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BIOQUMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

RELATRIO

DA

ATIVIDADE EXPERIMENTAL TP3

MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMDICA

Francisco Caiado -76032


Ins Domingos - 76973
Marta Barbas - 79693

Data do laboratrio: 22.10.2013


Turno: A, Laboratrio de Cincias Biolgicas

BBM
2013-2014, MEBIOM

RESUMO
A actividade laboratorial TP3 baseou-se na caracterizao cintica da
enzima invertase. Esta enzima capaz de catalisar a hidrlise da
sacarose nos seus diferentes monmeros.
Ento a finalidade do trabalho prtico foi estudar a influncia que a
quantidade de substrato tem na actividade da enzima.
Aps a medio da absorvncia de cada soluo e atravs dos
mtodos de Lineweaver-Burk e Michaelis-Menten, foi possvel
determinar o Km (concentrao de substrato) e a velocidade mxima
correspondente enzima em estudo.
Os valores obtidos
respectivamente,

para

Km

para

velocidade

so,

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Resultados
Com a realizao da actividade laboratorial obtivemos o valor de
absorvncia de cada uma das concentraes de sacarose ao longo do
tempo, em que ocorria a aco da enzima.

Concentra
o de
sacarose
(g/L)
15

Absorvncia

min0

min1

min3

min5

min7

0,057

0,093

0,335

0,703

0,655

30

0,01

0,202

0,942

1,599

2,244

45

0,011

0,236

0,788

1,422

2,477

60
75

0,005
0,004

0,375
0,117

1,084
0,453

1,782
0,91

2,415
1,37

0,3

0,931

1,735

2,057

100

TABELA 1 : VALORES OBTIDOS EXPERIMENTALMENTE NOS VRIOS


ENSAIOS

A partir dos valores anteriormente mencionados obteve-se


concentrao de Produto, atravs da recta de calibrao DNS (y=)
Concentrao de Produto
(g/mol)

Concentrao
de sacarose
(g/L)

15
30
45
60
75
100

min0

min1

min3

min5

min7

0,0811
0,0260
0,0271
0,0201
0,0189
0,0142

0,1234
0,2514
0,2913
0,4546
0,1516
0,3665

0,4076
1,1204
0,9395
1,2871
0,5461
1,1074

0,8397
1,8919
1,6840
2,1067
1,0828
2,0516

0,7833
2,6492
2,9229
2,8500
1,6229
2,4297

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TABELA 2 : VALORES DA CONCENTRAO DE PRODUTO FORMADO

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Foi possvel traar um grfico que mostra a variao de concentrao


de glucose em funo do tempo e ainda a sua regresso linear.
f(x) =
3.5000

3.0000
15g/L

f(x) = 0.41x + 0.05

Linear (15g/L)

f(x) = 0.4x - 0.12


f(x) = 0.38x - 0.04
f(x) = 0.36x + 0.04

2.5000

Linear (15g/L)
Linear (15g/L)
30g/L
Linear (30g/L)
Linear (30g/L)

2.0000

45g/L
Linear (45g/L)
Linear (45g/L)

1.5000

60g/l

f(x) = 0.23x - 0.06

Linear (60g/l)
75g/l
Linear (75g/l)
1.0000

Linear (75g/l)
100g/l
Linear (100g/l)
Linear (100g/l)

0.5000

0.0000

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GRFICO 1 : CONCENTRAO DE AUCAR (G/MOL, EIXO DOS YY) EM FUNO DO TEMPO (MIN, EIXO
DOS XX)

Nas tabelas 1 e 2 h a sinalizao de um valor a vermelho, o qual foi


desprezado na realizao do Grfico 1, para que os clculos do
trabalho ficassem sujeitos a um erro menor.

A partir do Grfico 1 podemos chegar velocidade de reao de cada


concentrao de sacarose, atravs do declive de cada regresso.

Concentra
o de
Sacarose
(g/L)

Velocida
de
(g/Lmin)

15

(1)
0,1041

30

0,3845

45

0,4055

1/V

1/S

Velocidade
(mol/Lmin)

(2)

(3)

(4)

9,606
1

0,0667

0,0003042

2,600
8
2,466

0,0333

0,0011235

0,0222

0,0011848

1/V
(Lmin/m
ol)
(5)
3287,608
07
890,0910
27
843,9950

Inverso da
concentra
o
mol/Lmin
(6)
22,8160

11,4080
7,6053

Concentra
o mol/L
(7)
0,04382889
2
0,08765778
4
0,13148667

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1
60

0,4031

75

0,2321

100

0,3613

2,480
8
4,308
5
2,767
8

68
0,0167

0,0011778

0,0133

0,0006782

0,0100

0,0010557

849,0200
94
1474,536
84
947,2460
56

5,7040
4,5632
3,4224

0,17531556
8
0,21914446
0,29219261
3

TABELA 3 : VALORES CALCULADOS. LEGENDA:

(1)- velocidade minima em (g/L); (2)- Inverso da velocidade 1;


concentrao de sacarose; (4) Velocidade minima em (mol/L);
velocidade 4; (7) Concentrao (mol/L)

(3) Inverso da
(5) Inverso da

Com os valores da tabela 3 foi possvel construir os grficos de


Michaelis-Menten e Lineweaver-Burk.

