Centro de Biotecnologa

Maldonado Fernndez

Univ. Miler

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMN

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGA
CARRERA DE INGENIERA QUIMICA

MONITOREO DE LA VARIACION DE COMUNIDADES MICROBIANAS EN

FUNCION DE CUATRO ESPECIES DE GRAMINEAS EN ENSAYOS DE
FITORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON DIESEL

Autor: Univ. Miler Maldonado Fernndez

Tutor: Univ. Lizeth P. Navarro
Materia: Laboratorio de Investigacin
Centro: Biotecnologa
Semestre: 1/2013

Cbba 2013

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NDICE
1 INTRODUCCINPag.3
2 OBJETIVOS.Pag.5
2.1 General..Pag.5
2.2 Especficos..Pag.5
3 MARCO TERICO .Pag.5
3.1 Fundamentos de la Biodegradacin.Pag.6
3.2 Tcnicas de Biorremediacin.Pag.11
3.3 LimitacionesPag.13
3.4 Anlisis microbiolgico.Pag.13
4 MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS...Pag.17
4.1 Materiales..Pag.17
4.2 ReactivosPag.18
4.3 Equipos...Pag.18
5 ASPECTOS PRELIMINARES.Pag.18
6 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALPag.19
7 DATOS, CLCULOS Y RESULTADOSPag.20
7.1 DatosPag.20
7.2 Clculos...Pag.22
7.3 Resultados..Pag.30
8 OBSERVACIONESPag.31
9 CONCLUSIONES...Pag.31
10 BIBLIOGRAFAPag.32

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1 INTRODUCCION
Los problemas de contaminacin en el mbito local, nacional e internacional son parte de
nuestra vida cotidiana; es preocupante la manera en cmo se han ido degradando los
ecosistemas de nuestro planeta, y la capa superficial de la corteza terrestre no es la
excepcin. La actividad industrial ha ocasionado uno de los problemas ms serios en
materia de contaminacin de suelos, donde el derrame de hidrocarburos derivados del
petrleo ocupa uno de los primeros lugares.
En Bolivia y otros pases , como consecuencia de varios siglos de actividad minera, la
industria de la qumica bsica, petroqumica y de refinacin del petrleo, han producido
grandes cantidades de residuos peligrosos difciles de cuantificar. Se sabe que en 1999
en Mxico, de acuerdo a cifras publicadas por el INEGIINE (2000), los sitios
contaminados, an en las estimaciones ms conservadoras, ascendan a varios miles de
lugares y stos eran equivalentes a 25 967 km2 de superficie de suelo degradado.
Existen numerosas tecnologas de remediacin de suelos contaminados y de acuerdo a
investigaciones cientificas (2002) se pueden agrupar en 3 tipos: a) biolgicos
(biorremediacin, bioestimulacin, fitorremediacin, biolabranza, etc.), en donde las
actividades metablicas de ciertos organismos permiten la degradacin, transformacin o
remocin de los contaminantes a productos metablicos inocuos; b) fisicoqumicos
(electrorremediacin, lavado, solidificacin/estabilizacin, etc.), aqu se toma ventaja de
las propiedades fsicas y qumicas de los contaminantes para destruir, separar o contener
la contaminacin; y c) trmicos (incineracin, vitrificacin, desorcin trmica, etc.), en los
cuales se utiliza calor para promover la volatilizacin, quemar, descomponer o inmovilizar
los contaminantes en un suelo.
La biorremediacin puede emplear organismos autctonos del sitio contaminado o de
otros sitios (exgenos), puede realizarse in situ o ex situ, en condiciones aerobias (en
presencia de oxgeno) o anaerobias (sin oxgeno). Aunque no todos los compuestos
orgnicos son susceptibles a la biodegradacin, los procesos de biorremediacin se han
usado con xito para tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos
del petrleo, solventes, explosivos, clorofenoles, pesticidas, conservadores de madera e
hidrocarburos aromticos policclicos, en procesos aerbicos y anaerbicos .
Adems se ha incursionado en el desarrollo de tecnologas emergentes e innovadoras
tales como la fitorremediacin, electrorremediacin y electrobiorremediacin, en donde si
bien es cierto hoy en da la informacin es limitada, la investigacin desarrollada respalda
su uso y se encuentra cobrando auge .
Sin duda muchas son las alternativas reportadas como exitosas, pero para seleccionar la
tecnologa de remediacin adecuada se debe tener en consideracin: a) caractersticas
del sitio, b) tipo de contaminante, concentracin y caractersticas fisicoqumicas, c)
propiedades fisicoqumicas y tipo de suelo a tratar y d) costo .
Por otra parte, los lodos residuales o bioslidos son el subproducto resultante del
tratamiento biolgico de las aguas domsticas, que cuando no se tiene un plan de manejo
de los mismos causan impacto al ambiente y a la salud de la poblacin (SEMARNAT
2002) y por tal motivo son considerados como residuos peligrosos (SEMARNAT 2005).
Sin embargo estos lodos residuales, cuando no contienen sustancias txicas, pueden ser

