Escola Tcnica Superior d'Enginyeria Industrial de Barcelona

Biotecnologa
Profesora: Nria Saperas

BIOQUMICA. INTRODUCCIN A LA
BIOTECNOLOGA
Expresin y purificacin de una protena eucariota en la bacteria
Escherichia coli

Integrantes del Grupo 2:

Gavorskis, Andrea
Gmez, Fabiola
Urbina, Juliana
ndice
Introduccin................................................................................................................................3
1.

Objetivos..............................................................................................................................4

2.

Conceptos bsicos................................................................................................................4

3.

Procedimiento experimental................................................................................................5
A. Comprobacin de la construccin de partida...................................................................5
B. Cromatografa de intercambio inico..............................................................................8
C. Precipitacin de las protenas de cada fraccin cromatogrfica......................................9
D. Anlisis electrofortico de cada fraccin cromatogrfica..............................................11
I.

Montaje para la electroforesis....................................................................................11

II. Preparacin de un gel de acrilamida al 15%. Para 12 ml:..........................................11

III.

Preparacin de las muestras....................................................................................12

V. Visualizacin de las bandas........................................................................................13

VI.

Conservacin del gel..............................................................................................14

E. Cuantificacin de las protenas de cada fraccin cromatogrfica (mtodo colormetro

de Bradford)..........................................................................................................................14

4.

Discusin de Resultados....................................................................................................15

5.

Conclusiones......................................................................................................................17

6.

Cuestiones..........................................................................................................................18

7.

1.

Obtencin de la mezcla protaminas/histonas.................................................................18

2.

Cromatografa de Intercambio Inico............................................................................18

3.

Precipitacin de las protenas de cada fraccin cromatogrfica...................................19

4.

Electroforesis de protenas. Con las protenas y condiciones utilizadas,.......................19

5.

Cuantificacin de protenas............................................................................................19
Bibliografa........................................................................................................................21

Introduccin
La biotecnologa es la aplicacin de organismos, sistemas o procesos biolgicos para las
industrias de fabricacin y/o servicios. El rea de aplicacin ms importante de la
biotecnologa, es la tecnologa del bioprocesamiento, particularmente la modificacin, el
cultivo de clulas y la purificacin de protenas. A partir de ellas, puede obtenerse materiales
de inters y relevancia para el ser humano.
El cultivo de clulas o microbiano, no es ms que un mtodo de multiplicacin de
microorganismos, tales como bacterias u hongos, a los que se les ha modificado
genticamente para que produzcan una sustancia de inters. En el caso de esta prctica de
laboratorio, se refiere a la modificacin de una bacteria para que produzca una protena
encontrada en las ranas. La modificacin de la bacteria para que exprese la protena de inters
se logra a travs de la introduccin de un plsmido que contiene el gen que la codifica. La
bacteria modificada es la Escherichia coli debido a su relativo bajo costo, alta densidad de
cultivo y su fcil manipulacin gentica. La protena que se expresar es la nucleoplasmina,
la cual es de gran importancia en el proceso de fecundacin y formacin del cigoto en
organismos que se reproducen de forma sexual. Interviene en la retirada de las protaminas
para que se d la incorporacin de histonas que se encarguen de empaquetar el ADN en el
nuevo organismo.
Este cultivo se debe preparar en un medio ptimo para favorecer el proceso deseado y el
producto de inters debe ser recuperado y purificado. Las tcnicas de recuperacin y
purificacin deben concentrarse en las caractersticas ms distintivas que tiene la protena de
inters y desarrollar un esquema de separacin en base a ello. La nucleoplasmina es una
protena de tamao grande, termoestable y de carcter muy acdico, ya que es rica en
aminocidos cidos.
Considerando todo lo mencionado anteriormente, en la presente prctica se expresar y
purificar una protena eucariota en la bacteria Escherichia coli. Como mtodo de
comprobacin de la construccin de partida se realizar una electroforesis en gel de agarosa.
La recuperacin y purificacin de la protena se lograr mediante un proceso qumico y un
proceso mecnico, refirindose a una lisis celular por la adicin de un detergente y a la
separacin mediante centrifugaciones a alta velocidad. Se utilizar la electroforesis como
tcnica de validacin.
2

1.

Objetivos

General: Familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas de ingeniera gentica,

cultivos microbianos y purificacin de protenas mediante la sobreexpresin de una
protena eucariota (nucleoplasmina) en la bacteria Escherichia coli.
Especficos:
1 Parte:
Comprobacin de la construccin de partida.
Transformacin de las bacterias.
Obtencin de suficiente volumen de cultivo en medio lquido.
2 Parte:
Procesamiento del cultivo recuperacin y purificacin del producto.
Control electrofortico del proceso de obtencin y purificacin del producto.
2.

Conceptos bsicos
Precipitacin: Es una forma de separacin, para la cuantificacin e identificacin
qumica, basada en la solubilidad del slido que se encuentra disuelto en un solvente.
Sobrenadante: La parte superior clara de cualquier mezcla despus de ser
centrifugada.
Sedimentacin: Es la separacin por la accin de gravedad de las fases slida y
lquida de una suspensin diluida para obtener una suspensin concentrada y un
lquido claro.
Centrifugacin: Proceso mecnico que permite, por medio de un movimiento
acelerado de rotacin, provocar la sedimentacin de los componentes de una mezcla.
Condicin de Asepsia: Condiciones que evitan que los microorganismos ajenos a los cultivos
contaminen o que los grmenes que se encuentran en la muestra se propaguen en el rea de trabajo.
Las condiciones de asepsia se alcanzan trabajando en proximidad a la llama de un mechero o en
campanas de seguridad biolgicas, y en un ambiente limpio y ordenado.

