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Universidade de So Paulo

Instituto de Qumica de So Carlos







Reatividade de iso--cidos e seus derivados


hidrogenados frente ao radical 1-hidroxietila:
implicaes na perda de qualidade sensorial da
cerveja




Natlia Ellen Castilho de Almeida





Dissertao apresentada ao Instituto de
Qumica de So Carlos, da Universidade de
So Paulo, como um dos requisitos para o
obteno do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de Concentrao: Qumica Analtical





Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso

So Carlos
2011




Este exemplar foi revisado e alterado


em relao verso original, sob a
exclusiva responsabilidade do autor.

So Carlos, 11/03/2011
___________________________
Natlia Ellen Castilho de Almeida

DEDICATRIA








Aos meus pais, Antnio e lia, e ao


meu irmo Kayo, pelo apoio, incentivo
constante e amor. A minha av Maria
pelos ensinamentos e carinho.








Ao meu namorado Gustavo Metzker


pelo carinho, apoio, conselhos e
ajuda.


EPGRAFE











"A diferena entre o possvel e o


impossvel est na vontade humana"
(Louis Pasteur)




AGRADECIMENTOS


Agradecimentos
Agradeo primeiramente a Deus por me acompanhar sempre. O meu Deus
o Deus do impossvel.
Ao Prof. Dr. Daniel R. Cardoso pela orientao e ensinamentos. Ao Prof. Dr.
Douglas W. Franco pela infra-estrutura utilizada.
Aos amigos Clayston e Tatiane (Fefe) por compartilharem momentos bons e
difceis.
A Rafaela e Leandro pelo companheirismo desde 2004 (Turma de
Bacharelado do IQSC-USP).
Aos colegas do Laboratrio da Qumica da Aguardente e Laboratrio de
Qumica Analtica e Inorgnica, IQSC-USP, pela convivncia. Em especial, agradeo
ao Wendel Aquino, Fernanda Seixas, Juliana Grippa e Andr (Barbie) pela ajuda e
amizade.
Ao Sr. Julio Landmann (Hopsteiner) pela gentileza de doar o extrato de lpulo
isomerizado.
Ao Prof. Dr. Antnio Gilberto Ferreira e Eduardo Sanches pela disponibilidade
na realizao dos experimentos de ressonncia magntica nuclear (DQ - UFSCar).
Ao Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo
(USP) pela oportunidade.
Ao Prof. Dr. Antonio C. Burtoloso e a Viviana pela ajuda nas snteses (IQSC USP).
A FAPESP pelo auxlio financeiro.

SUMRIO


SUMRIO

Lista de Esquemas
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. INTRODUO

18

2. OBJETIVOS

33

3. MATERIAL E MTODO

34

3.1.

Reagentes

34

3.2.

Isolamento das trans-isohumulonas

35

3.3.

Isolamento das cis-isohumulonas

36

3.4.

Preparo das dihidro-isohumulonas

37

3.5.

Preparo das tetrahidro-isohumulonas

38

3.6.

Caracterizao qumica dos compostos

39

3.6.1.

Estudo eletroqumico das isohumulonas

40

3.7. Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical


1-hidroxietila

41

3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao e


estabilidade do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

41

3.7.2. Determinao das constantes de velocidade aparentes


decorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical
1-hidroxietila

43

3.8. Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao das


propriedades eletrnicas das isohumulonas

45

3.9. Caracterizao qumica dos produtos da reao entre o


radical 1-hidroxietila e os iso--cidos

46

4. RESULTADOS E DISCUSSO

47

4.1. Isolamento das isohumulonas


4.2. Preparo
isohumulonas

dos

derivados

47
reduzidos/hidrogenados

das

48

SUMRIO


4.2.1. Preparo das dihidro-isohumulonas

48

4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas

49

4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus


derivados reduzidos/hidrogenados
4.3.1.

Caracterizao

qumica

das

trans-isohumulonas

50
50

isoladas
4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas

57

4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas

61

4.3.4. Caracterizao qumica das tetrahidro-isohumulonas

65

4.3.5.

70

Estudo eletroqumico das isohumulonas

4.4. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados e alguns


fenis frente o radical 1-hidroxietila

73

4.4.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao do aduto


radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

73

4.4.2. Estudos com o radical 1-hidroxietila: estabilidade do


aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

79

4.4.3. Estudos com o radical 1-hidroxietila: determinao das


constantes de velocidades aparentes da reao entre o radical
1-hidroxietila e os compostos de interesse

83

4.4.3.1. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados frente


o radical 1-hidroxietila

85

4.4.3.2. Reatividade de alguns fenis frente ao radical 1-

93

hidroxietila
4.5. Identificao dos produtos de reao

96

4.6. Mecanismo da reao

99

5. CONCLUSES

102

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

105

APNDICES

LISTA DE ESQUEMAS


Lista de Esquemas

Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis(2-ac) e trans-isohumulonas (1-ac) durante o cozimento do mosto
fermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas em
condies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-nhumulona, (b) isocohumulona, (c) isoadhumulona

23

Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos em


cerveja

27

Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais


1-hidroxietila, em destaque, e 2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o
proposto dor Andersen e Skibsted

30

Esquema 4. Reao de Fenton

31

Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH]

41

Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilha


qumica 4-POBN e a isohumulonas pelo radical 1-hidroxietila

44

Esquema 7. Reao de formao das espcies aduto oxidado e


4-POBN ligado a duas molculas de radical 1-hidroxietila

82

Esquema 8. Esquema de reao propondo o efeito de polifenis


contendo o grupo catecol na oxidao do etanol no vinho e na cerveja.
Adaptado de Elias e Andersen

96

Esquema 9. Mecanismo proposto para a reao entre as isohumulonas 101


e o radical 1-hidroxietila

LISTA DE FIGURAS


Lista de Figuras

Figura 1. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grfico
da distribuio de bebidas alcolicas no mercado brasileiro

18

Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro

19

Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) nlupulona, (1b) colupulona, (1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b)
cohumulona, (2c) adhumulona

22

Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular


(a) e aninica (b)

24

Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidroisohumulonas (2a-c), derivados reduzidos e hidrogenados dos iso-cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona, (1b) dihidroisocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-nhumulona, (2b) tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona

28

Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a)


quercetina, (b) morina, (c) kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cido
clorognico, (f) cido cafeico

32

Figura 7. Ilustrao esquemtica da separao dos diastereoismeros


por complexao com a -ciclodextrina

48

Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da


reao dihidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar
utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:4 v/v)
acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura;
(P) precursores

49

Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da


reao tetrahidro-isohumulonas - no sistema de cromatografia planar
utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico (1:1 v/v)
acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;
(P) precursores

50

Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonas


isoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo
aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de trans-isohumulonas de 3,2
10-5 mol L-1

51

LISTA DE FIGURAS


Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial


contendo as isohumulonas, formas cis- e trans- (em vermelho) e das
trans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr = 11,4
min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulona
referente ao pico 4, tr = 16,5 min

52

Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonas


isoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas
presentes na amostra

54

Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas em


meio alcolico (5,0 10-3 mol L-1) submetido a separao em uma coluna
LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel
2,5 mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de
monitoramento = 270 nm

55

Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta


da frao 1 contendo trans-isohumulona

56

Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta


da frao 2 contendo trans-isohumulonas

56

Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonas


isoladas em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo
aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 4,6 10-5 mol L-1

57

Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial


contendo as isohumulonas, formas cis- e trans-, (em vermelho) e das cisisohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) da
espcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr = 10,5 min. (c) Espectro
de massas (ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-nhumulona referente ao pico 3, tr = 14,7 min. Os sinais marcados com (*)
indicam impurezas presentes na amostra

58

Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonas


isoladas, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas
presentes na amostra

59

Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meio


alcolico (1,0 10-3 mol L-1) submetido a separao em uma coluna LUNA
C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da fase mvel 2,5
mL min.-1 Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de
monitoramento = 270 nm

60

Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta


da frao 1 contendo cis-isohumulonas

61

Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta


da frao 2 contendo cis-isohumulonas

61

LISTA DE FIGURAS


Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas,


formas cis- e trans-, em soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de
soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1). Concentrao de 2,3 10-5 mol L-1

62

Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b)


Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidroisocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr = 6,3 e 7,6 min. (c) Espectro
de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-iso-n-humulona
referente aos picos 3 e 4, tr = 8,2 e 10,0 min. (d) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-dihidro-isoadhumulona referente aos
picos 5 e 6, tr = 11,7 e 15,1 min

63

Figura 24. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das dihidro-isohumulonas,


formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam
impurezas presentes na amostra

65

Figura 25. Espectro eletrnico de absoro das tetrahidro-isohumulonas,


formas cis- e trans-, em meio etanol. Concentrao de 2,3 10-5 mol L-1

66

Figura 26. (a) Cromatograma de ons total das tetrahidro-isohumulonas,


formas cis- e trans-. (b) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie cis- e
trans-tetrahidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr = 19,2 e 21,5
min., respectivamente. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies
cis- e trans-tetrahidro-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr = 26,0 min.
(d) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies cis- e trans-tetrahidroisoadhumulona referente ao pico 4, tr = 29,6 min

