GuionPracticas GradoBiologia 2014-15

Departamento de Biologa Molecular
Prcticas de Bioqumica
2 Curso del Grado de BIOLOGA
Informacin general y normas del laboratorio de prcticas .................................................. 2

1. Aislamiento de inmunoglobulinas de suero........................................................................ 3
1.1. Precipitacin fraccionada de protenas....................................................................................... 4
1.2. Determinacin cuantitativa de protenas: Metodo de Lowry..................................................... 5
1.3. Cromatografa de intercambio inico .......................................................................................... 9
1.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS ........................................................................ 11
2. Qumica cido-base. Valoracin pH-mtrica ..................................................................... 16

3. Actividad Butiril-colinesterasa de suero de caballo ......................................................... 20
4. Aislamiento de cidos nucleicos........................................................................................ 24
4.1. Purificacin de cidos nucleicos a partir de hgado de rata. .................................................. 24
4.2. Mini-preparacin de ADN plasmdico. ....................................................................................... 25
5. Amplificacin de ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) .............................. 28

6. Electroforesis en gel de agarosa........................................................................................ 32
Anexos ...................................................................................................................................... 34
Resultados de las prcticas.................................................................................................... 36
Informacin general y normas del laboratorio de prcticas
Es necesario aprobar las prcticas para aprobar la asignatura.

La calificacin se basar en un examen tipo test que se realizar el ltimo da de
prcticas. La nota del examen supone el 70% de la nota global de prcticas.
La asistencia, as como la entrega de los resultados indicados por los profesores y la
hoja de cuestiones son obligatorias.
La participacin, ejecucin y elaboracin/presentacin de los resultados se
corresponde con el 30% de la nota global de prcticas.
Es necesario el uso de la bata y gafas protectoras (a suministrar por los alumnos). Se
indicar cuando es necesario el uso de guantes (suministrados por la universidad).
No se puede comer, beber, fumar dentro del laboratorio
No se puede salir del laboratorio sin haber informado al profesor responsable.
Antes de tirar cualquier material utilizado, preguntad, pues en muchos casos es
necesaria una adecuada separacin de residuos.
Cada da se lavar el material utilizado. Los tubos graduados de polipropileno
(falcon) se lavan. Los tubos de 1,5mL (eppendorf) y los de poliestireno no graduados
(tapn rojo) se tirarn a la basura; si se requiere separacin de residuos txicos se os
advertir previamente.
Se han de rotular bien los tubos para su identificacin con rotulador excepto en el
caso de los tubos falcon, en los que se utilizar cinta adhesiva que colocaremos en la
parte superior del tubo (lo ms cercano al tapn).
Cada da, al terminar, se dejar el lugar de trabajo limpio y recogido.
2 curso del Grado de Biologa
1. Aislamiento de inmunoglobulinas de suero

Los anticuerpos pertenecen a un grupo de protenas llamadas "inmunoglobulinas", que
estn compuestas por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras unidas entre s por puentes
disulfuro, y son muy abundantes en la circulacin sangunea dado su papel en la defensa frente
a agentes infecciosos (Figura 1). Un cierto nmero de tcnicas ampliamente utilizadas en los
laboratorios de bioqumica y en empresas biotecnolgicas y farmacuticas requieren la
utilizacin de inmunoglobulinas purificadas. Hay muchos mtodos de purificacin de
inmunoglobulinas, pero en esta prctica vamos a seguir el mtodo ms convencional que
incluye un enriquecimiento de la muestra inicial mediante la precipitacin fraccionada de las
protenas del suero con sulfato amnico y una posterior purificacin de mayor grado mediante
cromatografa de intercambio inico. El anlisis del resultado de ambos mtodos se realizar
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (protenas) en presencia de SDS. Se
pretende con ello que el alumno se familiarice con tres tcnicas de separacin de protenas que
se basan en diferentes principios de separacin.
Figura 1. Esquema de las cadenas peptdicas que forman las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas estn
formadas por cuatro cadenas peptdicas, 2 de ellas de un peso molecular aproximado de 50-55 kDa (cadenas
pesadas, o IgGH), que estn unidas entre s por dos puentes disulfuro, y 2 de menor peso molecular (20-25 kDa)
conocidas como cadenas ligeras o IgGL. Las cadenas ligeras estn unidas de forma covalente a las cadenas
pesadas por un puente disulfuro.
3
Dpto. de Biologa Molecular
Universidad Autnoma de Madrid
1.1. Precipitacin fraccionada de protenas

Cuando se aumenta la concentracin de sal gradualmente en una disolucin de
protenas, se produce inicialmente un incremento de la solubilidad de las mismas (solubilizacin
por salado o "salting in"). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilizacin en
solucin de la protena por la disminucin de los coeficientes de actividad de los grupos
ionizables. A medida que la fuerza inica se eleva, por aumento en la concentracin en la sal,
se alcanza un mximo de solubilidad seguido de una disminucin hasta que las protenas
precipitan (precipitacin salina o "salting out") (Figura 2). La precipitacin es el resultado de la
competencia por las molculas de agua de solvatacin entre la protena y la sal, por lo que las
interacciones protena-protena aumentan, producindose su precipitacin. El sulfato amnico,
(NH4)2SO4, tiene una gran solubilidad (superior a 700 g/L) y es la sal ms utilizada para el
fraccionamiento de protenas.
Figura 2. Solubilidad de las protenas

en funcin de la concentracin de sal.
Material y reactivos
-
Suero de ternera (ST).

Disolucin saturada de (NH4)2SO4 (100% de saturacin).
Tampn Tris-HCl 10mM, pH 7,4.
Mtodo
1.- Realizar una dilucin 1/6 del ST en tampn Tris-HCl (10mM, pH 7,4). Preparar un
volumen final de 6 mL en un tubo de tapn rojo. Transferir 5mL de la dilucin a un tubo falcon
graduado de 15mL.
La adicin de (NH4)2SO4 se va a realizar aadiendo el volumen suficiente (lentamente, y
a 4C) de disolucin saturada hasta alcanzar la concentracin que se desea. Para determinar la
cantidad de sulfato amnico a aadir se utilizar la siguiente ecuacin:
V (S2-S1)
V = ---------------(1 - S2)
siendo,
V = Volumen que hay que aadir a la muestra proteica de la disolucin saturada
de sal para conseguir una concentracin final de sal de S2.
V= Volumen de muestra que se tiene.
4
S2 = Tanto por uno de saturacin a la que se quiere llevar la muestra.

S1 = Tanto por uno de la concentracin inicial de sulfato amnico en la muestra.
2.- Calcular el volumen que hay que aadir de (NH4)2SO4 saturado a 5mL de la dilucin
1/6 de ST para llevarla hasta un 30% de saturacin. Mezclar lentamente en fro, e incubar 10
minutos en hielo para precipitar las protenas.
3.- Sedimentar las protenas por centrifugacin a 2.800xg (3.500rpm) durante 10 minutos
a 4C.
4.- Transferir el sobrenadante (SB1) a un tubo graduado y guardar el precipitado de
protenas (fraccin 1) a 4C..
5.- Calcular el volumen que hay que aadir de (NH4)2SO4 saturado al SB1 para llevarlo
hasta un 40% de saturacin. Mezclar lentamente en fro, e incubar 10 minutos en hielo para
precipitar las protenas.
a 4C.
7.- Transferir el sobrenadante (SB2) a un tubo graduado y guardar el precipitado de
protenas (fraccin 2) a 4C.
8.- Calcular el volumen que hay que aadir de (NH4)2SO4 saturado al SB2 para llevarlo
hasta un 60% de saturacin. Mezclar lentamente en fro, e incubar 10 minutos en hielo para
precipitar las protenas.
a 4C.
7.- Retirar el sobrenadante (SB3) y guardar el precipitado de protenas (fraccin 3) a
4C.
8.- Resuspender cada fraccin en 6mL de Tris 10mM, pH 7,4 y conservar a 4C hasta su
utilizacin en el siguiente ensayo.
1.2. Determinacin cuantitativa de protenas: Metodo de Lowry