Plsmido: Molculas circulares de ADN de doble cadena que se encuentra

naturalmente en varias especies de bacterias. Estos elementos genticos son
extracromosmicos, se replican de manera independiente del cromosoma bacteriano y
metales pesados, degradan complejos orgnicos y/o producen toxinas, entre otros.
Dadas estas caractersticas, los plsmidos han sido empleados como vehculos de
clonacin de molculas de ADN forneas que permiten el transporte y manipulacin
del mismo. Los plsmidos presentan un sitio mltiple de clonacin en donde se
encuentran sitios nicos para determinadas enzimas de restriccin, de manera que al
realizar la digestin del ADN plasmdico con la enzima de restriccin adecuada,
genera la misma enzima empleada en el proceso de clonacin, y se obtiene la
liberacin del inserto clonado, lo cual se puede observar mediante electroforesis en
geles de agarosa teidos con bromuro de etidio.
3

Electroforesis en gel de agarosa: Es un mtodo bastante utilizado para separar,

identificar y purificar fragmentos de ADN. La agarosa es un polmero lineal, extrado
de algas marinas, en el cual las molculas de ADN de doble cadena migran de manera
inversamente proporcional al logaritmo en base 10 (log 10) de sus tamaos
moleculares. Dado que el ADN est cargado negativamente debido a los grupos
fosfatos de la molcula, la migracin en la cmara de electroforesis ocurre del polo
negativo hacia el polo positivo.
Bromuro de Etidio: Molcula hidrfoba que tiene casi el mismo tamao que una base
de ADN y ARN, de coloracin fluorescente cuando se expone a luz ultravioleta. Las
bases de ADN son molculas hidrfobas que le temen al agua. El enrollamiento
helicoidal del ADN atrapa las bases presentes en el ambiente acuoso. Cuando el
bromuro de etidio est en presencia de ADN, se intercala entre las bases de una cadena
de ADN y ARN y marca el cido nucleico. El bromuro de etidio puede aadirse
durante la formacin del gel o luego de la electroforesis, mediante la inmersin del gel
en una solucin buffer que contiene bromuro de etidio. Al colocar el gel bajo luz
ultravioleta el bromuro de etidio fluoresce con un color naranja, y produce bandas
donde estn los fragmentos de ADN.
Medio Luria-Bertani (LB): Es uno de los ms usados para el cultivo de Escherichia
coli y de otras especies bacterianas, debido a que es rico en nutrientes, de fcil
elaboracin y permite el crecimiento de una gran variedad de cepas. Est constituido
por tres componentes, de los cuales uno es mineral, generalmente NaCl, y dos son
orgnicos: triptona y el extracto de levadura.
3. Procedimiento experimental
Primera Parte
El ADN recombinante que contiene el gen que expresa la protena de nuestro inters
(nucleoplasmina) se ha construido siguiendo el siguiente esquema:

Figura 1. Esquema de produccin del ADN recombinante

La nucleoplasmina es una protena que proviene de la rana. El gen que codifica esta
protena fue tomado e insertado en un plsmido, para que pudiese ser luego
sobreexpresado mediante su introduccin en la bacteria Escherichia coli.
Los pasos indicados en el apartado a y b fueron realizados de forma alternada,
minimizando los tiempos muertos durante la prctica de laboratorio.
A. Comprobacin de la construccin de partida
Para comprobar que la construccin del ADN recombinante se ha realizado
correctamente se cort este ADN con enzimas de restriccin adecuadas y se someti
la muestra a un proceso de electroforesis. Para verificar el plsmido se usaron
diferentes combinaciones de enzimas de restriccin, aunque lo usual es usar una
nica combinacin de enzimas.
4

El proceso de electroforesis se usa para verificar la construccin del ADN

recombinante porque, con la utilizacin de un marcador molecular que aporta
fragmentos de ADN de medidas conocidas, se puede confirmar que los fragmentos
de nuestra muestra son de la medida esperada. Las medidas de los fragmentos de
nuestra muestra pudieron ser estimadas de forma precisa porque el plsmido inicial
es de origen comercial y se conocen sus medidas, as como tambin se conoce el
tamao de los fragmentos que cortan las enzimas de restriccin.

I.

Digestin de la construccin con enzimas de restriccin

1) Se debe preparar la mezcla de digestin: para 5 l de muestra se agrega 1 l del
tampn de digestin (10x), 0,5l de cada enzima de restriccin y agua hasta
completar 10 l. En la Tabla 1 se muestra las combinaciones de enzimas de
restriccin utilizadas, con las cantidades necesarias para preparar las muestras de
digestin.
Tabla 1. Preparacin de la mezcla de digestin
Enzimas de Restriccin
(l)
N
muestra
6 y RE
2y5
3y4

Nde I

Bam
HI

XhoI

0,5
0,5
0,5

0,5
-

0,5
-

Tampn de
digestin TR (10x)
(l)
1
1
1

Muestra
(l)

Agua
(l)

