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1a AULA

INTRODUO AO LABORATRIO E SOLUES


INSTRUES
1. Lembre-se que o laboratrio um lugar para trabalhos srios e no para brincadeiras.
2. Leia os guias das prticas com antecedncia para obter melhor aproveitamento das aulas.
3. Realize somente os experimentos indicados na aula. No permitido realizar aqueles no
autorizados.
4. Tendo qualquer dvida solicite aos professores os devidos esclarecimentos.
5. Comparea s aulas nos dias e nos laboratrios designados para sua turma.
6. No permitido fumar ou consumir alimentos durante as aulas prticas.
7. Para sua prpria segurana, vista um guarda-p (avental) ao entrar no laboratrio.
8. No troque os reagentes de uma mesa para outra.
9. No final de cada aula, limpe todo o material: Passe gua de torneira nos tubos e outros
materiais utilizados. As pipetas devem ser colocadas dentro das cubas.
10. Quando houver quebra ou danos nos materiais ou aparelhos, comunique aos professores.
11. Se engolir um pouco de cido, lave rapidamente a boca com bastante gua e em seguida
com soluo de carbonato de sdio 2%.
PRINCPIOS DE TCNICA
a. Pipetas graduadas, no devem ser sopradas ao fim do escoamento. Portanto recomendase empregar o comeo (o zero) e no o fim da graduao para dispensar volumes
pequenos.
b. Uma mesma pipeta no pode ser usada para medir solues diferentes a no ser que seja
lavada.
c. Nunca aquecer material volumtrico.
d. Antes de retirar de um frasco uma soluo qualquer, ler o rtulo.
e. Para aspirar solues de cidos e lcalis concentrados, usar uma pipeta de segurana
(pera), antes testada com gua.
f. Nunca devolver uma soluo para o frasco estoque.
UNIDADE DE VOLUME
A unidade fundamental de volume na medida de lquidos o litro (l) e o mililitro (ml) o seu
submltiplo, correspondente milsima parte do litro.
MATERIAIS FUNDAMENTAIS DE LABORATRIO
VIDRARIA - De um modo geral, encontramos num laboratrio de Qumica dois tipos de
material de vidro, volumtrico e no volumtrico. Dentre os volumtricos temos: pipetas,
provetas e bales volumtricos.
PIPETAS - So destinadas a transferir determinados volumes de lquido. H dois tipos:
graduados e volumtricos. Nestas prticas, s pipetas graduadas so usadas. Elas tm
volumes de 1, 2, 5 e 10 ml e permitem escoar volumes variveis de lquido, de acordo
com a sua graduao, dividida em dcimos ou centsimos de ml.
PROVETAS - (Cilindros graduados) - So de medida volumtrica no muito rigorosa,
graduadas para diversos volumes de lquido: 25, 50, 100, 250 ... ml.
BALES VOLUMTRICOS
- So bales aferidos a fim de conterem um volume
determinado por um trao de referncia (50, 100, 250, 500 ... ml). So usados no
preparo de solues que exijam grande exatido na sua concentrao. No entanto, para
esta exatido ser garantida, todas as operaes de preparo de solues devem ser
feitas na temperatura do aferimento do material volumtrico, geralmente 20 o C.
MATERIAL NO VOLUMTRICO
Os principais tipos de vidraria utilizados nestas prticas so: tubo de ensaio, bquer,
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erlenmeyer e funil. So tambm freqentemente usados estantes e pinas para tubos
de ensaio.
TCNICA DE LEITURA DE MATERIAL VOLUMTRICO
Faz-se pela observao da coincidncia entre a curvatura que se forma na superfcie
livre do lquido (menisco) e a graduao existente no material volumtrico. A parte
inferior do menisco deve coincidir com o trao de graduao correspondente ao volume
desejado. Para evitar erro, sua vista, o menisco e o trao de graduao devem estar
num mesmo plano horizontal.
VELOCIDADE DE ESCOAMENTO
Se o escoamento for muito rpido (soprando na pipeta, por exemplo), a quantitade de
lquido que resta na pipeta aderido s paredes ser maior do que a que deve ficar. Com
gua, considera-se o que o tempo mnimo para o escoamento total de pipetas de 1 ml e
5 ml deve ser de 15 segundos.
EXPERINCIAS
Treinamento com pipetas - Procure identificar as pipetas de diferentes capacidades e
graduaes (1, 2, 5 e 10 ml) que esto em sua bancada. Faa ento os exerccios
seguintes, comeando com uma pipeta de 10 ml:
Introduza a extremidade inferior da pipeta em gua destilada contida em um bquer.
Aspire com a boca at que o nvel da gua ultrapasse o trao superior da aferio
(zero). Tire rapidamente a boca da abertura da pipeta e obture a mesma com o indicador