68

Figura 27. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das tetrahidro-isohumulonas,


formas cis- e trans-, em CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam
impurezas presentes na amostra

69

Figura 28. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma


aninica, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato de
tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopado
com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia
interna). A velocidade de varredura foi 50 mV s-1

71

Figura 29. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma


molecular, em acetonitrila contendo 0,2 mol L-1 de perclorato de
tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante dopado
com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia
interna). As velocidades de varredura foram: a = 10 mV s-1,b = 50 mV s-1,
c = 100 mv s-1, d = 200 mV s-1

72

LISTA DE FIGURAS


Figura 30. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da


reao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob
atmosfera de O2. T = 250 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) do eluato em tr = 6 min referente espcie 4-POBN

74

Figura 31. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da


reao de formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob
atmosfera de Ar. T = 250 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr = 7,9 min. (c)
Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr
= 8,6 min. (d) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons
do eluato em tr = 9,2 min. (e) Espectro de massas (ESI(+)MS) com
atribuio dos ons do eluato em tr = 12,8 min

77

Figura 32. Estruturas qumicas das quatro espcies formadas da reao


entre 4-POBN e o radical 1-hidroxietila: (a) aduto oxidado; (b) aduto
radical; (c) e (d) 4-POBN ligado a duas molculas do radical 1-hidroxietil;
(e) aduto reduzido

77

Figura 33. Espectro de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)


registrado em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4POBN/CH(CH3)OH] obtido em soluo aquosa gua/etanol ( 5%) a
temperatura de 250 C

78

Figura 34. Decaimento do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] na


presena e ausncia de catalase (47,4 mg mL-1). T = 250C

80

Figura 35. rea dos picos cromatogrficos referentes s espcies aduto


oxidado, aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] e 4-POBN contendo duas
molculas do radical 1-hidroxietila em funo do tempo de reao e na
presena de catalase

81

Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de transisohumulonas. Medidas obtidas por espectrometria de massas (ESI-(+)MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons
(EPR). T = 25 oC; 1 minuto de reao

85

Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e transisohumulonas (b), com os respectivos momentos de dipolo eltrico

90

Figura 38. Ilustrao dos orbitais moleculares ocupados de maior


energia (HOMO) calculados para os diastereoismeros cis- (a) e transisohumulonas (b)

91

Figura 39. Representao das ligaes C-H envolvidas na abstrao do


tomo de hidrognio na reao. (a) trans-isohumulonas; (b) cisisohumulonas

92

LISTA DE FIGURAS


Figura 40. Espectro de on isolado 240,1 m/z decorrente da reao do


radical 1-hidroxietila e 4-POBN (pico 1), na presena de cido
clorognico (pico 2) ou cido cafeico (pico 3). As injees foram
realizadas em batelada

94

Figura 41. Espectros de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE)


registrados em banda-X (9,521 GHz) do aduto radical [4POBN/CH(CH3)OH]decorrente da reao controle (em preto), reao
processada na presena cido clorognico (em vermelho) e reao
processada na presena do cido cafeico (em azul). Os espectros foram
obtidos a temperatura de 25oC

95

Figura 42. (a) Cromatogramas de ons total da soluo alcolica


contendo as trans-isohumulonas (em vermelho) e dos produtos
decorrentes da reao das trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila
(em azul),sob atmosfera de Ar, T = 250 C, t = 1 minuto de reao. (b)
Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on do eluato em tr =
17,7 min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio do on do
eluato em tr = 21,5 min

98

LISTA DE TABELAS


Lista de Tabelas

Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo prisomerizado

53

Tabela 2. Dados cinticos com respeito ao decaimento do aduto radical


[4-POBN/CH(CH3)OH] no meio reacional e a temperatura de 25 0C

80

Tabela 3. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical


1-hidroxietila e os iso--cidos e seus derivados, em sua forma aninica,
determinadas por EPR e ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem

86

Tabela 4. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical


1-hidroxietila e as iso-n-humulonas, em sua forma molecular,
determinadas ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de amostragem

88

Tabela 5. Propriedades eletrnicas dos diastereismeros cis- e trans-iso-cidos, em sua forma molecular, calculadas usando o mtodo M06/631+G(d)

89

ABREVIATURAS


Abreviaturas

4-POBN

-4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona

-CD

-ciclodextrina

BDE

Bond Dissociation Energy

CDCl3

Clorofrmio deuterado

CID

Colision Induced Dissociation

ESI-MSn

Espectrmetro de Massas

DFT

Density Functional Theory

IEF-PCM

Integral Equation Formalism as Polarizable


Continuum Model

HER

1-hydroxyethyl radical

Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio

HOMO

Highest Occuped Molecular Orbital

IAA

Iso--cidos

LC-MSn

Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

MBT

3-metil-but-2-eno-1-tiol

NHE

Normal hydrogen electrode

Rf

Riboflavina 5-monofosfato de sdio

RPE

Ressonncia Paramagntica de eltrons

H RMN

RESUMO


RESUMO
Os iso--cidos so os principais constituintes responsveis pelo sabor amargo da
cerveja, sendo estes facilmente degradados durante o seu processo de
envelhecimento ou exposio a radiao luminosa, em particular o diastereoismero
trans-. O radical 1-hidroxietila o radical majoritrio formado na cerveja durante o
processo de envelhecimento. O presente trabalho descreve a reatividade dos iso-cidos frente ao radical 1-hidroxetila atravs do uso da tcnica de spin-trapping com
deteco por espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) e
espectrometria

de

massas

(ESI-(+)-MS/MS).

Observou-se

que

ambos

os

diastereoismeros cis- e trans-iso--cidos so degradados na presena do radical


1-hidroxietila com constantes de velocidade aparentes de 1,8 108 e 9,2 109 L mol-1 s1

, respectivamente. A reatividade dos dihidro-iso--cidos com o radical estudado foi

similar reatividade da mistura diastereoisomrica dos iso--cidos, apresentando


constante de velocidade aparente de 1,5 109 L mol-1 s-1. Os anlogos tetrahidro-iso-cidos no apresentaram reatividade para com o radical 1-hidroxietila, sugerindo
os hidrognios allicos como stio reacional. Adicionalmente, os clculos ab initio por
DFT demonstraram que os valores de BDE para os hidrognios allicos das cadeias
laterais prenila e isohexenoila so equivalentes e, desta maneira, sugerindo a maior
reatividade do diastereoismero trans- a ser creditada a um fator entrpico, j que
ambos os grupos esto no mesmo plano espacial. Os produtos de oxidao foram
determinados por LC-ESI-MSn e verificou-se a formao dos hidroxi-allo-iso-cidos, recentemente descritos na literatura. O conjunto de resultados obtidos
possibilitou a proposta de mecanismo para processo de oxidao e perda dos cidos
amargos da cerveja, observado no envelhecimento da bebida.

ABSTRACT


ABSTRACT
The iso--acids are the main responsible constituents for the bitter taste of beer, they
are easily degraded during the aging and light exposed process, specially the transdiastereoisomer. The 1-hydroxyethyl radical is the major radical produced during the
beer aging process. The present work describes the reactivity of iso--acids towards
the 1-hydroxyethyl radical as probed by the spin-trapping technique and detected by
electron paramagnetic resonance (EPR) and mass spectrometry (ESI-(+)-MS/MS). It
was observed that both diastereoisomers cis- and trans-iso--acids are degraded in
the presence of 1-hydroxyethyl radical with apparent rate constant of 1.8 108 e 9.2
109 L mol-1 s-1, respectively. The reactivity of dihydro-iso--acids towards the studied
radical was similar to the reactivity of the iso--acids diastereoisomeric mixture,
showing apparent rate Constant of 1.5 109 L mol-1 s-1. The tetrahydro-iso--acids
analogues did not observed reactivity towards the 1-hydroxyethyl radical suggesting
the allilic hydrogens as the reaction sites. In addition, the ab initio DFT calculations
demonstrated that the BDE values for the allilic hydrogens of the prenyl and
isohexenoyl side chains are equivalents and according to that suggesting the higher
reactivity of the trans- diastereoisomer to be accounted to an entropic factor since
both goups are in the same plane of the space. The oxidation products were
determined by LC-ESI-MSn and its was verified the formation of hydroxyl-allo-iso-acids. The data colected allows a mechanism to be proposed for the oxidation
process and loss of bitter acids of beer during the beverage aging.

INTRODUO


1. INTRODUO

A cerveja considerada a bebida alcolica mais consumida


con
mundialmente,
com um consumo mundial mdio per capita ao redor de 21,9 litros/ano e uma
produo anual em torno de 1,22 106 hectolitros1. O consumo per capita no Brasil
apresenta uma mdia de 47,6 litros/ano2, representando 66% do mercado de
bebidas alcolicas no pas, Figura 1.