5
5
5

3
3
3,5

La zona de la tabla rodeada por un doble borde corresponde a las muestras

entregadas por la profesora de laboratorio. Las mismas fueron previamente
preparadas con el ADN recombinante y las cantidades correspondientes de tampn
de digestin y agua.
Los nmeros de muestra asignados hacen referencia a los grupos de laboratorio que
realizaron la combinacin indicada de enzimas, dando dos rplicas por cada
combinacin. La muestra denominada RE corresponde a una rplica extra de stock
viejo de plsmido realizada por la profesora de laboratorio a modo de comparacin.
Esta rplica se realiz con un lote fresco de enzimas de restriccin.
Adicionalmente, se debe sealar que los grupos 2 y 3 trabajaron con un stock de
enzimas con problemas de almacenamiento, denominado stock viejo; mientras que
los grupos 4, 5 y 6 trabajaron con un stock nuevo de enzimas. El stock viejo fue
almacenado en un congelador daado por un tiempo desconocido, lo que pudo causar
la desnaturalizacin de las enzimas, debido al brusco cambio de temperatura. Este
experimento sirve para comprobar si las enzimas de dicho stock siguen activas.
Con respecto al tampn de digestin, se utiliza un tampn 10 veces concentrado
sobre la concentracin de trabajo final, de modo que al preparar las muestras las
enzimas tendrn actividad ptima, con una cantidad de nutrientes, sales y
condiciones adecuadas para su desarrollo.
El procedimiento descrito anteriormente puede observarse en la Figura 2.

Figura 2. Preparacin de la mezcla de digestin

Se prepar una muestra control (1) para verificar la accin de las enzimas de
restriccin sobre el plsmido modificado. Esta muestra fue tratada de la misma forma
que las dems pero no se le agregaron enzimas de restriccin.
2) Se debe incubar a 37C durante 1 hora las muestras, de forma que se les d el tiempo
necesario a las enzimas para que acten y corten los fragmentos del ADN
recombinante.
3) Se debe aadir 2l de tampn de muestra para electroforesis (conteniendo el
colorante de migracin azul de bromofenol o Naranja G) y analizar las muestras
mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. El colorante de migracin, en este
caso Naranja G, se usa para tener una nocin precisa de cuando es el momento de
detener el proceso de electroforesis. Adems, le da al gel una tonalidad ligeramente
anaranjada. El procedimiento descrito en los pasos 2 y 3 se presenta en la Figura 3.

Figura 3. Digestin de la construccin por enzimas y preparacin para la

electroforesis
II.

Anlisis electrofortico del ADN digerido en gel de agarosa al 1%

El anlisis electrofortico de las muestras se basa en la separacin de las mismas por la

aplicacin de un campo elctrico sobre el gel. De esta manera, las molculas migran
por el gel poroso de agarosa. El gel de agarosa es el ms habitual para analizar ADN.
1) Se debe disolver 0,3 g de agarosa en 30 ml de tampn TAE calentando en el
microondas. El calentamiento debe realizarse en un matraz de Erlenmeyer en el que
previamente fue mezclada la agarosa y el tampn TAE, medido en una probeta de
medicin. Al calentar debe evitarse la formacin de burbujas y la evaporacin
excesiva para minimizar la prdida de muestra y la variacin de concentracin. La
manera de lograrlo es colocar un minuto de calentamiento en el microondas y revisar
repetidamente el matraz. Se puede medir la concentracin antes y despus del
calentamiento para asegurar que no ha habido variacin; y en caso de conseguirla, se
deber al agua evaporada. El procedimiento descrito puede observarse en la Figura 4.

Figura 4. Preparacin del gel de agarosa al 1%

2) Cuando se haya enfriado un poco (que no queme), aadir un marcador de ADN hasta
0.5 g/ml. En esta prctica sola usarse bromuro de etidio, que es un marcador muy
exacto y tiene un color naranja al ser sometido a radiacin UV, sin embargo, debido a
su carcter cancergeno, ha sido sustituido por Simply Safe (SYBR Safe) que produce
un color verde azulado y muestra la misma exactitud. La cantidad adecuada de
marcador a ser aadido es de 1,5 l. El clculo se demuestra a continuacin:
5 l marcador
30 ml tampn TAE=1,5 l
100 ml tampn TAE
3) Verter la mezcla sobre un molde y dejar polimerizar. El molde utilizado es una cajita
de acrlico, completada con trozos de cinta, y en l ocurrir la electroforesis de forma
horizontal. Para ello, deben crearse los pozos de carga de las muestras utilizando un
peine con dos opciones de tamao/nmero de pozo. En esta ocasin se escoge la
opcin de pozos pequeos para que d cabida a todos los carriles necesarios para la
prctica. Estos pozos son capaces de contener los volmenes de trabajo. Debe
introducirse el peine de modo que los pozos queden rectos y ubicarlo prximo al fondo
de la caja, pero sin llegar a tocarlo, a aproximadamente 1-1,5 mm. Adems debe
colocarse en un extremo del molde, ya que el movimiento de los fragmentos de ADN,
cargado negativamente, se dar en una sola direccin, hacia el electrodo positivo. De
esta manera se garantiza que podr cargarse el volumen de muestra completo y que no
se perder por el fondo de la caja.
4) Se deben retirar los trozos de cinta y colocar la caja con el gel polimerizado en el
montaje para la electroforesis. Se debe aadir tampn TAE hasta que quede cubierto el
gel. Finalmente, se deben cargar las muestras colocando un papel oscuro debajo del
montaje que permita ver ms fcilmente los pozos. Empezando en el extremo
izquierdo, en el tercer pozo debe cargarse la muestra RE, en el cuarto pozo se carga el
marcador de masa molecular (MMM), en el quinto se carga el grupo control (1) y a
partir de all, las muestras de 2 a 6 en orden numrico creciente. Las muestras deben
cargarse con una micropipeta de 12 l, mientras que el MMM debe cargarse con una
micropipeta de 10 l debido a que el volumen a utilizare estar entre 5,5 y 6 l. Lo
descrito puede observarse en la Figura 5, mostrada a continuacin.