El objetivo de la prctica es calcular la cantidad total de protenas contenida en una
disolucin. Existen diferentes mtodos para el clculo de la concentracin de protenas, entre
los que se encuentra el mtodo de Lowry, descrito en 1951 y que es un mtodo colorimtrico
de valoracin cuantitativa de las protenas. Este mtodo consta de dos etapas:
1) Se aade el reactivo 1, que contiene iones Cu2+ en medio alcalino que se unen a las
protenas formando complejos de coordinacin con los tomos de nitrgeno de los enlaces
peptdicos (Figura 3). Adems, los iones Cu2+ provocan el desdoblamiento de la estructura
tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a
participar en la segunda etapa de la reaccin.
a
Protena
NaOH
CuSO 4
5
Figura 3. Esquema de la primera parte de la reaccin para la cuantificacin de protenas
por el mtodo de Lowry. (a) El reactivo 1 est compuesto de hidrxido sdico y sulfato
cprico, junto con tartrato de sodio y potasio. El reactivo cambia de color (azul claro-violeta)
en presencia de protenas. (b), Complejo formado por los enlaces peptdicos y el catin cobre en
medio alcalino.
2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos
fenlicos de los residuos de tirosina presentes en la mayora de las protenas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido
fosfo-molibdo-tngstico de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar
a un complejo de color azul intenso (Figura 4).
Figura 4. Reaccin de los complejos formados en la reaccin 1 (reaccin de Biuret) en presencia del reactivo 2 o
reactivo de Folin. Los grupos hidroxilo de los radicales de las tirosinas reducen al reactivo de Folin provocando el
cambio de color amarillo a color azul. La intensidad del color azul es proporcional a la cantidad de protena
presente en la mezcla.
La intensidad del color, que depender tambin de la cantidad presente en las protenas
de estos aminocidos aromticos, ser proporcional a la concentracin de protenas en la
disolucin segn la ley de Lambert-Beer:
A=cL
(A=Absorbancia, =Coeficiente de extincin molar; c=concentracin molar; L=longitud de paso
o ancho de la cubeta)
Cuando no se conoce el coeficiente de extincin molar, la concentracin de una disolucin
problema suele calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de
calibrado trazada con valores conocidos de concentracin de una protena y sus respectivas
absorbancias.
- Albmina de suero bovina (BSA) 1mg/mL.
- NaOH 1M.
- Reactivo 1:
6
10 volmenes de Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 M.

0,1 volmenes de tartrato sdico potsico al 2% (KNaC4H4O6).
0,1 volmenes de CuSO4 al 1%.
- Reactivo 2:
-
1 volumen de reactivo de Folin.

1 volumen de H20 destilada.
- Tris-HCl 10mM pH 7,4
Mtodo
A partir de una disolucin de albmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/mL de
concentracin, preparar 8 diluciones, con Tris-HCl 10mM pH 7,4, de concentraciones: 0, 20, 40,
80, 160, 240, 320 y 400 g/mL siguiendo las indicaciones de las columnas 3 y 4 de la tabla
adjunta. En paralelo, preparar otros 8 tubos con 0,25 mL de cada una de las siguientes
muestras diluidas:
- ST (diluido 1/6):
- Fraccin 1:
- Fraccin 2:
- Fraccin 3:
1/150; 1/300
1/2; 1/4
1/30; 1/60
1/30; 1/60
A cada uno de estos 16 tubos, aadir NaOH 1 M hasta una concentracin final de 0,1M
(25 L). Aadir a cada tubo 2mL del reactivo 1, mezclarlo bien e incubar durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Aadir ahora 0,225 mL del reactivo 2, mezclarlo bien e incubarlo
durante 20 minutos a temperatura ambiente (ver tabla).
Para medir la absorbancia de las muestras utilizaremos un espectrofotmetro (Figura 5), que
nos encontraremos ya encendido y en el que habr que seleccionar la longitud de onda de
750nm.
Figura 5. Esquema bsico de un espectrofotmetro.
Los pasos a seguir son los siguientes:

1. Volcar el contenido del tubo 1 (blanco sin protena) en la cubeta y colocarla en la posicin
seleccionada dentro del espectrofotmetro.
2. Ajustar la lectura a cero (Set Ref o Medir Blanco, segn espectrofotmetro).
3. Devolver el contenido de la cubeta a su tubo original.
4. Lavar la cubeta con agua destilada.
5. Volcar en la cubeta limpia y seca el contenido de la siguiente muestra (tubo 2).
6. Sin modificar ningn parmetro, anotar la lectura de la absorbancia.
5. Repetir los pasos 3-6 para medir la absorbancia del resto de muestras.
7
Figura 6. Representacin de los valores de absorbancia frente a la concentracin. Aparece indicada la zona
lineal en la cual el valor de absorbancia (se ajusta a una recta) es proporcional a la concentracin de protena.
Cuestiones.
Representar grficamente las concentraciones de la recta patrn de BSA frente a la
absorbancia. Calcular las concentraciones de protena de las diferentes fracciones ,
interpolando los valores de absorbancia de las muestras problema. Se puede realizar la
interpolacin de modo grfico o mediante ajuste lineal hallando la pendiente de la recta patrn
teniendo en cuenta las diluciones realizadas.
N
tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
PROTEINA
Recta patrn
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
BSA 1mg/mL
MUESTRA
ST 1/150
ST 1/300
F1 1/2
F1 1/4
F2 1/30
F2 1/60
F3 1/30
F3 1/60
BSA
L
0
5
10
20
40
60
80
100
L
250
250
250
250
250
250
250
250
Tris
L
250
245
240
230
210
190
170
150
NaOH
1M
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
React.1
10 min
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
React.2
20 min
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
DO 750
nm
Conc.
(g/mL)
0
20
40
80
160
240
320
400
Conc.
diluida
Conc. sin
diluir
Media
(g/mL)
(g/mL)
(g/mL)
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
Bibliografa
-O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
8
1.3. Cromatografa de intercambio inico

La cromatografa de intercambio inico de protenas tiene su fundamento en las
propiedades cido-base de stas. Las protenas tienen una carga neta determinada por su
composicin aminoacdica y por el pH del medio en el que se encuentran. El carcter y
magnitud de esta carga neta les permite interaccionar o no con un grupo cargado. El
comportamiento de una protena en una cromatografa de intercambio inico puede predecirse
a partir de su punto isoelctrico (pI). Una protena con un pI de 5,8, tendr una carga neta
positiva a valores de pH inferiores a su pI, y negativa a pH superiores. Atendiendo al pI de la
protena y a los valores de pH con los que deseemos trabajar, deberemos elegir un
intercambiador aninico o catinico. El intercambiador est constituido por una matriz insoluble
y, a ser posible, inerte a la que est unida un grupo funcional con una carga positiva (cuando se
trate de un intercambiador de aniones) o negativa (en el caso de un intercambiador de
cationes).
Un experimento cromatogrfico de intercambio inico consta de tres fases: a)
Equilibrado, o ajuste de la resina y de la muestra a las condiciones salinas y de pH iniciales
requeridas para el experimento; b) Fijacin de la muestra, por incubacin de la mezcla, en
este caso de protenas, que deseamos resolver, uniendo todas o parte de ellas para despus
eluirlas de forma diferencial y c) Elucin de la muestra, utilizando concentraciones variables
de sales y/o tampones con diferente pH. Estas tres fases van precedidas de una fase de
Empaquetamiento de la resina, cuando realicemos la cromatografa en una columna, siendo
innecesario cuando realicemos la cromatografa incubando directamente la resina con la
muestra y luego separando la primera por decantacin o centrifugacin.
La prctica que se realiza a continuacin tiene como objetivo la purificacin de
inmunoglobulinas de suero de ternera a partir de un extracto parcialmente enriquecido en esta
protena por precipitacin con sulfato amnico. Para ello emplearemos una resina de
intercambio de aniones, el DEAE-celulosa (DEAE-Sephacel), constituido por una matriz a la
que est unido como grupo funcional un radical dietil-amino-etilo (Figura 7).
CH2CH3
CELULOSACH2CH2N+H
CH2CH3
Figura 7. Frmula qumica del grupo DEAE empleado
en el intercambio inico.
El procedimiento empleado ser una cromatografa en columna, utilizando una solucin

tampn Tris-HCl a pH 8,5, que nos asegure que la carga neta de las inmunoglobulinas sea
negativa y, por consiguiente, que la protena se una de forma efectiva al intercambiador.
- Extracto correspondiente al corte del 40% de la prctica de precipitacin con (NH4)2SO4
- Tampones de equilibrado/lavado y elucin de la columna:
*Tris-HCl 10mM, pH 8,5
*Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 50mM NaCl
9