Figura 1.. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grfico da distribuio de
d bebidas
1
alcolicas no mercado brasileiro .




INTRODUO


Por regulamentao, a cerveja produzida a partir de gua de boa qualidade,


malte de cevada, fermento e lpulo (Humulus lupulus), podendo ainda ser utilizadas
outras fontes de carboidratos como co-adjuntos tais como arroz, milho e trigo3. A
cerveja , por definio, uma bebida carbonatada de baixo teor alcolico que tem
atrado consumidores h mais de 100 anos por apresentar atributos sensoriais
peculiares, tais como frescor, aroma e amargor caracterstico4.
O processo industrial para a produo de cerveja encontra-se ilustrado na
Figura 2. O incio do processo ocorre pela moagem do malte de cevada juntamente
com a gua, resultando em uma suspenso que submetida a aquecimento a
temperatura de aproximadamente 60 oC para que as enzimas, amilase e protease,
degradem o amido e protenas do malte, formando uma mistura de glicose e
aminocidos tambm denominada mosto doce.

malte de cevada

gua

MOAGEM
FILTRAO
FERVURA
FERMENTAO

lpulo
leveduras

MATURAO
FILTRAO
CO2

ENVASE

PASTEURIZAO

Figura 2. Fluxograma do processo industrial cervejeiro.




INTRODUO


Logo aps a etapa de filtrao, h adio do lpulo# e em seguida aplica-se


um gradiente de temperatura, podendo chegar at 95 oC, durante aproximadamente
uma hora; tem-se ento o processo de fervura/cozimento dos mosto doce. Em
seguida, os materiais suspensos provenientes do lpulo so retidos e a mistura
ento resfriada para a adio das leveduras; dar-se- a fermentao. Esta etapa
dividida em dois estgios: aerbico e anaerbico. No estgio aerbico ocorre o
crescimento das leveduras na presena de oxignio, ao passo que no estgio
anaerbico, as leveduras transformam a glicose em etanol e dixido de carbono,
sendo este ltimo recuperado e armazenado para o reaproveitamento ao final do
processo. Existem dois tipos de leveduras que so utilizadas no processo cervejeiro,
Saccharomyces carlsbergensis e Saccharomyces cerevisiae, as quais conferem o
tipo de fermentao empregado. Utilizando leveduras do tipo Saccharomyces
carlsbergensis tem-se uma cerveja de baixa fermentao, as quais decantam
durante a produo de etanol, ao passo que uma cerveja tida como de alta
fermentao so empregadas leveduras do tipo Saccharomyces cerevisiae, as quais
ficam suspensas no final do processo e suportam altas concentraes de etanol.
Ao final da fermentao, as leveduras so removidas, obtendo uma cerveja
denominada green beer, esta ltima ainda no adequada ao consumo imediato por
apresentar compostos de sabor e aroma indesejveis. Consequentemente,
requerido um perodo denominado de maturao, no qual a cerveja mantida em
torno de 0

C por um tempo relativamente grande (semanas) para que tais

compostos sejam vagarosamente degradados/transformados at atingirem nveis de


concentrao abaixo de seus valores crticos (limiares de sensao). Ainda,
comumente empregada, ao final do processo cervejeiro, uma correo do amargor

#

O lpulo pode ser adicionado ao processo cervejeiro atravs da adio direta de flores secas (in
3
natura), pellets ou extratos .




INTRODUO


da cerveja acabada adicionando-se extrato de lpulo pr-isomerizado. Por fim, a


cerveja segue para o envase, aps filtrao e adio de dixido de carbono,
podendo ainda passar ou no pelo processo de pasteurizao5,6.
De acordo com a Lei da Pureza da Cerveja (Reinheitsgebot), promulgada
pelo Duque Guilherme IV da Baviera em 1516, foi institudo na Alemanha o uso
apenas do malte de cevada, gua, lpulo e fermento como ingredientes para a
fabricao da cerveja7. Desta forma, o uso do lpulo no processo de fabricao da
cerveja foi reforado. Este ingrediente foi introduzido na cervejaria durante a Idade
Mdia pelos monges europeus que refinaram as tcnicas de produo. Inicialmente,
o lpulo era adicionado como um preservativo de ao bactericida de origem natural
para que a cerveja pudesse ser estocada por longos perodos; porm, passou a ser
um agente de aroma essencial e singular da cerveja.
O

lpulo

uma

planta

trepadeira

perene,

pertencente

famlia

Cannabinaceae, espcie Humulus lupulus, cuja composio qumica complexa,


compreendendo uma gama muito grande de metablitos secundrios localizados
especialmente nas glndulas localizadas atrs das brcteas do cone de lpulo.
Estas glndulas so cobertas com um p resinoso amarelo chamado de lupulina.
Entre as diversas classes de compostos qumicos presentes na lupulina encontramse os leos essenciais (0,5 5% v/m), polifenis (3 6% m/m) e os -cidos e cidos (4 30% m/m)5,8, tambm denominados humulonas e lupulonas
respectivamente, os quais possuem grande impacto na qualidade da cerveja. As
estruturas qumicas dos -cidos e -cidos esto apresentadas na Figura 3.




INTRODUO


1a-c

2a-c

Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona,
(1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b) cohumulona, (2c) adhumulona.

Desta forma, o lpulo e seus componentes so considerados essenciais na


produo de cerveja e responsveis pela distino desta de qualquer outra bebida
alcolica carbonatada. Ainda, dentre os componentes utilizados no processo
industrial da cerveja, o lpulo representa o de menor custo6 e, neste contexto,
interessante enfatizar que apenas as plantas femininas formam o cone de lpulo e,
portanto, somente estas so comercializadas.
Apesar de no possurem impacto direto nas propriedades sensoriais da
cerveja, os -cidos so os precursores dos iso--cidos, comumente chamadas por
isohumulonas, responsveis pelo amargor caracterstico e qualidade da espuma da
cerveja9,10. Conforme j mencionado, as humulonas so introduzidas ao processo
cervejeiro pela adio do lpulo ao mosto e, aps a fervura deste, h converso das
humulonas, pouco solveis em meio aquoso (60 mg L-1 a 100 oC), s espcies mais
hidroflicas denominadas isohumulonas, conforme ilustrado no Esquema 1.




INTRODUO

+
2

+

5


+2

+2

2
+2

+XPXORQDV
S.D


2

+

2
5

2
+ 2

5HDUUDQMR
GH DFLORtQD
2

+2




WUDQVLVRKXPXORQDV
DF


2+

+2

2
5




2+

FLVLVRKXPXORQDV
DF

D 5 &+&+ &+ 
E 5 &+ &+ 
F 5 &+ &+ &+&+

Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis- (2-ac) e trans-isohumulonas


(1-ac) durante o cozimento do mosto fermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cisishumulonas em condies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-n-humulona, (b)
9
isocohumulona, (c) isoadhumulona .

Estes compostos contendo um anel de 5 membros consistem em pares de


diastereoismeros, trans-isohumulonas (1a-c, Esquema 1) e cis-isohumulonas (2ac, Esquema 1), cada qual com 3 anlogos: iso-n-humulona (a), isocohumulona (b) e
isoadhumulona (c), Esquema 1. A configurao absoluta cis-/trans- determinada
pela orientao do grupo hidroxila em C4 e a cadeia lateral prenila em C5, sendo a
denominao trans- referente direo oposta de ambos os substituintes com
respeito ao anel de 5 membros. Verifica-se que, aps a fervura do mosto, a razo
cis-/trans- em geral 7:3, uma vez que os diastereoismeros cis- so



INTRODUO


termodinamicamente mais estveis (configurao de menor energia), visto que os


grupos laterais volumosos prenila e isohexenoila esto trans posicionadas9.
O valor de pKa varia sensivelmente para cada anlogo de iso--cidos; porm,
este pode ser aproximado para 311,12. Sabe-se que o pH da maioria da cerveja gira
em torno de 4,2 e 4,4, principalmente para cervejas do tipo large11,12. Desta forma,
as isohumulonas encontram-se predominantemente na forma aninica na bebida
(aproximadamente 84%), cuja frmula estrutural est apresentada na Figura 4b.
Evidentemente, esta afirmativa pode no ser verdadeira para cervejas mais cidas,
estando presentes, neste caso, os iso--cidos em sua forma molecular, Figura 4a.

(a)

(b)

Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular (a) e aninica (b).

