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NOÇÕES GERAIS PARA AS CULTURAS IN VITRO
NOÇÕES GERAIS PARA AS CULTURAS IN VITRO

NOÇÕES GERAIS PARA AS CULTURAS IN VITRO

NOÇÕES GERAIS PARA AS CULTURAS IN VITRO
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Recipientes

2 Recipientes
2 Recipientes
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Recipientes

3 Recipientes
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Equipamento de laboratório

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Equipamento de laboratório 6  Área para preparação de meios  Equipamento para purificar a água

Área para preparação de meios

Equipamento para purificar a água (água destilada e desionizada fornecida em contentores plásticos)

Frigorifico

Balanças, sendo uma analítica

Placa de aquecimento

Agitador

Aparelho de pH

Distribuidor de meio/bomba peristáltica

Material apropriado para colocar o meio para autoclavar

Estufa para secar, se necessário, materiais após esterilização

Estufa capaz de esterilizar material

Filtros para esterilizar soluções não autoclaváveis

Pinças, bisturis

Material diverso de uso corrente em laboratórios

Equipamento de laboratório

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Equipamento de laboratório 7  Área para inoculação/transferência de material

Área para inoculação/transferência de material

Equipamento de laboratório 7  Área para inoculação/transferência de material

Equipamento de laboratório

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Equipamento de laboratório 8  Área de crescimento  ambiente com temperatura, fotoperiodo e humidade controlados;

Área de crescimento

ambiente com temperatura, fotoperiodo e humidade controlados;

A humidade relativa é difícil de controlar dentro dos recipientes de cultura, no entanto, grandes flutuações fora podem causar efeitos negativos;

Actualmente recorre-se a câmaras de cultura onde os parâmetros referidos podem ser controlados.

Trabalhar em assepsia

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Trabalhar em assepsia 9  Objectivo: reduzir os riscos de contaminação e, consequentemente, a perda de

Objectivo: reduzir os riscos de contaminação e, consequentemente, a perda de tempo, de reagentes e de material biológico.

As fontes mais comuns de contaminação são com fungos e bactérias e são introduzidas pelo operador, ar, bancadas, soluções e recipientes.

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Técnicas assépticas

10 Técnicas assépticas  Manter a porta sempre fechada (sem correntes de ar). Não fumar ou

Manter a porta sempre fechada (sem correntes de ar). Não fumar ou comer na sala. Evitar a permanência de pessoas que não estejam directamente envolvidas no trabalho naquele momento.

Lavar mãos e braços com água e sabão antes de entrar na sala de cultura.

Limpar mãos e câmara de fluxo laminar com álcool a 70% antes de iniciar o trabalho.

Planear as etapas necessárias à realização do protocolo para evitar a saída do fluxo laminar.

Todo o material deverá ser rigorosamente limpo com álcool a 70% antes de ser levado para a área interna da câmara de fluxo laminar.

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Técnicas assépticas

11 Técnicas assépticas  A pipetagem deve ser feita com muito cuidado e atenção - num

A pipetagem deve ser feita com muito cuidado e atenção - num local aberto as bocas das garrafas e as tampas deves ser flamejadas antes e após a abertura e antes e após o fecho. As pipetas devem ser flamejadas antes do uso;

As tampas devem ser colocadas de na posição invertida em cima duma superfície limpa, ou então segura na mão durante a pipetagem;

As garrafas, quando abertas, não devem permanecer na vertical, mas num ângulo o mais baixo possível sem risco de verter os líquidos;

Ao trabalhar na câmara de fluxo laminar, não deixe as mãos ou qualquer outro material entre um frasco aberto ou pipetas estéreis e o filtro de ar.

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Técnicas assépticas

12 Técnicas assépticas  Evitar debruçar-se sobre a mesa da câmara de fluxo laminar, ou tocar

Evitar debruçar-se sobre a mesa da câmara de fluxo laminar, ou tocar noutra pipeta a não ser aquela que será usada.

Limitar

a

entrada

de

papel

e

lápis

pois

soltam

partículas.

Abrir as embalagens de material descartável dentro do fluxo laminar e fechá-las com fita adesiva, antes de retirá-las de dentro do fluxo.

Controlar o bom funcionamento dos aparelhos (fluxo laminar, estufas, microscópios, ar-condicionado, bomba de aspiração, banho-maria, etc.).