da mo direita. Diminua a presso exercida pelo indicador sobre a abertura, de modo a
deixar a gua cair gota a gota, at que a parte inferior do menisco coincida com o zero
(mantendo a pipeta na vertical e a marca no nvel dos olhos). Acertado o zero, comece
ento a escoar lentamente volumes variveis (10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml), acertando
a cada vez o menisco no zero.
REPITA O EXERCCIO
Com uma pipeta de 5 ml, escoando: 5 ml - 4 ml - 3 ml - 2 ml.
Com uma pipeta de 2 ml, escoando: 2 ml - 1,7 ml - 1,5 ml - 1 ml.
LEMBRE-SE
Volumes compreendidos entre 10 e 5 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 10
ml, volumes entre 5 ml e 2 ml devem ser transferidos com uma pipeta de 5 ml, volumes
entre 2 e 1 ml com uma pipeta de 2 ml e volumes entre 1 e 0,1 ml com uma pipeta de 1
ml.
SOLUES
As principais maneiras de definir a concentrao de uma soluo so atravs da
percentagem, da molaridade ou da normalidade.
Uma soluo percentual contm uma quantidade medida do soluto numa determinada
quantidade do solvente. Os trs principais tipos de solues percentuais resultam da
definio destas quantidades por peso ou por volume:
1 - Soluo percentual peso por volume - % p/v - Ex.: soluo de cloreto de sdio
2% (2 g do sal em 100 ml da soluo)
2 - Soluo percentual peso por peso - % p/p - Ex.: soluo de cido clordrico
37% (37 g do cido em 100 g da soluo)
3 - Soluo percentual volume por volume - % v/v - Ex.: soluo de cido actico
5% (5 ml do cido em 100 ml da soluo)
Uma soluo molar aquela que contm o peso molecular do soluto em gramas, por
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litro de soluo. representada por 1 M ou M. Pode haver mltiplos ou submltiplos do
peso molecular : 2 M - 4 M - 0,1 M - 0,2 M etc. Uma soluo M de cloreto de sdio
contm 58,5 g (p.m.) do sal, em um litro. Uma soluo 2 M conter 2x58,5g = 117 g.
Uma soluo 0,1 M conter 5,85 g.
Solues normais so aquelas que contm um equivalente-grama do soluto por litro de
soluo. Podemos ter mltiplos e submltiplos do equivalente-grama: 1 N, 2 N, 0,1 N...
O clculo do equivalente-grama depende da natureza qumica do soluto. Se um cido,
calcula-se dividindo o peso molecular pelo nmero de tomos de H ionizveis. Ex.: sol.
HCl 1 N (36,5 g/l); sol. HCl 0,1 N (3,65 g/l); sol. H 2SO4 1 N (98/2 = 49 g/l).
EXPERINCIA - PESAGEM E PREPARAO DE SOLUO
Preparar 25 ml de uma soluo de cloreto de sdio 20 % p/v.
TCNICA
Coloque todos os pesos da balana em zero.
O ponteiro deve estar no centro, posio de equilbrio.
Sobre o prato coloque um bquer. Observe que o ponteiro deslocou-se para cima. Mova
os pesos das escalas at restabelecer o equilbrio. Por exemplo, se o bquer pesou 68
g, o peso da escala de 10/100 g dever estar em 60 e o da escala 1/10 g em 8.
Anote o peso do bquer: __________
Ao peso do bquer some a quantidade de NaCl necessria para se preparar 25 ml da
soluo a 20 % p/v.
Anote o resultado do clculo bquer + NaCl: ___________
Desloque os pesos da balana at obter o total calculado. Observe que o equilbrio da
balana foi desfeito. Para restabelec-lo, adicione NaCl ao bquer. Temos assim pesada
a quantidade de sal necessria para se preparar os 25 ml da soluo a 20%.
Preparao da soluo
Ao cloreto de sdio contido no bquer junte cerca de 10 ml de gua destilada. Misture
com basto de vidro at dissolver. Transfira a soluo do sal para uma proveta de 25 ou
50 ml, tomando cuidado para no perder lquido. Ao bquer adicione 5 ml de gua
destilada e transfira para a proveta. Complete o volume at a marca de 25 ml com gua
destilada no deixando ultrapassar a marca.
OBSERVAES
Nas cincias modernas, a tendncia substituir o termo peso por massa.
As quantidades definidas por volume so sujeitas a alteraes significativas pela
temperatura. Em ambientes onde a temperatura no pode ser controlada rigorosamente,
recomendvel definir todas as quantidades pelas massas.
SOLUES-TAMPO
Tampes so solues que resistem a variaes de pH. So constitudos de cidos
fracos e seus sais ou de bases fracas e seus sais. Ex.: tampo acetato (cido actico +
acetato de sdio).
MECANISMO DE AO
Vamos tomar como exemplo o tampo acetato.
Se a este tampo se adicionar um cido forte como o HCl, haver formao de um sal
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neutro e de um cido fracamente ionizado, e o pH da soluo permanecer quase o
mesmo.
CH3COOH
CH3COONa +