A concentrao de iso--cidos presentes no produto acabado varia entre 15


a 80 mg L-1 (4,1 10-5 a 2,2 10-4 mol L-1), conferindo diferentes graus de amargor13.
Desta forma, as isohumulonas representam aproximadamente 80% de todo
componente derivado do lpulo presente na cerveja10.
Quimicamente, a cerveja pode ser considerada uma soluo alcolica com
concentrao hidrogeninica (CH+) de 10-4,2 mol L-1, contendo centenas de
substncias dissolvidas14. Entretanto, os constituintes de uma cerveja fresca, recm
engarrafada, no esto em equilbrio qumico. Termodinamicamente, uma garrafa de
cerveja um sistema fechado e ir empenhar-se para alcanar uma condio de
menor energia e mxima entropia. Por conseguinte, muitas converses de seus



INTRODUO


constituintes so termodinamicamente possveis, sendo que sua relevncia para a


qualidade de cerveja , em sua maioria, determinada pelas velocidades de reao
em condies prticas de armazenamento do produto14.
Com o aumento da exportao da cerveja, principalmente devido
globalizao do mercado, problemas relacionados ao tempo de prateleira do produto
(shelf-life) tornam-se de extrema importncia para a indstria cervejeira. Sabe-se
que a cerveja suscetvel a sofrer diversas reaes durante o seu armazenamento,
as quais levam a perda de amargor e frescor do produto, bem como o
desenvolvimento de compostos que conferem aroma e sabor indesejveis14. Desta
forma, o conhecimento dos possveis caminhos, mecanismos e constantes de
velocidade especficas das reaes que ocasionam a perda da qualidade sensorial
do produto podem auxiliar no desenvolvimento de tcnicas e mtodos para a
conservao do produto.
Neste aspecto, as isohumulonas so particularmente sensveis a degradao
durante o armazenamento15, o que leva no somente a perda sensorial de amargor,
mas tambm formao de compostos volteis de aroma, tais como 4-metil-2pentanona e 3-penteno-2-ona14,15. Existem indcios fortes que apontam o
envolvimento dos iso--cidos na formao de aromas indesejveis tpicos de
cerveja velha, podendo estes cidos sofrerem degradao oxidativa, mesmo na
ausncia de oxignio molecular12.
Diversos estudos reportaram que o envelhecimento da cerveja est
diretamente relacionado com a degradao das trans-isohumulonas, visto que a
configurao cis- mostrou-se mais estveis e menos suscetveis aos processos


A velocidade de cada reao ir determinar a viabilidade de cada caminho e est intrinsecamente


relacionada a constante de velocidade especfica da reao e ao teor dos reagentes.

 Constante de velocidade especfica refere-se constante de velocidade determinada diretamente


pelo decaimento ou formao da espcie de interesse.


INTRODUO


deteriorativos4,5,16. Todavia, produtos de oxidao de ambos os diastereoismeros,


cis- e trans-isohumulonas, formados durante o armazenamento da cerveja contida
em garrafa PET, foram apontados em estudos recentes17,18. Estes compostos foram
chamados de hidroperoxi-allo-isohumulonas e hidroxi-allo-isohumulonas e so
decorrentes de reaes de degradao dos iso--cidos via radicalide, na presena
de traos de metais de transio, tais como ons de ferro, e oxignio molecular17.
Durante um tempo considervel a reao de degradao via foto-oxidao
das isohumulonas foi estudada com muito afinco11,19-22. Neste contexto, verificou-se
que os iso--cidos sofrem degradao na presena de luz e riboflavina,
fotosensibilizador naturalmente presente na cerveja19,20. Este tipo de reao tem
impacto direto na qualidade sensorial da bebida no somente pela perda do amargor
caracterstico do produto, mas, sobretudo, pelo impacto negativo de alguns produtos
de degradao.
A ttulo de exemplificao, pode-se citar a formao do 3-metil-2-buteno-1-tiol
(MBT)19-22, cujo mecanismo de formao est ilustrado no Esquema 2. Verifica-se
que aps iniciada a reao com a transferncia de 1 eltron do cromforo
-tricarbonila das isohumulonas para a riboflavina no estado tripleto excitado (3RF*),
excelente aceptor de eltrons (E = + 1,77 V vs. NHE)22, o radical alcoxila formado
sofre uma clivagem de Norrish do Tipo I gerando o cido dihidrohumulnico e o
radical 4-metilpenta-3-enol. Este radical sofre rpida descarbonilao e, na presena
de radicais tiis (SH) o MBT ento formado11,21. A presena desta substncia
confere um odor extremamente desagradvel ao produto, lembrando o odor
decorrente dos tiis secretados pelas glndulas anais do gamb listrado (Mustela
Vison L.), fato este agravado pelo baixo limiar de percepo do produto formado
(aproximadamente 1 ng L-1)19,22.



INTRODUO



11,21

Esquema 2. Reao de degradao fotoqumica dos iso--cidos em cerveja

Em adio, Lusk e Murakami23 revelaram recentemente a existncia de dois


novos compostos formados a partir da exposio da cerveja luz. Pouco se
conhece sobre a estrutura destes compostos; no entanto, sabe-se que estes so
decorrentes da fotodegradao dos iso--cidos sensibilizado pela riboflavina. Como
resultado, atravs da anlise sensorial dos mesmos, verificou-se que estas
substncias possuem aroma indistinguvel ao conferido pelo MBT, alm de
apresentarem a mesma massa molecular.




INTRODUO


Verifica-se

uma

crescente

busca

pelas

indstrias

cervejeiras

por

aperfeioamento em seu processo industrial, cuja finalidade consiste em atribuir ao


produto acabado melhorias referentes estabilidade, qualidade sensorial e aumento
do tempo de prateleira do mesmo. De fato, os derivados hidrogenados e reduzidos
dos iso--cidos, em especial tetrahidro-isohumulonas (2a-c, Figura 5) e dihidroisohumulonas (1a-c, Figura 5), vm sendo empregados no processo industrial da
cerveja por serem reconhecidamente menos sensveis* a degradao via
fotoqumica que os seus precursores, isohumulonas.

(1a-c)

(2a-c)

Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidro-isohumulonas (2a-c),


derivados reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona,
(1b) dihidro-isocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-n-humulona, (2b)
tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona.

Assim, o uso dos derivados reduzidos dos cidos amargos do lpulo vem de
encontro melhoria na qualidade sensorial do produto, uma vez h, em parte, uma
minimizao na formao de aromas indesejveis e perda sensorial de amargor19-22.
Entretanto, na prtica, vrios problemas so detectados, j que os derivados
reduzidos tambm podem sofrer decomposio via radicalide, levando a formao
de produtos de degradao especficos, tais como 4-metil-3-pentenal, o qual lembra
o odor de papelo e assim conferindo um aroma tpico de cerveja velha22. A
exposio das tetrahidro-isohumulonas luz conduz a formao do composto

*

O atributo menos sensvel est relacionado ao menor impacto sensorial dos fotoprodutos de
degradao e no a estabilidade qumica da espcie.




INTRODUO


4-metilpentanal, sendo, neste caso, a descarbonilao do radical 4-metil-pentanoil


competitiva com a abstrao de hidrognio a partir de um doador apropriado22.
Entretanto, os produtos de degradao dos derivados hidrogenados e reduzidos dos
iso--cidos no apresentam um impacto negativo to expressivo quanto ao
conferido ao MBT, formado a partir da isohumulonas.
Adicionalmente, a presena das tetrahidro-isohumulonas na cerveja resulta
em uma maior estabilidade da espuma, bem como o aumento no poder de amargor
do produto. Por outro lado, o uso das dihidro-isohumulonas no processo cervejeiro
culmina em uma reduo do amargor, bem como o decrscimo da estabilidade da
espuma5,24. Neste contexto, um aspecto importante a ser lembrado o fato de que o
uso dos derivados de iso--cidos, os quais no so de origem natural, no
permitido na fabricao de cervejas destinadas ao mercado Alemo em decorrncia
do Reinheitsgebot.
A

partir

desses

exemplos

de

alteraes

que

ocorrem

durante

armazenamento da cerveja, segue que a natureza das mudanas do sabor um


processo complexo e depende principalmente do tipo da cerveja, concentrao de
oxignio dissolvido e das variaes de temperatura submetidas ao produto durante o
transporte e estocagem.
Sabe-se que a concentrao de radicais gerados durantes o processo de
envelhecimento natural da cerveja aumenta com o teor de oxignio dissolvido, com
elevadas temperaturas de armazenamento14 ou com o aumento das concentraes
de alguns metais de transio, tais como ons de ferro e cobre. Entretanto, pelo fato
do radical hidroxila (OH) apresentar alta reatividade (E0 = + 2,7 V vs. NHE) e baixa
seletividade, Andersen e Skibsted25 demonstraram, atravs de experimentos de




INTRODUO


spin-trapping e ressonncia paramagntica de eltrons, que o radical 1-hidroxietila


(HER) o radical predominante formado na cerveja.
O radical HER proposto por originar-se da reao entre o etanol, cosolvente, com o radical hidroxila, conforme ilustrado o Esquema 325,26. De fato,
verificou-se que radicais hidroxila abstraem tomos de hidrognio de molculas de
etanol com uma constante de velocidade de 1,9 109 L mol-1 s-1. Esta abstrao de
tomo de hidrognio ocorre preferencialmente no carbono C1 (85%), formando o
radical 1-hidroxietila, sendo em menor extenso no carbono C2 (13%), resultando no
radical 2-hidroxietila25. Sabe-se ainda que ambos os radicais formados durante a
oxidao do etanol reagem com o oxignio molecular (O2), resultando na formao
do radical hidroperoxila (OOH) e acetaldedo como produto principal ao final25.