Limpar e guardar tudo ao terminar.

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Técnicas assépticas

13 Técnicas assépticas http://www.youtube.com/watc h?v=zd0iVJrQwyY &feature=related

&feature=related

Esterilização de materiais

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Esterilização de materiais 14  Esterilização: eliminação completa de todos os microrganismos na forma vegetativa

Esterilização: eliminação completa de todos os microrganismos na forma vegetativa e esporulada;

Desinfecção: destruição ou inactivação

dos microrganismos na forma

vegetativa, mas geralmente não afecta os esporos bacterianos.

Escolha do processo de esterilização:

bacterianos.  Escolha do processo de esterilização: material a ser esterilizado agente esterilizante compatível

material a ser esterilizado

agente esterilizante compatível

microrganismos alvo

Esterilização de materiais

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Esterilização de materiais 15  Avaliação da Esterilização  Química (ex. Fita que muda de cor

Avaliação da Esterilização

Química (ex. Fita que muda de cor ao atingir certa temperatura). Biológica (ex. ampola lacrada que vai ao autoclave e fica, supostamente, desinfectada; ao colocar essa mesma ampola na estufa não deverá revelar-se crescimento de nenhum microrganismo; caso se verifique – p.ex. Bacillus subtilis ou Geobacillus stearothermophylus – recomenda-se verificação do autoclave).

Esterilização de materiais

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Esterilização de materiais 16  Destruição física dos microrganismos através do ar seco e quente, vapor

Destruição física dos microrganismos através do ar seco e quente, vapor e irradiação (ultravioleta ou gama);

Destruição

química

usando

compostos

esterilizantes

(óxido de etileno, álcool, hipoclorito, etc);

Eliminação física dos microrganismos por filtração e lavagem.

Esterilização de materiais

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Esterilização de materiais 17  Destruição física dos microrganismos através do ar seco e quente, vapor

Destruição física dos microrganismos através do ar seco e quente, vapor e irradiação (ultravioleta ou gama);

Destruição

química

usando

compostos

esterilizantes

(óxido de etileno, álcool, hipoclorito, etc);

Eliminação física dos microrganismos por filtração e lavagem.

Aquecimento – calor seco e húmido

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Aquecimento – calor seco e húmido 18  Calor húmido  desnaturação e a coagulação de

Calor húmido

desnaturação e a coagulação de proteínas vitais;

o processo de desnaturação exige temperaturas e tempos de exposição menores;

a propagação do calor em ambiente húmido é mais rápida;

fungos, bactérias e leveduras são destruídas a temperaturas mais baixas pelo calor húmido (50-70ºC), entre 5 e 10 minutos;

os endosporos precisam de temperaturas mais elevadas (120ºC);

Autoclave – 121º, 15 a 20 min., 1.02 atm

Calor seco

oxidação dos constituintes orgânicos das células;

requer temperatura e tempo maiores que o calor húmido;

aplica-se apenas em casos de materiais impermeáveis ou danificáveis pela humidade;

Fornos e Estufas 180º, 1 a 2 horas

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Autoclave

19 Autoclave
19 Autoclave
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Autoclave

20 Autoclave  ineficiente para microrganismos presentes em matérias impermeáveis ao vapor;  não pode ser

ineficiente

para

microrganismos

presentes

em

matérias impermeáveis ao vapor;

não

pode

ser

utilizado

para

materiais

termossensiveis, como vitaminas e proteínas, que

possam estar nos meios de cultura.

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Radiações

21 Radiações  Radiações ionizantes (X e gama):  Elevada energia e poder de penetração; 

Radiações ionizantes (X e gama):

Elevada energia e poder de penetração;

Actuam sobre os constituintes da célula, nomeadamente DNA e proteínas celulares;

Usam-se

para

esterilização

de

material

plástico

(seringas, placas de Petri, etc) e borracha;

não

podem

ser

utilizadas

para

materiais

termossensiveis, como vitaminas e proteínas, que possam estar nos meios de cultura.

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Radiações

22 Radiações  Radiações não ionizantes (raios UV, 240-280 nm):  Fraca energia e fraco poder

Radiações não ionizantes (raios UV, 240-280

nm):

Fraca energia e fraco poder de penetração; Actuam ao nível do DNA impedindo a sua replicação ou alterando-o; Utilizam-se na desinfecção do ar de salas, recintos hospitalares, câmaras de fluxo; Altamente agressivas para a pele e para os olhos.