Figura 5. Carga de muestras para la electroforesis en gel de agarosa al 1 %

5) Desarrollar la electroforesis a un voltaje constante de 80 V hasta que el colorante de
migracin llegue a la distancia deseada. Se debe conectar el electrodo negativo en el
extremo donde se han cargado las muestras de fragmentos de ADN para que ocurra
migracin. Como ya se mencion, el ADN tiene carga negativa, de manera que
migrar hacia el extremo del electrodo positivo.
Idealmente, se detiene el proceso cuando el colorante ha llegado al final del gel, pero
7

por cuestiones de tiempo se detuvo al llegar aproximadamente a la mitad del mismo.

6) Visualizar los fragmentos de ADN obtenidos por exposicin del gel a radiacin
ultravioleta. Esta visualizacin se desarrolla en un cuarto oscuro y es posible gracias a
la presencia del marcador de ADN en el gel polimerizado. Las marcas obtenidas para
las muestras, al compararlas con las de MMM, nos permiten comprobar el plsmido
observando si los fragmentos son de la medida esperada. El procedimiento descrito en
los pasos 3 al 6 para el anlisis electrofortico del ADN se muestra en la Figura 6.

Figura 7. Anlisis electrofortico del ADN digerido en gel de agarosa al 1 %

B. Transformacin de las bacterias
Consiste en introducir el ADN recombinante (es decir, el plsmido que contiene el
gen que codifica a la protena de nuestro inters) a una poblacin competente de la
bacteria Escherichia coli (cepa BL21 (DE3)pLysS). El trmino poblacin
competente indica que la cepa de bacterias a utilizar ha sido tratada previamente para
garantizar que la transformacin de las mismas tenga xito, es decir, que se logre la
introduccin del plsmido. Los tratamientos realizados pueden ser de diferente
naturaleza como la electroporacin, generando una apertura de poros en la clula por
electricidad, o de tipo qumico como la adicin de CaCl 2 haciendo permeable la
cubierta de la bacteria.
Las bacterias fueron previamente refrigeradas en glicerol lquido a -80 C y luego
descongeladas en hielo. El glicerol previene la formacin de cristales y conserva a
las bacterias en un estado lquido.
Importante: Se debe recordar trabajar en condiciones de asepsia, ya que se est
realizando un cultivo de bacterias. Se debe mantener el medio esterilizado para
prevenir contaminacin del cultivo y que se desarrolle otro microorganismo diferente
al de inters.
1) Sobre una alcuota de 50 l de clulas competentes de Escherichia coli, aadir 0,5 l
de la solucin que contiene nuestro plsmido de inters, ADN recombinante con un
gen de resistencia a la ampicilina. El recipiente que contiene las bacterias debe ser
abierto lo mnimo para que sea posible la adicin del plsmido y luego cerrado
inmediatamente. Este proceso debe realizarse al lado de una llama para que las
corrientes convectivas generadas minimicen la contaminacin de la muestra.
2) Debe dejarse la preparacin en hielo entre 10 y 20 minutos. El procedimiento
indicado en el paso 1 y 2 se muestra en la Figura 7.

Figura 7. Paso 1 y 2 de la transformacin de las bacterias

3) Realizar un choque trmico a las bacterias llevndolas 5 minutos en una gradilla de
plstico a un bao trmico de 37 C. Este cambio de temperatura facilita la entrada
del plsmido al interior de la clula.
4) Llevar a un bao de hielo por 2 minutos para refrescar un poco la muestra. Los pasos
3 y 4 pueden observarse en la Figura 8, mostrada a continuacin.

Figura 8. Paso 3 y 4 de la transformacin de las bacterias

5) Aadir 1 ml de medio de cultivo LB (sin antibitico), que corresponde a un lquido
de color amarillento. El medio de cultivo aporta los nutrientes necesarios para el
crecimiento de las bacterias. En esta etapa no se agrega antibitico para minimizar
los cambios que han sufrido las bacterias y darles la oportunidad de crecer en
condiciones ptimas de temperatura y presencia de nutrientes.
6) Incubar a 37 C durante una hora para que se arranque el crecimiento de las bacterias.
7) Centrifugar a baja velocidad (4000 rpm) durante 3 minutos. Este proceso permitir
concentrar un poco la muestra para reducir el tiempo de absorcin durante el
plaqueado. As quedarn las clulas como un pequeo sedimento y el medio de
cultivo como sobrenadante.
8) Eliminar con una micropipeta alrededor de 850 l de sobrenadante hasta dejar slo
200 l. Luego, con la micropipeta se debe suspender el sedimento en el sobrenadante
restante para pasar al plaqueado. El procedimiento descrito en los pasos 5, 6, 7 y 8 se
muestra en la Figura 9.

Figura 9. Pasos 5, 6, 7 y 8 de la transformacin de las bacterias

9) Empezar el proceso de seleccin de las clulas transformadas por adicin de
ampicilina. La seleccin se realiza en medio slido y en las partes del mismo donde
existan clulas transformadas, se desarrollarn colonias. Para ello, se debe plaquear,
es decir, se debe repartir las bacterias sobre placas de Petri. El plaqueado se realiza
mediante un asa de siembra, haciendo patinar la base recta sobre la placa para
9