- Resina DEAE-Sephacel.
- Una columna cromatogrfica comercial.
Mtodo
- Empaquetamiento de la resina
Colocar a la salida de la columna un trozo de conduccin de goma y una llave, que nos
permita interrumpir el flujo a travs de la misma si lo deseamos
Para empaquetar la columna, colocarla verticalmente y, dejando la salida libre, aadir
resina (diluida previamente en el tampn de equilibrado) hasta que el volumen de la resina
empaquetada llegue a 1 mL.
Una vez empaquetada la columna procederemos a su equilibrado en el tampn inicial de
la cromatografa. Esto se lleva a cabo pasando 10 veces el volumen de la resina (10mL) con
tampn inicial (Tris-HCl 10mM pH 8,5). De esta forma nos aseguramos que la resina se halla
al pH que deseamos.
- Unin de la muestra a la resina
Tomar el volumen necesario de la fraccin 2 que contenga 5 mg de protena (utilizar los
resultados del ensayo de Lowry) y diluirlo en 5 volmenes de tampn inicial, con el fin de
disminuir en lo posible la concentracin de sales y as asegurarnos de que la protena se
encontrar al pH adecuado para interaccionar con el intercambiador.
Lavar la columna con un volumen equivalente a 4 veces el volumen de resina
empaquetada (4mL) del tampn inicial para eliminar las protenas que no se hayan unido al
intercambiador.
- Elucin de la muestra
Para separar las inmunoglobulinas de la muestra del resto de las protenas se llevarn a
cabo varias eluciones de la columna con concentraciones crecientes de NaCl en tampn TrisHCl 10mM a pH 8,5 (Figura 8). Cada uno de los pasos se llevar a cabo con 4mL del
correspondiente tampn (ver tabla), y se recogern fracciones de 1mL que, posteriormente,
se analizarn por electroforesis en gel de poliacrilamida.
TAMPON
1
2
3
4
COMPOSICION
Tris 10 mM, pH 8,5; NaCl 50 mM
VOLUMEN
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
10
Concentracin de sal
Figura 8. Esquema de elucin de la muestra de un intercambio

de aniones por aumento en la fuerza inica
Del total de las fracciones correspondientes a cada uno de los tampones guardar la 2 y 3, que
son las que van a contener la mayora de la protena eluida, ya que el primer mililitro de cada
lavado equivale aproximadamente al volumen muerto de la columna (el volumen que ha de
recorrer el tampn desde su entrada en la resina hasta su salida).
1.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

La electroforesis se basa en el movimiento que experimenta una partcula cargada en un
determinado medio cuando se ve sometida a la accin de un campo elctrico. Esta tcnica se
utiliza frecuentemente en el laboratorio para la separacin de protenas y de cidos nucleicos.
La tcnica electrofortica ms comn en la separacin de protenas es la que se realiza en
geles de poliacrilamida en presencia del detergente dodecil-sulfato sdico (SDS). El gel se
obtiene mediante la polimerizacin de acrilamida y el entrecruzamiento de las cadenas con bisacrilamida. De esta manera el gel forma una red o malla a travs de cuyos poros circulan las
protenas a separar. El tamao de los poros depende de la concentracin absoluta y de la
proporcin acrilamida/bis-acrilamida del gel. La polimerizacin es promovida por el persulfato
amnico y estabilizada por el TEMED.
Los pesos moleculares de las protenas se pueden determinar midiendo su movilidad en
geles de poliacrilamida en presencia de SDS. Esto es debido a que la cantidad de SDS
(cargado negativamente) que se une a una protena es proporcional al peso molecular del
polipptido y es independiente de su secuencia. A saturacin, se une aproximadamente 1,4 g
de detergente por gramo de protena. De esta manera, cuando una mezcla de protenas de
peso molecular conocido se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida en presencia
de SDS, la representacin grfica de la distancia recorrida por cada protena en funcin del
logaritmo de su peso molecular deber ajustarse a una lnea recta (Figura 9 y 10).
11
Figura 9. Clculo del peso molecular a partir de la migracin por electroforesis en gel de acrilamida. (a) Aspecto
terico de los marcadores de peso molecular preteidos tras haber desarrollado la electroforesis en gel de
acrilamida. (b) Recta de regresin con pendiente negativa que se obtiene al representar el log10 de los pesos
moleculares de los marcadores (a) en el eje de ordenadas y la migracin relativa (Rf) en el eje de abscisas. El
peso molecular aproximado de la protena problema se obtendr por interpolacin a partir de la recta de regresin
utilizando para ello su migracin relativa.
Figura 10. Efecto del porcentaje final de Acrilamida en el gel separador sobre la separacin de las protenas
segn su peso molecular. Como se puede observar, las protenas de mayor peso molecular se separan mejor
cuando el porcentaje final de acrilamida es menor, y viceversa, las protenas de menor tamao se separan mejor
en porcentajes altos de acrilamida.
12
- Disolucin de acrilamida-bisacrilamida al 40% en agua destilada.
- Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
- Tris-HCl 3 M pH 8,8
- SDS 10%
- Persulfato amnico al 10%
- Tampn de electroforesis (Tris 25mM pH 8,3; Glicina 192mM; SDS 0,1%)
- Tampn de ruptura (TR) (Tris 313 mM pH 6,8; SDS 10%; Glicerol 25%; mercaptoetanol 25%;
azul de bromofenol 0,02%)
- Cubetas de electroforesis, cristales, fuentes de alimentacin, separadores, pinzas.
- Marcadores de peso molecular de protenas preteidos Dual Color (Bio-Rad) (ver figura 9)
- Solucin de fijacin y tincin (azul de Coomassie 0,1%; etanol 40%; cido actico 10%)
- Solucin para desteir: cido actico 10%.
Mtodo
- Preparacin del gel
En esta prctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por el gel de separacin
o resolucin y el gel de concentracin o empaquetamiento. Las cantidades de cada reactivo se
muestran en la tabla.
Limpiar los cristales y montar el gel con los separadores en la carcasa correspondiente
siguiendo las siguientes instrucciones:
13
Preparar la solucin del gel de separacin (8 mL por gel) en el tubo de 10mL

correspondiente que ya contiene la acrilamida, teniendo en cuenta que el persulfato amnico
y el TEMED son los ltimos que se aaden. Verter el gel separador rpida y cuidadosamente
entre los cristales hasta 2,5 cm por debajo del nivel que ser ocupado por el peine formador de
los pocillos. Colocar un poco de agua destilada cuidadosamente sobre el gel y dejarlo
polimerizar a temperatura ambiente (conviene conservar el resto de la mezcla del gel como
control de polimerizacin). Una vez polimerizado (unos 30 minutos), retirar el agua y preparar la
solucin del gel de concentracin. Verter esta solucin sobre el gel de separacin hasta llenar
el espacio entre cristales y colocar un peine previamente lavado con agua y etanol, evitando
que queden burbujas entre el peine y el gel. Dejarlo polimerizar a temperatura ambiente
durante 20-30 minutos (proceder del mismo modo que antes, conservando el resto de la
mezcla como control de polimerizacin).
Gel de separacin (10%)
Acrilamida-Bisacrilamida
Agua
Tris HCl 3 M pH 8,8
Tris HCl 0,5 M pH 6,8
SDS 10%
Persulfato amnico 10%
TEMED
Volumen final
2,00 mL
4,87 mL
1,00 mL
-----80 L
30 L
6 L
8,0 mL
Gel de concentracin
(4%)
0,25 mL
1,59 mL
-----0,6 mL
25 L
25 L
3 L
2,5mL
Figura 11. Esquema del gel discontinuo de Acrilamida/Bisacrilamida

para la separacin de protenas segn su peso molecular.
- Preparacin de las muestras

En esta prctica se van a analizar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
SDS las muestras provenientes de las dos prcticas anteriores. Por un lado, las muestras
resultantes de la precipitacin con sulfato amnico del suero de ternera y, por otro lado, las
muestras eluidas de la columna de DEAE. Se incluir tambin un carril con marcadores de
peso molecular, que consta de una mezcla de protenas de peso molecular conocido que nos
servirn de referencia. Las muestras a analizar son las siguientes:
14
Suero de ternera (ST)

Fraccin 1 (precipitado del 30% de sulfato amnico)
Fraccin C50 (segunda fraccin de 1 mL eluida con NaCl 50 mM)
Fraccin C150 (segunda y tercera fraccin de 1 mL eluida con NaCl 150 mM)
Fraccin C300 (segunda y tercera fraccin de 1 mL eluida con NaCl 300 mM)
Fraccin C500 (segunda fraccin de 1 mL eluida con NaCl 500 mM)
En base a los valores de concentracin de protenas obtenida en el ensayo de Lowry,
preparar una muestra de cada fraccin de sulfato amnico con 40g de protena total tomando
el volumen correspondiente de la fraccin; aadir tampn de ruptura (5x) para que quede 1x,
(este ltimo paso se realiza con las muestras dentro de la campana extractora) (ver tabla
adjunta). Preparar las muestras del intercambio inico utilizando 80L de cada fraccin (ver
tabla adjunta). Finalmente, calentar las muestras en un termobloque a 100C, en tubos
eppendorf perfectamente cerrados y con la tapa agujereada, durante 3-5 minutos para
desnaturalizar las protenas.
Masa (g)
V muestra (L)
H2O (L)
TR 5x (L)
V final (L)
PM
-10
--10
S.T.
40
Sulfato amnico
F1
F2
F3
40
40
40
20
100
20
100
20
100
50mM
1.2
-80
-20
20
100
100
Intercambio inico
150mM
300mM
2.2 2.3
3.2 3.3
-- --- -80 80
80 80
-- --- -20 20
20 20
100 100
100 100
500mM
4.2 4.3
-- -80 80
-- -20 20
100 100
3.- Desarrollo de la electroforesis

