Efecto de la actividad enzimtica de inulinasas usando metales

Mg y Co como posibles activador o inhibidor utilizando

Kluyveromyces marxianus
Garduo Del Razo Carla Stephania, Hernndez Rodrguez Miriam, Martnez Gonzlez
Luis Enrique, Rodrguez Calderas Gloria Estrella.
Licenciatura Qumica Farmacutica Biolgica
Universidad Autnoma Metropolitana

Resumen
Palabras claves:
Abstract
Keywords:

Introduccin
Kluyveromyces marxianus es una levadura de
grado alimenticio que produce enzimas de
inters industrial, tales como B-galactosidasa
(lactasa), endo-poligalacturonasa (pectinasa) y
B-fructofuranosidasa
(inulinasa).
(Guerrero
1995)
La inulinasa es una enzima caracterizada por
hidrolizar la inulina en fructosa prcticamente
pura, ampliamente usada en la industria de
alimentos como edulcorante diettico con un
poder de dulzor de 1.5 a 2 veces la sacarosa.
De ah el inters por su estudio para producirla,
purificarla y caracterizarla a partir de cultivos
microbianos en medios sintticos, siendo las
levaduras Kluyveromyces marxianus las ms
estudiadas. (Castillo 2010).
Muchas enzimas requieren la presencia de
ciertos constituyentes no proteicos para
funcionar como catalizadores. Tales como

pueden ser
(Tapia.2006).

cofactores

coenzimas.

Los cofactores son iones inorgnicos que

facilitan la unin enzima-sustrato o estabilizan la
estructura tridimensional de la enzima. El
magnesio es un catin intracelular que posee
mltiples funciones: es cofactor de enzimas del
metabolismo glicdico y de enzimas de la
degradacin de los cidos nucleicos, protenas y
cidos grasos; regula el paso de los iones
transmembrana e interviene en la actividad de
varias enzimas. (Barbosa 2010).
El cobalto es un inhibidor de la sntesis de
etileno, el cual bloquea la conversin del cido1-aminociclopropano carboxlico. (Mandujano
2012).

Objetivo
Inducir la sntesis de inulinasas a partir de
inulina utilizando Kluyveromyces marxianus.
Objetivos Especficos
Cronograma

Materiales y Mtodos
Determinacin de azcares reductores
Para la determinacin de azcares reductores
se aplicar el mtodo de colorimetra DNS
(cido
3,5
dinitrosaliclico)
usando
el
espectrofotmetro.
Por lo que se realizar una curva de calibracin
(tabla 1) a partir de una solucin de glucosa (2
g/L).
A cada una de estas diluciones se les adicionar
1000 L de DNS y 10 mL de agua destilada.
Posterior a la realizacin de las diluciones, estas
se llevarn a bao mara a 50C para que el
DNS reaccione con el azcar de las muestras.
Se leer en el espectrofotmetro a una longitud
de onda 540 nm, teniendo de esa manera la
curva de calibracin.

83.333
116.667

0.298
0.4353

Tabla 1.Curva de calibracin.

Por otro lado se tomar muestras de 1000 L
cada una;, se le adicionar 1000 L de DNS,
luego se agregar 10 mL de agua destilada y se
llevaran a bao de mara, a 50C.
Posteriormente se leer en el espectrofotmetro
y con base a la curva de calibracin se
cuantificar la glucosa presente en cada una de
las muestras a una longitud de onda 540 nm.
(Cortes, 2013)
Preparacin del reactivo
dinitrosaliclico (DNS)

del

cido

3,5

Se pesarn 5 g de cido 3,5 dinitrosaliclico, 150

g de tartrato de Na-K y 8 g de NaOH. Se
disolver el NaOH en 200 ml de agua destilada
y se aadir en agitacin el tartrato de Na-K
lentamente.
Se aforar con agua destilada hasta 400 ml y se
aadir lentamente el cido 3,5 dinitrosaliclico.
Se dejar en agitacin toda la noche, por ltimo
se llevar a volumen de 500 ml y se filtrar.
La preparacin del reactivo en caliente es
idntica pero se hace con agitador magntico y
con calentamiento.
Falta poner composicin del medio de cultivo
Tabla 2.compocicion del medio de cultivo lquido.
Determinacin de protenas

Curva de calibracin azucares

reductores
Glucosa g/ml
abs
4.1667
0.0083
8.333
0.023
16.667
0.0543
33.333
0.11
50
0.1696
66.667
0.2396

Falta poner el procedimiento de protenas

Curva de calibracin
muestr absorvan concentracion
a
cia
g/ml

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

0.0335
0.069
0.0915
0.127
0.2265
0.3395
0.4305
0.5125
0.531
0.5765
0.6115
0.6575

3.846153846
7.692307692
11.53846154
15.38461538
30.76923077
46.15384615
61.53846154
76.92307692
84.61538462
92.30769231
100
107.6923077

0.213
0.411
0.528
0.612
0.696
0.963
0.681

56.0639316
108.169195
138.958668
161.063932
183.169195
253.432353
179.221826

d
enzim
tica U
0
7.5
9.63
11.17
12.7
17.58
12.43

Especfica
mol/min x
mg
0
470.51
522.6
390.96
556.77
577.52
553.18

Fermentacin
Las fermentaciones se realizarn aerbicamente
en matraces Erlenmeyer de 100 ml con 25 ml
del medio correspondiente (pH 5,5). Se aadir
4% (v/v) de inculo y se incubarn en un
agitador orbital a una temperatura de 42 C y
una agitacin de 150 rpm. Como medios de
fermentacin se utilizara medio de inulina
previamente esterilizado en autoclave a una
temperatura de 125C y 1 atm de presin,
durante 15 min. (Cortes, 2013)
Determinacin del Crecimiento
Resultados
curva de crecimiento
muestra
abs
0
2
4
6
8
10
12

mue

Abs

azucares reductores
conc. g/ml
activida

Actividad

0.779
0.886
1.379
1.728
1.96
2.098
1.258

Metales
contro
l

inhibidor
1 mM
Co

12.43

6.85

5 mM
Co
8.62

activador
1 mM
Mg

5
mM
Mg
13.76 13.6
5
Discusin

Conclusin
Referencias
1. Augusto

Castillo Caldern, Rolando

Chamy Maggi, produccin de inulinasa
por
levaduras
de
Kluyveromyces
marxianus.2010.

2. Guerrero

Cruz
Alma
Elizabeth,
Regulacin de la sntesis y excrecin de
enzimas
extracelulares
de
Kluyveromyces marxianus.1995.

3. Fabiano Timb Barbosa, Usos do sulfato

de magnsio em
anestesia 2010.

obstetrcia

em

4. Mandujano-Pia, Manuel; Colinas-Len,

Ma. Teresa; cobalto como retardante de

la senescencia de lilium hbrido oriental
en postcosecha.2012.

Bioqumica de los procesos metablicos, scar

Cuamatzi Tapia.2006