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Filtração

23 Filtração  Utiliza-se sempre que se pretende eliminar as bactérias dos produtos líquidos que se

Utiliza-se sempre que se pretende eliminar as bactérias dos produtos líquidos que se alteram com o calor (termolábeis) ou de gases (ex. ar atmosférico);

Este processo difere dos outros métodos de esterilização porque não envolve a destruição de microrganismos, mas sim a sua remoção através da passagem por filtros sintéticos, granulares ou fibrosos;

Os filtros são de material diverso tal como amianto, porcelana, celulose (acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato);

Os filtros de membrana de 0,2 um (micrómetros) são utilizados para filtrar soro, plasma, antibióticos, vitaminas.

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Agentes químicos

24 Agentes químicos  Esterilizantes – agentes químicos que eliminam de um objecto ou material biológico

Esterilizantes – agentes químicos que eliminam de um objecto ou material biológico todas as formas de vida microbiana. Óxido de etileno - é um gás altamente solúvel em água e violentamente explosivo. Utilizado na esterilização de material termosensível. A esterilização faz-se em câmaras apropriadas. Actualmente tem vindo a ser substituído pelo plasma de peróxido e pelo formaldeído a 2% a baixa temperatura. Estes métodos têm a vantagem de não necessitarem de período de arejamento exigido pelo óxido de etileno.

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Agentes químicos

25 Agentes químicos  Desinfectantes e antisépticos  os desinfectantes podem ter sobre os microrganismos as

Desinfectantes e antisépticos

os desinfectantes podem ter sobre os microrganismos as seguintes acções:

Bactericida / Bacteriostático/ Bacteriolítico (efectuando a lise da parede da célula);

Fungicida / Fungistático;

Virucida / Virustático;

Esporicida.

- Bactericida – induz a morte celular sem ocorrer lise.

- Bacteriostático – inibe crescimento e divisão, sem morte celular.

- Bacteriolítico – induz a morte celular por lise.

Agentes químicos - Desinfectantes

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Agentes químicos - Desinfectantes 26  Compostos fenólicos – inactivam as proteínas e podem interagir com

Compostos fenólicos – inactivam as proteínas e podem interagir com o DNA. Muito usados na descontaminação de instrumentos clínicos.

Álcool (etanol, propanóis) – coagulam as proteínas e solubilizam lípidos de que resulta a destruição das membranas celulares.

Cloro (hipoclorito e compostos N-clorados) – oxidantes que conduzem à destruição da actividade de proteínas celulares.

Iodo (tintura de iodo ou iodopovidona) – destruição da actividade de proteínas e enzimas essenciais por oxidação.

Agentes químicos - Desinfectantes

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Agentes químicos - Desinfectantes 27  Peróxido de Hidrogénio – oxidante que reage com componentes celulares

Peróxido de Hidrogénio – oxidante que reage com componentes celulares essenciais, como os lípidos membranares e DNA.

Sais metálicos e compostos mercuriais (nitrato de prata, mercurocromo,mertiolato): inactivação das proteínas celulares.

Detergentes catiónicos (compostos quaternários de amónio - cetrimida): inactivam as proteínas e alteram a membrana citoplasmática.

Clorexidina: parece ligar-se às superfícies celulares, ocasionando a desorganização estrutural e funcional da membrana.

Ozono.

Desinfeção dos explantes

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Desinfeção dos explantes 28  A associação explante-meio e as condições físicas de incubação das culturas

A associação explante-meio e as condições físicas de incubação das culturas in vitro, tornam o ambiente propicio ao desenvolvimento de microrganismos (principalmente fungos e bactérias) as quais podem competir com os explantes pelos nutrientes do meio ou ainda modificar a composição química tornando-o impróprio para o desenvolvimento das culturas;

A desinfeção é complicada quando há microrganismos endógenos, em tecidos com reentrâncias ou pilosidade excessiva ou explantes próximos do solo (raízes, tubérculos)

Os microorganismos endógenos muitas vezes não se manifestam nas fases iniciais, tornando-se visíveis após semanas em cultura