Una vez polimerizado el gel de concentracin, retirar el peine con cuidado de no romper
los pocillos para las muestras. Montar el gel en la cubeta de electroforesis siguiendo las
instrucciones de los profesores de prcticas. Aadir tampn de electroforesis y cargar 30L de
las muestras anotando el orden. Una vez cargadas las muestras, se conectan los cables
correctamente (el polo positivo, rojo, abajo y el negativo, negro, arriba) y se desarrolla la
electroforesis a 40 mA hasta que el frente azul est cerca de la parte inferior del gel.
Cuando el frente est cerca de la parte inferior del gel, se desconecta la corriente, se
separan con mucho cuidado los dos cristales, se retira el gel y se coloca en un recipiente donde
se fija y tie durante 30-45 minutos con la solucin de fijacin y tincin; posteriormente se retira
esta solucin y se aade la solucin de cido actico al 10%, en la que se incuba hasta que el
gel est completamente desteido.
15
2. Qumica cido-base. Valoracin pH-mtrica

El control del pH es de vital importancia en todos los procesos metbolicos celulares
puesto que las enzimas tienen una actividad mxima a un determinado valor de pH y disminuye
bruscamente con una mnima variacin del mismo. Por esta razn, los seres vivos deben
mantener el pH de los fluidos intra y extracelulares a un valor constante, y lo consiguen gracias
a sistemas tampn. El objetivo de esta prctica es entender qu son y cmo funcionan los
sistemas de tamponamiento. Para ello definiremos primero una serie de conceptos bsicos:
cidos: compuestos donadores de protones.
Bases: compuestos aceptores de protones.
Anfolitos: especies inicas que pueden actuar como cidos o como bases. Se
denominan tambin anfteras o anfiprticas.
cidos o bases fuertes: compuestos que, en concentraciones bajas, estn
prcticamente ionizados por completo en solucin, de modo que la
concentracin de H3O+ u OH- es aproximadamente la misma que la
concentracin del cido o base total.
cidos o bases dbiles: compuestos que no se disocian totalmente, de forma que la
concentracin de H3O+ o de OH- libre depende del valor de sus constantes de
disociacin.
Los cidos dbiles (HA) se disocian parcialmente en el agua, produciendo su base
conjugada (A-) y un protn en forma de H3O+:
La concentracin de cada especie en el equilibrio esta definida por la relacin:
donde Ka es la constante de disociacin. Despejando [H3O+] de la ecuacin:
Aplicando el logaritmo a ambos lados y la propiedad de los logaritmos para un producto

se llega a:
E invirtiendo el cociente dentro del logaritmo se obtiene la ecuacin de HendersonHasselbalch:
16
Que es equivalente a expresar:

[base conjugada]
pH =pKa+ log -------------------------------------------[cido =molcula protonada]
donde pH= -log10 ([H3O+]) y pKa= -log10(Ka)
En las curvas de valoracin de una sustancia en disolucin se representa grficamente
la variacin del pH de dicha disolucin cuando se van aadiendo cantidades determinadas de
iones H3O+ o de iones OH-.
Los tampones son sistemas acuosos que resisten los cambios en su pH cuando se les aaden
cantidades pequeas de cido (H3O+) o de base (OH-). Un sistema tampn est constituido por
un cido dbil y su base conjugada o bien por una base dbil y su cido conjugado. Es
importante sealar que un sistema tampn slo funciona como tal en un rango limitado de pH,
como veremos en la presente prctica. La capacidad ptima de tamponamiento tiene lugar en
la regin en la cual el pH es igual al pKa.
Los aminocidos son sustancias anfteras puesto que presentan, al menos, dos grupos
ionizables. Como ejemplo de ello vemos la curva de valoracin de la Glicina:
13
11
H 2NCH 2COO (H 3N +CH 2COO-)=(H 2NCH 2COO -)

pKa2=9,6
pH
H 3N +CH 2COO -
pI=6
5
pKa1=2,34
(H 3N +CH 2COOH)=(H 3N +CH 2COO -)
H 3N +CH 2COOH
0,5
1,0
1,5
2,0
Moles de OH /mol de aminocido
Figura 18.Curva de valoracin del aminocido Glicina. En

la grfica se indican los diferentes pKa, as como su punto
Isoelctrico (pI).
17
Los aminocidos comunes son cidos dbiles poliprticos (ms de 1 grupo protonable) por lo
que se pueden aplicar todos los conceptos anteriormente descritos (curva de valoracin, pKa).
Los aminocidos neutros, entre los que se encuentran Glicina, Alanina o Treonina, se
comportan como cidos dbiles diprticos (dos grupos protonables) y tendrn dos valores de
pKa, uno correspondiente al grupo carboxilo y otro correspondiente al grupo amino, ambos del
carbono alfa. Los aminocidos cidos y bsicos se comportan como cidos dbiles triprticos
(3 grupos protonables), por lo que tendrn, adems del pKa del grupo carboxilo y del pKa del
grupo amino del carbono alfa, otro valor adicional de pKa del grupo protonable de la cadena
lateral (R). La carga neta del aminocido vendr dada por la suma de las cargas de los grupos
protonables. En el caso de un aminocido diprtico, como la Glicina (ver figura 18),
encontramos 3 formas o especies: una forma totalmente protonada cuando se encuentra en
medio cido y cuya carga neta es +1, otra forma parcialmente desprotonada cuya carga neta
es 0 y una ltima especie o forma totalmente desprotonada con carga neta -1.
AA+1 <--pKa1--->AA0<--pKa2--->AA-1
pH cido
pH bsico
Al valor de pH en el que el aminocido tiene carga neta cero se conoce como punto
isoelctrico (pI). Para calcularlo se ha de conocer entre qu dos valores de pKa se encuentra
la forma del aminocido con carga neta cero. El valor del pI ser la media de ambos valores
([pKa1+pKa2]/2).
Durante la valoracin de un aminocido, partimos de la forma totalmente protonada (en medio
cido) y se aade de forma progresiva grupos OH- (en forma de base fuerte) para ir
desprotonando gradualmente al aminocido. La relacin es mol a mol de tal forma que
necesitaremos 1mol de OH- para desprotonar 1 mol del grupo ionizable. Por lo tanto, para 1
mol de un aminocido neutro (2 pKa) necesitaremos 2 moles totales de OH- para conseguir la
forma totalmente desprotonada (AA-1).
Objetivos experimentales
La prctica que vamos a realizar consiste en obtener la curva de valoracin de un
aminocido desconocido.
Curva de titulacin de un aminocido problema.
1. Realizar una curva de titulacin de 10mL de una disolucin 50mM de un aminocido
desconocido.
2. Sin dejar de agitar, medir su pH y anotar este valor como el pH inicial (punto 0).
3. Con una pipeta automtica aadir 100L de una solucin de NaOH 0,5M.
4. Anotar el nuevo valor de pH.
5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta que el valor del pH sea constante y mayor de 13, anotando
siempre el valor de pH despus de cada adicin de NaOH.
6. Representar los resultados con los valores de pH en el eje de ordenadas (eje Y) y en el eje
de abscisas (eje X) la relacin de moles de anin hidroxilo (OH-) por mol de aminocido inicial
(mol OH/mol aa).
7. De acuerdo con la tabla de valores de pKa, averiguar qu aminocido se ha titulado.
18
8. Formular las especies moleculares mayoritarias presentes en cada tramo de la curva de

titulacin.
Tabla I. Valores de pK de los diferentes aminocidos.
Aminocido
pK -COOH
pK -NH3
Gly
2,34
9,60
Ala
2,34
9,69
9,62
Val
2,32
Leu
2,36
9,68
Ile
2,36
9,68
Ser
2,21
9,15
Thr
2,63
10,43
Phe
1,83
9,13
Trp
2,38
9,39
Asn
2,02
8,80
Gln
2,17
9,13
Pro
1,99
10,60
9,21
pK R
Met
2,28
Asp
2,09
9,82
3,86
Glu
2,19
9,67
4,25
His
1,82
9,17
6,0
Cys
1,71
10,78
8,33
Tyr
2,2
9,11
10,07
Lys
2,18
8,95
10,53
Arg
2,17
9,04
12,48
19
3. Actividad Butiril-colinesterasa de suero de caballo