repartir las clulas sobre toda la superficie; mientras se tiene cuidado de no aplicar
fuerza excesiva y romper el vidrio. El asa de siembra debe estar asptica, por lo que
debe flamearse con alcohol siguiendo el siguiente procedimiento:
a. Sumergir la placa en un vaso precipitado que contenga alcohol.
b. Escurrir el exceso de lquido.
c. Pasar rpidamente por la llama para evitar que se ennegrezca.
d. Dejar extinguir la llama.
e. Enfriar el asa agitndola cerca de la llama para evitar la muerte de las bacterias
al plaquear.
La placa Petri contiene medio de cultivo LB y ampicilina gelificados con agar. Para
lograr este medio slido debi calentarse y disolver el agar a alta temperatura y
aadir antibitico a la mezcla antes de que gelifique. Las caractersticas de este
medio hacen que las bacterias plaqueadas tengan movilidad limitada y se queden en
la zona de la placa donde fueron colocadas.
El proceso de plaqueado se realiz en una placa diferente para cada muestra de los
grupos del laboratorio. Adicionalmente, se crearon dos grupos control compuestos
por clulas huspedes sensibles a la ampicilina, es decir, a las que no se les adicion
el ADN recombinante. Uno de los controles, denominado C1, se coloc en un medio
sin ampicilina y el otro, C2, se coloc en un medio con ampicilina. Ambos controles
sirven como referencia para la comprobacin de la eficacia de la transformacin de
nuestras clulas.
10) Incubar en la estufa a 37 C durante 1 hora. El procedimiento descrito en los pasos 9
y 10 se muestra en la Figura 10.

Figura 10. Seleccin de clulas transformadas por adicin de ampicilina

C. Obtencin de suficiente volumen de cultivo en medio lquido
Importante: Trabajar en condiciones de asepsia para evitar la contaminacin del
cultivo de microorganismos por otros provenientes del medio.
Por cuestiones de tiempo, los pasos 2, 3 y 4 del proceso de obtencin de suficiente
volumen de cultivo en medio lquido fueron llevados a cabo con antelacin por la
profesora de laboratorio. Sin embargo, igualmente sern desarrollados y sustentados
a continuacin.
1) Marcar una colonia de clulas transformadas en la placa de petri usando un marcador.
Se debe escoger una colonia, preferiblemente, del centro de la placa para evitar que
est contaminada. Se debe abrir la placa, raspar rpidamente un poco de la colonia e
introducirla en un tubo con 3 ml de medio LB y antibitico. Para este proceso debe
usarse un asa de siembra de platino. Al igual que con el asa de vidrio, debe
garantizarse condiciones de asepsia mediante el siguiente procedimiento:
10

a. Pasar el asa por la llama hasta que se ponga completamente rojo el hilo de
platino.
b. Enfriar el asa agitndola cerca de la llama para evitar la muerte de las bacterias
al picar las colonias.
2) Incubar a 37 C y agitar a 250 rpm durante 4-6 horas. Este proceso de agitacin se
hace colocando los tubos de forma inclinada, no cerrados por completo, de manera que
se airee la muestra y se evite su contaminacin.
3) Reinocular la muestra sobre 25 ml de LB y ampicilina. El aumento progresivo de
volumen de cultivo logra que se reduzca la fase de ajuste de las bacterias y su
crecimiento empiece rpido y con mnimas perturbaciones.
4) Incubar a 37 C y agitar a 250 rpm durante toda la noche. Por cuestiones de tiempo de
uso del laboratorio, en el caso de las muestras trabajadas, la mitad de ellas fue
refrigerada durante dos das y luego fue incubada como se describe; mientras que la
otra mitad fue incubada durante dos das.
Segunda Parte
A Procesamiento del cultivo: Recuperacin y purificacin del producto
Una vez obtenido un cultivo de suficiente volumen de bacterias que habrn estado
expresndose ("fabricando") la protena de nuestro inters (nucleoplasmina en este
caso) tendremos que recuperar, enriquecer y purificar esta protena. Los diferentes
pasos se irn controlando mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Importante: ahora no hay que trabajar en condiciones de asepsia pero s que conviene
trabajar siempre en fro (hielo) a menos que se especifique lo contrario. No se
requieren condiciones tan controladas de asepsia porque ya no se llevar a cabo
cultivo, sin embargo el fro es conveniente porque conserva mejor el material
biolgico.
1)

Centrifugar los cultivos en tubos de 50 ml a baja velocidad (4000 rpm) durante 10

min, de esta manera se lograr separar las clulas del medio.
2) Descartar el sobrenadante que corresponde al medio de cultivo. El sedimento
corresponde a la fraccin celular de bacterias.
3) Ruptura de las bacterias:
3.1 Congelar el pellet que contiene el sedimento celular con hielo seco ms etanol.
3.2 Aadir 0,5 ml de tampn de lisis con inhibidores de proteasas. El producto a
encargarse de la lisis celular, o ruptura de las clulas, es un detergente que aporta
condiciones no desnaturalizantes y logra perforar la pared de la clula para extraer
la protena de inters. El tampn usado contiene inhibidores de proteasas
encargados de prevenir la protelisis o degradacin de las protenas, que ocurre si
se alarga el proceso de lisis. Para reducir la viscosidad de la muestra obtenida
despus del proceso de lisis, el detergente aadido contiene nucleasas, enzimas
que rompen enlaces entre nucletidos, fragmentando el ADN. El carcter
polimrico del ADN hace que las soluciones que lo contienen sean viscosas.
3.3 Se debe resuspender bien el pellet con una varilla de vidrio, dispersando
completamente el sedimento y cuidado de no raspar el tubo. Luego, incubar con
agitacin suave durante 10 minutos o menos. No es necesario prolongar el
proceso de agitacin ya que el proceso de congelacin/descongelacin que han
sufrido las clulas y su posterior lisis qumica, ya ha contribuido enormemente a
la ruptura celular.
3.4 Si es necesario, puede realizarse un proceso mecnico adicional e incluso un
proceso de ultrasonido. El proceso mecnico consiste en pasar la solucin varias
veces por una jeringa y el proceso de ultrasonido consiste en realizar varias rondas
11

4)

5)

6)

7)
8)