HCl

NaCl
+
(sal neutro)

CH3COOH
(cido fraco)

Se ao mesmo tampo adicionarmos uma base forte como o hidrxido de sdio, haver
formao de acetato de sdio (menos alcalino que o NaOH) e gua. Tambm neste caso
o pH quase no se modificou.
CH3COOH +
CH3COONa

NaOH

CH3COONa

+ H2O

TAMPES FISIOLGICOS
Um dos mecanismos de controle da neutralidade dos lquidos celulares devido ao
de tampes. Os principais tampes que estabilizam o pH do sangue na faixa de 7,35 a
7,45 so: bicarbonato/cido carbnico, fosfato e hemoglobina. A manuteno deste pH
importante porque valores de pH acima de 7,7 ou abaixo de 6,8 so incompatveis com
a vida.
EXPERINCIAS COM TAMPES
Distribuir em quatro bquers marcados:
Bquer 1 e 2: 25 ml de gua destilada
Bquer 3 e 4: 25 ml de sol. tampo acetato 0,1 N pH 5.
Medir com papel indicador o pH aproximado dos lquidos dos 4 bquers. Anotar o
resultado no quadro a seguir.
Aos bquers 1 e 3 adicionar em cada, uma gota de HCl concentrado.
Aos bquers 2 e 4 adicionar em cada, uma gota de sol. NaOH 50%.
Misturar por leve agitao.
Medir com papel indicador o pH dos lquidos em cada bquer e anotar.
Bquer

pH inicial

pH aps HCl

pH aps NaOH

1
2
3
4

Baseado nos resultados da tabela, o que concluiu?

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2a AULA
AMINOCIDOS
1. REAO XANTOPROTICA
Pesquisa de Tirosina e Triptofano
Esta reao positiva com compostos portadores de radicais aromticos substitudos.
Nas protenas estes radicais aparecem na tirosina e no triptofano.

Tirosina

Triptofano

Os radicais aromticos destes aminocidos reagem com o cido ntrico formando


nitroderivados que em meio alcalino so alaranjados.
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias:
Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
Ao no 2 - juntar 1 ml de amido
Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)
Adicionar a cada tubo, 10 gotas de cido ntrico concentrado (muito corrosivo; usar pipeta
de 5 ml e apenas com imerso da ponta, no com aspirao). Agitar levemente e colocar
no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em gua corrente e acrescentar 4 ml de NaOH 2
N. Anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com um sinal + o(s)
teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:
Tubo

Reao

1
2
3
O aparecimento de colorao alaranjada indica a positividade do teste, confirmando a
presena dos aminocidos tirosina e triptofano. Nas condioes descritas, a fenilalanina no
reage.
2. REAO DE MILLON
Pesquisa de tirosina.
Esta reao devida a presena do grupo hidroxifenil. Nas protenas o nico grupo deste
tipo encontrado no aminocido tirosina. O teste de Millon usa como reagente o nitrato de
mercrio, dissolvido numa soluo de cido ntrico. O grupo hidroxifenil produz um fenolato
de mercrio de cor avermelhada.
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um as seguintes substncias:
Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
Ao no 2 - juntar 1 ml de fenol 1 %
Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)

AMINOCIDOS

2a AULA
Adicionar a cada tubo, 5 gotas do reativo de Millon (corrosivo e txico). Agitar levemente e
colocar no banho-maria fervente por 5 min. Esfriar em gua corrente e anotar os resultados
em forma de tabela como anteriormente. Que concluiu ?
3. REAO DO BIURETO
Reao geral para protenas.
Esta reao denominada do biuretoporque um composto chamado biureto o mais
simples que apresenta este teste positivo. O biureto um composto artificial, obtido pelo
aquecimento forte de uria, e tem a seguinte frmula:
H2N - CO - NH - CO - NH2
Biureto
O biureto o composto mais simples capaz de reagir em meio alcalino com cobre
divalente produzindo um complexo de cor violeta. Outros compostos com duas ligaes
amida dispostas de maneira semelhante ao biureto respondem de maneira semelhante;
portanto observamos a reao do biureto principalmente com as protenas, que tm muitas
ligaes peptdicas:
- NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO - NH - CHR - CO -

Ligaes peptdicas
Os complexos coloridos formados com cobre divalente em meio alcalino tm
estruturas parecidas:

Complexo Cprico do Biureto

Complexo Cprico da Protena

A reao das protenas com o reativo do biureto no muito sensvel, porm to


segura que ela usada como referencial para a dosagem da concentrao protica no
plasma e soro do sangue humano.
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml do reativo do biureto (sulfato cprico
complexado com tartarato em meio alcalino).
Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
Ao no 2 - juntar 1 ml de amido
Ao no 3 - juntar 1 ml de gua (tubo controle)
Misturar por leve agitao dos tubos, esperar 10 minutos, anotar os resultados em forma de
tabela.

AMINOCIDOS

3a AULA
PROTENAS
REAES DE PRECIPITAO
As protenas podem ser precipitadas de suas solues por ao de cidos fortes, por
solues concentradas de sais (p.e. sulfato de amnio), por solventes orgnicos (p.e. lcool) e
ainda por sais de metais pesados, em determinadas condies. Ainda que superficialmente
parecidas, as reaes de precipitao de protenas podem ter mecanismos muito diferentes. A
precipitao de protenas acompanha-se quase sempre de uma desnaturao das mesmas; no
entanto, s vezes esta mudana de conformao reversvel. Por outra lado, existem formas
de desnaturao irreversvel (p.e. com bases fortes ou detergentes), que no levam as
protenas precipitao.
1. PRECIPITAO PELO CIDO TRICLOROACTICO
cidos fornecem ons negativos e precipitam as protenas sob forma de sais; no
entanto, este mecanismo vem associado com uma destruio daquelas partes da conformao
nativa que dependem de pontes de hidrognio e de ligaes inicas. A atividade de cidos
particularmente eficientes para precipitar protenas, como p.e. os cidos tricloroactico,
tngstico e pcrico, explica-se porque estes reagentes atacam, adicionalmente, os centros
hidrofbicos das protenas.
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml de ovoalbumina. Posteriormente,
adicionar em cada um as seguintes solues (cuidado):
Ao no 1 - juntar 1 ml sol. cido actico 20 %
Ao no 2 - juntar 1 ml sol. cido clordrico 20 %
Ao no 3 - juntar 1 ml sol. cido tricloroactico 20 %
Agitar e misturar bem. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue,
marcando pelo nmero de sinais + , a quantidade de precipitado que apareceu.
Tubo