Introduccin
Las colinesterasas son hidrolasas que, bajo condiciones ptimas, catalizan la hidrlisis
de steres de colina a mayores velocidades que otros steres siendo inhibidas por bajas
concentraciones de eserina y compuestos organofosforados. La butirilcolinesterasa
(E.C.3.1.1.8) es una enzima de 574 aminocidos (85,54 kDa), presente en plasma y en la
mayora de los tejidos, y diferencindose de la acetilcolinesterasa en su especificidad de
sustrato. As, la butirilcolinesterasa, tambin llamada no especfica, pseudo-, S-
butirocolinesterasa, prefiere butirilcolina como sustrato frente a acetilcolina.
La importancia clnica de la butirilcolinesterasa radica en que es la responsable de la
hidrlisis y, por tanto, inactivacin de succinilcolina, un relajante muscular ampliamente
utilizado en operaciones. La succinilcolina elimina cualquier contraccin indeseable del msculo
esqueltico por un periodo corto de tiempo, permitiendo, al comienzo de la anestesia, la
canulacin de las vas respiratorias. Individuos portadores de algunas formas allicas producen
una baja concentracin de enzima o protenas que no utilizan succinilcolina como sustrato.
Dichas formas allicas prolongan el efecto relajante de la succinilcolina, pudiendo llegar sus
efectos a ser fatales. A modo de ejemplo, la forma allica de la butirilcolinesterasa tpica tiene
una Km=0,1 mM para la succinilcolina, mientras que la llamada forma allica atpica (Asp70
Gly; GAT GGT) tiene una Km=40,0 mM. Otros sustratos de la butirilcolinesterasa
importantes a nivel clnico son la procana, un anestsico local, as como la cocana.
El objetivo de la prctica es comprender el significado de los parmetros cinticos que
definen la actividad cataltica de las enzimas (Km y Vmax) as como aprender cmo se
determinan en la prctica dichos parmetros. Antes de describir el desarrollo experimental
conviene introducir algunos conceptos.
Velocidad inicial. Para una enzima con comportamiento Michaeliano y que cataliza una
reaccin monosustrato, como es el caso propuesto en esta prctica, el esquema del proceso
puede expresarse del siguiente modo:
E + S ES
Kcat
E+P
Inmediatamente despus de producirse la mezcla de la enzima con el sustrato, y

asumiendo que se establece rpidamente un equilibrio con la consiguiente formacin del
complejo ES, la velocidad de formacin de producto (velocidad de la reaccin) depender de la
[ES], la cual a su vez ser una funcin de la [S] empleada (mantendremos constante la [E]).
Dicha velocidad podr expresarse como:
v = Kcat [ES]
y ser constante mientras la [ES] lo sea, lo cual ser cierto a tiempos cortos y mientras la [P]
sea lo suficientemente pequea para no interferir en el desarrollo de la reaccin. Esto es lo que
se denomina estado estacionario, y la velocidad determinada en estas condiciones se conoce
20
como velocidad inicial de reaccin. Todo clculo de parmetros cinticos de una enzima
deber basarse siempre en la determinacin de velocidades iniciales de reaccin. Es por ello
que al realizar un anlisis cintico lo primero que se hace es determinar el tiempo durante el
que la formacin de producto tiene lugar a una velocidad constante. En el caso que nos ocupa
las determinaciones se efectuarn a los dos minutos, tiempo en el que se ha comprobado
previamente que se mantiene el estado estacionario en las condiciones de ensayo.
Km y Vmax. Del esquema de reaccin propuesto anteriormente es fcil deducir que la [ES] en
el estado estacionario depender de la [S] aadida a la cubeta de reaccin. La relacin
existente entre la velocidad inicial de reaccin y la [S] viene dada por la ecuacin de MichaelisMenten:
Vm [S]
v = -------------Km + [S]
Dicha ecuacin incluye los dos parmetros cinticos que se quiere determinar, Km y Vmax. Km
(constante de Michaelis) representa la [S] para la cual se obtiene una velocidad inicial de
reaccin equivalente a la mitad de la Vmax. Es una constante propia de cada enzima y se
expresar en unidades de concentracin.
Vmax es la velocidad inicial mxima que puede alcanzarse en las condiciones del ensayo.
Dicha Vmax se obtiene a [S] saturante que es aqulla que aunque se incremente no permite un
aumento significativo de la [ES], puesto que toda la enzima se encuentra ligada al sustrato. En
estas condiciones [ES] = Etotal y Vmax vendr dada por:
Vmax = Kcat Etotal
Las unidades de Vmax sern de velocidad, es decir, vendr expresada en moles de S
transformados/min o unidades equivalentes.
Actividad especfica. De la expresin de Vmax anterior resulta evidente que sta variar con
la cantidad de enzima presente en el ensayo de un modo proporcional. Dicha proporcionalidad
se mantendr dentro de un rango de cantidad de enzima, por encima del cual se producen
fenmenos que impiden la correcta determinacin de la actividad enzimtica. Por consiguiente,
en cualquier anlisis cintico de una enzima, es preciso determinar previamente el rango de
cantidad de enzima para el cual se mantiene una proporcionalidad con la Vmax. Dichos
ensayos, puesto que determinan Vmax, se llevarn a cabo utilizando una [S] saturante. La
actividad especfica de una preparacin enzimtica se define como su actividad (o Vmax)
dividida por la cantidad de enzima (o de protena si se trata de un extracto no purificado), y se
expresar en mol S x min-1 x mg -1, o bien en Unidades/mg. Dicha actividad especfica puede
calcularse a partir de cualquiera de los valores de la grfica Vmax vs. E, siempre que se
encuentren en la zona de proporcionalidad.
En esta prctica se determinar la actividad de la enzima butirilcolinesterasa comercial
obtenida a partir de suero de caballo, as como los parmetros cinticos de la misma (Km y
Vmx) utilizando como sustrato butiriltiocolina.
21
Reactivos
-Tampn fosfato sdico 75 mM, pH 7,4
- cido 5-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB) 1 mM en tampon fosfato 75 mM, pH 7,4
- Butiriltiocolina 80 mM en tampn fosfato 75 mM, pH 7,4
- Butirilcolinesterasa comercial de suero de caballo, 2,5 Unidades/mL en tampn fosfato 75
mM, pH 7,4.
Ensayo enzimtico
El mtodo de ensayo de la actividad butirilcolinesterasa se basa en la reaccin
irreversible que tiene lugar entre la tiocolina formada durante la hidrlisis de la butiriltiocolina
con el cido 5-ditio-bis-2-nitrobenzoico (DTNB) liberndose un producto coloreado, el cido 5tio-2-nitrobenzoico que tiene un pico de absorcin a 412 nm y un coeficiente de extincin molar
de 13,6 mM-1 x cm-1 (Figura 12).
CH3-CH2- CH2-CO-S-CH2-CH2-N+(CH3)3
Butiril-Tio-colina
CH3-CH2- CH2-COO-
cido Butrico
+ HS- CH2-CH2-N (CH3)3
DTNB
5,5-ditiobis(2-nitrobenzoato)
- S- CH2-CH2-N (CH3)3
Tio-colina
HS- CH2-CH2-N+(CH3)3
Tio-colina
TNB
5-tio-2-nitrobenzoato
Figura 12. Esquema de la reaccin que tiene lugar como consecuencia de la actividad enzimtica de la butirilcolinesterasa en presencia de butiriltiocolina y DTNB.
Actividad enzimtica en funcin de la concentracin de protena

En un tubo de medida de espectrofotmetro, aadir los volmenes indicados en la tabla
de tampn fosfato, butiriltiocolina y DTNB. A continuacin, ajustar el espectrofotmetro a cero
de absorbancia. Posteriormente, iniciar la reaccin aadiendo el volumen correspondiente de
enzima butirilcolinesterasa. Tapar con parafilm, agitar el tubo y anotar la absorbancia a 412 nm
al cabo de 2 min (la reaccin se desarrollar a temperatura ambiente). Una vez acabada la
primera reaccin se lava el tubo y se realizan sucesivamente las siguientes reacciones (ver
tabla).
22
_______________________________________________________________
Ensayo
Tampn fosfato
Butiriltiocolina
DTNB BuChEasa
(75 mM, pH 7,4)
(80 mM)
(1 mM)
(2,5 U/mL)
(mL)
(L)
(mL)
(L)
_______________________________________________________________
Blanco
3,50
100
0,4
0
1
3,48
100
0,4
20
2
3,46
100
0,4
40
3
3,44
100
0,4
60
4
3,42
100
0,4
80
5
3,40
100
0,4
100
_______________________________________________________________
Determinacin de los parmetros Km y Vmax
Se procede igual que en el apartado anterior, utilizando la cantidad de enzima ptima
determinada en el ensayo anterior (sta ser el valor X de la tabla inferior). Antes de aadir la
enzima se ajusta a cero el colormetro (esto resta la hidrlisis inespecfica del sustrato).
Posteriormente se aade la enzima y se anota el valor de DO (412 nm) cada 1 min, por
espacio de 5 min. La reaccin se lleva a cabo en un volumen final de 4 mL, utilizando
concentraciones finales de sustrato de 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 y 8mM respectivamente. Para
ello se prepararn diluciones previas de la disolucin stock de sustrato (80mM) tal como se
indica en la tabla, y se aadirn 0,4mL de cada una de estas diluciones a cada tubo de
reaccin.
_______________________________________________________________
Tubo
Tampn fosfato
Butiriltiocolina
DTNB
BuChEasa
75 mM, pH 7,4
1 mM
(2,5 U/mL)
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
_______________________________________________________________
3,16
1
3,2 - X
0,4 (1,25mM)
0,4
X
2
3,2 - X
0,4 (2,50mM)
0,4
X
3
3,2 - X
0,4 (5,00mM)
0,4
X
4
3,2 - X
0,4 (10,00mM)
0,4
X
5
3,2 - X
0,4 (20,00mM)
0,4
X
6
3,2 - X
0,4 (40,00mM)
0,4
X
7
3,2 - X
0,4 (80,00mM)
0,4
X
_______________________________________________________________
0.04 mL
Bibliografa
-Scriver, C.R., Beaudet, A.L., Sly, W.S. y Valle, D. (1995) The metabolic and molecular bases of
inherited disease. Vol I. (8 edicin). McGraw-Hill Inc.
-Massouli, J. (1980) The polymorphism of cholinesterases and its physiological significance.
Trends in Biochemical Sciences 5 (6) 160-164.
23
4. Aislamiento de cidos nucleicos