Esquema 3. Formao e reaes subseqentes dos radicais 1-hidroxietila, em destaque, e


25
2-hidroxietila em cerveja, de acordo com o proposto dor Andersen e Skibsted .

Ainda, Elias e Andersen27 demonstraram recentemente que o radical HER


quantitativamente a espcie radical responsvel pela oxidao do vinho. Desta



INTRODUO


forma, o radical 1-hidroxietila formado a partir da oxidao do etanol pelo radical


hidroxila decorrente da reao de Fenton25,28, Esquema 4.

25,28

Esquema 4. Reao de Fenton

interessante ressaltar que compostos fenlicos, presentes tanto na cerveja


quanto no mosto, so reativos frente ao radical 1-hidroxietila29,30. Estas substncias
fenlicas esto presentes na bebida em teores considerveis, os quais giram em
torno de 460 mg L-1 (2,7 10-3 mol L-1 expresso em equivalente de cido glico)30-32.
Dentre estes compostos fenlicos, pode-se citar compostos pertencentes classe
dos flavonides, tais como: quercetina, kaempferol e morina; bem como alguns
cidos cinmicos como cido cafeico, clorognico e p-cumrico, cujas estruturas
qumicas esto apresentadas na Figura 6.




INTRODUO


(a)

(c)

(e)

(b)

(d)

(f)

Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a) quercetina, (b) morina, (c)
kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cido clorognico, (f) cido cafeico.

Substncias fenlicas so conhecidas pela suas propriedades antioxidantes,


sendo ento de extrema importncia na preservao de alimentos ao evitar ou inibir
processos oxidativos que levam a deteriorao o produto. Neste contexto, Marfak e
Trouillas30 determinaram as constantes de velocidade da reao entre o radical HER
e alguns flavonides, tais como quercetina (4,0 104 L mol-1 s-1), kaempferol
(3,1 104 L mol-1 s-1) e morina (2,9 104 L mol-1 s-1). Consequentemente, esta
reatividade ocasiona a decomposio destes antioxidantes naturais e, portanto, a
diminuio da capacidade redox do produto.




OBJETIVOS


2. OBJETIVOS

Aparte do melhor conhecimento a respeito do processo de deteriorao


oxidativa da cerveja, os principais objetivos e metas do presente trabalho podem ser
resumidos conforme descrito a seguir:
- Estudo da reatividade de isohumulonas frente ao radical 1-hidroxietila;
- Estudo da reatividade dos derivados reduzidos e hidrogenados dos
iso--cidos, dihidro-isohumulonas e tetrahidro-isohumulonas respectivamente,
frente ao radical 1-hidroxietila;
- Determinao dos produtos de reao;
- Estudo eletroqumico da forma molecular das trans-isohumulonas;
- Propor o mecanismo de degradao das isohumulonas via radicalide, bem
como elucidar o stio de reao e verificar a dependncia estereoqumica da reao;
- Estudo da reatividade de alguns fenis, presentes na cerveja, frente ao
radical 1-hidroxietila.




MATERIAL E MTODO


3. MATERIAL E MTODO

3.1.

Reagentes.

Acetonitrila, cido clordrico 36-38% e etanol foram obtidos da J. T. Baker;


acetato de etila e metanol foram obtidos da Tedia, cido frmico 98-100%, cloreto de
ferro (II) (FeCl2.4H2O), hidrxido de amnia e o perxido de hidrognio 30% foram
obtidos da Merck; acetato de amnio, cido p-cumrico, borohidreto de sdio,
-4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona (4-POBN), -ciclodextrina 98%, catalase de
fgado bovino, catalisador paldio suportado em carbono 10%, diciclohexilamina
99%, ferroceno, quercetina e o perclorato de tetrabutilamnio foram obtidos da
Sigma-Aldrich; sulfato de sdio (Hexis); clorofrmio deuterado (Acros Organics);
gases argnio (5,0), hidrognio (4,5), Helio (5,0) e nitrognio foram obtidos da White
Martins. O extrato de lpulo pr-isomerizado (30% massa/volume) foi gentilmente
cedido pela empresa Hopsteiner. A gua de alta pureza (18 M cm-1) utilizada foi
previamente destilada e purificada utilizando um sistema de purificao Milli-Q
(Millipore). Placas de TLC com matriz slica gel suportadas em alumnio contendo
200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm) foram obtidas da
Fluka Analytical. Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico e utilizados
sem prvio tratamento. Os solventes foram de grau cromatogrfico (HPLC) utilizados
sem prvio tratamento, com exceo do acetato de etila que foi tratado seguindo
procedimento descrito na literatura33.




MATERIAL E MTODO


3.2.

Isolamento das trans-isohumulonas.

Os diastereoismeros trans- foram isolados utilizando metodologia proposta


por Khatib e Verpoorte34, na qual se partiu de uma soluo aquosa comercial
contendo uma mistura de sais de potssio das isohumulonas na forma cis- e trans(6,6 g). A esta soluo foi adicionada uma soluo aquosa de -ciclodextrina (1,5 g,
em 12 mL de gua), gota a gota, mantida a 70 oC, utilizando-se a razo molar
(Riso--cidos/-ciclodextrina) 4:1. A mistura reacional foi mantida sob agitao a 70 oC
durante 30 minutos, ocorrendo a complexao seletiva ao formar complexos de
-ciclodextrina com os trans-iso--cidos. A seguir, a mistura reacional foi
devidamente armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em repouso, por 48 horas.
Ao trmino da reao de complexao, formou-se um precipitado amarelo
claro, o qual foi filtrado e lavado vrias vezes com etanol/gua (1:2 v/v) e acetato de
etila. Na etapa seguinte, adicionou-se 50 mL de metanol ao complexo, sob agitao,
para que houvesse a liberao das trans-isohumulonas, as quais ficaram em
soluo enquanto que a -ciclodextrina precipitou. Por conseguinte, um novo
processo de filtrao foi realizado utilizando-se um filtro de placa porosa e o solvente
removido por roto-evaporao a presso reduzida. Ento, adicionou-se acetato de
etila (25 mL) para que resqucios de -ciclodextrina fossem precipitados e, por fim, a
soluo resultante de uma nova filtrao foi roto-evaporada at a secura. Obteve-se,
desta forma, uma mistura contendo as trans-isohumulonas na sua forma aninica, a
qual foi posteriormente caracterizada por espectroscopia eletrnica de absoro
(UV-vis), ressonncia magntica nuclear (1H RMN) e cromatografia lquida hifenada
ao espectrmetro de massas (LC-ESI-MSn).




MATERIAL E MTODO


Adicionalmente, a trans-isocohumulona foi cromatograficamente separada da


trans-iso-n-humulona utilizando-se um sistema de cromatografia lquida de alta
eficincia (HPLC) semi-preparativo, detector de arranjo de diodos na regio do
UV-vis. A separao foi obtida atravs de uma coluna LUNA C-18 10 m (20 cm x
0,7 cm); fluxo 2,5 mL min.-1; fase mvel solvente A H2O/cido frmico (99:1 v/v) e
solvente B Etanol/cido frmico (99:1 v/v); sistema isocrtico, cuja relao da fase
mvel foi 56% do solvente B em A. Uma soluo alcolica contendo apenas os
diastereismeros trans- (20 mg/injeo) foi ento injetada para obter o perfil
cromatogrfico desejado, coletando as fraes dos analitos de acordo com os
respectivos tempos de reteno. As fraes foram posteriormente caracterizadas por
LC-ESI-MSn.

3.3.

Isolamento das cis-isohumulonas.

Os cis-iso--cidos foram isolados partindo-se se uma soluo comercial


contendo sais de potssio dos diastereismeros cis- e trans- (1,6 g). A esta soluo
contendo a mistura diastereoisomrica foi adicionada vagarosamente a uma soluo
aquosa

equimolar

de

-ciclodextrina

(1,5

g,

em

12

mL

de

gua)

(Riso--cidos/-ciclodextrina = 1:1)34, mantida a 70 oC. A reao seguiu durante 30 minutos,


sob agitao a 70 oC, havendo a complexao das trans-isohumulonas com a
-ciclodextrina. A mistura reacional foi armazenada a 4 oC, sob o abrigo de luz e em
repouso, por 48 horas e, aps a precipitao do complexo, este foi isolado atravs
de uma prvia filtrao e o sobrenadante, contendo os cis-iso--cidos dissolvidos,
foi centrifugado a 7.000 rpm, 4 oC, por 30 minutos, com o intuito de precipitar



MATERIAL E MTODO


resqucios de complexo na soluo. Em seguida, todo complexo foi retido no filtro de


placa porosa e a soluo resultante liofilizada.Adicionou-se cuidadosamente acetato
de etila (25 mL) ao slido resultante e -ciclodextrina remanescente foi retida em um
filtro de placa porosa, sendo a soluo sobrenadante roto-evaporada at a secura.
Por fim, obteve-se uma mistura contendo os diastereoismeros cis- em sua forma
aninica, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.
Ainda, a cis-isocohumulona foi separada dos homlogos cis-isoadhumulona e
cis-iso-n-humulona aplicando as mesmas condies experimentais empregadas na
separao dos trans-iso--cidos, partindo-se de uma soluo alcolica contendo os
trs anlogos de cis-iso--cidos. Em seguida, as fraes foram caracterizadas por
LC-ESI-MSn.