9)

cortas de ultrasonido en fro, para evitar el calentamiento de la muestra. Estos

procesos lograran romper las paredes y membranas faltantes. En esta prctica, el
proceso de lisis qumico logra la ruptura total de las clulas.
Centrifugar en tubos Eppendorf a alta velocidad durante 5 min. Esto se realiza en la
micrfuga a 13000 rpm y ocasionar la aparicin de un sedimento. El sedimento
corresponde a restos celulares, como fragmentos grandes de ADN. La protena de
inters permanece soluble en el medio.
Pasar el sobrenadante a un nuevo tubo y descartar el pellet anterior. Se debe reservar
una alcuota de 7,5 l del sobrenadante para control electrofortico. Esta alcuota se
identificar como EI (extracto inicial) y se colocar en un volumen adecuado de
tampn de muestras para electroforesis, conteniendo el colorante de migracin azul de
bromofenol. La muestra EI permitir ver como avanza el proceso de purificacin ya
que contiene todo el conjunto de protenas iniciales.
Calentar a 80 C durante 10 min. El calentamiento explotar la caracterstica
termoestable de la nucleoplasmina a nuestro favor, ya que es una propiedad que la
diferencia del resto de las protenas de la muestra. stas se desnaturalizarn, mientras
que la nucleoplasmina permanecer intacta ya que soporta temperaturas entre 80 y 90
C por hasta 20 minutos. Las protenas desnaturalizadas se volvern insolubles,
formarn agregados y harn que la muestra adquiera un aspecto turbio.
Colocar la muestra en hielo durante dos minutos para que se enfre un poco.
Centrifugar a alta velocidad (13000 rpm) en la micrfuga durante 10 min. Esto
permitir recuperar el sobrenadante, muy enriquecido en nucleoplasmina y algunas
otras protenas que hayan resistido el proceso de calentamiento. El sedimento obtenido
en el proceso de centrifugacin es una masa blanca constituida por las protenas
desnaturalizadas.
Pasar el sobrenadante a nuevo tubo Eppendorf y etiquetarlo como TE
(termoestable), haciendo referencia a la nucleoplasmina. Reservar 7,5 l para
control electrofortico y agregarlo a un segundo tubo con un volumen adecuado de
tampn de muestra y colorante de migracin. El pellet y el sedimento puede
descartarse.

B Control electrofortico del proceso de obtencin y purificacin del producto

Por cuestiones de tiempo, los pasos 1 y 2 del proceso de control electrofortico fueron
llevados a cabo con antelacin por la profesora de laboratorio. Sin embargo,
igualmente sern desarrollados y sustentados a continuacin.
1) Se debe preparar un gel de poliacrilamida al 12 % con SDS. El SDS, llamado de esta
manera por sus siglas en ingls (Sodium Dodecyl Sulfate), es un detergente aninico
que tiene la capacidad de desplegar y recubrir homogneamente de cargar negativas a
las protenas, independientemente de la carga original que hayan tenido. Como
consecuencia de esto, al aadir SDS al gel de electroforesis se puede observar el
avance de todas las protenas sin importar su carga, dndose la migracin en base al
tamao de las molculas. Al preparar el gel debe abrirse y cerrarse rpidamente el
recipiente que contenga el tampn de muestra dado que tiene un olor desagradable por
la presencia del agente reductor -mercaptoetanol.
2) Polimerizar el gel. El gel debe tener dos fases, llamadas stacking o apilador y
resolving o separador, para que se puedan observar con mayor facilidad las bandas,
independientemente de los volmenes de carga. Para conseguir una interfaz recta entre
las dos zonas del gel se debe seguir el siguiente procedimiento:
a. Verter el gel de poliacrilamida con una concentracin aproximada de 12-15 %.
b. Agregar isopropanol y dejar que ocurra la polimerizacin.
c. Remover isopropanol.
d. Verter el gel de poliacrilamida con una concentracin menor a la anterior, de
12

3)

4)

5)
6)

aproximadamente 4 %.
La presencia de dos zonas de diferente concentracin de poliacrilamida ocasionar una
diferencia en la movilidad de las protenas en cada una de ellas. En la zona de menor
concentracin o apilador, las protenas irn rpido hasta llegar a la interfaz, pasando a
la otra zona de forma simultnea. En la segunda zona, de mayor concentracin, se
separarn en base a su movilidad relativa.
Hervir las muestras a 100 C durante 6 min, ocasionando que se desnaturalicen las
protenas y se desplieguen, obteniendo monmeros desnaturalizados. Este proceso a
alta temperatura se realiza para asegurar que la nucleoplasmina se despliegue, ya que
por su alta estabilidad qumica, es posible que el SDS no logre hacerlo por completo.
Este despliegue incompleto ocasionara que la nucleoplasmina tuviese secciones
pentamricas y secciones desplegadas, y no avanzase correctamente en el gel.
Colocar el gel en el montaje de electroforesis y cargar las muestras. Esta electroforesis
se realiza de forma vertical y usa azul de bromofenol como colorante de migracin.
Adicionalmente, se desarrolla a 130 V y se deben cargar las muestras en el extremo
donde se conecte el electrodo negativo para la electroforesis. Como se coment
anteriormente, las muestras tendrn carga negativa por la adicin de SDS y migrarn
hacia el electrodo positivo.
Teir el gel con Azul de Coomassie para visualizar las bandas de protena. El gel
deber sufrir un proceso de destincin posterior para que las mismas sean observables.
Secar el gel entre dos papeles de celofn y observar las bandas ocasionadas por la
migracin de las protenas.