La purificacin de cidos nucleicos se basa en la diferente solubilidad de las
macromolculas biolgicas en funcin de la polaridad del disolvente. Vamos a realizar una
extraccin de cidos nucleicos a partir de hgado de rata y tambin una purificacin de DNA
plasmdico de bacterias. Los resultados de ambas purificaciones se sometern a electroforesis
en un gel de agarosa con un agente intercalante (SybrSafe). Los cidos nucleicos se visualizan
con luz ultravioleta debido a la fluorescencia del SybrSafe intercalado entre las bases de los
cidos nucleicos.
4.1. Purificacin de cidos nucleicos a partir de hgado de rata.

El homogeneizado de hgado de rata se trata con un detergente, dodecil sulfato sdico
(SDS), que provoca la desnaturalizacin de las protenas componentes de las membranas
plasmtica y nuclear. La ruptura de las membranas libera los complejos de nucleoprotenas que
sern tambin disgregadas por la accin desnaturalizante del detergente. La extraccin
posterior con fenol y cloroformo separa los componentes de la mezcla. Los cidos nucleicos se
extraen en la fase acuosa, los lpidos aparecen en la fase fenlica y las protenas,
desnaturalizadas, en la interfase fenol-agua. Finalmente, los cidos nucleicos se precipitan
mediante la adicin de etanol y una sal (en nuestro caso acetato sdico).
-Hgado de rata
-Tampn salino: NaCl 0,14 M, acetato de magnesio 1,5 mM, KCl 5mM, SDS al 1%
-Fenol saturado con tampn Tris-HCl 100mM pH8.
-Cloroformo.
-Alcohol isoamlico.
-Acetato sdico 2M.
-Etanol absoluto.
-Etanol al 70%.
-Tampn TE: EDTA 1mM, Tris-HCl 10mM pH 8
Mtodo
1. Pesar 0,2-0,4 g de hgado de rata sobre un trozo de papel de aluminio y anotar el peso
(peso hmedo).
2. Trocearlo tanto como sea posible con unas tijeras, transferirlo a un tubo graduado con
ayuda de las pinzas.
3. Aadirle un volumen de tampn salino igual a 10 veces el peso hmedo del tejido (mL/g).
Anotar el volumen final que se obtiene al mezclar tejido ms tampn.
Extraccin con mezcla fenlica
4. Aadir 1 volumen de fenol saturado con agua/cloroformo/alcohol isoamlico mezclados
previamente en proporciones 50:49:1 (Ojo!, el fenol es muy custico, el tubo debe
estar muy bien cerrado y nunca cerca de la cara).
5. Colocar el tubo bien cerrado en una noria para tubos y mezclar durante 15 minutos.
6.
Centrifugar a 2.800xg (3.500rpm) durante 10 minutos.
24
7.
Separar con cuidado la fase acuosa (superior) donde estn los cidos nucleicos y
transferirla a un tubo nuevo.
Precipitacin con etanol

8. Aadir acetato sdico 2M hasta una concentracin final de 0,2M.
9. Aadir despus 2 volmenes de etanol absoluto, cerrar bien el tubo y mezclar bien
invirtiendo el tubo varias veces.
10. Incubar en hielo durante 10 minutos.
11. Centrifugar a mxima velocidad durante 15 min.
12. Decantar el sobrenadante con cuidado invirtiendo el tubo sobre un vaso de precipitados.
13. Aadir 1mL de etanol al 70% para eliminar el exceso de sal.
14. Centrifugar de nuevo durante 5 min.
15. Eliminar el sobrenadante con cuidado y dejar secar bien el precipitado a temperatura
ambiente con el tapn abierto durante unos minutos.
16. Resuspender el precipitado en 0,5-1,0mL de tampn TE. Este tampn puede contener
RNAsa A a una concentracin de 50 g/mL.
Degradacin del ARN
17.
Incubar a 37C durante 30 min las muestras que contienen RNAsa A.
18.
Guardar la muestra a 4C hasta el momento de su uso.
4.2. Mini-preparacin de ADN plasmdico.

Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena, cerradas covalentemente, con
un tamao variable de 1-20 kilobases (miles de pares de bases). Se encuentran en una gran
variedad de especies bacterianas, funcionando como elementos genticos que se replican, y
heredan, de manera independiente del cromosoma bacteriano y que, frecuentemente,
contienen genes que confieren a la bacteria resistencia a antibiticos (Figura 13).
Figura 13. Esquema del plsmido. En la figura aparecen indicadas las regiones esenciales para un plsmido, que
incluye un gen de resistencia a antibitico (en este caso a ampicilina) y el origen de replicacin. Adems se detalla
la posicin de un ADN exgeno clonado en este vector y la posicin de los oligonucletidos (Oligo 1 y 2) que se
van a emplear para la amplificacin por PCR (ver prctica 4).
En esta prctica vamos a purificar DNA plasmdico de una estirpe de la bacteria

Escherichia coli. Tras crecer la bacteria toda la noche, el mtodo de purificacin comienza con
25
la destruccin de la pared celular. Seguidamente las clulas son expuestas a la accin de un

detergente (dodecil sulfato sdico) y lisadas por tratamiento con hidrxido sdico. Como
consecuencia se produce la desnaturalizacin del DNA cromosmico y de las protenas
formndose una matriz insoluble. El DNA circular cerrado del DNA plasmdico no se
desnaturaliza a no ser que el tratamiento con sosa sea prolongado. La mezcla se neutraliza con
acetato potsico y se centrifuga. El DNA del plsmido queda soluble en el sobrenadante y es
precipitado con etanol. Tras centrifugar y eliminar el etanol, el DNA precipitado se resuspende
en tampn TE.
- 1,5 mL de cultivo bacteriano crecido durante una noche.
Todos los reactivos deben esterilizarse por autoclavado o filtracin y se deben manejar
posteriormente en condiciones estriles.
- Solucin I: Glucosa 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM pH 8
- Solucin II: NaOH 0,2M, SDS al 1%
- Solucin III: (5M de in potasio, 3M de in acetato, pH 4,8)
- Fenol saturado con tampn Tris-HCl pH 8
- Cloroformo.
- Alcohol isoamlico.
- Etanol absoluto.
- Etanol al 70%
- H2O desionizada y filtrada.
- Ribonucleasa A (RNAsa A) 10 mg/mL (conservada a -20C)
Mtodo
1
Transferir 1,5 mL de cultivo de bacteria crecido durante toda la noche a un tubo de
polipropileno (eppendorf).
2.
Centrifugar en la centrfuga a mxima velocidad (10.000xg) durante 1 min.
3.
Decantar y eliminar todo el sobrenadante con ayuda de una pipeta.
Lisis alcalina
4.
Resuspender bien las clulas, con ayuda del agita-tubos, en 100 L de solucin I.
5.
Aadir 200 L de solucin II. Mezclar con cuidado, invirtiendo el tubo tres veces.(No se
debe dejar la preparacin ms de 2-3 min en esta solucin).
6.
Aadir 150 L de solucin III. Mezclar con cuidado e incubar en hielo 5 min.
7.
Centrifugar en la centrfuga a mxima velocidad durante 10 min.
8.
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y estril.
Degradacin del ARN
9.
Aadir 5L de RNAsa A al sobrenadante.
10.
Incubar durante 10min en una estufa a 37C.
Extraccin con mezcla fenlica
11.
Aadir 0,5 mL de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico (50:49:1). Agitar fuertemente, con el
tubo bien cerrado, durante 1 min.
12.
Centrifugar durante 3 min para separar las fases (orgnica y acuosa).
13.
Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo.
26
Precipitacin con etanol.