Precipitado

1
2
3
Que concluiu sobre a eficincia dos diferentes cidos para precipitar a protena ? Existe
relao entre a molaridade do cido e o seu efeito sobre a ovoalbumina?
2. PRECIPITAO COM SAIS DE METAIS PESADOS
As bases, mesmo fortes, no precipitam as protenas apesar de elas quebrarem
tambm as pontes de hidrognio e ligaes inicas. No entanto, o meio alcalino aumenta
substancialmente o nmero de cargas negativas presentes nas protenas. Nestas condies,
reativos como os ons de metais pesados (p.e. mercrio, chumbo), precipitam as protenas
devido formao de sais insolveis (proteinatos) dos metais. ( de se observar que, mesmo
em ausncia de protenas, estes metais em condies alcalinas formam hidrxidos, tambm
insolveis. O precipitado final consiste, portanto, de dois componentes).
proteina + OH protena - + metal
metal + + OH -

PROTENAS

proteina
proteinato de metal, insolvel
metal-OH, insolvel

3a AULA
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 gotas de NaOH (corrosivo; usar pipeta
de 5 ml e apenas com imerso da ponta, no com aspirao).
Ao no 1 - juntar 1 ml de ovoalbumina
Ao no 2 - juntar 1 ml de ovoalbumina e 5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %
Ao no 3 - juntar 1 ml de gua e 5 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %
(tubo controle)
Misturar por leve agitao dos tubos, esperar 10 minutos, e anotar os resultados em forma
de tabela como segue, marcando com um sinal - o teste negativo e com um ou vrios
sinais + , a quantidade de precipitado que apareceu nos testes positivos.
Tubo

Precipitado

1
2
3
Que concluiu sobre a natureza do precipitado no tubo n o 2?
3. PRECIPITAO POR SATURAO SALINA E COM SOLVENTE ORGNICO
Muitas protenas so hidrosolveis. Todas elas devem sua solubilidade a uma extensa
camada de gua estruturada que interage com cargas eltricas e resduos polares na
superfcie da molcula proteica. A adio de sais (sulfato de amnio) ou solventes misturveis
com gua (lcool, acetona) leva a solvatao das respectivas molculas ou ons, em
competio com a protena, que se torna insolvel na retirada da sua camada superfcial de
gua estruturada. No entanto, boa parte desta precipitao reversvel pela adio de mais
gua, ao contrrio das experincias anteriores.
TCNICA
Marcar 2 tubos de ensaio e colocar em cada um 1 ml de ovoalbumina. A seguir, adicionar a
estes tubos:
Ao no 1 - juntar 3 ml de sol. saturada de sulfato de amnio
Ao no 2 - juntar 3 ml de lcool
Misturar bem e deixar em repouso antes de anotar os resultados. Depois de 5 min,
adicionar a cada tubo, 5 ml de gua destilada e misturar outra vez. Na tabela abaixo, utilize
um ou mais sinais + para indicar a quantidade de precipitado que apareceu antes e depois
da adio de gua:
Tubo

1O precipitado

2O precipitado
(aps adio de gua)

1
2
Que concluiu sobre a reversibilidade das precipitaes nos tubos 1 e 2 ?

PROTENAS

3a AULA
4. PRECIPITAO ISOELTRICA
O ponto isoeltrico de uma protena o valor de pH no qual a molcula apresenta
carga total nula.
As protenas apresentam uma solubilidade mnima nos seus pontos isoeltricos, ou
seja, um mximo de precipitaco. Este efeito pode ser demonstrado mais rapidamente em
condies que removem parcialmente a proteo fornecida pela camada superficial de gua, o
que pode ser obtido pela adio de lcool.
TCNICA
Marcar 3 tubos de ensaio e colocar em cada um 2 ml dos seguintes tampes:
Ao no 1 - soluo tampo pH 6,0
Ao no 2 - soluo tampo pH 4,7
Ao no 3 - soluo tampo pH 3,0
A cada tubo adicionar 1 ml de ovoalbumina e 4 ml de lcool. Misturar bem por agitao
eficiente. Observar e anotar os resultados em forma de tabela como segue, marcando com
um sinal + o(s) teste(s) positivo(s) e com um sinal - os negativos:
Tubo

Reao

1
2
3
Que concluiu sobre o ponto isoeltrico da ovoalbumina ? Quais aminocidos ionizados so
mais abundantes nesta protena ?