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compostados y ser usados para mejorar la calidad de los suelos y estimular a la poblacin
microbiana para que promueva la degradacin de contaminantes orgnicos, ya que son
ricos en materia orgnica, macro y micro nutrientes. Adems, los lodos residuales
contienen una alta diversidad microbiana, mucho ms grande que la de cualquier suelo
frtil.
Ya que los microorganismos son los agentes primarios de la degradacin de
contaminantes orgnicos en el suelo, una premisa es que al incrementar la densidad
microbiana en un suelo contaminado, se puede tambin acelerar la degradacin de los
contaminantes orgnicos como los hidrocarburos.
De acuerdo a lo anterior, el proceso ms ampliamente usado es la biorremediacin y la
variable a controlar es la bioestimulacin de los microorganismos nativos del suelo a
travs de la adicin de nutrientes (fuente alterna). Tal aseveracin est basada en el
hecho de que la entrada de grandes cantidades de carbono (hidrocarburos) perturba el
balance natural de nutrientes en el sistema ocasionando una rpida disminucin de otros,
como el nitrgeno y el fsforo, y con ello se reduce o detiene la tasa de crecimiento
bacteriano.
Como ya se mencion, los lodos residuales contienen grandes concentraciones de
nitrgeno inorgnico, fsforo y materia orgnica, lo que los hace ideales para estimular la
actividad microbiana del suelo. Los lodos residuales pueden ser usados como fuente
alterna de macro y micro nutrientes y al estimular la actividad microbiana se lograr una
mayor degradacin de los hidrocarburos presentes en el suelo, siempre y cuando la
concentracin de patgenos, metales pesados y compuestos orgnicos txicos sea baja .
Dicha prctica resulta benfica para el ambiente, dndole un uso a lo que comnmente se
ha venido manejando como un desecho.
La biorremediacin es un proceso de mineralizacin, al que tambin se le conoce como
composteo. Dicho proceso es usado para estabilizar los lodos residuales y del cual se
obtiene el humus como producto, mismo que funge como mejorador de las caractersticas
fsicas de un suelo (Haug 1980). Lo que resulta de la combinacin de suelo con
hidrocarburo y lodos residuales es un suelo mejorado en sus caractersticas fsicas y sin
el contaminante, apto para ser usado en cualquier actividad agrcola.

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OBJETIVOS
2.1 General: Monitorizar el ciclo de degradacin microbiana en relacin a cuatro
NNNNNNtipos de especies de gramneas en suelos contaminados con diesel.

2.2 Especficos:
Analizar el mecanismo y nivel de degradacin ocasionado por los
microorganismos del mismo suelo.

Identificar microorganismos de alto y bajo nivel de degradacin en cada tipo suelo.

Realizar un anlisis de comparacin de microorganismos degradadores de

hidrocarburos.

Determinar las unidades formadoras de colonias tras el anlisis de cada tipo y

concentracin de suelo.

Determinar variables de rendimiento productivo en la degradacin de suelos

contaminados con diesel.

Realizar un anlisis de comparacin de microorganismos degradadores de

hidrocarburos.

MARCO TERICO

En la naturaleza existe una amplia variedad de microorganismos que se encuentran en el

medio de forma natural y que descomponen sustancias, incluidos los hidrocarburos, en
formas menos complejas. Este proceso de biodegradacin es caracterstico de todos los
sistemas ambientales. La introduccin de hidrocarburos, por ejemplo durante un vertido,
concede a estos organismos la oportunidad de proliferar si las condiciones son
adecuadas.
La biodegradacin de los hidrocarburos puede producirse en presencia de oxgeno
(condiciones aerbicas) o en ausencia del mismo (condiciones anaerbicas). Sin
embargo, en condiciones anaerbicas el proceso se produce de forma mucho ms lenta
y, des del punto de vista operacional, tiene poco inters para la biorremediacin.
Las bacterias, hongos, levaduras y algas que son responsables del proceso de
biodegradacin, requieren adems fuentes de alimento en forma de nitrgeno (N) y
fsforo (P), elementos que se encuentran de forma habitual en el medio marino. La
frmula siguiente representa el modelo tpico de biodegradacin en condiciones
aerbicas:
1 Kg.de hidrocarburos + 2,6Kg. de O2 + 0,07Kg. de N + 0,007Kg. de P => 1,6Kg. de CO2 + 1Kg.de H2O +1 Kg.de biomasa

En consecuencia, los productos del proceso de biodegradacin son: dixido de carbono,

agua y biomasa de microorganismos.