14.
Aadir 1 mL de etanol absoluto (100%), cerrar el tubo y mezclar bien invirtiendo el tubo
varias veces.
15.
Incubar el tubo 5 min en hielo.
16.
Centrifugar 10 min y eliminar el etanol.
17.
Lavar el precipitado aadiendo 1 mL de etanol al 70% para eliminar el exceso de sal.
18.
Centrifugar de nuevo durante 3 min.
19.
Eliminar el etanol y dejar secar bien el precipitado a temperatura ambiente con el tapn
abierto durante unos minutos.
20.
Una vez seco, resuspender el DNA con 50 L H2O desionizada y filtrada. Guardar las
muestras a 4C hasta el momento de su uso.
27
5. Amplificacin de ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction)

Introduccin
La tcnica conocida como PCR (del ingls Polymerase Chain Reaction) desarrollada
por Kary Mulis en 1985 es un mtodo de sntesis y amplificacin de un fragmento de ADN in
vitro (Figura 14). Esta tcnica supuso una revolucin metodolgica en la biologa molecular
puesto que permite obtener grandes cantidades de una secuencia de ADN a partir de muy
pocas molculas.
Figura 14. Esquema de las 3 etapas del ciclo de amplificacin

exponencial del ADN mediante PCR.
La tcnica consiste en separar las dos cadenas de la doble hlice del ADN molde que
contiene nuestra secuencia de inters mediante un aumento de temperatura (1,
desnaturalizacin); posteriormente se hace descender la temperatura para permitir que dos
oligonucletidos, tambin llamados cebadores o primers, hibriden en direccin 5-3 con las
secuencias complementarias situadas en los extremos opuestos del fragmento a amplificar (2,
alineamiento o anillamiento). Finalmente, en presencia de una enzima ADN polimerasa se lleva
28
a cabo la sntesis de las nuevas cadenas de ADN en direccin 5-3 a partir de oligonucletidos
y utilizando como molde el ADN molde (3, elongacin).
Estas tres etapas se repiten sucesivamente hasta un mximo de 40 ciclos, a partir de los
cuales ya se ha alcanzado el mximo producto (Figura 15). Generalmente hay dos pasos
extras aadidos a los ciclos de PCR: se suele aadir un paso inicial de desnaturalizacin para
garantizar la separacin inicial de las dos cadenas molde y un paso final de extensin para
permitir la finalizacin de la elongacin de todos los fragmentos.
Figura 15.Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: marcadores de
peso molecular, 2: producto especfico amplificado, 3: producto inespecfico); B concentracin de ADN respecto
del tiempo.
Aunque en principio se puede utilizar cualquier ADN polimerasa, el descubrimiento de la

polimerasa termoestable presente en el microorganismo Thermus aquaticus (Taq polimerasa) y
cuya actividad no se ve afectada por temperaturas altas, permiti la simplificacin de la tcnica
mediante la creacin de bloques trmicos programables o termocicladores. Un aspecto
importante de esta tcnica es que, debido a su gran capacidad de amplificacin de molculas
de ADN, cualquier pequea contaminacin de ADN que haya en nuestra muestra puede
ocasionar problemas de contaminacin, obteniendo fragmentos inespecficos. Por ello siempre
habr que extremar las precauciones para evitar las contaminaciones: preparar primero la
mezcla sin ADN molde, utilizar guantes, emplear siempre puntas nuevas y estriles, etc.
El objetivo de esta prctica es amplificar mediante PCR el inserto clonado
(tamao=713pb) en el plsmido extrado en la prctica anterior. Para ello se emplearn
secuencias de oligonucletidos (cebadores o primers) que hibridan con el principio (oligo 1) y el
final (oligo 2) del fragmento de ADN a amplificar (Figura 13).
Materiales y reactivos
-Molde de ADN plasmdico (obtenido en la prctica anterior).
-Mezcla de oligodesoxi-ribonucletidos:
Oligo1
(5 GCCTCGAGGACTACAAGGATGACG 3) 1,0M
Oligo2
(5 CGAGATCTCACCATGGTTGTGGCC 3) 1,0M
-Mster mix (2x):
Mezcla de los 4 desoxi-ribonucletidos, dNTPs (400M cada uno).
29
Taq ADN polimerasa

Tampn de la ADN polimerasa (2x)
MgCl2 3,0 mM
Tampn de carga para electroforesis.
-Termociclador
-H2O desionizada y filtrada.
Mtodo
-Programacin del termociclador
Antes de preparar todos los reactivos para la PCR se ha de programar el termociclador.
La forma de programar depende de cada termociclador, por lo que se suelen dar las
condiciones de PCR como se indica a continuacin y despus el usuario ha de programar la
mquina de PCR segn el manual correspondiente:
Desnaturalizacin inicial
2min a 95C
40 Ciclos:
o (1) 30seg a 95C
o (2) 30seg a 66C
o (3) 45seg a 72C
Elongacin final
5min a 72C
Paso final de conservacin a 4C
-Preparacin de la mezcla de reactivos para la PCR.

Como prctica habitual en el laboratorio para evitar errores tcnicos y ahorrar material,
vamos a utilizar una mezcla comn (Master Mix) para todas las reacciones que se llevarn a
cabo en esta prctica. En esa mezcla estarn presentes todos los reactivos a excepcin de la
cadena molde y los oligos especficos para la amplificacin. En el tubo de PCR, debidamente
rotulado, aadiremos los siguientes reactivos en el orden indicado:
por tubo
Mster mix
25,0L
Mezcla de oligos
20,0L
-Preparacin de la cadena molde para la PCR.
Cada pareja de alumnos ha de preparar 50L de una dilucin 1/5 con H2O desionizada y
filtrada de la muestra de DNA plsmidico obtenido en la prctica anterior. De esta dilucin
utilizar 5L para aadir a su tubo de PCR que est en hielo, asegurando que la muestra
molde entra en contacto con la mezcla de reactivos del tubo. Pipetear con cuidado hacia arriba
y abajo para su homogenizacin. Se preparar un tubo como control negativo (H2O estril
como sustrato) y un tubo como control positivo (plsmido utilizado para transformar las
bacterias) para toda la clase.
-Desarrollo de la PCR
Colocar el tubo en el termociclador, asegurando que la base del tubo, que ha estado en
contacto con el hielo, est seca. Una vez colocados todos los tubos en el bloque trmico y
confirmado el programa, pulsaremos el botn para que empiece la reaccin de PCR. Una vez
30
finalizada la reaccin, guardaremos los tubos a 4C hasta su anlisis por electroforesis en gel
de agarosa.
Bibliografa
-Kramer M.F., Coen M.D. 2001. Enzymatic Amplification of DNA by PCR: Standard Procedures
and Optimization. Captulo 15.1 de Current protocols in molecular biology. John Wiley and
Sons, New York.
-Zyskind J.W. and Bernstein S.I. 1992. Recombinant DNA laboratory manual, 2nd Revised
Edition. Academic Press, San Diego.
31
6. Electroforesis en gel de agarosa