Grfico de Michaelis-Menten
0
0
0
0

Velocidade(mol/min) 0
0
0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Concentrao (mol/L)

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GRFICO 2 : GRFICO DE MICHAELIS-MENTEN

O grfico foi obtido atravs da equao de Michaelis-Menten:


v=

Vmax [ S]
Km+[ S ]

No entanto parra termos de simplificao, inverteu-se a equao de


forma a criar um grfico de Lineweaver-Burk, da seguinte maneira:
1
Km
1
1
=

+
v Vmx [ S ] Vmx

Obtemos assim o grfico de onde possvel retirar os valores de


velocidade mxima (Vmx) e do Km.

Linewearer Burk
3500
3000
f(x) = 114.14x + 325.94
2500
2000

Inverso da velocidade

1500
1000
500
0
0.0000

10.0000

20.0000

30.0000

Inverso da concentrao de sustrato

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GRFICO 3 : LINEWEAVER-BURK

y= 114,14x + 325,94

y=

mx +


1
Km
1
1
=

+
V
Vmx [ S ] Vmx

.
possvel ento chegar aos valores de Vmx e Km:

Vmx
(g/Lmin
)
0,00307

Km(mM
)
Produto
Substra
to

350,187
2
332,615
6

TABELA 4 : VALORES DE VELOCIDADE MXIMA E KM DO PRODUTO E SUBTRATO

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DISCUSSO
No

presente

trabalho,

pretendia-se

caracterizar

cintica

de

Michaelis-Menten para a enzima invertase.


No modelo da cintica de Michaelis-Menten, afirmado que a
variao da velocidade de uma reao enzimtica depende do
aumento da concentrao de substrato com que a enzima reage e
demonstra-se da seguinte forma:

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Figura Curva de Michaelis-

Menten
Nesta figura possvel observar o Km, constante de Michaelis, que
representa a concentrao de sacarose (substrato) para a qual a
velocidade metade da velocidade mxima. Esta constante uma
medida

de

afinidade,

sendo

que

valores

muito

elevados

correspondem a uma afinidade muito baixa. Tambm se pode


observar a velocidade mxima, Vmx, que corresponde ao valor
mximo para que tende a curva experimental. Esta curva descrita

pela seguinte equao:

v =vmax

[ S]
Km+[S]

Assim, de modo a obter Km for necessrio recorrer a uma forma


linearizada da equao (Lineweaver-Burke), isto , calcularam-se os
parmetros pretendidos a partir da equao inversa. Deste modo,
obtiveram-se como valores experimentais para o Km 114.0940.
Estes apresentam um enorme um erro relativo, isto um erro de
86.4281% (relativamente ao tabelado de apenas 61.2, pelo que se
devem ter em considerao quais os erros realizados.

|114.094061.2|

erro relativo( Km)=

61.2

0.864281

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importante referir que no que diz respeito espcia acerca da qual


era necessrio procurar na literatura - Saccharomyces bayanus no
foram encontrados quaisquer dados, pelo que utilizmos dados
acerca de Saccharomyces cerevisiae, uma espcie muito semelhante.
No

que

diz

respeito

aos

erros

sistemticos

nesta

atividade

experimental, para a obteno de resultados mais consistentes e com


erro menos aprecivel, foram desprezados alguns pontos, por estes
se afastarem da linha de tendncia.
No entanto, como possvel observar, os erros obtidos foram ainda
assim bastante elevados. Este fenmeno ficou-se a dever-se a vrios
fatores. Podem ter ocorrido erros de valores devido a uma pipetagem
no uniforme para todos os ensaios de DNS. O DNS um reagente
que apenas tem afinidade para aucares redutores, como a frutose e
a glucose, pelo que no deteta a sacarose. Tambm podem ter
ocorrido erros como o prprio efeito de diluio quando era
adicionada a gua destilada e, ainda, com a pipetagem de enzima
invertase. A no homogeneizao da enzima antes da adio ao vaso
reacional pode tambm alterar os valores obtidos.
A existncia de risco ou impurezas nas clulas onde era lida a
absorvncia tambm pode ter alterado a leitura, diminuindo o valor
da absorvncia.
ainda fundamental ter em ateno que os valores de tempo
assinalados relativamente extrao da amostra do vaso reacional e
do banho quente so tempos relativos e no tempos exatos, ou seja,
a regularidade destas aes no foi sempre a mesma, ainda que fosse
medida com um cronmetro, existem sempre substncias que podem
ter estado mais 2 ou 3 s no vaso.

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Como concluso, o grupo pensa que esta atividade no foi totalmente


bem conseguida uma vez que os erros obtidos foram demasiado
elevados.

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