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Esta reaccin metablica de origen natural puede emplearse como mecanismo de

remediacin de una contaminacin por derrame de hidrocarburos, y es en este punto
cuando se habla de Biorremediacin.
Es necesario, inicialmente, distinguir entre los siguientes conceptos:

BIODEGRADACION, se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u

otros microorganismos alteran y convierten molculas orgnicas en otras
sustancias, como cidos grasos y CO2.
BIORREMEDIACIN, adicin de materiales a ambientes contaminados para
producir una aceleracin del proceso natural de biodegradacin.

FERTILIZACIN, mtodo de biorremediacin de adicin de nutrientes, como

Nitrgeno o Fsforo a un medio contaminado para estimular el crecimiento de
microorganismos nativos.

INOCULACIN, adicin de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales

pueden adicionarse junto con nutrientes.

3.1 Fundamentos de la Biodegradacin

Organismos Hidrocarburoclsticos
Los llamados organismos hidrocarburoclsticos o petroleolticos son bacterias y hongos
capaces de degradar petrleo fisiolgica y metablicamente. Ms de 100 especies de 30
gneros microbianos son capaces de usar hidrocarburos, como mtodo de subsistencia.
Los gneros de organismos hidrocarbonoclsticos son: Pseudomonas, Nocardia, Vibrio,
Candida, Brevibacterium, Corynebacteium, Flavobacterium, Acinetobacter, Micrococcus,
Arthrobacter, Achromobacter, Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium, Bacillus,
Aspergillus,Mucor, Fusarium, Penicillium, Rhodotorula y Sporobolomyces. La fraccin del
total de organismos que metabolizan hidrocarburos es altamente variable, 6 a 82% para
hongos terrestres, 0,13% a 50% para bacterias de la tierra, y del 0,003% a 100% para
bacterias marinas.
En ecosistemas no contaminados, los microorganismos degradadores de hidrocarburos
constituyen menos del 0,1% de la comunidad microbiana; mientras que en ecosistemas
contaminados con hidrocarburos pueden constituir el 100% de la comunidad microbiana.
Las poblaciones dominantes en estas comunidades poseen caractersticas nutricionales
relacionadas al contaminante y pueden ser tambin resistentes a muchas formas de
estrs ambiental. Cuando la fuente de carbono es un substrato insoluble como un
hidrocarburo, los microorganismos facilitan su difusin hacia la clula produciendo
substancias como carbohidratos, cidos grasos, enzimas y biosurfactantes. Los
microorganismos utilizan estos compuestos a manera de un biofilm alrededor de la
molcula del hidrocarburo, para posteriormente ingerirlo o romperlo en compuestos
simples de carbono y oxgeno. Estos microorganismos usan la energa liberada para
manejar los procesos termodinmicamente no espontneos como la sntesis de
componentes celulares.

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Tabla 3.1. Principales microorganismos petroleolticos objeto de estudio en los ltimos aos (Fuente: Tratamiento
microbiolgico de la contaminacin por petrleo en ambientes marinos. Estudio de su posible optimizacin. M.A: Murado,
J.Mirn, M.P.Gonzlez)

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Biodegradabilidad de los Hidrocarburos

No todos los compuestos hidrocarburazos presentarn la misma biodegradabilidad, y por
tanto, el tipo de hidrocarburos y sus caractersticas son muy importantes. La complejidad
de los compuestos individuales determina si estos pueden degradarse y en qu medida.
Se pueden identificar diferentes grupos de compuestos, en orden de biodegradabilidad,
que van desde los hidrocarburos saturados (alcanos y ciclocalcanos) a los asfaltenos,
resinas y compuestos polares, pasando por los hidrocarburos insaturados y aromticos
(incluidos los hidrocarburos poliaromticos).
Fraccin de los alcanos, incluye alcanos normales, alcanos ramificados (isoalcanos) y
cicloalcanos (naptenos).
Compuestos aromticos e hidrocarburos policclicos aromticos. Dentro de los cuales
estn los monoaromticos voltiles como el benceno, tolueno, xileno, etc., los
naptenoaromticos y compuestos aromticos sulfurados como los tiopenos y
benzotiopenos. Estos compuestos son los de mayor importancia debido a su toxicidad y
tendencia a la bioacumulacin.
Fraccin polar que son las resinas (piridinas, quinolinas, carbazoles, sulfxidos y amidas)
y asfaltenos (fenoles, cidos grasos, cetonas, steres y porfirinas)
Tabla 3.2. Esquema de biodegradabilidad de los diversos hidrocarburos.

