NOES GERAIS PARA

AS CULTURAS IN VITRO

Recipientes
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Recipientes
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Equipamento de laboratrio
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rea para preparao de meios

Equipamento para purificar a gua (gua destilada e desionizada fornecida em
contentores plsticos)
Frigorifico
Balanas, sendo uma analtica
Placa de aquecimento
Agitador
Aparelho de pH
Distribuidor de meio/bomba peristltica
Material apropriado para colocar o meio para autoclavar
Estufa para secar, se necessrio, materiais aps esterilizao
Estufa capaz de esterilizar material
Filtros para esterilizar solues no autoclavveis
Pinas, bisturis
Material diverso de uso corrente em laboratrios

Equipamento de laboratrio
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rea para inoculao/transferncia de material

Equipamento de laboratrio
8

rea de crescimento
ambiente

com temperatura, fotoperiodo e humidade

controlados;
A

humidade relativa difcil de controlar dentro dos

recipientes de cultura, no entanto, grandes flutuaes

fora podem causar efeitos negativos;
Actualmente

recorre-se a cmaras de cultura onde os

parmetros referidos podem ser controlados.

Trabalhar em assepsia
9

Objectivo: reduzir os riscos de contaminao e,

consequentemente,

perda

de

tempo,

de

reagentes e de material biolgico.

As fontes mais comuns de contaminao so com

fungos e bactrias e so introduzidas pelo
operador, ar, bancadas, solues e recipientes.

Tcnicas asspticas
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Manter a porta sempre fechada (sem correntes de ar). No

fumar ou comer na sala. Evitar a permanncia de pessoas
que no estejam directamente envolvidas no trabalho
naquele momento.
Lavar mos e braos com gua e sabo antes de entrar na
sala de cultura.
Limpar mos e cmara de fluxo laminar com lcool a 70%
antes de iniciar o trabalho.
Planear as etapas necessrias realizao do protocolo
para evitar a sada do fluxo laminar.
Todo o material dever ser rigorosamente limpo com lcool
a 70% antes de ser levado para a rea interna da cmara
de fluxo laminar.

Tcnicas asspticas
11

A pipetagem deve ser feita com muito cuidado e ateno num local aberto as bocas das garrafas e as tampas deves
ser flamejadas antes e aps a abertura e antes e aps o
fecho. As pipetas devem ser flamejadas antes do uso;
As tampas devem ser colocadas de na posio invertida em
cima duma superfcie limpa, ou ento segura na mo durante
a pipetagem;
As garrafas, quando abertas, no devem permanecer na
vertical, mas num ngulo o mais baixo possvel sem risco de
verter os lquidos;
Ao trabalhar na cmara de fluxo laminar, no deixe as mos
ou qualquer outro material entre um frasco aberto ou pipetas
estreis e o filtro de ar.

Tcnicas asspticas
12

Evitar debruar-se sobre a mesa da cmara de fluxo

laminar, ou tocar noutra pipeta a no ser aquela que
ser usada.
Limitar a entrada de papel e lpis pois soltam
partculas.
Abrir as embalagens de material descartvel dentro
do fluxo laminar e fech-las com fita adesiva, antes de
retir-las de dentro do fluxo.
Controlar o bom funcionamento dos aparelhos (fluxo
laminar, estufas, microscpios, ar-condicionado, bomba
de aspirao, banho-maria, etc.).
Limpar e guardar tudo ao terminar.

Tcnicas asspticas
13

http://www.youtube.com/watch?v=zd0iVJrQwyY
&feature=related

Esterilizao de materiais
14

Esterilizao: eliminao completa de todos os microrganismos na forma

vegetativa e esporulada;

Desinfeco: destruio ou inactivao

dos microrganismos na forma

vegetativa, mas geralmente no afecta os esporos bacterianos.

Escolha do processo de esterilizao:

material a ser esterilizado
agente esterilizante compatvel
microrganismos alvo

Esterilizao de materiais
15

Avaliao da Esterilizao
Qumica

(ex. Fita que muda de cor ao atingir certa

temperatura).
Biolgica (ex. ampola lacrada que vai ao autoclave e
fica, supostamente, desinfectada; ao colocar essa
mesma ampola na estufa no dever revelar-se
crescimento de nenhum microrganismo; caso se verifique
p.ex. Bacillus subtilis ou Geobacillus stearothermophylus
recomenda-se verificao do autoclave).

Esterilizao de materiais
16

Destruio fsica dos microrganismos atravs do ar seco

e quente, vapor e irradiao (ultravioleta ou gama);

Destruio qumica usando compostos esterilizantes

(xido de etileno, lcool, hipoclorito, etc);

Eliminao fsica dos microrganismos por filtrao e

lavagem.