3.4.

Preparo das dihidro-isohumulonas.

As dihidro-isohumuloonas foram preparadas partindo-se de uma mistura de


cis- e trans-iso--cidos (400 mg; 1,1 10-3 mol) em metanol (27 mL) e adicionandose borohidreto de sdio (92,0 mg), sobre agitao, por 23 horas, a temperatura
ambiente (25 oC). Aps o trmino da reao, a mistura reacional foi acidificada com
cido clordrico (12 mol L-1) a pH 1 e o solvente foi removido por roto-evaporao a
presso reduzida. O resduo foi ento re-dissolvido em gua (20 mL) e a soluo
resultando extrada com acetato de etila (3 x 20 mL), sendo a fase orgnica
posteriormente seca com Na2SO4. Aps seca, o solvente da fase orgnica foi
removido por roto-evaporao, obtendo uma mistura cis- e trans-dihidroisohumulonas, a qual foi caracterizada por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.



MATERIAL E MTODO


O desenvolvimento da reao foi monitorado atravs de cromatografia planar,


TLC, utilizando-se placas de matriz slica gel suportada em alumnio contendo
200 m de espessura de camada e indicador fluorescente (254 nm). Como solvente
de eluio foram utilizados Hexano/ter etlico (1:4 v/v) acidificado com cido actico
e como revelador foi utilizado o permanganato de potssio (KMnO4).

3.5.

Preparo das tetrahidro-isohumulonas.

Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram obtidos seguindo a rota


sinttica descrita por Verzele e De Keukeleire9. Assim, a hidrogenao das olefinas
das cadeias laterais conectadas aos carbonos C5 e C4, referentes aos grupos
prenila e isohexenoila respectivamente, foi obtida partindo-se de uma soluo
contendo os diastereismeros cis- e trans- (200 mg; 5,52 10-4 mol) em metanol
(25 mL), com adio do catalisador paldio suportando no carbono 10% (59,0 mg),
sob atmosfera de hidrognio (H2) (presso ambiente). Depois de decorrido 6 horas
de reao, sobre agitao vigorosa e a temperatura ambiente (25 oC), o catalisador
foi retido e a mistura reacional roto-evaporada at a secura para a obteno da
mistura cis- e trans- tetrahidroisohumulonas. Os produtos da reao seguiram para
posterior caracterizao qumica por UV-vis, 1H RMN e LC-ESI-MSn.
A reao foi monitorada atravs de cromatografia planar TLC, utilizando-se
placas de slica gel e solventes de eluio Hexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado
com cido actico.




MATERIAL E MTODO


3.6.

Caracterizao qumica dos compostos.

A pureza dos compostos isolados e sintetizados foi avaliada por


Espectroscopia Eletrnica de Absoro (UV-vis), Cromatografia Lquida hifenada ao
Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn) e Ressonncia Magntica Nuclear
(1H RMN).
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo ion-trap Bruker modelo
Esquire 4000.
Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,5 mL min-1; fase
mvel35 solvent A Acetato de Amnio (5 10-3 mol L-1)/H2O/Etanol (80:20 v/v), pH
aparente ajustado a 9,4 com hidrxido de amnia, solvente B Acetonitrila/Etanol
(60:40 v/v); gradiente 0,3 min: 0% B isocrtico, 3 4 min.: 0 16% B, 4 - 54 min.: 16
30% B, 54 57 min.: 30 95% B, 57 65 min.: 95% B isocrtico.
Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi 150
L min-1. Condies de nebulizao: presso 40 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min-1;
temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco
de ons negativo.
- 1H RMN: para realizar as anlises de ressonncia magntica nuclear, os
compostos foram previamente dissolvidos em uma soluo etanol/cido frmico
(99:1 v/v) e todo solvente foi removido por roto-evaporao a presso reduzida. Este
procedimento foi requerido para garantir que os iso--cidos e seus derivados
estivessem em sua forma protonada. Assim, os espectros de ressonncia magntica
nuclear foram obtidos utilizando-se clorofrmio deuterado (CDCl3) como solvente,



MATERIAL E MTODO


nos equipamentos: Bruker 200 MHz, 4,7 T, AC200, Instituto de Qumica de So


Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo (USP); Bruker, 400,21 MHz, DRX 400-9.4
T, Departamento de Qumica (DQ), Universidade Federal de So Carlos (UFSCar).
- UV-vis: os espectros eletrnicos de absoro na regio do ultravioleta visvel
dos compostos foram obtidos em um espectrofotmetro Hitachi modelo U-3501.
Utilizou-se uma cela de quartzo de caminho tico 1,0 x 1,0 cm. As medidas de
absoro foram efetuadas pela leitura direta dos espectros, sendo utilizado como
referncia o prprio solvente.

3.6.1.

Estudo eletroqumico das isohumulonas.

As medidas eletroqumicas foram realizadas em um potenciostato AUTOLAB


modelo PGSTAT100, utilizando-se o eletrodo de diamante dopado com boro como
eletrodo de trabalho, fabricado pela Adamant Technologies S.A., Sua, com
dopagem 8.000 ppm de boro e rea superficial 6,25 mm2. O contra-eletrodo utilizado
foi uma rede de platina, cuja rea superficial de 3,0 mm2. O potencial do eletrodo
de referncia foi checado contra o potencial padro do par de ferroceno (Fe+1/Fe).
Neste caso, o potencial medido relatado contra o Eletrodo Normal de Hidrognio
(NHE) usando Eo = 0,630 V vs. NHE para o Fe+1/Fe, em acetonitrila36.
Variou-se a taxa de velocidade de varredura de 10 mV s-1 a 200 mV s-1.
Ainda,

as

medidas

foram

efetuadas

em

meio

orgnico

(perclorato

de

tetrabutilamnio em acetonitrila 0,1 mol L-1), a temperatura ambiente (25 oC), sob
atmosfera inerte (N2).




MATERIAL E MTODO


3.7.

Reatividade dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.

3.7.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao e estabilidade do


aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH].

O radical 1-hidroxietila foi gerado, conforme j demonstrado no Esquema 3, a


partir do radical hidroxila, o qual resulta da Reao de Fenton25,28, Esquema 4.
Entretanto, em funo da dificuldade na deteco direta da maioria dos radicais
devido seus baixos tempo de meia vida, a reao deste com os compostos de
interesse, presentes na cerveja, foi estudada utilizando-se o 4-POBN como
armadilha qumica (spin-trap), formando o aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH],
Esquema 5.

Esquema 5. Reao de formao do spin radical [4-POBN/CH(CH3)OH] .

O valor da constante de velocidade especfica da reao entre o 4-POBN e o


radical 1-hidroxietila est relatada na literatura com o valor de 3,1 107 L mol-1 s-1 37.
Como um todo, a reao foi conferida adicionando-se 60 L de uma soluo
de FeCl2.4H2O (2,0 10-3 mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4,5) a 1 mL de uma
soluo contendo o 4-POBN (3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (ca. 1 mol L-1). A
mistura reacional foi cuidadosamente desgaseificada com argnio, seguida do
acrscimo de 80 L de soluo de H2O2 30% (59,0 10-3 mol L-1) para promover a



MATERIAL E MTODO


formao do radical 1-hidroxietila e posterior gerao do aduto radical. A reao foi


monitorada at os 5 primeiros minutos aps a adio do perxido de hidrognio,
verificando as espcies formadas. Vale ressaltar que a concentrao analtica do
perxido de hidrognio foi determinada atravs do espectro eletrnico de absoro
( = 240 nm; 240 = 39,4 L mol-1 cm-1)38.
A reao foi ento monitorada atravs de duas tcnicas: Espectroscopia de
Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE) e Cromatografia Lquida hifenada ao
Espectrmetro de Massas (LC-ESI-MSn).
Parmetros instrumentais:
- Espectrmetro de Ressonncia Paramagntica de Eltrons (RPE):
Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.
Campo magntico central: 3.378 G; freqncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;
potncia: 1 mW; modulao da freqncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio de tipo ion-trap Bruker Esquire 4000.
Coluna Agilente C-18 extended (5 m; 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min.-1;
fase mvel solvente A H2O/cido Frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B
Acetonitrila/cido Frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 - 15 min.: 0 25% B, 15 20
min.: 25 100% B, 20 23 min.: 100% B isocrtico, 23 25 min.: 100 0% B.
Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura 250 oC, voltagem do capilar de 3.000 V, operando no modo
de deteco de ons positivo.