Por tanto, las diferentes partes de los hidrocarburos exhibirn tendencias de

biodegradacin muy diferentes. En general, los componentes ms ligeros se
descompondrn con mucha ms facilidad mientras que los componentes ms pesados y
complejos se biodegradarn con menos facilidad y durante un periodo de tiempo ms
largo o incluso pueden no descomponerse en absoluto. Los crudos ligeros con una
proporcin relativamente alta de componentes simples pueden ofrecer mayores
posibilidades para la biorremediacin que, por ejemplo, los crudos o fueles pesados, que
disponen de proporciones relativamente altas de componentes complejos. Se ha de
admitir tambin que los productos derivados del petrleo ligeros y el gasoil contienen una

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proporcin relativamente elevada de compuestos txicos, que pueden afectar o matar a

los microorganismos responsables de la biodegradacin.
Los alcanos (o saturados) se degradan con rapidez en presencia de oxgeno gracias a
una amplia gama de microorganismos. Pueden dividirse en parafinas normales
(compuestos de cadena lineal, n-alcanos), saturados en cadenas ramificadas y saturados
cclicos (o naftenos o alicclicos).
Mientras que los saturados en cadenas lineales o ramificados, pueden degradarse rpida
y completamente (la degradacin comienza con los compuestos de cadena lineal), los
compuestos cclicos se degradan con mayor lentitud y en menor grado.
Los aromticos son compuestos con uno o ms anillos aromticos condensados (o de
benceno), que tambin pueden estar ramificados (estos incluyen el benceno y sus
derivados, bencenos sustituidos, dos, tres, cuatro o cinco hidrocarburos poliaromticos
cclicos). Los compuestos ligeros (con uno o dos anillos de benceno) se degradan
bastante bien y con relativa rapidez, pero los compuestos con ms de cuatro anillos de
benceno son mucho ms resistentes a la degradacin.
Por ltimo, los asfaltenos y las resinas, que son mezclas de hidrocarburos
deficientemente definidas que se encuentran en las fracciones pesadas (compuestos con
elevado peso molecular) de los crudos y de los refinados pesados, tienen una velocidad
de degradacin muy baja (e incompleta) en comparacin con otros componentes que se
encuentran en el crudo. A pesar de que habitualmente estos compuestos constituyen una
pequea proporcin de los productos petrolferos, son extremadamente resistentes a la
biodegradacin, lo cual incrementa su peligrosidad.
Factores que afectan a la Biodegradacin del Petrleo
La concentracin y composicin de la comunidad microbiana y la tasa de transformacin
de contaminantes est influenciada por diversos factores:

Temperatura
Generalmente las especies bacterianas crecen a intervalos de temperatura
bastante reducidos en torno a un valor medio tpico de cada zona. Para aguas
canarias, este rango oscila entre -2 y 35C (condiciones mesfilas).
La biodegradacin decrece por desnaturalizacin de las enzimas a temperaturas
superiores a 40C, mientras que se inhibe con temperaturas bajas. Una
temperatura ptima de crecimiento bacteriano suele estar en torno a los 25 C. La
tasa de degradacin decrece exponencialmente cuando se baja de esta
temperatura, habindose comprobado que es 10 veces inferior a 5C.

Oxigenacin
La disponibilidad de oxgeno es fundamental para las degradaciones aerbias, que
son las que resultan ms eficientes. Aunque su disponibilidad no suele ser
limitante en ambientes marinos, la concentracin del mismo depende de su

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ubicacin en el ambiente marino; por ejemplo, es mucho menor en sedimentos de

baja granulometra y en playas de baja energa, etc.

Necesidad de nutrientes
El metabolismo microbiano est orientado a la reproduccin de los organismos y
stos requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su
asimilacin y sntesis. Los nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el
nitrgeno, cuya disponibilidad suele ser ms limitante que la de oxgen, siendo la
mayora de los ambientes marinos deficitarios en estos nutrientes, as como en
hierro.
Por lo general suele haber en el suelo una concentracin de nutrientes suficiente,
sin embargo, si estos no se encontrasen en el rango normal se puede adicionar
mayor cantidad al medio. El rango normal de C:N:P depende del sistema de
tratamiento a emplear, siendo de modo habitual 120:10:1.

pH del suelo
Afecta significativamente en la actividad microbiana. El crecimiento de la mayor
parte de los microorganismos es mximo dentro de un intervalo de pH situado
entre 6 y 8.
Asimismo, el pH tambin afecta directamente en la solubilidad del fsforo y en el
transporte de metales pesados en el suelo. La acidificacin o la reduccin del pH
en el suelo se puede realizar adicionando azufre o compuestos del azufre.

Humedad
Los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio
de transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son
movilizados hasta el interior de las clulas.
Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir la
concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin de la tcnica.

Estructura qumica del hidrocarburo

La inherente biodegradabilidad de un hidrocarburo depende, en gran medida, de
su estructura molecular. Siendo los parmetros que ms van a afectar la
halogenacin, la existencia de ramificaciones, la baja solubilidad en el agua y la
diferente carga atmica.

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Ventajas e Inconvenientes de la Biodegradacin

Ventajas
Generalmente solo origina cambios fsicos menores sobre el medio, con lo
que resulta una tcnica de bajo impacto ambiental.
Cuando se usa correctamente no produce efectos adversos significativos
en la biota local del medio contaminado.
Ofrece una solucin mas sencilla y completa que las tecnologas
mecnicas, y resulta menos costosa que stas tecnologas.