Figura 13. Visualizacin de las bandas y conservacin del gel

Figura 14. Conservacin del gel de electroforesis
Figura 14. Mtodo colorimtrico de Bradford y cuantificacin de protenas
4. Discusin de Resultados

Obtencin de la mezcla protaminas/histonas

Partiendo de una muestra Esto fue logrado, primero mediante una centrifugacin que
permiti recuperar la fraccin celular de la muestra. Se realiz luego una
desestabilizacin de las membranas celulares y una siguiente obtencin de sus
orgnulos usando el detergente Triton X-100. Estos orgnulos fueron tratados
mecnicamente con una centrifugacin que separ los ncleos celulares por diferencia
de peso y densidad.
Una vez obtenidos los ncleos, con la adicin de HCl se logra una solubilizacin de
las protenas presentes, correspondiendo a las protaminas e histonas de inters, que
luego fueron separadas mediante otro proceso de centrifugacin.
De la forma descrita, se obtiene una mezcla de protaminas/histonas apta para pasar a
un proceso de separacin ms fino.
Cromatografa de intercambio inico
La mezcla de protenas fue secada y solubilizada en tampn de equilibrado para
hacerla pasar por una columna empaquetada con una resina de intercambio catinico.
A la muestra de partida, MP se le tom una alcuota para el posterior clculo de
rendimiento. Esta resina, atrap a las protenas, todas ellas cargadas positivamente, y
mediante la adicin de eluyente (NaCl) en concentraciones crecientes, se logr la
separacin de las histonas y protaminas.
Las fracciones obtenidas de la cromatografa corresponden a:
1. Dos muestras constituidas principalmente por histonas (FT y 0,6M), las
13

protenas ms dbilmente unidas a la resina, eluidas mediante la adicin de

NaCl 0,6 M. Si en estas muestras hubiese protaminas, se explicara por la
saturacin de la resina de intercambio catinico.
2. Una muestra constituida por protaminas (2M), las protenas ms fuertemente
unidas a la resina, eluidas mediante la adicin de NaCl 2 M. Las protaminas
son las protenas de inters.
Precipitacin de las protenas de cada fraccin cromatogrfica
Para realizar adecuadamente el proceso de electroforesis, se concentraron las
fracciones cromatogrficas. Esto se logr mediante la adicin de TCA y un posterior
proceso de enfriamiento y centrifugado, que permiti obtener un precipitado de
protaminas. Este precipitado se trat con acetona para eliminar resto de TCA y se
disolvi en agua.
A cada muestra, FT, 0,6M y 2M se le tom una alcuota que fue mezclada con
tampn de electroforesis (TM-6), para pasar al proceso de anlisis electrofortico.
Anlisis electrofortico de cada fraccin cromatogrfica
Para realizar la electroforesis, se realiz previamente el montaje descrito en la
metodologa experimental, el cual fue llenado con el gel de poliacrilamida preparado
al 15%, se reserv durante su polimerizacin y se almacen, conservando su humedad,
hasta la realizacin del experimento.
Se coloc la placa en la cubeta de polimerizacin, se agreg cido actico como medio
de conduccin y se realiz la carga de las muestras en los pozos del gel polimerizado.
Se conect el electrodo negativo en la parte inferior de la cubeta y el positivo en la
parte superior, para garantizar la migracin de las protenas en el gel. Despus que se
observ el avance del colorante de migracin hasta la mitad del gel, se retir el
montaje.
Para poder observar el avance de las protenas, se realiz un proceso de tincin y
destincin utilizando Coomassie brilliant blue. Esto permiti la visualizacin de las
bandas de protaminas e histonas en el gel de electroforesis. El esquema de la carga de
las muestras de electroforesis y las bandas obtenidas pueden observarse en la Figura
15 y en la muestra colocada a su derecha.
Figura 15. Gel de electroforesis y muestra de gel
La banda ms oscura observada en la figura, es decir, el pozo de la de la derecha,
sealado como 2M es la que muestra mayor avance en el gel. Esta banda
corresponde a la banda de las protaminas. Presenta el comportamiento esperado, ya
que la migracin de las protaminas debe ser mayor debido a que poseen una densidad
de carga ms positiva y son ms pequeas que las histonas.
El pozo de la izquierda, sealado como FT, y el pozo del medio, sealado como 0,6
M, tienen una sola banda de avance moderado. Esto indica que no existen protaminas
presentes en las muestras, lo que confirma que la resina de intercambio catinico fue
capaz de retener a todas las protaminas y que no estaba saturada, eluyendo slo
histonas a una concentracin de NaCl 0,6 M.
Se puede notar que se gener una burbuja en el celofn durante el proceso de
conservacin del gel, sin embargo, no afect la visualizacin de las bandas en el
experimento.
Cuantificacin de las nucleoplasmida de cada fraccin cromatogrfica
5. Conclusiones
Se logr la obtencin de protenas entre ellas la de nuestro inters (protena
14

nucleoplasmida) mediante la aplicacin de tratamientos qumicos y mecnicos a

una muestra tomada de un plsmido.
Trabajando en condiciones de aspectico se logr que el microorganismo no se
contaminara.
Se provecho las propiedades de la protenas nucleoplasmida para separarla de las
otras protenas encontradas en el plsmido.
Los diferentes tipos de enzimas de restriccin permitieron verificar ADN en gel
de agarosa en luz ultravioleta.
La electroforesis permiti la movilidad relativa de las protenas nucleoplasmida y
de otras protenas, formando bandas observables, para cada una de las muestras
analizadas.