La agarosa es un polmero lineal que, al fundirlo y dejarlo solidificar de nuevo, forma una
matriz cuyo tamao de poro depende de la concentracin de agarosa (Figura 16). Sirve para
separar fragmentos de ADN de tamao comprendido entre 200 hasta 50.000 pares de bases
(pb). Al aplicar una corriente elctrica al gel de agarosa, los cidos nucleicos migran hacia el
nodo y se van a separar por tamao. El tamao y la cantidad relativa de los cidos nucleicos
se determina por tincin con un agente intercalante (SYBRSafe) y exposicin en un
transiluminador con la fuente de luz adecuada (luz ultravioleta o luz azul).
D-Galatosa
3,6 anhidro-L-Galactosa
Figura 16. Estructura de la agarosa.
- Agarosa
- Tampn TAE (se prepara a partir de TAE 50x):
EDTA 0,01M
Tris-acetato 0,04M; pH 8
- SYBRSafe, agente intercalante (10.000 x en DMSO)
- Tampn de carga (6x):
Azul de bromofenol al 0,25%
Xilencianol al 0,25%
Glicerol al 30%
- Marcadores de peso molecular: fago digerido con HindIII y fago 29 digerido con HindIII.
32
Durante la preparacin y manejo del gel es necesario el uso de guantes. Utilizaremos un gel
de agarosa al 1% para cargar las muestras de ADN (genmico y plasmdico) y el producto de
PCR.
Se pesa la cantidad correspondiente de agarosa (0,5g), se aade a 50 mL de tampn
TAE, se calienta la mezcla, agitndola, hasta que se funda completamente la agarosa. Se deja
enfriar un poco y se aade SYBRSafe (3 L/50 mL de gel de agarosa). Se mezcla bien y se
vierte sobre la placa que va a contener el gel. Posteriormente colocamos el peine con mucho
cuidado y se deja solidificar al menos durante 30 min.
El volumen final de las muestras que vamos a cargar en el gel es de 10 L. Para
preparar las mismas utilizaremos 18L de la muestra de ADN (genmico o plasmdico) que
pasaremos a un tubo nuevo y a la que aadiremos 2L de tampn de carga (10x). El producto
de PCR no necesita tampn de carga puesto que el tampn de la reaccin de PCR ya lo
contiene. Se introduce 10L de cada muestra en pocillos individuales con la pipeta automtica
junto a una muestra (5L) de cada marcador de peso molecular. La electroforesis se desarrolla
en tampn TAE a 100 voltios durante 30 min. Una vez terminada la electroforesis, el DNA se
visualiza con luz ultravioleta y se fotografa.
Figura 17. Preparacin del gel de agarosa para la separacin de cidos nucleicos. (a) Se mezcla
la agarosa con el tampn TAE y se calienta para (b) fundir la agarosa. Antes de solidificar, (c) se
vierte sobre la bandeja donde gelificar y se coloca el peine apoyado sobre los laterales de la
bandeja y con las hendiduras hacia abajo para formar los pocillos donde se aplicarn las
muestras. (c) Posteriormente se introduce en la cubeta horizontal y (d) se aplican las muestras.
33
Anexos
Anexo I. Fraccionamiento con sulfato amnico. En la tabla se indican las cantidades (en
gramos) a aadir de sulfato amnico por cada 100mL para conseguir los porcentajes de
saturacin indicados.
34
Anexo II. Sistemas tampn empleados en bioqumica. En la tabla se indica el nombre del
tampn, el rango de pH de empleo y el valor de pKa a diferentes temperaturas.
Tampn
Rango de pH
MES
pKa
20C
25C
37C
5.56.7
6.16
6.10
5.97
Bis-Tris
5.87.2
n/a
6.50
6.36
ADA
6.07.2
6.65
6.59
6.46
aces
6.17.5
6.88
6.78
6.54
PIPES
6.17.5
6.80
6.76
6.66
MOPSO
6.27.6
n/a
6.90
6.75
Bis-Tris Propane
6.39.5
n/a
6.8, 9.0
n/a
BES
6.47.8
7.17
7.09
6.90
MOPS
6.57.9
7.28
7.20
7.02
TES
6.88.2
7.50
7.40
7.16
HEPES
6.88.2
7.55
7.48
7.31
DIPSO
7.08.2
n/a
7.60
7.35
MOBS
6.98.3
n/a
7.60
n/a
TAPSO
7.08.2
n/a
7.60
7.39
Trizma
7.09.0
8.20
8.06
7.72
HEPPSO
7.18.5
n/a
7.80
6.66
POPSO
7.28.5
n/a
7.80
7.63
TEA
7.38.3
n/a
7.80
n/a
EPPS
7.38.7
n/a
8.00
n/a
Tricine
7.48.8
8.16
8.05
7.80
Gly-Gly
7.58.9
n/a
8.20
n/a
Bicine
7.69.0
8.35
8.26
8.04
HEPBS
7.69.0
n/a
8.30
n/a
TAPS
7.7-9.1
8.49
8.40
8.18
AMPD
7.89.7
n/a
8.80
n/a
TABS
8.29.6
n/a
8.90
n/a
AMPSO
8.39.7
n/a
9.00
9.10
CHES
8.610.0
9.55
9.49
9.36
CAPSO
8.910.3
n/a
9.60
9.43
AMP
9.010.5
n/a
9.70
n/a
CAPS
9.711.1
10.56
10.40
10.02
CABS
10.011.4
n/a
10.70
n/a
35
Resultados de las prcticas de Bioqumica

Resultados de las prcticas

(A entregar por el alumno)
Alumno (Apellidos, Nombre):
Grupo:
Pareja:
1.2. Determinacin cuantitativa de protenas: Metodo de Lowry
Representar la recta patrn de BSA (Valores de absorbancia frente a concentracin de BSA).
...
9
10
11
12
13
14
15
16
Calcular la concentracin de las muestras por interpolacin en la recta de BSA.
MUESTRA
Tris
ST 1/150
ST 1/300
F1 1/2
F1 1/4
F2 1/30
F2 1/60
F3 1/30
F3 1/60
250
250
250
250
250
250
250
250
NaOH
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
25L
React.1
React.2
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
225L
DO 750
nm
Conc.
diluida
Conc. sin
diluir
Media
(g/mL)
(g/mL)
(g/mL)
37
1.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
Representar la grfica del log10 del peso molecular (eje Y) frente a la movilidad relativa (eje X) y calcular el
peso molecular de las protenas ms abundantes enriquecidas en las fracciones C150 y C300 del
intercambio inico.
38
2. Qumica cido-base. Valoracin pH-mtrica
Realizar una curva de titulacin, representando los valores de pH en el eje de ordenadas (eje Y) y en el
eje de abscisas (eje X) la relacin de moles de anin hidroxilo (OH-) por mol de aminocido inicial (mol
OH/mol aa).
A partir de dicha curva determinar grficamente los valores de pKa para cada grupo ionizable.
De acuerdo con la tabla de valores de pKa, averiguar qu aminocido se ha titulado.
Formular las especies moleculares mayoritarias presentes en cada tramo de la curva de titulacin
Calcular el punto isoelctrico del aminocido problema.
39
3. Actividad butirilcolinesterasa de suero de caballo.
Representar grficamente D.O. (412 nm) frente a Unidades de butirilcolinesterasa empleadas en cada
ensayo. El valor obtenido en el Blanco deber restarse a todos los dems valores, ya que indica la
descomposicin espontnea, no catalizada enzimticamente, del sustrato de la reaccin.
Representar grficamente nmol de Butiriltiocolina hidrolizados vs Tiempo de incubacin.
Determinar, a continuacin, el valor de Vo y representar dicho valor de Vo frente a la concentracin de
sustrato inicial, So.
Calcular los valores de Km y Vmax a partir de una representacin de inversos.
40
6. Electroforesis en geles de agarosa
Representar la grfica del log10 del tamao de los fragmentos de ADN conocidos (eje Y) frente a la
distancia recorrida en el gel (eje X) y calcular el tamao del inserto amplificado por PCR.
41

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Departamento de Biologa Molecular

Informacin general y normas del laboratorio de prcticas .................................................. 2

2. Qumica cido-base. Valoracin pH-mtrica ..................................................................... 16

5. Amplificacin de ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) .............................. 28

Informacin general y normas del laboratorio de prcticas

Es necesario aprobar las prcticas para aprobar la asignatura.

1. Aislamiento de inmunoglobulinas de suero

1.1. Precipitacin fraccionada de protenas

Figura 2. Solubilidad de las protenas

Suero de ternera (ST).

S2 = Tanto por uno de saturacin a la que se quiere llevar la muestra.

1.2. Determinacin cuantitativa de protenas: Metodo de Lowry

10 volmenes de Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 M.

1 volumen de reactivo de Folin.

Figura 5. Esquema bsico de un espectrofotmetro.

Los pasos a seguir son los siguientes:

1.3. Cromatografa de intercambio inico

El procedimiento empleado ser una cromatografa en columna, utilizando una solucin

*Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 500mM NaCl

Figura 8. Esquema de elucin de la muestra de un intercambio

1.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

Preparar la solucin del gel de separacin (8 mL por gel) en el tubo de 10mL

Figura 11. Esquema del gel discontinuo de Acrilamida/Bisacrilamida

- Preparacin de las muestras

Suero de ternera (ST)

3.- Desarrollo de la electroforesis

2. Qumica cido-base. Valoracin pH-mtrica

La concentracin de cada especie en el equilibrio esta definida por la relacin:

donde Ka es la constante de disociacin. Despejando [H3O+] de la ecuacin:

Aplicando el logaritmo a ambos lados y la propiedad de los logaritmos para un producto

E invirtiendo el cociente dentro del logaritmo se obtiene la ecuacin de HendersonHasselbalch:

Que es equivalente a expresar:

H 2NCH 2COO (H 3N +CH 2COO-)=(H 2NCH 2COO -)

(H 3N +CH 2COOH)=(H 3N +CH 2COO -)

Moles de OH /mol de aminocido

Figura 18.Curva de valoracin del aminocido Glicina. En

8. Formular las especies moleculares mayoritarias presentes en cada tramo de la curva de

3. Actividad Butiril-colinesterasa de suero de caballo

Inmediatamente despus de producirse la mezcla de la enzima con el sustrato, y

+ HS- CH2-CH2-N (CH3)3

Actividad enzimtica en funcin de la concentracin de protena

4. Aislamiento de cidos nucleicos

4.1. Purificacin de cidos nucleicos a partir de hgado de rata.

Precipitacin con etanol

4.2. Mini-preparacin de ADN plasmdico.

En esta prctica vamos a purificar DNA plasmdico de una estirpe de la bacteria

la destruccin de la pared celular. Seguidamente las clulas son expuestas a la accin de un

Precipitacin con etanol.

5. Amplificacin de ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction)

Figura 14. Esquema de las 3 etapas del ciclo de amplificacin

Aunque en principio se puede utilizar cualquier ADN polimerasa, el descubrimiento de la

Taq ADN polimerasa

-Preparacin de la mezcla de reactivos para la PCR.

6. Electroforesis en gel de agarosa

Figura 16. Estructura de la agarosa.

Resultados de las prcticas de Bioqumica

Resultados de las prcticas

Calcular la concentracin de las muestras por interpolacin en la recta de BSA.

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