PROTENAS

4a AULA
ENZIMAS / UREASE
UREASE (uria amidohidrolase E.C.3.5.1.5)
A urease uma enzima encontrada nas sementes das leguminosas, especialmente no
feijo de porco (Canavalia ensiformis), mas tambm nas sementes da melancia (Citrullus
vulgaris). Atua especificamente sobre a uria transformando-a em CO 2 e amnia.
DETERMINAO DA ATIVIDADE
A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma soluo de
uria a pH 7, muito fracamente tamponada. A soluo contm um indicador, vermelho de
fenol (Vermelho Neutro), que muda de amarelo para rosa (pH 6,8 a 8,4). Estando a
enzima ativa, ocorrer liberao de NH3 em quantidade suficiente para sobrepujar a ao
do tampo tornando o meio da reao alcalino. Como conseqncia da subida do pH, a
soluo, originalmente amarela, passa cor rsea.
urease
uria
(substrato)

indicador
cor amarela

2 NH3 + CO2
(produtos)

indicador
cor rsea

RESUMINDO: Se a enzima estiver com atividade, ocorrer mudana de cor de


amarela para rsea. Por que ?

1. TESTE DE ATIVIDADE ENZIMTICA


Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a
seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada:
s

Tubo

Uria
tamponada
com indicador

Ureas
a

gu

1
2

3 ml
3 ml

3 gotas
-

3 gotas

A
G
I
T
A
R

Mudan
a de cor

2. ESPECIFIDADE
A urease altamente especfica para a uria. Isto pode ser demonstrado fazendo a
enzima reagir com um composto com estrutura semelhante do substrato, a tiouria
H2N-CS-NH2, e verificar se houve mudana de cor.
Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a
seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada:
Tubos

Uria
Tiouria
tamponada
tamponada
com indicador com indicador

1
2

ENZIMAS / UREASE

2 ml
-

2 ml

Urease
3 gotas
3 gotas

A
G
I
T
A
R

Mudan
a de cor

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4a AULA
3. DESNATURAO PELO CALOR
Devido sua natureza protica, as enzimas so sensveis ao de temperaturas
elevadas, que podem destruir a funo cataltica do seu centro ativo.
Colocar num tubo 3 ml de gua destilada e 3 gotas de urease. Agitar. Colocar em
banho maria fervente por 3 minutos. Esfriar em gua corrente.
Em outro tubo pipetar 2 ml de uria tamponada e juntar 1 ml da urease fervida (tubo
anterior). Agitar. Verificar se houve modificao de cor da soluo nos prximos 5 minutos.
Explicar porque a urease foi diluda antes de esquentar e porque a elevao da
temperatura desnatura as protenas.

4. INIBIO
Grupos sulfidrila (SH) prximos ao centro ativo da urease so essenciais para a
manuteno da conformao ativa. Compostos como os sais de metais pesados (Hg, Pb,
Ag) ao se combinarem com os grupos SH, causam modificaes permanentes na
conformao da enzima, provocando diminuio e perda de sua atividade:
enzima - SH + Hg2+
ativa

enzima - S - Hg+ + H+
inativa

Marcar 2 tubos e distribuir neles as substncias nas quantidades indicadas na tabela a


seguir. Na ltima coluna, marque com um + ou um - a mudana de cor observada, aps
5 minutos de observao:
Tubos

Urease

gua

HgCl2

Uria
tamponada
com indicador

1
2

3 gotas
3 gotas

1 ml
1 ml

8 gotas
-

3 ml
3 ml

ENZIMAS / UREASE

A
G

Mudana de
cor

I
T
A
R

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5a AULA
CARBOIDRATOS
1. TESTE DE MOLISCH
Reao geral para carboidratos.
A ao desidratante de cidos concentrados sobre os monossacardeos leva formao de
furfural e derivados. As aldopentoses formam o furfural e as hexoses produzem o
hidroximetilfurfural. Os aldedos de furano podem se condensar com fenis e aminas dando
compostos coloridos do tipo trifenilmetano. Este o fundamento da reao que
considerada geral para carboidratos e conhecida como teste de Molisch. Reagem
pentoses e hexoses no apenas como monossacardeos livres, mas tambm so positivos
no teste todos os compostos que levam carboidratos ligados: polissacardeos,
glicoprotenas, glicolipdeos e outros, que so hidrolisados pelo cido sulfrico concentrado.
Exemplo:

5-Hidroximetilfurfural

Derivado Trifenilmetano

TCNICA
Marcar 3 tubos e distribuir neles:
tubo 1 - 2 ml de sol. glicose 1 %
tubo 2 - 2 ml de sol. amido 1 %
tubo 3 - 2 ml de gua destilada (tubo controle)
Aos 3 tubos adicionar 5 gotas de sol. de alfa naftol. Misturar por leve agitao. Pipetar com
muito cuidado cerca de 2 ml de cido sulfrico (extremamente corrosivo, no aspirar o
cido, usar pipeta de 10 ml) e deixar o cido escoar lentamente pela parede do tubo sem
agitar, a fim de se formar uma camada de cido por debaixo da soluo teste. Sem agitar,
colocar o tubo na estante. A reao positiva quando aparece um anel violeta na interfase.
O surgimento de colorao esverdeada na camada inferior devida a impurezas do naftol.
Anotar os resultados em forma de tabela.
2. TESTE DE BIAL
Reao para identificao de pentoses.
O mecanismo da reao de Bial (ou reao do orcinol) semelhante ao da reao de
Molisch, ou seja, com cido concentrado se forma o furfural. A diferena que neste caso o
cido usado o cido clordrico e o fenol o orcinol. Consequentemente, o produto
formado e sua cor sero diferentes.
TCNICA
Marcar 3 tubos e colocar em cada um, 1 ml do reativo de Bial (HCl com orcinol e FeCl 3).
Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de pentose (arabinose)
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de glicose
Ao tubo 3 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)
Levar os tubos ao banho-maria fervente por 30 segundos e anotar os resultados em forma
de tabela. O teste positivo quando se forma uma colorao esverdeada.

CARBOIDRATOS

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5a AULA
3. TESTE DE SELIWANOFF
Distino entre aldoses e cetoses.
Nas condies do teste, as cetohexoses transformam-se nos derivados do furfural mais
rapidamente que as aldohexoses. Em conseqncia, nas referidas condies e sendo
curto o tempo de incubao, o resorcinol forma um produto colorido apenas com as
cetohexoses. No entanto, prolongando-se o tempo de incubao, as aldoses reagem de
maneira semelhante.
TCNICA
Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Seliwanoff (HCl com resorcinol).
Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de frutose
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de glicose
Ao tubo 3 adicionar 1 ml de soluo de sacarose
Ao tubo 4 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)
Colocar todos os tubos ao mesmo tempo no banho-maria fervente e cronometrar o
aparecimento de colorao vermelha. Anotar os resultados na seguinte tabela:
1 min

2 min

4 min

6 min

Frutose
Glicose
Sacarose
gua
Qual o melhor tempo para diferenciar entre a frutose e a glicose ? Quem dos dois
monossacardeos a cetose ? Por que a sacarose reage?
4. TESTE DE BENEDICT
Reao para identificar carboidratos redutores.
Os monossacardeos e alguns dissacardeos possuem em suas estruturas grupos aldedo
ou cetona, livres ou hidratados. Estes podero reduzir certos ons metlicos contidos em
reagentes especiais. A maioria destes reagentes contm sais de cobre e so usados para
pesquisa de acares redutores. Um destes reagentes o de BENEDICT que contm
sulfato cprico, carbonato de sdio e citrato de sdio. Este ltimo composto produz um
complexo azul com cobre divalente e isto evita a formao de hidrxido cprico insolvel
no meio alcalino:

Cuprocitrato (Cu2+)
Sob ao de um agente redutor, o cobre divalente reduzido a cobre monovalente que no
pode formar um complexo solvel com o citrato. Conseqentemente, o cobre precipita sob
a forma de hidrxido cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidrxido cuproso passa
a xido cuproso de cor vermelha:
redutor
Cuprocitrato (Cu )
2+

solvel, azul

CARBOIDRATOS

calor
hidrxido cuproso (Cu )
+

insolvel, amarelo

xido cuproso(Cu+)
insolvel, vermelho

13

5a AULA
TCNICA
Marcar 4 tubos e colocar em cada um, 3 ml do reativo de Benedict.
Ao tubo 1 adicionar 1 ml de soluo de glicose
Ao tubo 2 adicionar 1 ml de soluo de frutose
Ao tubo 3 adicionar 1 ml de soluo de sacarose
Ao tubo 4 adicionar 1 ml de gua destilada (tubo controle)
Colocar todos os tubos no banho-maria fervente por 3 min. Retirar os tubos e anotar os
resultados em forma de tabela. O que concluiu ?
5. TESTE DE IODO
Identificao de polissacardeos.
Alguns polissacardeos reagem com iodo formando produtos coloridos. Com o amido, a cor
azul, com o glicognio castanho-avermelhado. Os monossacardeos no reagem. No
amido, a frao no ramificada (amilose) que responsvel pela formao do complexo
da cor azul; a amilopectina reage de forma semelhante ao glicognio.
TCNICA
Marcar 3 tubos e distribuir neles:
Tubo 1 - 2 ml de amido 1 %
Tubo 2 - 2 ml de glicose 1 %
Tubo 3 - 2 ml de gua destilada (tubo controle)
Aos 3 tubos adicionar duas gotas da soluo de Lugol. Este reativo uma soluo de poliiodetos, produzidos por dissoluo de iodo metlico numa soluo de iodeto de potssio, e
ele reage como se fosse iodo elementar. Anotar os resultados em forma de tabela.
REVERSO DA REAO DO IODO PELO CALOR
Colocar o tubo 1 do ensaio anterior no banho-maria fervente por alguns minutos at o
desaparecimento da cor azul. Resfriar em gua corrente. O que observou ?
A cadeia da amilose (frao no ramificada do amido) tem a conformao de uma hlice
que absorve o iodo no interior da espiral. Este complexo forma-se por interaes fracas que
podem ser desfeitas pelo calor.