Inconvenientes
Para muchos tipos de vertidos su efectividad no ha sido determinada, y en
general es poco eficiente con compuestos pesados.
Su aplicacin en el mar reviste una elevada dificultad y en general no es
viable debido a la inestabilidad del medio
El tiempo necesario para la actuacin de los microorganismos es largo
Su implementacin es especfica para cada lugar contaminado, tanto en lo
referente al tipo de microorganismos empleados como a las tcnicas de
enriquecimiento nutricional y tcnicas de aplicacin.
Su optimizacin requiere informacin sustancial acerca del lugar
contaminado y las caractersticas del vertido, por lo que generalmente no
es una tcnica de aplicacin inmediata.

3.2 Tcnicas de Biorremediacin

Las medidas de biorremediacin pueden dividirse en aquellas que se llevan a cabo en el
lugar afectado por la contaminacin (In Situ) y aquellas que se llevan a cabo fuera de este
(Ex Situ), con el material que ha sido retirado de la zona contaminada y depositado en
zonas de tratamiento designadas.
Entre las tcnicas Ex Situ se incluyen el cultivo de tierras, la transformacin en abonos y
el bioapilamiento. Durante muchos aos se han empleado con xito algunas de estas
tcnicas, principalmente la de cultivo de tierras, que ha sido explotada como la forma ms
habitual de tratamiento de los residuos oleosos. Sin embargo, en el mbito de la
contaminacin del litoral por hidrocarburos, frecuentemente el gran volumen de residuos
hace que sean las tcnicas In Situlas ms adecuadas para su tratamiento.
Los principales factores que se incluyen en el proceso de biodegradacin son la
disponibilidad de oxgeno y nutrientes. En consecuencia, muchas tcnicas In Situ se

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centran en medidas que pueden tomarse para manipular los niveles de estos elementos
con el objeto de crear condiciones ptimas que permitan potenciar el proceso de
biodegradacin. Estas tcnicas reciben habitualmente la denominacin de
Bioestimulacin.
Un enfoque alternativo consiste en introducir microorganismos adicionales, que
complementen a los presentes o bien presenten una mayor eficiencia que los autctonos,
y estas reciben el nombre de Bioaumento. La Bioestimulacin y el Bioaumento no se
excluyen entre s, y pueden realizarse de forma conjunta.
Una medida adicional, la fitorrehabilitacin, se vale de un proceso biolgico alternativo
como es la tendencia de algunas plantas a extraer contaminantes del terreno o
transformarlos en el proceso bioqumico de su crecimiento, o incrementando la actividad
microbiolgica en los sedimentos (alrededor de las races). La fitorrehabilitacin tambin
se considera por tanto una tcnica de biorremediacin.
Otro tipo de biorremediacin consiste en la adicin de enzimas que actuan como
catalizadores en la degradacin de hidrocarburos.
Fitorremediacin
Este es el proceso de utilizar el crecimiento de las plantas para acelerar la biodegradacin
natural de los hidrocarburos. Los hidrocarburos que se encuentran infiltrados en el terreno
son, o bien transformados en el proceso de crecimiento de las plantas, o bien asimilados
y metabolizados por la propia vegetacin.
Esta tcnica puede ofrecer buenos resultados en los derrames que afectan a zonas
frgiles como marismas o saladares, donde el tratamiento posible se reduce a una
limpieza suave
con tcnicas poco agresivas. Se puede potenciar el proceso estimulando el crecimiento
de las plantas existentes mediante la adicin de fertilizantes, o bien mediante la
introduccin de plantas nuevas, procurando que sean autctonas de la zona afectada.
En algunos casos, la restauracin del crecimiento vegetal tiene el beneficio aadido de
prevenir o reducir al mnimo los efectos perjudiciales de la erosin.
Los mecanismos por los que acta la fitorremediacin incluyen la rizodegradacin, la
fitoextraccin, la fitodegradacin y la fitoestabilizacin.

Rizodegradacin : Este proceso se lleva a cabo en el suelo que rodea a las

races. Las sustancias excretadas naturalmente por stas, suministran nutrientes
para los microorganismos, mejorando as su actividad biolgica.
Fitoextraccin : Durante la fitoextraccin, los contaminantes son captados por
las races (fitoacumulacin), y posteriormente stos son traslocados y/o
acumulados hacia los tallos y hojas (fitoextraccin).
Fitodegradacin : La fitodegradacin consiste en el metabolismo de
contaminantes dentro de los tejidos de la planta, a travs de enzimas que
catalizan su degradacin.

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Fitoestabilizacin : Las plantas limitan la movilidad y biodisponibilidad de los

contaminantes en el suelo, debido a la produccin en las races de compuestos
qumicos que pueden adsorber y/o formar complejos con los contaminantes,
inmovilizndolos as en la interfase races:suelo.