Esterilizao de materiais
17

Destruio fsica dos microrganismos atravs do ar seco

e quente, vapor e irradiao (ultravioleta ou gama);

Destruio qumica usando compostos esterilizantes

(xido de etileno, lcool, hipoclorito, etc);

Eliminao fsica dos microrganismos por filtrao e

lavagem.

Aquecimento calor seco e hmido

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Calor hmido

desnaturao e a coagulao de protenas

vitais;

o processo de desnaturao exige

temperaturas e tempos de exposio menores;

a propagao do calor em ambiente hmido

mais rpida;

fungos, bactrias e leveduras so destrudas a

temperaturas mais baixas pelo calor hmido
(50-70C), entre 5 e 10 minutos;

os endosporos precisam de temperaturas mais

elevadas (120C);

Autoclave 121, 15 a 20 min., 1.02 atm

Calor seco

oxidao dos constituintes

orgnicos das clulas;
requer temperatura e tempo
maiores que o calor hmido;
aplica-se apenas em casos de
materiais impermeveis ou
danificveis pela humidade;
Fornos e Estufas 180, 1 a 2
horas

Autoclave
19

Autoclave
20

ineficiente para microrganismos presentes em

matrias impermeveis ao vapor;

no

pode

ser

utilizado

para

materiais

termossensiveis, como vitaminas e protenas, que

possam estar nos meios de cultura.

Radiaes
21

Radiaes ionizantes (X e gama):

Elevada

energia e poder de penetrao;

Actuam sobre os constituintes da clula, nomeadamente
DNA e protenas celulares;
Usam-se para esterilizao de material plstico
(seringas, placas de Petri, etc) e borracha;
no
podem ser utilizadas para materiais
termossensiveis, como vitaminas e protenas, que
possam estar nos meios de cultura.

Radiaes
22

Radiaes no ionizantes (raios UV, 240-280

nm):
Fraca

energia e fraco poder de penetrao;

Actuam ao nvel do DNA impedindo a sua replicao
ou alterando-o;
Utilizam-se na desinfeco do ar de salas, recintos
hospitalares, cmaras de fluxo;
Altamente agressivas para a pele e para os olhos.

Filtrao
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Utiliza-se sempre que se pretende eliminar as bactrias dos

produtos lquidos que se alteram com o calor (termolbeis) ou de
gases (ex. ar atmosfrico);

Este processo difere dos outros mtodos de esterilizao porque

no envolve a destruio de microrganismos, mas sim a sua remoo
atravs da passagem por filtros sintticos, granulares ou fibrosos;

Os filtros so de material diverso tal como amianto, porcelana,

celulose (acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato);

Os filtros de membrana de 0,2 um (micrmetros) so utilizados para

filtrar soro, plasma, antibiticos, vitaminas.

Agentes qumicos
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Esterilizantes agentes qumicos que eliminam de um

objecto ou material biolgico todas as formas de vida
microbiana.
xido de etileno - um gs altamente solvel em gua e
violentamente explosivo. Utilizado na esterilizao de
material termosensvel.
A esterilizao faz-se em cmaras apropriadas.
Actualmente tem vindo a ser substitudo pelo plasma de
perxido e pelo formaldedo a 2% a baixa temperatura.
Estes mtodos tm a vantagem de no necessitarem de
perodo de arejamento exigido pelo xido de etileno.

Agentes qumicos
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Desinfectantes e antispticos

os desinfectantes podem ter sobre os microrganismos as

seguintes aces:
Bactericida / Bacteriosttico/ Bacterioltico
(efectuando a lise da parede da clula);
Fungicida / Fungisttico;
Virucida / Virusttico;
Esporicida.

- Bactericida induz a morte celular sem ocorrer lise.

- Bacteriosttico inibe crescimento e diviso, sem morte celular.
- Bacterioltico induz a morte celular por lise.

Agentes qumicos - Desinfectantes

26

Compostos fenlicos inactivam as protenas e podem

interagir com o DNA. Muito usados na descontaminao de
instrumentos clnicos.
lcool (etanol, propanis) coagulam as protenas e
solubilizam lpidos de que resulta a destruio das membranas
celulares.
Cloro (hipoclorito e compostos N-clorados) oxidantes que
conduzem destruio da actividade de protenas celulares.
Iodo (tintura de iodo ou iodopovidona) destruio da
actividade de protenas e enzimas essenciais por oxidao.