Tratamentos das plantas doadoras dos explantes

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Tratamentos das plantas doadoras dos explantes 29
Tratamentos das plantas doadoras dos explantes 29

Desinfeção dos explantes

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Desinfeção dos explantes 30  Preparação do material vegetal de “stock”  O material vegetal proveniente

Preparação do material vegetal de “stock”

O material vegetal proveniente do campo está normalmente mais contaminado;

Por vezes é necessário fazer um tratamento prévio do material vegetal com fungicidas e bactericidas;

“forçar” uma rebentação em condições controladas pode ajudar a obter material menos contaminado;

Outra opção é germinar semente desinfetadas;

O material do qual se vão preparar os explantes pode ser lavado com uma solução detergente e ficar durante 1-2 h em água corrente.

Desinfeção dos explantes

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Desinfeção dos explantes 31  Hipoclorito de sódio  Lixívia – desinfetante mais comum;  Facilmente

Hipoclorito de sódio

Lixívia – desinfetante mais comum;

Facilmente disponível e pode ser diluído para concentrações ideais;

A lixívia comercial (à base de hipoclorito de sódio diluído, sem corantes nem detergentes, normalmente possui uma concentração de hipoclorito de sódio de 2 % (20gr/l);

A diluição normal é de 10 a 20% (conc. final de hipoclorito de sódio de 0,2 a 0,4%);

O material vegetal é normalmente submergido nesta solução durante 10-20 minutos;

O equilíbrio entre a concentração e o tempo deve ser ajustado experimentalmente a cada tipo de explante.

Desinfeção dos explantes

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Desinfeção dos explantes 32  Etanol  Poderoso esterilizante mas também fitotóxico;  O material vegetal

Etanol

Poderoso esterilizante mas também fitotóxico;

O material vegetal deve estar exposto ao etanol apenas alguns segundos ou minutos;

Normalmente utiliza-se o etanol a 70% antes dos outros tratamentos;

Quanto mais “tenro” for o material vegetal, mais danificado pode ficar;

Sementes, gomos por abrir ou dormentes podem ser tratados por mais tempo.

Desinfeção dos explantes

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Desinfeção dos explantes 33  Outros desinfetantes  Hipoclorito de cálcio  Peróxido de hidrogénio 

Outros desinfetantes

Hipoclorito de cálcio

Peróxido de hidrogénio

Aumentar a eficácia da desinfeção

Adicionar tween 20 à solução de hipoclorito de sódio

Agitar as soluções durante o processo de desinfeção

Enxaguamento

Após o processo de desinfeção o material vegetal deve ser abundantemente enxaguado em água estéril e em ambiente asséptico.

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Calos cultivados em meios nutritivos esterilizados por autoclavagem (A) e por meio químico (B). Os números 0, 10, 20, 30 e 40 correspondem às concentrações de sacarose (g L -1 )

correspondem às concentrações de sacarose (g L - 1 ) Peso médio da biomassa fresca dos

Peso médio da biomassa fresca dos calos de P. glomerata, nos dois métodos de esterilização. A curva em azul corresponde aos tratamentos esterilizados por autoclavagem e a curva a vermelho corresponde aos tratamentos esterilizados quimicamente. Os dados acompanhados de, pelo menos uma mesma letra, são estatisticamente iguais segundo o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

acompanhados de, pelo menos uma mesma letra, são estatisticamente iguais segundo o Teste de Tukey a
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Número médio de ramos de Eucalyptus pellita por cultura, em função das diferentes concentrações (%) de hipoclorito de sódio no meio de cultura. Os dados acompanhados de pelo menos uma mesma letra, são estatisticamente iguais segundo o Teste de Tukey a 5% de probabilidade. * A concentração zero de cloro ativo total corresponde ao tratamento autoclavado.

36 O tratamento autoclavado A e os tratamentos B, C, D e E, esterilizados quimicamente,
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36 O tratamento autoclavado A e os tratamentos B, C, D e E, esterilizados quimicamente, apresentaram

O tratamento autoclavado A e os tratamentos B, C, D e E, esterilizados quimicamente, apresentaram número de culturas contaminadas estatisticamente iguais entre si e menores do que o valor apresentado pelo tratamento F. A partir da concentração de 0,0005% de cloro ativo total no meio de cultura não ocorreu qualquer contaminação, indicando serem estas concentrações seguras neste sentido.