MATERIAL E MTODO


Avaliou-se tambm a influncia da adio de catalase na estabilidade do


aduto radical, a qual decompe o excesso de perxido adicionado que
supostamente pode interferir na quantificao do aduto [4-POBN/CH(CH3)OH].
Assim, foi realizado um estudo sobre a estabilidade do aduto radical na presena e
ausncia de catalase. Desta forma, para o estudo na presena de catalase,
adicionou-se 100 L da enzima (47,4 mg mL-1)38 mistura reacional aps decorrido
o tempo de amostragem da reao, seguindo para a anlise por ESI-(+)-MSn,
segundo os parmetros instrumentais abaixo:
Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.
Modo de deteco de ons positivo.

3.7.2.

Determinao

das

constantes

de

velocidade

aparentes

decorrentes das reaes dos compostos de interesse frente ao radical 1-hidroxietila.

Para estimar as constantes de velocidade de segunda ordem de capitao do


radical 1-hidroxietila pelos iso--cidos e seus derivados, foi utilizada a abordagem
de cintica de competio39,40. Neste contexto, o 4-POBN compete com os
compostos de interesse pela captao do radical 1-hidroxietila formado, conforme
ilustrado no Esquema 6.



Constante de velocidade aparente refere-se constante de velocidade determinada indiretamente


atravs da utilizao de uma sonda qumica.




MATERIAL E MTODO


Esquema 6. Ilustrao da reao de competio entre a armadilha qumica 4-POBN e a


isohumulonas pelo radical 1-hidroxietila.

Desta forma, os compostos foram primeiramente dissolvidos em etanol. No


caso dos cidos amargos derivados do lpulo, as concentraes destes foram
determinadas atravs da leitura da soluo pelo espectrofotmetro UV-vis, de
acordo com os respectivos coeficientes de absortividade (279
L mol-1 cm-1, iso--cidos; 279

nm

nm

= 11.150

= 11.150 L mol-1 cm-1, dihidro-isohumulonas;

254 nm = 17.690 L mol-1 cm-1, tetrahidro-isohumulonas)9.


Seguindo uma cintica de competio, volumes diferentes da soluo de iso-cidos foram adicionados em 60 L de uma soluo aquosa de FeCl2.4H2O
(2,0 10-3 mol L-1) levemente acidificada (pH ~ 4) e 1 mL de uma soluo de 4-POBN
(3,2 10-3 mol L-1) a 6% de etanol (1 mol L-1). Desgaseificou-se a mistura por 5
minutos para ento acrescentar 80 L da soluo de H2O2 30% (59,0 10-3 mol L-1). A
reao foi monitorada pelo aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] aps decorrido 1
minuto da adio do perxido de hidrognio, acrescentando 100 L de catalase
(47,4 mg mL-1) ao final.



MATERIAL E MTODO


interessante ressaltar que a sonda utilizada foi o aduto radical


[4-POBN/CH(CH3)OH],

sendo

este

monitorado

pelas

tcnicas

RPE

ESI-(+)-MS/MS.
Parmetros instrumentais:
Espectrmetro

de

Ressonncia

Paramagntica

de

Eltrons

(RPE):

Espectrmetro Bruker modelo EMX operando na banda-X.


Campo magntico central: 3.378 G; frequncia: 9,53 GHz; atenuao: 23 dB;
potncia: 1 mW; modulao da frequncia: 100 KHz; modulao da amplitude: 1 G.
Espectrmetro de Massas (ESI-(+)-MS/MS): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min.-1. As condies de nebulizao foram presso 30 psi, fluxo de gs (N2)
9 L min.-1, temperatura de desolvatao 250 oC, voltagem do capilar de 3000 V.
Modo de deteco de ons positivo.

3.8.

Clculo quntico, ab initio DFT, na determinao das propriedades

eletrnicas das isohumulonas.

Para a determinao das configuraes espaciais mais estveis das


molculas dos diastereoismeros cis- e trans-isohumulonas foi utilizado o clculo de
dinmica molecular por DFT (Teoria de Densidade do Funcional), com o mtodo
B3LYP, base 6-311+G(d,p), otimizando em um contnuo dieltrico simulado em
etanol com o formalismo da equao integral como modelo contnuo polarizado
(IEF-PCM). Por outro lado, as entalpias de dissociao dos hidrognios (BDE),




MATERIAL E MTODO


momento dipolo eltrico e energia dos orbitais de fronteira HOMO foram obtidas
atravs de clculo usando o mtodo DFT utilizando a base M06/6-31+G(d).

3.9.

Caracterizao qumica dos produtos da reao entre o radical

1-hidroxietila e os iso--cidos.

Os produtos da reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila foram


caracterizados por LC-ESI-MSn.
- LC-ESI-MSn: Sistema de HPLC Shimadzu Prominience LC20AD hifenado ao
espectrmetro de massas de mltiplo estgio do tipo on-trap Bruker modelo
Esquire 4000.
Coluna: Agilent C-18 extended (5 m, 2,1 x 150 mm); fluxo 0,3 mL min-1; fase
mvel solvente A H2O/cido frmico (99,9:0,1 v/v), solvente B Acetonitrila/cido
frmico (99,9:0,1 v/v); gradiente 0 5 min: 0 30% B, 5 20 min.: 30 50% B, 20 35 min.: 50 65% B, 35 55 min.: 65 100% B, 55 60 min.: 100 0% B.
Espectrmetro de Massas (ESI-MSn): utilizou-se um divisor de fluxo na
interface HPLC/MS, cujo fluxo que chegou at o espectrmetro de massas foi
100 L min-1. Condies de nebulizao: presso 30 psi, fluxo do gs (N2) 9 L min-1;
temperatura de desolvatao 365 oC, voltagem do capilar 3500 V; modo de deteco
de ons negativo.




RESULTADOS E DISCUSSO


4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Isolamento das isohumulonas.

Primeiramente, foi testada uma metodologia clssica consolidada por Verzele


e De Keukeleire9 para promover o isolamento dos diastereoismeros cis- e trans-.
De acordo com este procedimento, formam-se sais de diciclohexilamina das transisohumulonas ao final. No entanto, este mtodo eficaz somente na situao em
que se tem ao menos 30% das espcies trans- em soluo comparado com a forma
cis-. Como no se obteve os sais de diciclohexilamina dos diastereoismeros trans-,
sups ser devido presena de contaminantes oriundo da oxidao do extrato, o
que em princpio pode inibir a precipitao dos sais de deciclohexilamina. Deve-se
dizer que no se obteve sucesso mesmo aps exaustivas tentativas.
As trans- e cis-isohumulonas foram isoladas e purificadas eficientemente com
o emprego da -ciclodextrina para promover a complexao estreo-seletiva dos
diastereoisomeros trans-32. A Figura 7 ilustra esquematicamente o processo de
separao dos iso--cidos por complexao seletiva com -ciclodextrina, o qual se
d pelas interaes hidrofbicas entre a cavidade interior da -ciclodextrina
(hidrofbica) com as cadeias laterais isohexenoila e prenila dos ismeros trans-,
conectadas aos carbonos C4 e C5, respectivamente.




RESULTADOS E DISCUSSO





Figura 7.. Ilustrao esquemtica da separao dos diastereoismeros


diastereoismeros por complexao com a
-ciclodextrina.

4.2. Preparo dos derivados reduzidos/hidrogenados das isohumulonas.

4.2.1. Preparo das dihidro-isohumulonas.


Os derivados reduzidos dos iso--cidos foram preparados de acordo
com a metodologia descrita anteriormente no item 3.4. A evoluo da reao foi
monitorada atravs de cromatografia planar (TLC).. Desta forma, atravs da evoluo
dos compostos na placa de slica gel, apresentada na
n Figura 8,, constatou-se
constatou
que a
reao foi completada com 23 horas de amostragem. Neste
Neste caso, os precursores
representado pela letra P apresentaram um fator de reteno (Rf) igual a 0,35,
0,35 ao
passo que o fator de reteno (Rf) verificado para os produtos da reao
representado pela letra R foi igual a 0,32. O rendimento final obtido para a reao
de reduo foi de 87%.




RESULTADOS E DISCUSSO


Z D W


Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao dihidro-isohumulonas no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico
(1:4 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura; (P) precursores.

4.2.2. Preparo das tetrahidro-isohumulonas.

Os derivados hidrogenados dos iso--cidos foram preparados de acordo


com a metodologia proposta por Verzele e De Keukeleire9. A reao foi
acompanhada utilizando-se uma placa de slica gel (TLC), em um sistema de
cromatografia planar, conforme consta na Figura 9. Desta forma, de acordo com os
fatores de reteno (Rf) dos precursores e produtos da reao, 0,11 e 0,20
respectivamente, aps

horas

de amostragem

todos

precursores foram

consumidos, sendo ento a reao finalizada. O rendimento verificado para a reao


de hidrogenlise foi de 89%.




RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao tetrahidroisohumulonas - no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e
hexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;
(P) precursores.

4.3. Caracterizao qumica das isohumulonas isoladas e seus derivados


reduzidos/hidrogenados.