3.3 Limitaciones
Existen varias limitaciones que deben considerarse para su aplicacin:
a) El tipo de plantas utilizado determina la profundidad a tratar, ya que el tratamiento
del terreno contaminado slo se produce en la zona en que la planta arraiga.
b) Altas concentraciones de hidrocarburos pueden resultar txicas para el vegetal,
por lo que generalmente se requiere una retirada previa de los grandes volmenes
de contaminante.
c) La eficiencia del proceso y su viabilidad puede depender de la estacin del ao.
d) Esta tcnica no es efectiva para tratar contaminantes fuertemente sorbidos al
sedimento.
e) La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradacin no siempre se
conocen, y pueden movilizarse o bioacumularse en animales.

3.4 Anlisis microbiolgico

Crecimiento Microbiano
Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo
largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo
que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin.
Cultivo de Microorganismos
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En
general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del
medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en
el medio.
Medios de Cultivo
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de
carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2
atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono
orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que
supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del
50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%)
y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La
elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en

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una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico
para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o
de NO2 - o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe
estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4 2-, etc.
Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos
aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden
sintetizar.
Mtodos de Aislamiento
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora delos
casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica
clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales
adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales (un clon bacteriano).
Concepto de Cultivo Puro
Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos. Los
cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos
del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para
poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con
seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce ms sobre el funcionamiento de las
comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un
cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologa de
los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en
condiciones de cultivos puros.
Crecimiento Microbiano en Medio Lquido
Si crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en
cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de
clulas libres.
En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio lquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el
tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad
mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se
explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.

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3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de microorganismos (ni la

masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un
metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una
acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia
industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente
esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase
exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano. La fase
estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad
el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de microorganismos viables
del cultivo.
Crecimiento Microbiano en Medio Slido
Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de los cultivos
lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este
caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmero de clulas viables por unidad
de superficie o por unidad de masa.
Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se
denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula microbiana viva y aislada que
si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales adecuadas da lugar a la
produccin de una colonia en un breve lapso de tiempo. Si el nmero inicial de bacterias
por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se
llama un csped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio. En el caso de
microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un
crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o
miceliares.
Concepto de Muerte de un Microorganismo

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Maldonado Fernndez

Univ. Miler

Desde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muere cuando pierde de forma

irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta prdida, no se produce
aumento en el nmero de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento. Sin embargo,
un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiolgico y continuar
desarrollando una actividad metablica que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de
toxinas.
Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin (crecimiento)
de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las
condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar como
muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de
nuevo favorables.
Medida del Crecimiento y Enumeracin de Microorganismos
Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los
principales, se enumeran a continuacin:
1.- Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy
pequeos de suspensiones de microorganismos. Se usan unos portaobjetos especiales
denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario
que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml.
2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin
dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en
suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de
medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe ser
del orden de 105 por ml.
3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o
muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables
contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de
una clula aislada. Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico,
es necesario contar ms de 300 UFC.
En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja,
stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao
de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para
que se formen las colonias.
4.- Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas.
Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas;
pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas.
5.- Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN, protenas,
peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.
6.- Medida de actividad metablica de los microorganismos como que respiran
producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como
consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacinreduccin tales como el azul de metileno).
Crecimiento Microbiano Equilibrado

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Se denomina crecimiento equilibrado a aqul en el que todos los parmetros del cultivo
(biomasa, nmero de clulas, cantidad de protenas, de ADN, etc.) evolucionan en
paralelo. El crecimiento equilibrado probablemente ocurra en muy contadas ocasiones en
condiciones naturales. Por tanto, es principalmente un concepto de aplicacin en el
laboratorio (o en microbiologa industrial). Sin embargo, es til porque permite estudiar el
crecimiento microorganismos.

MATERIALES , REACTIVOS Y EQUIPOS

4.1 Materiales

Muestra de suelo
6 frascos con tapas de 200ml (para cada muestra)
24 cajas Petri (4 por dilucin)
1 caja de tips (para dilucion)
1 caja de tips (para crudo)
1 caja de tips (para muestra)
4 marcadores permanentes
Papel cerafin (cant. considerada)
Papel aluminio (cant. considerada)
Papel madera (cant. considerada)
Bolsas plsticas (cant. considerada)
1 Matraz Erlenmeyer de 200 ml
1 Matraz Erlenmeyer de 1000 ml
1 probeta graduada de 1000 ml
3 Micro Pipetas para 20- 200 L, 800 L,200 L
1Tijera
Pares de Guantes
1 Recipiente de etanol
1 Encendedor

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Hazas Drigalsky (para crudo y muestra)
1 Cronometro
1 tamiz de 200 micrones
4.2 Reactivos
Agua destilada (volumen considerado)
1080 ml Solucin buffer PBS(para cada muestra)
(para 1000ml)
8g NaCl
0.2g KCl
1.44g Na2HPO4
0.24g KH2PO4

600ml Solucin PCA(para cada muestra)

(para 1000ml)
5g/L Triptona
2.5g/L Extracto de
Levadura
1g/L Dextrosa
12g/L Agar

4.3 Equipos

Autoclave
Hornilla
Incubadora
Campana de absorcin
Balanza analtica
Cmara frigorfica
PH metro

ASPECTOS PRELIMINARES

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El uso de piedritas secas y limpias se debe a la alta eficiencia al momento de

agitar los frascos para posteriormente realizar las diluciones.

