado 1.2 debera dar

herramientas para entender cmo ocurre la contaminacin por los microorganismos sealados en
la legislacin.
Como ejemplo, en el documento CAC/GL 61 2007 editado por la FAO (Directrices sobre la
aplicacin de principios generales de higiene de los alimentos para el control de Listeria
monocytogenes, diseado para la prevencin de Listeria monocytogenes, las recomendaciones van
dirigidas por el hecho de que se trata de un contaminante de origen ambiental que sobrevive en un
gran rango de condiciones ambientales (entre ellas, a temperatura de refrigeracin), y por ello
incluye entre sus anexos:

Obviamente, las recomendaciones para un patgeno de origen fecal (por ejemplo Salmonella), son
sustancialmente diferentes, y suelen ir encaminadas a prevenir la contaminacin por materia fecal
(control de fertilizantes de origen orgnico)

6. Muestreo segn legislacin

Las siguientes definiciones pueden ser encontradas en el Artculo 2 (Definiciones) del Reglamento
(CE) n 2073/2005 de la Comisin, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios
microbiolgicos aplicables a los productos alimenticios:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

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Estos criterios microbiolgicos deberan de incluir una serie de informacin:

Matriz a la que
aplica

Mtodo de
examen

Plan de
muestreo

Lmite
microbiolgico

(Tomado de ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for Food (2006), Gua simplificada para
el entendimiento y uso de objetivos de inocuidad de los alimentos y objetivos de rendimiento)

Tanto la matriz que aplica y el mtodo de examen han sido ya tratados. Queda por tanto revisar en
legislacin cmo estn establecidos los lmites microbiolgicos y qu plan de muestreo proponen
para su cumplimiento.
En legislacin, pueden verse lmites microbiolgicos nicos. Por ejemplo en Real Decreto 140/2003,
de 7 de febrero, por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad del agua de consumo
humano:

No obstante, en otras ocasiones los lmites microbiolgicos se definen del siguiente modo:

J o s L u i s P a r r a M o nt o ya
R e sp o n sa b l e T c n i c o d e l D e p a r t a m e n t o d e M i c r o b i o l o g a y F i t o p a t o l o g a d e L a b o r a t o r i o s F i t o so i l S . L

27

NOTA: Este ejemplo est tomado del Reglamento 2073/2007. Ntese como en este caso el criterio microbiolgico define
todas las caractersticas mencionadas en la gua de la ICMSF (matriz, mtodo de examen -mtodo de referencia-, plan de
muestro y lmite microbiolgico).

Cmo se interpreta este criterio microbiolgico?

En microbiologa, los criterios microbiolgicos se refieren frecuentemente a planes de muestreo de
dos o tres clases:

Programa de atributos de dos clases

Las muestras se clasifican en satisfactorio o insatisfactorio.
Usual en criterios de presencia / ausencia.
Se definen valores n, c y M

Programa de atributos de tres clases

Las muestras se clasifican en 3 categoras: satisfactorio, aceptable e
insatisfactorio
Usual en criterios de recuento
Se define, adems de los valores anteriores, m

Los nmeros establecidos en cada caso por la legislacin son:

Nmero Definicin
n
Nmero de unidades de muestra requerida para hacer el anlisis
myM
Nmero mximo de microorganismos permitido.
M no puede ser superado. Por el contrario, en un muestreo a tres clases, se
permite que un cierto nmero de muestras (=c) sobrepasen m sin llegar a M
c
nmero mximo de muestras que pueden valores por encima de m y sin llegar a
M

Por tanto, en el caso de un muestreo a tres clases las muestras aceptables seran aquellas cuyo
valor se encontrase entre m y M. Ntese que, en cualquier caso, para muestreo donde se define n
la evaluacin global de un producto requiere de un histrico de resultados (como en el caso del
Real Decreto 1620/2007) o bien del anlisis de varias muestras del mismo lote (como en el
Reglamento 2073/2007).
Y es que tal y como ya se ha sealado, el muestreo es una de las etapa que mayor incertidumbre
aporta al proceso de medida en el laboratorio (ver apartado 2.3. Flujo de trabajo en el laboratorio

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28

de microbiologa), de modo que establecer varias medidas ayuda a establecer un valor medido ms
fiable.

7. Ejemplos de informes de laboratorio de matrices de inters

El informe de laboratorio es la expresin final del trabajo realizado. Cuando se examina un
documento emitido por un laboratorio, puede encontrarse informacin que puede clasificarse en
tres categoras:

Informacin sobre la muestra

Cliente
Fecha de toma de muestra
Fecha de inicio y fin de anlisis
Referencia

Ensayo realizado
Parmetros analizados
Resultado obtenido
Metodologa empleada

Informacin tcnica varia

Procedimiento de muestreo
Parmetros acreditados y no acreditados
Opiniones e interpretaciones sobre los resultados

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29

8. Visita a las instalaciones de Fitosoil.

30

Fitosoil Laboratorios, S.L.

Pol.Ind.Oeste. C/ Alcalde Clemente Garca, Parc.24/37.Md.D-1 y 2
30169-San Gins-Murcia (Espaa)
Tfno: 968-883271/72; Fax: 968-883278
info@fitosoil.com

www.fitosoil.com

https://facebook.com/pages/Fitosoil/615170091832182

https://twitter.com/Fitosoil

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