CARBOIDRATOS

14

6a AULA
HIDRLISE DO AMIDO
O amido quando tratado por um cido a quente, sofre uma hidrlise sucessiva, dando
vrias dextrinas e como produtos finais, maltose e glicose.
As dextrinas tm tamanhos diferentes, mas conservam, em princpio, a estrutura em
hlice do amido. Em consequncia, as dextrinas absorvem o iodo e sua reao com o reativo
de Lugol gera solues coloridas; as diferenas de colorao permitem classificar as
diferentes dextrinas. (O reativo de Lugol uma soluo de poli-iodetos, produzidos por
dissoluo de iodo metlico numa soluo de iodeto de potssio, e ele reage como se fosse
iodo elementar). As cores observadas so as seguintes:
AMIDO
AMILODEXTRINA
ERITRODEXTRINA
ACRIDEXTRINA

cor azul
cor roxa
cor alaranjada
no d cor

A maltose e glicose possuem propriedades redutoras que podem ser reconhecidas pela
reao de BENEDICT. O reativo de BENEDICT contm sulfato cprico, carbonato de sdio e
citrato de sdio. O ltimo composto produz um complexo azul com cobre divalente, que evita
a formao de hidrxido cprico insolvel no meio alcalino. A ao de um agente redutor
(maltose e glicose) reduz o cobre divalente a cobre monovalente, o qual no pode formar um
complexo solvel com citrato. Consequentemente, o cobre precipita sob forma de hidrxido
cuproso, de cor amarela. Por aquecimento, o hidrxido cuproso passa a xido cuproso de cor
vermelha:
redutor
Cuprocitrato (Cu2+)

calor
hidrxido cuproso (Cu+)

solvel, azul

insolvel, amarelo

xido cuproso(Cu+)
insolvel, vermelho

TCNICA
Preparar um banho de gua fervente e numerar 7 tubos de ensaio.
Num Erlenmeyer, colocar 30 ml da soluo de amido a 15 % e 7 ml de HCl 2N.
Transferier 3 ml desta mistura para cada um dos tubos.
Ao tubo 1 adicionar 1 gota do reativo de Lugol e observar a cor azul que se desenvolve.
Colocar os tubos restantes no banho de gua fervente. Cada tubo ser retirado ao trmino
dos perodos de tempo indicados no quadro abaixo e, depois de resfriado em gua
corrente, receber uma gota de Lugol, com exceo do tubo 7.
Ao tubo 7 adicionar 3 ml do reativo de Benedict e retornar ao banho de gua fervente. O
aparecimento de um precipitado vermelho ou alaranjado indica a presena de substncia
redutora, no caso maltose ou glicose.
TUBO

MINUTOS DE
REAO

10

15

20

25

HIDRLISE DO AMIDO

COR
COM IODO

PRODUTOS
IDENTIFICADOS

Reao de Benedict

15

7a AULA
LIPDIOS
1. SAPONIFICAO
Colocar num tubo de ensaio grande (25 x 200 mm) cerca de 0,5 g de gordura animal e
adicionar 10 ml de soluo alcolica de KOH 0,5 N (extremamente corrosiva, no aspirar com
a boca, usar pipeta de 10 ml).
Adaptar ao tubo de ensaio um tubo condensador cheio de gua de torneira, que ir
minimizar a evaporao do lcool. Colocar o conjunto (tubo grande + tubo condensador) em
banho maria fervente e deixar l por 5 minutos. Retirar o tubo do banho e remover o tubo
condensador. Desprezar qualquer sobra eventual de material slido e continuar apenas com o
lquido contido no tubo grande.
Adicionar 10 ml de gua destilada mistura de saponificao. Agitar. Observar a
formao de espumas. Guardar o contedo do tubo para as experincias seguintes.
2. PREPARAO DE CIDOS GRAXOS LIVRES
Adicionar mistura de saponificao, j diluda com gua destilada, 1 ml de cido
clordrico concentrado, gota a gota, agitando o tubo posteriormente com cuidado (o cido
corrosivo, portanto no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Colocar novamente o tubo
no banho maria at obter uma boa separao de camada oleosa, acima da camada aquosa
(os cidos graxos livres so pouco solveis na gua e menos densos que ela).
Deixar o tubo esfriar num recipiente com gua gelada. A camada superior solidificar, pois os
cidos graxos de gordura animal so em grande parte saturados, tendo alto ponto de fuso,
ao contrrio dos cidos graxos insaturados que predominam na gordura vegetal.
Decantar o lquido do tubo e guardar apenas a parte slida para as experincias
seguintes.
3. SOLUBILIDADE DOS CIDOS GRAXOS LIVRES
Retirar com auxlio de um basto de vidro, uma pequena quantidade dos cidos
graxos isolados e colocar num tubo de ensaio limpo e seco. Adicionar 2 ml de ter. Agitar. O
que observou?
4. FORMAO DE SABES SOLVEIS POR REDISSOLUO DOS CIDOS GRAXOS
LIVRES.
Adicionar ao tubo da experincia 2, que contm a maior parte dos cidos graxos
isolados, 10 ml de gua destilada e 5 ml de soluo alcolica de KOH 0,5 N (extremamente
corrosiva, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml). Levar ao banho maria por 3 minutos.
Agitar. Observar a formao de espumas. Conservar o contedo do tubo para a experincia
seguinte.
5. FORMAO DE SABES INSOLVEIS
Tomar 2 tubos de ensaio e pipetar em cada um 2 ml da soluo de sabes solveis
obtida na experincia anterior. Ao primeiro adicionar 10 gotas de soluo de cloreto de clcio
5% e ao segundo 10 gotas de soluo de acetato de chumbo 10 %. Observar a formao de
precipitados (sabes insolveis de clcio e chumbo, alm dos respectivos hidrxidos).
6. REAO DO COLESTEROL COM O REATIVO DE LIEBERMAN-BURCHARD
Colocar 1 ml de uma soluo diluda de colesterol em um tubo de ensaio limpo e seco.
Adicionar 10 gotas de anidrido actico e 3 gotas de cido sulfrico concentrado (os dois
reativos so extremamente corrosivos, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml).
Observar aps alguns minutos o aparecimento de uma colorao esverdeada. Esta reao, de