En la preparacin de las diluciones se debe tomar en cuenta que este como

otros es un procedimiento que se realiza dentro de la cmara de absorcin

En la prepara racin de la solucin del PCA colocar los tres primeros

componentes, regular el pH a 7 2 y luego colocar el agar.

Antes de realizar el plaqueado de cajas se debe de esterilizar todo material a

usar (tips ,cajas, hazas, solucin PCA, etc.).

Las cajas petrie a usar tienen que estar completamente secas (sin agua) y se
debe de trabajar en la cmara de absorcin.

El sembrado debe de realizarse dentro de la cmara de absorcin

Es muy importante mencionar que las cajas petrie con las que se est
trabajando estn bien selladas con parafin de otra forma podra contaminar y
variar nuestro anlisis posterior.

Para poder calcular la humedad del suelo se toma 10 gramos de suelo en un

crisol para luego colocarlo dentro de una hornilla verificando que el peso sea
constante .finalmente por diferencia de masa inicial y final saber el porcentaje
de humedad en la muestra.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Seleccionar 6 frascos con tapas de 200ml con 20g de piedritas (limpias)
dentro.
2. Preparar la solucin PBS (180ml para cada frasco), colocara en cada frasco y
luego regular el pH a 7.4 2
3. Preparar la solucin PCA para 24 cajas petrie (aprox 20ml en cada caja),
posterior mente realizar el plaqueado y dejar que solidifique.
4. Realizar el etiquetado y las diluciones en los 6 frascos (101,102,103,104,105,106) primeramente agitando 1min la muestra(101) y luego traspasando 20ml
a la siguiente dilucin(102) y sucesivamente hasta la dilucion106
5. Realizar el sembrado colocando en dos cajas petrie la muestra de suelo (20l
hasta la 10-3 y 200l desde la 10-4 hasta 10-6) sin crudo y en otras dos la
muestra de suelo despus del crudo (800l de crudo) para cada dilucin.

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6. Sellar y etiquetar las cajas para luego incubarlas hasta el siguiente da (durante
tres das), luego realizar el conteo correspondiente de cada caja.

DATOS, CLCULOS Y RESULTADOS

7.1 DATOS
0 INICIAL

V(L)

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

20

:10-2

206

209

170

183

20

:10-3

92

95

50

43

200

:10-4

33

36

21

23

200

:10-5

11

200

:10-6

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

:10-2

140

171

176

173

Repeticion
es
1
2
Peso suelo 20 g
humedo(P)
Peso suelo 20 g
seco

24,65
56
24,44
16

25,96
58
25,75
58

0 Sorgo

V(L
)
20
20

:10-3

113

112

133

171

Peso suelo 20 g
humedo(P)

24,896
9

25,160
1

Peso suelo 20 g
seco

24,034
5

24,292
2

200

:10-4

29

21

62

77

200

:10-5

10

16

17

16

200

:10-6

12

14

0 Cloris

Repeticione
s
1
2

Centro de Biotecnologa
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V(L
)
20

Univ. Miler

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

:10-2

200

180

290

291

Repeticiones

20

:10-3

93

77

99

100

Peso suelo 20 g
humedo(P)

200

:10-4

34

40

147

132

Peso suelo 20 g
seco

200

:10-5

14

20

55

61

200

:10-6

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

:10-2

268

276

612

764

24,894
7

25,1592

23,150
5

22,9936
4

0 Tremula

V(L
)
20
20

:10-3

118

130

114

Repeticione
s
1
2

132

Peso suelo 20 g
humedo(P)

24,89
5

25,159
1

Peso suelo 20 g
seco

22,90
28

23,145
1

200

:10-4

56

50

50

57

200

:10-5

27

38

49

48

200

:10-6

12

16

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

:10-2

272

252

360

400

0 Cynodon

V(L
)
20

Repeticione
s
1
2

Centro de Biotecnologa
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20

:10-3

160

Univ. Miler

260

168

228

Peso suelo 20 g
humedo(P)

25,160
9

24,896
8

Peso suelo 20 g
seco

21,425
6

23,702

200

:10-4

69

60

63

65

200

:10-5

13

13

17

11

200

:10-6

0 (2 meses desp)

V(L
)
20

F.D.

con
dies
el
N.C.

con
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

sin
dies
el
N.C.

