1 METODOLOGA

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Inocular 2 ml de medio rico (LB) que contiene el antibitico apropiado con una sola
colonia de bacterias transformadas. Incubar la cultivo durante la noche a 37 C con
agitacin vigorosa.
Viertir 1,5 ml del cultivo en un tubo de microcentrfuga. Centrifugar a mxima
velocidad durante 30 segundos a 4 C en una microcentrfuga. Guardar la parte no
utilizada del original a 4 C.
Retirar el medio por aspiracin, dejando el sedimento bacteriano tan seco como
posible.
Resuspender el sedimento bacteriano en 100 l de solucin de lisis alcalina enfriada
con hielo, agitar por vrtex vigorosamente.
Aadir 200 l de solucin recin preparada lisis alcalina II a cada bacteriana
suspensin. Cerrar el tubo con fuerza, y mezclar el contenido invirtiendo el tubo
rpidamente cinco veces. No agitar. Guardar el tubo en hielo.
Aadir 150 l de solucin de lisis alcalina enfriada con hielo III. Cerrar el tubo y
dispersar la solucin de lisis alcalina III a travs del lisado bacteriano viscoso
invirtiendo el tubo varias veces. Guardar el tubo en hielo durante 3-5 minutos.
Centrifugar la bacteriana lisado a la velocidad mxima durante 5 minutos a 4 C en
una microcentrfuga. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
(opcional) Aadir un volumen igual de fenol: cloroformo. Mezclar lo orgnico y fases
acuosas mediante vrtex y centrifugar la emulsin a la mxima velocidad durante 2
minutos a 4 C en una microcentrfuga. Transferir la capa superior acuosa a un nuevo
mximo tubo.
Precipitar el sobrenadante de cidos nucledos mediante la adicin de 2 volmenes
de etanol a temperatura ambiente. Mezclar la solucin mediante agitacin con vrtex
y luego permitir que la mezcla durante 2 minutos a temperatura ambiente.
Recoger los cidos nucledos precipitados por centrifugacin a velocidad mxima
durante 5 minutos a 4 C en una microcentrfuga.
Eliminar el sobrenadante por aspiracin suave. Mantener el tubo en posicin
invertida sobre una toalla de papel para permitir que todo el lquido se escurra.
Aadir 1 ml de etanol al 70% al sedimento e invertir el tubo cerrado en varias
ocasiones. Recuperar el ADN por centrifugacin a velocidad mxima durante 2
minutos a 4 C en una microcentrfuga.
Eliminar de nuevo todo el sobrenadante por aspiracin suave.
Quitar cualquier perla de etanol que se forma en los lados del tubo. Guardar el tubo
abierto a temperatura ambiente hasta que el etanol se haya evaporado y el fluido no
es visible en el tubo (5-10 minutos).
Disolver los cidos nucledos en 50 l de TE (pH 8,0) que contiene 20 g / ml DNAaseRNasa libre. Agitar en vortex la solucin suavemente durante unos segundos. Guardar
la solucin de ADN a -20 C