LIPDIOS

16

7a AULA
mecanismo oxidativo, identifica os esterides que possuem dupla ligao entre os carbonos 5
e 6 (anis A e B), como o colesterol.

COLESTEROL

LIPDIOS

CTION CARBNICO
PENTAENLICO

17

8a AULA
IDENTIFICAO DE CIDOS NUCLICOS
Os cidos nuclicos presentes num tecido (especialmente o DNA) podem estar
firmemente ligados a ctions ou a protenas catinicas, tais como histonas e protaminas.
Assim, estas protenas estaro presentes juntamente com os cidos nucleicos, quando estes
ltimos forem precipitados a partir de um homogenato de fgado de rato. Os polinucleotdeos
podem ser precipitados pela ao de solues salinas, ou por lcool em presena de sais.
Nesta prtica, usamos um mtodo mais antigo que utiliza o cido tricloroactico para precipitar
complexos nucleoproticos. O precipitado nucleoprotico posteriormente dissociado a
quente, libertando-se os cidos nuclicos sob forma de oligonucleotdeos solveis, enquanto
que as protenas permanecem insolveis. Em seguida, no extrato solvel dos
oligonucelotdeos ser testada a presena dos acares caractersticos do RNA e DNA.
A reao do orcinol (reativo de Bial) permite identificar o RNA, atravs da ribose
presente. Determinaes quantitativas foram procedidas usando esta reao (conforme
Schneider & Hoogebom e Dische & Schwartz, 1937).
+ HCl
Ribose

+ orcinol
Furfural

Derivado Trifenilmetano

No passado, a reao da difenilamina com desoxirribose foi muito utilizada para


identificar e determinar quantitativamente o DNA (reao descrita por Dische em 1930, e mais
usada na sua verso modificada por Burton em 1956). O DNA em meio cido hidrolizado
libertando desoxirribose, e esta, atravs do seu grupamento CHO livre, reage com a
difenilamina com formao de composto de cor azul, com absoro a 600 nm.
TCNICA
1. Obteno de homogenato de fgado de rato.
2. Extrao de cidos nucleicos do homogenato.
3. Identificao de DNA no extrato cido pela reao da difenilamina.
4. Identificao de RNA no extrato cido pela reao do orcinol.
PROCEDIMENTO
1.

Obteno de extrato cido de cidos nuclicos.

1.1. Homogenizar o fgado de um rato em nove volumes de sol. cido ctrico 2%. Pipetar 2
ml do homogenato num tubo de centrfuga e adicionar 1 ml de sol. cido tricloroactico 20
%. Agitar. Deixar em repouso por 10 minutos.
1.2. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante.
1.3. Ao sedimento (cidos nucleicos e protenas), juntar 5 ml de sol. cido tricloroactico
5%. Misturar cuidadosamente com basto de vidro e decantar a suspenso para um
tubo de ensaio (o tubo de centrfuga no pode ser esquentado).
1.4. Levar ao banho maria fervente por 20 minutos. Esfriar e transferir novamente a
supenso para o tubo de centrfuga.
1.5. Centrifugar a 2000 rpm por 10 minutos. Decantar o sobrenadante para um tubo de
ensaio limpo (o sobrenadante conter quase todo RNA e DNA existente nos 2 ml de
homogenato usados inicialmente).
2. Identificao dos cidos nucleicos no extrato cido.
2.1. Identificao do DNA. Pipetar num tubo de ensaio 2 ml do sobrenadante da etapa 1.5
e em outro tubo, 2 ml de gua destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 2 ml do
reativo da difenilamina (corrosivo, no aspirar com a boca, usar pipeta de 10 ml).
Agitar. Aquecer os dois tubos a 100o C por 10 minutos. O que observou?
2.2. Identificao do RNA. Pipetar num tubo de ensaio 0,2 ml do sobrenadante da etapa
1.5 e em outro tubo, 0,2 ml de gua destilada (Branco). Adicionar aos dois tubos 0,8 ml
de gua destilada e 2 ml do reativo de orcinol (corrosivo, no aspirar com a boca, usar
pipeta de 10 ml). Agitar. Levar ao banho maria fervente por 10 minutos. O que
observou?

IDENTIFICAO DE CIDOS NUCLICOS

18