:10-2

444

304

556

531

20

:10-3

312

264

126

120

Peso suelo 20 g
humedo(P)

30,791
5

25,4931

Peso suelo 20 g
seco

29,537
5

24,1511

200

:10-4

33

35

81

27

200

:10-5

10

20

27

200

:10-6

7.2 CALCULOS

Repeticione
s
1
2

Centro de Biotecnologa
Maldonado Fernndez

Peso suelo 20 g
humedo(P)
Peso suelo 20 g
seco
cant. de agua en la
muestra
H
H(%)
F.H.

(*)Peso
U.F.C.Prom/g
s.s.
suelo 20 g
humedo(P)
(*) N.C.Prom
Peso suelo 20 g
seco
cant. de agua en la
muestra
H

Univ. Miler

Repeticiones
1
2
24,6556
25,965
8
24,4416
25,755
8
0,214
0,21
0,008679 0,0080
57
88
0,9
0,8
0,991320 0,9919
43
12
Repeticiones
1
2
203179,4
24,8969
25,160
236
1
60,05
24,0345
24,292
2

25,3
1
25,1
0
0,21
0,01
0,84
0,99

25,0
3
24,1
6

0,8624

0,8679

0,87

0,034638
851

0,0344
95

0,03

H(%)

3,5

3,4

3,46

F.H.

0,965361
149

0,9655
05

0,97

(*) U.F.C.Prom/g s.s.

514622,5
531

(*) N.C.Prom

73,65

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Univ. Miler

Peso suelo 20 g
humedo(P)

Repeticiones
1
2
25,159
24,8947
2

25,0
3

Peso suelo 20 g
seco

23,1505

22,993
64

23,0
7

Repeticiones
2,1655
1
2
1,7442
6
24,895
25,159
0,070063 10,0860
106
74
22,9028
23,145
7,0
1 8,6

1,95
25,0
3
0,08
23,0
7,81
2

cant. de agua en la
muestra
Peso suelo 20 g
humedo(P)
H
Peso suelo 20 g
seco
H(%)
cant. de F.H.
agua en la
muestra
H
(*) U.F.C.Prom/g s.s.
H(%)
Peso suelo 20 g
F.H. humedo(P)
(*) N.C.Prom
Peso suelo 20 g
seco

0,929936 2,014
0,9139 2,00
1,9922
894
26
0,92
0,080024
0,0800 0,08
101
51
Repeticiones
360287,8
1
8,0
8,02
8,00
468
25,1609
24,89 25,0
0,919975
0,9199
0,92
68
3
92,15
899
49
21,4256
23,70 22,5
2
6

(*)
U.F.C.Prom/g
cant.
de agua ens.s.
la
muestra

718708,0
3,7353
733

1,194
8

2,47

(*) N.C.Prom
H

141,5
0,148456
534

0,047
99

0,10

H(%)

14,8

4,8

9,82

F.H.

0,851543
466

0,952
01

0,90

(*) U.F.C.Prom/g s.s.

259343,7
141

(*) N.C.Prom

120,85

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Repeticiones
1
2
Peso suelo 20 g
humedo(P)

25,4931

28,1
4

29,5375

24,1511

26,8
4

1,254

1,342

1,30

0,040725
525

0,052641
695

0,05

H(%)

4,1

5,3

4,67

F.H.

0,959274
475

0,947358
305

0,95

Peso suelo 20 g
seco
cant. de agua en la
muestra
H

30,7915

(*) U.F.C.Prom/g s.s.

289943,3
59

(*) N.C.Prom

145,45

7.3 RESULTADOS

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OBSERVACIONES

Cada tipo de suelo contiene diferentes clases de microorganismos los cuales

pueden y no degradar el hidrocarburo.

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No todos los microorganismos del suelo degradan hidrocarburos solo algunas

logran tolerar.

El crecimiento microbiano varia en cuanto el tipo de suelo y la concentracin

del hidrocarburo.

La degradacin de hidrocarburo a altas concentraciones disminuye el

crecimiento de colonias microbianas debido a la baja tolerancia.

CONCLUSIONES

La biorremediacion es un conjunto mtodos en el que se pone en marcha el

ingenio humano con el fin de solucionar problemas ocasionados al medio
ambiente ya se por el o de forma natural.

La contaminacin en suelos podra ocasionar serios problemas al medio en el

que vivimos ya que es quien ayuda a producir nuestros alimentos y a mantener
nuestro medio natural estable.

Los suelos tratados contaminados con diesel casi en la mayora de los casos
pueden llegar a tener buenos rendimientos en cuanto a degradacin por
microorganismos seleccionados del mismo suelo.

La eficiencia de un microorganismo en cuanto a degradacin se basa en la

tolerancia a altos grados de concentracin del hidrocarburo.

10 BIBLIOGRAFA

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Univ. Miler

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