FUNDACIN UNIVERSIDAD DE AMRICA

INGENIERA QUMICA
BIOPROCESOS
III PRCTICA DE LABORATORIO
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA DE LA INVERTASA

1. OBJETIVOS

Reconocer el concepto de reaccin enzimtica

Desarrollar habilidades de trabajo en laboratorio con enzimas comerciales
Determinar las velocidades de actividad enzimtica de la invertasa

2. INTRODUCCIN
La fuente principal en la produccin industrial de enzimas por mtodos biotecnolgicos
son las clulas microbianas, como bacterias, mohos y levaduras. Sin embargo, la
quimiotripsina y renina se producen industrialmente de fuentes animales, como del
pncreas y el estmago de ovejas, aunque con los avances en biologa molecular el
proceso industrial biotecnolgico de este tipo de enzimas actualmente se realiza con
microrganismos modificados genticamente. Otras fuentes son los vegetales, ya sea de
tejidos o clulas, entre las enzimas producidas por vegetales estn la bromelina, la ficina y
la papana, entre otras.
El conocimiento en la produccin de enzimas ha permitido establecer que estas se
elaboran durante el crecimiento celular de un organismo, es decir, son compuestos
primarios del metabolismo de cualquier organismo y su produccin est asociada a la
clase de sustratos presentes en el medio extracelular, lo cual induce las etapas de
transcripcin y traduccin de protenas, en las que se incluyen las enzimas, as como para
iniciar las transformaciones metablicos que proporcionan energa a la clula y as inducir
los pasos de la divisin celular. Estos biocatalizadores se encuentran extracelular como
intracelularmente, no obstante, algunas existen de forma basal en la clula y su
concentracin no es diferente en los procesos de divisin celular, es decir, no aumentan ni
disminuyen.
La produccin industrial de enzimas se basa en el medio de cultivo en el cual se
desarrollan las fuentes u organismos de donde proceden las enzimas.
El efecto de la concentracin del sustrato en la enzima cuando se evala
experimentalmente presenta un comportamiento cintico hiperblico, en el cual se
muestra la saturacin de la enzima por parte del sustrato, este procedimiento de
saturacin hiperblico es normal para todas las enzimas michaelinas. Sin embargo, las
enzimas alostericas presentan curvas de saturacin sigmoideas.
Segn Michaelis y Menten el Km indica la especificidad de la Enzima por su sustrato y
Vmax es la velocidad mxima que indica la capacidad cataltica de la enzima frente a su
sustrato.

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3. MATERIALES

3.1 Equipos

Dos baos serolgicos uno a 60 C y otro a 92 C

Espectrofotmetro a 540 nm y celdas para espectrofotmetro

3.2 Reactivos

Reactivo DNS
Solucin de sacarosa 50g/L
Agua destilada
Hielo

3.3 Materiales

Termmetro
4 vasos de precipitado de 50 ml
10 tubos de ensayo con tapa
10 tubos de ensayo sin tapa
1 Gradilla para tubos de ensayo
2 pipetas 1 ml graduadas
4 pipetas de 5 ml graduadas
1 pipeta graduada de 10 ml
2 pipeteadores
5 agitadores de vidrio
Papel Reynolds
1 Cronometro

4. METODOLOGIA
a) De la solucin de sacarosa (50 g/L) preparar las concentraciones de la tabla 1. En
tubos de ensayo previamente rotulados con tapa
Tabla 1. Concentraciones de sustrato
Tubo

1
2
3
4
5

Solucin
sacarosa
(ml)
0.2
0.4
0.6
0.8
1

Agua
(ml)
0.8
0.6
0.4
0.2
0

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b) Preparar las mezclas que se indican en la tabla 2, sobre las soluciones de
sacarosa preparadas anteriormente
Tabla 2. Variacin de la concentracin de sustrato para la reaccin enzimtica
Tubo

Sacarosa
(ml)

1
2
3
4
5
B

1
1
1
1
1
0

Tampn acetato
80 mM pH 4,5
(ml)
2
2
2
2
2
2

Agua
destilada
(ml)
1
1
1
1
1
2

Enzima
(ml)

Absorbancia
(540 nm)

1
1
1
1
1
1

Elaborar un blanco con 1 ml de la enzima, 2 ml de agua destilada y 2 ml de tampn

acetato 80 mM a pH 4,5
c) Calentar a 60 C por 15 minutos cada tubo. Introducir un agitador a cada tubo de
ensayo y agitar constantemente durante la reaccin
d) Pasado el tiempo de incubacin tomar 0,5 ml de cada tubo en tubos de ensayo
aparte previamente rotulados, adicionar 2 ml del reactivo DNS, incubar
posteriormente a 92 C durante 10 minutos.
e) Enfriar en bao de agua hielo y leer absorbancia a 540 nm. Calibrar el equipo con
un blanco de DNS (0,5 ml de agua + 2 ml de DNS, previamente incubado a 92 C
por 10 min)
5. RESULTADOS ESPERADOS
a) Graficar y realizar el anlisis de la grfica

(Actividad de la enzima) vs concentracin de S (mM)

Donde
Absorbancia del blanco (Ab) Absorbancia de la muestra (Am)
min: tiempo donde se realiza la actividad de la enzima, dada en minutos
mg de protena: concentracin de la enzima
b) Consultar cul es la definicin de actividad enzimtica
c) Analice cul es el efecto de la concentracin del sustrato en la actividad
enzimtica de la invertasa.

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6. BIBLIOGRAFA
Bacca G. C., Manual de enzimologa. Colombia. Universidad Incca de Colombia, 2009.
Pg. 127
Referencias web:
http://www4.mpbio.com/ecom/docs/proddata.nsf/%28webtds2%29/151345
http://images.mpbio.com/docs/msds/eu/es/151345-ES-EU.pdf