Agentes qumicos - Desinfectantes

27

Perxido de Hidrognio oxidante que reage com

componentes celulares essenciais, como os lpidos
membranares e DNA.
Sais metlicos e compostos mercuriais (nitrato de prata,
mercurocromo,mertiolato): inactivao das protenas celulares.
Detergentes catinicos (compostos quaternrios de amnio cetrimida): inactivam as protenas e alteram a membrana
citoplasmtica.
Clorexidina: parece ligar-se s superfcies celulares,
ocasionando a desorganizao estrutural e funcional da
membrana.
Ozono.

Desinfeo dos explantes

28

A associao explante-meio e as condies fsicas de

incubao das culturas in vitro, tornam o ambiente propicio ao
desenvolvimento de microrganismos (principalmente fungos e
bactrias) as quais podem competir com os explantes pelos
nutrientes do meio ou ainda modificar a composio qumica
tornando-o imprprio para o desenvolvimento das culturas;
A desinfeo complicada quando h microrganismos
endgenos, em tecidos com reentrncias ou pilosidade
excessiva ou explantes prximos do solo (razes, tubrculos)
Os microorganismos endgenos muitas vezes no se
manifestam nas fases iniciais, tornando-se visveis aps
semanas em cultura

Tratamentos das plantas doadoras dos

explantes
29

Desinfeo dos explantes

30

Preparao do material vegetal de stock

O material vegetal proveniente do campo est
normalmente mais contaminado;
Por vezes necessrio fazer um tratamento prvio do
material vegetal com fungicidas e bactericidas;
forar uma rebentao em condies controladas pode
ajudar a obter material menos contaminado;
Outra opo germinar semente desinfetadas;
O material do qual se vo preparar os explantes pode ser
lavado com uma soluo detergente e ficar durante 1-2 h
em gua corrente.

Desinfeo dos explantes

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Hipoclorito de sdio
Lixvia desinfetante mais comum;
Facilmente disponvel e pode ser diludo para concentraes
ideais;
A lixvia comercial ( base de hipoclorito de sdio diludo, sem

corantes nem detergentes, normalmente possui uma concentrao

de hipoclorito de sdio de 2 % (20gr/l);
A diluio normal de 10 a 20% (conc. final de hipoclorito de
sdio de 0,2 a 0,4%);
O material vegetal normalmente submergido nesta soluo
durante 10-20 minutos;
O equilbrio entre a concentrao e o tempo deve ser ajustado
experimentalmente a cada tipo de explante.

Desinfeo dos explantes

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Etanol
Poderoso

esterilizante mas tambm fitotxico;

O material vegetal deve estar exposto ao etanol
apenas alguns segundos ou minutos;
Normalmente utiliza-se o etanol a 70% antes dos
outros tratamentos;
Quanto mais tenro for o material vegetal, mais
danificado pode ficar;
Sementes, gomos por abrir ou dormentes podem ser
tratados por mais tempo.

Desinfeo dos explantes

33

Outros desinfetantes
Hipoclorito de clcio
Perxido de hidrognio

Aumentar a eficcia da desinfeo

Adicionar tween 20 soluo de hipoclorito de sdio
Agitar as solues durante o processo de desinfeo

Enxaguamento

Aps o processo de desinfeo o material vegetal deve ser

abundantemente enxaguado em gua estril e em
ambiente assptico.

34

Calos cultivados em meios nutritivos esterilizados por

autoclavagem (A) e por meio qumico (B). Os nmeros
0, 10, 20, 30 e 40 correspondem s concentraes
de sacarose (g L-1)

Peso mdio da biomassa fresca dos calos de P.

glomerata, nos dois mtodos de esterilizao. A
curva em azul corresponde aos tratamentos
esterilizados por autoclavagem e a curva a
vermelho corresponde aos tratamentos
esterilizados quimicamente. Os dados
acompanhados de, pelo menos uma mesma
letra, so estatisticamente iguais segundo o
Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

35

Nmero mdio de ramos de Eucalyptus pellita por cultura, em funo das

diferentes concentraes (%) de hipoclorito de sdio no meio de cultura. Os
dados acompanhados de pelo menos uma mesma letra, so estatisticamente
iguais segundo o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.
* A concentrao zero de cloro ativo total corresponde ao tratamento
autoclavado.

36

O tratamento autoclavado A e os tratamentos B, C, D e E,

esterilizados quimicamente, apresentaram nmero de culturas
contaminadas estatisticamente iguais entre si e menores do que o
valor apresentado pelo tratamento F. A partir da concentrao de
0,0005% de cloro ativo total no meio de cultura no ocorreu
qualquer contaminao, indicando serem estas concentraes
seguras neste sentido.