MATERIA: Biologa Celular

PROFESOR: Daniela Coria

O Henry
PRACTICA DE LABORATORIO
:
Anlisis e identificacin de bacterias
.
CARRERA
:
_________ GRUPO:________ FECHA DE APLICACIN:_________________
ALUMNA/O:_______________________________________ CALIFICACIN:

PRCTICA No. 1
PREPARACIN DE FROTIS Y TINCIONES
INTRODUCCIN
Dado que por lo general las bacterias no tienen pigmentos y son
incoloras en estado natural en su forma real. Algunos investigadores
como Robert Koch, Paul Erlich y otros vencieron esta dificultad usando
mtodos de fijacin (preparacin de frotis) y tincin de bacterias ya que
es necesario teirlas para poder observar su morfologa as como
tambin poner de manifiesto algunas caractersticas de su estructura.
Los mtodos de tincin pueden ser simples o diferenciales.
a) Tinciones Simples: son aquellas en las que solo se utiliza un colorante ya
que muchas bacterias tienen material cido (RNA o DNA) distribuido en
su clula, por lo que se colorea intensamente con colorantes bsicos
estos son colorantes nucleares ejemplo: fucsina bsica, cristal violeta,
azul de metileno entre otras.
b) Las tinciones diferenciales: son aquellas en las que se utilizan dos o ms
colorantes que ponen de manifiesto alguna(s) estructura (s) o un tipo de
clulas se tien de un color y el resto de otro.
El mtodo de tincin ms utilizado es el de la tincin del Gram., ya que
es la coloracin ms importante para bacterias fue ideada por Hans
Cristian Gram en 1884, permiti distinguir entre varias especies de
bacterias que pueden presentar morfologa colonial similar. Cuando las
bacterias retienen la combinacin cristal violeta-iodo y se tie de violeta,
son bacterias gram (+), las bacterias que se tian de rojo por la
safranina son gram negativas.

Las clulas bacterianas gram (+) se les adhiere el cristal violeta, porque
hay disminucin de la permeabilidad de la pared celular causada por el
efecto deshidratante del alcohol, mientras que las gram (-) el complejo
sale por el aumento de la permeabilidad causada por la solubilidad de
los lpidos de la pared celular al alcohol.
OBJETIVOS
1. Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias.
2. Conocer los mtodos de tinciones, aprender a realizar la tcnica de
tincin simple usada en bacteriologa.
3. Conocer y distinguir que es tincin diferencial as como aplicar la
tcnica de Tincin de Gram.
MATERIALES
-

Cultivos bacterianos de la boca

- Asa bacteriolgica
Abatelenguas
- Marcador permanente
Azul de metileno - Alcohol y algodn para limpiar su mesa
Cristal violeta 0.1% en solucin acuosa - Goteros y micro pipeta
Yodo lugol - Mecheros
Alcohol-cetona (1:1)
- Portaobjetos
Safranina - Microscopio compuesto
Agua destilada
- Solucin de cloro (desinfectante)
Aceite de inmersin
- KOH al 3%
Papel seda
PROCEDIMIENTO
a) Preparacin de Frotis y Fijado
1. Limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizar el frotis,
dejarlo secar, una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces.
2. Cuando este fri, marcar la cara donde se har el frotis.
3. Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo
4. Tomar el cultivo del que se har el frotis y flamear la boca de este.
Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de
un asa o escobilln.
5. Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa,
debidamente marcado.
***Si la muestra se encuentra en un medio lquido, basta con colocar una
pequea gota con el asa estril sobre el portaobjetos.
***Si la muestra est en un medio slido, colocar una gotita de solucin
salina o agua destilada estril sobre el portaobjetos y con el asa estril
se transfiere una pequea muestra de bacterias en la gotita.

6. Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda

con el asa la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme.
Secar al aire.
7. Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.
8. Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10 min
o hasta que seque completamente.
9. Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero,
pasndolo tres veces a travs de la llama con la muestra hacia
arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre el dorso de la mano.
b) Tincin Simple
1.- Cubra el frotis con la solucin de azul de metileno durante 2 minutos.
a. Lave el portaobjetos, con una corriente suave de agua, de
manera que el agua no incida directamente sobre la
preparacin hasta que ya no escurra colorante.
b. Deje secar el frotis al aire.
c. Observar al microscopio con el objetivo de 100X.
c) Tincin de Gram:
Consta de cuatro reactivos diferentes: el cristal violeta es el primer
colorante o colorante primario que imparte color a todos los
microorganismos del frotis.
Enseguida se utiliza una solucin del yodo (lugol), la que acta como
mordente (que aumenta o refuerza la unin, entre un colorante y un
sustrato), el tercer reactivo es un decolorante que disuelve y arrastra el
colorante primario, los organismos que resisten la decoloracin y
conserva una tonalidad azul son Gram
(7), el cuarto reactivo es el colorante de contraste la safranina que se
aplica como contra tincin ya que los organismos se destieron con el
decolorante, ahora toman el color rojo de la safranina denominndose
gram (-).
PASOS A SEGUIR EN LA TCNICA DE GRAM
1. Preparar los frotis como en la tcnica de tinciones simples. Y
preparacin de frotis y fijado.
2. Preparar los frotis con cultivos.
3. Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto.
4. Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
5. Cubrir los frotis con yodo lugol durante 1 minuto.
6. Lavar como se indic en el paso (4).
7. Decolorar con alcohol-acetona hasta que no escurra lquido
azul.
8. Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).

9. Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.

10.Lavar como en el paso (4).
11.Observar al microscopio a inmersin. OB (100 X). Ver figura
Tincin Gram

Nota: Al finalizar el proceso de Tincin de Gram, las bacterias grampositivas se tien de color prpura-violeta y las bacterias gramnegativas se tien de color rojizo-rosado

En la practica separamos muestras de dos de nuestros

compaeros, dejando 4 muestras de cada uno, extrajimos la
muestra con unas lengetas de madera, de las ocho muestras
recolectadas observamos 1 de cada compaero en el
microscopio sin ningn tipo de tincin a 100x , previamente
preparado la muestra en un portaobjetos y con una gota de
aceite de inmersin cada una, no se logro observar nada en la
muestra tomada por lo que procedimos a continuar con las
siguientes muestras, tindolas antes de observarlas, se
tieron con el proceso antes mencionado en la practica
siguiendo especficamente los pasos y con ayuda de nuestra
profesora,
12.Preparar los frotis como en la tcnica de tinciones simples. Y
preparacin de frotis y fijado.
13.Preparar los frotis con cultivos.
14.Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto.
15.Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
16.Cubrir los frotis con yodo lugol durante 1 minuto.
17.Lavar como se indic en el paso (4).
18.Decolorar con alcohol-acetona hasta que no escurra lquido
azul.
19.Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).
20.Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.
21.Lavar como en el paso (4)

Al observar las nuevas tinciones nos dimos cuenta de que el

microscopio estaba daado, dado a que no se observaba
ningn cambio con respecto a las muestras sin teir, por lo
tanto limpiamos el lente a 100x del microscopio con papel
encerado para no daar el cristal.
Una vez acabada la limpieza observamos en la muestra una
estructura de color morado pero sin forma alguna, llegamos a
la conclusin de que el microscopio estaba daado as que
procedimos a hacer el cambio en el almacn, con el nuevo
microscopio. Logramos observar diferentes estructuras
dependiendo de la muestra vista con forma de vacilo peor con
una mancha en el lente derecho de la muestra que se
quedaba permanente.