6. Cuestiones
Primera Parte
a) Comprobacin de la construccin de partida
1. De qu tamao se espera encontrar los fragmentos resultantes de la digestin? Haga
un esquema de electroforesis mostrando los resultados de la digestin.
En el proceso de electroforesis realizada se da una separacin de las bandas por
tamao de los fragmentos. Como muestra de referencia se usa un Marcador de Masa
Molecular (MMM), que es un marcador de kilobases. Es decir, aparecer una banda
cada 1000 pares de bases (pb). Especialmente notable ser la banda en 1 Kilobase, la
que tiene mayor intensidad y servir como gua para localizar a las otras bandas. Los
resultados esperados para la electroforesis de los fragmentos de la digestin son los
mostrados en la Figura xx.

Figura xx. Esquema de electroforesis de los fragmentos resultantes de la digestin

Los carriles indicados como 1, 2 y 3 corresponden a las diferentes combinaciones de
enzimas de restriccin usadas para la digestin:
1: Nde I + BamHI, correspondiente a las muestras 6 y RE.
2: Nde I + Xho I, correspondiente a las muestras 2 y 5.
15

3: Nde I, correspondiente a las muestras 3 y 4.

La longitud de los fragmentos de ADN fue estimada a travs del esquema de
construccin del ADN recombinante a partir de un plsmido comercial y totalmente
caracterizado. El esquema mencionado se muestra en la Figura 1 del presente informe.
Los clculos se muestran a continuacin.
-

Datos de partida
Plsmido:
Gen NP (Nucleoplasmina):
Longitud inicial = 3716 pb
Longitud Gen NP = 363 pb
Longitud diana [BamHI - Nde I] = 90
pb
Longitud diana [Xho I - BamHI] = 42
pb
Clculos
ADN recombinante:
ADN recombinante=Plsmidodiana [ BamHI Nde I ] +Gen NP=3716 pb90 pb+363 pb=
1 combinacin: Se espera la aparicin de dos fragmentos, la diana [BamHI - Nde
I] y el resto del plsmido.
1 fragmento=Gen NP=363 pb
2 fragmento= ADN RecombinanteGen NP=3989 pb363 pb=3626 pb
2 combinacin: Se espera la aparicin de dos fragmentos, siendo el primero la
diana [Xho I - BamHI] y el gen NP, y segundo el resto del plsmido.
1 fragmento=diana [ Xho I BamHI ] +Gen NP=42 pb+ 363 pb=405 pb

2 fragmento= ADN RecombinanteGen NPdiana [ Xho I BamHI ] =3989 pb363 pb42

3 combinacin: Se espera la aparicin de slo un fragmento ya que el plsmido
fue cortado con una sola enzima.
Fragmento= ADN recombinante=3989 pb
2. Para qu sirve el colorante de migracin electrofortica?
El colorante de migracin electrofortico usado fue el Naranja G. El avance de este
colorante en el gel de electroforesis indica cuando puede detenerse el experimento.
Esto debe hacerse antes de que los fragmentos migren por completo y despus que
haya diferencias de movilidad. Dado que el avance de los fragmentos de ADN sobre el
gel no es apreciable a simple vista porque no tienen coloracin, es necesario utilizar un
colorante de migracin.
El colorante de migracin est conformado por partculas coloreadas, ms pequeas
que las muestras y de la misma carga (negativa en este caso). De esta manera, el
colorante se mueve ms rpido que los fragmentos de ADN y asegura que cuando el
mismo llegue al final del gel, los fragmentos seguirn sobre el mismo.
b) Transformacin de las bacterias
1. Para qu hay que realizar un control durante la transformacin? Qu significara la
aparicin de colonias en la placa control?
El grupo control en este experimento sirve para validar los resultados de la seleccin
por ampicilina de bacterias transformadas. En el grupo control no se espera
crecimiento porque slo contiene clulas huspedes sensibles a la ampicilina. Sin
16

embargo, la aparicin de colonias en el grupo control indica que la muestra se

contamin por un microorganismo ambiental resistente a la ampicilina; o que se us
una clula husped resistente a la ampicilina por error; o que se utiliz ampicilina
caducada. Si aparecen colonias en el grupo control no se podr asegurar que las
colonias de las otras muestras sean colonias de clulas trasnformadas.
2. Para qu sirve el bromuro de etidio?

3. Por qu primero incubamos 1 hora con medio sin antibitico y en cambio al plaquear
lo hacemos sobre placas conteniendo el antibitico ampicilina?
c) Obtencin de suficiente volumen de cultivo en medio lquido
1. Por qu hay que trabajar en condiciones de asepsia en las partes b) y c)?
2. Por qu no se pica directamente la colonia sobre el volumen final deseado?
Segunda Parte
a) Procesamiento del cultivo: Recuperacin y purificacin del producto
1. Cul es la finalidad del SDS que utilizamos en esta electroforesis?
2. Por qu podemos utilizar el mismo colorante de migracin (azul de bromofenol) tanto
en el caso de la electroforesis de ADN como en la de protenas? Por qu no utilizar el
mismo colorante de migracin que vamos a utilizar en la electroforesis de protenas de
la prctica anterior (verde de metilo?
7. Bibliografa
Saperas, N. (2014). BIOTECNOLOGA: APUNTES (I). Barcelona: Servis Grafics
Copisteria Imatge, SL.
Negroni, M. (2004). MICROBIOLOGA. Buenos Aires: Editorial Panamericana.
Puerta y Uruena. (2003). PRCTICAS DE BIOLOGA MOLECULAR. Bogot:
Pontificia Universidad Javeriana.
Rodak, B. (2002). HEMATOLOGA. Mxico: Panamericana.
Brown, T. (2008). GENOMAS. Buenos Aires: Panamericana.
Garboza y Frontado. (2011). REVISTA DE LA SOCIEDAD VENEZOLANA DE
MICROBIOLOGA. Venezuela.

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