4.3.1. Caracterizao qumica das trans-isohumulonas isoladas.

Primeiramente, os diastereoismeros trans- foram caracterizados por


espectrofotometria UV-vis pela leitura direta das trans-isohumulonas isoladas em
soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L-1).
Desta forma, atravs da leitura do espectro eletrnico de absoro, Figura 10, notase a presena de duas bandas centradas em 227 e 279 nm, cujos coeficientes de
absortividade molar so 10.200 e 11.150 L mol-1 cm-1, respectivamente. Estes
valores esto de acordo com os reportados na literatura9 para a espcie transisohumulona.




RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonas isoladas em soluo contendo
-1
10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de trans-isohumulonas
-5
-1
de 3,2 10 mol L .

segunda

tcnica

utilizada

na

caracterizao

qumica

das

trans-

isohumulonas isoladas foi a LC-ESI-MSn. Comparando-se o perfil cromatogrfico dos


diastereoismeros trans- isolados (em azul) com o cromatograma da soluo
comercial de iso--cidos contendo as formas cis- e trans- (em vermelho), Figura
11, constata-se que h uma sobreposio do segundo pico do cromatograma
inerente a soluo das isohumulonas com o primeiro pico do cromatograma das
trans-isohumulonas, cujo tempo de reteno (tr) 11,4 minutos. Estes picos so
referentes aos diastereoismeros trans-, sendo o pico em 10,5 minutos (tr) do
cromatograma da soluo de isohumulonas referente forma cis-. Esta informao
deve-se ao fato de que os compostos trans- esto presentes em menor proporo
que as formas cis-, pois a formao deste ltimo termodinamicamente favorecida9.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x10 5

soluo comercial de iso--cidos


trans-isohumulonas isoladas

(a)
1
4

5
2

0
0

10

Intens.
x104

15

20

25

Time [min]

-MS, 11.3-11.5min #(1117-1137), Background Subtracted

(b)

[M-H]-

2.0

347.2

+2
2+

2
1.5

WUDQVLVRFRKXPXORQDV

1.0

[M-H-isohexenoila]-

0.5

251.1

[M-H-H2O]

[M-H-prenila]

100

150

Intens.
x10 4

200

369.2

329.2

278.1

0.0
250

300

350

m/z

-MS, 16.1-16.7min #(1595-1653)

(c)

[M-H]361.3

+2
3

2+

WUDQVLVRQKXPXORQDV
-

[M-H-isohexenoila]
1

265.2

[M-H-H2O]
283.3

343.2

383.2

0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formas
cis- e trans- (em vermelho) e das trans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr = 11,4 min. (c) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulona referente ao pico 4, tr = 16,5 min.

A Figura 11b apresenta o espectro de massas do pico 2 do cromatograma


das trans-isohumulonas isoladas, no qual se observa o on [M-H]- 347 m/z referente
molcula desprotonada. Este on referente espcie trans-isocohumulona, a
qual apresenta uma massa molecular igual a 348 g mol-1.
Por outro lado, o pico 4, tr = 16,5 minutos, refere-se a trans-iso-n-humulona,
cuja massa molecular 362 g mol-1, resultando no on referente molcula



RESULTADOS E DISCUSSO


desprotonada [M-H]- = 361 m/z , Figura 11c. interessante ressaltar que a transisoadhumulona, por estar presente inicialmente no extrato de lpulo isomerizado em
pequena quantidade, sua complexao no foi efetiva; consequentemente, no foi
detectada a trans-isoadhumulona na soluo final das trans-isohumulonas isoladas.
Ainda, pela da anlise cromatogrfica do extrato de lpulo pr-isomerizado
(cromatograma em vermelho apresentada na Figura 11a), concedido gentilmente
pela Hopsteiner, constatou-se um excesso de 70% dos ismeros cis- em relao aos
trans-iso--cidos, sendo os percentuais dos compostos apresentados na Tabela 1.
Como um todo, a pureza verificada para a soluo aquosa comercial contendo as
formas cis- e trans-iso--cidos foi de 90%.

Tabela 1. Percentuais de isohumulonas no extrato de lpulo pr-isomerizado.

cisisocohumulona

transisocohumulona

iso-n-humulona
(cis- e trans-)

isoadhumulona
(cis- e trans-)

25,9%

3,6%

66,0%

4,5%

As trans-isohumulonas isoladas foram caracterizadas ainda por 1H RMN, cujo


espectro obtido encontra-se na Figura 12. A partir deste, foram identificados alguns
sinais caractersticos dos diastereoismeros trans-9,13, cujos deslocamentos
qumicos () so: 2,14 ppm (1H, m); 2,40 ppm (2H, m); 2,70 ppm (2H, d, J = 7 Hz);
3,27 ppm (2H, d, J = 7 Hz); 5,00 ppm (1H, t, J = 7 Hz); 5,18 ppm (1H, t, J = 7 Hz).
Ainda, interessante ressaltar que o sinal em 2,70 ppm caracterstico das transisohumulonas, sendo este parmetro utilizado para a distino destes compostos
dos seus ismeros cis- pela leitura dos espectros de ressonncia magntica nuclear.




RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinais
marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Portanto, constata-se que as formas trans- foram isoladas com sucesso a


partir da complexao seletiva utilizando a -ciclodextrina, resultando em uma
pureza estimada de 95%.
Utilizando um sistema HPLC semi-preparativo, buscou-se isolar os anlogos
trans-isocohumulona e trans-iso-n-humulona. Para tal, testou-se vrias condies
cromatogrficas, variando-se desde a composio da fase mvel at o tipo de
coluna utilizada. Referente fase mvel, testou-se diversos solventes de eluio,
acidificados ou no, bem como a aplicao de gradiente de eluio ou no modo
isocrtico, variando, neste ltimo, a proporo entre os solventes empregados.
Dentre as colunas testadas, Waters X-Bridge C18 5 m (10 mm x 250 mm) e LUNA
C-18 10 m (20 cm x 0,7 cm), a coluna LUNA foi aquela que apresentou maior
eficincia na separao dos anlogos. Desta forma, as melhores condies obtidas




RESULTADOS E DISCUSSO


na separao esto descritas no item 3.2, na qual foi empregado um sistema


isocrtico com a relao de fase mvel de 56% do solvente B sobre o solvente A.
O cromatograma resultante est apresentado na Figura 13, no qual se pode
notar a presena de dois picos majoritrios P.1 e P.2. De fato, o primeiro pico
apresenta o tempo de reteno de 15,0 minutos e refere-se trans-isocohumulona,
ao passo que o pico 2, tr = 18,6 minutos, referente eluio da trans-iso-nhumulona.

-3

-1

Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas em meio alcolico (5,0 10 mol L )
submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da
-1
fase mvel 2,5 mL min. Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento
= 270 nm.

Assim, os compostos foram coletados em duas fraes respectivas aos picos


P.1 e P.2. No espectro de massas da frao 1, Figura 14, verificou-se a presena
dos ons das molculas desprotonadas [M-H]- 347 e 361 m/z, os quais so
referentes a trans-isocohumulona, [Ma-H]-, e resqucios da trans-iso-n-humulona,
[Mb-H]-, respectivamente. Ainda, os ons 379 e 393 remetem a produtos (impurezas
na amostra) decorrentes da oxidao dos iso--cidos. Como um todo, o percentual




RESULTADOS E DISCUSSO


verificado para a trans-isocohumulona foi de 55% com relao aos demais


compostos presentes, no obtendo uma boa separao cromatogrfica.
Intens.
x105
1.50

-MS, 0.2-2.5min #(27-297)

[Ma-H]

1.25

347.1
1.00

[Ma-H+O2]-

0.75

[Mb-H]

361.1

0.50

[Mb-H+O2]393.1

0.25

379.1

[Ma-H-isohexenoila]
251.0
0.00
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo transisohumulona.

Por outro lado, pelo espectro de massas da frao 2, apresentado na Figura


15, obteve-se um percentual de 85% referente a trans-isocohumulona. Aqui, nota-se
a presena dos mesmos ons contidos no espectro de massas da frao 1;
entretanto, a intensidade relativa ao on da molcula desprotonada [M-H]- 361 m/z,
respectivo a trans-isocohumulona, bem maior que os demais ons.
Intens.
x105
1.0

-MS, 0.2-1.6min #(20-187)

[Ma-H]-

0.8

361.1

0.6

[Mb-H+O2]
0.4

[Ma-H+O2]

379.1
0.2

[Mb-H]
-

[Ma-H-isohexenoila]

393.1

347.1

265.0

0.0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo transisohumulonas.




RESULTADOS E DISCUSSO


4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas.

O espectro eletrnico de absoro da soluo contendo as cis-isohumulonas


isoladas, apresentado na Figura 16, foi similar ao espectro apresentado pelas transisohumulonas, Figura 10. De fato, as bandas centradas em 227 e 279 nm aqui
apresentadas so condizente com os dados reportados na literatura9, sendo os
coeficientes de absortividade molar (227 nm = 10.200 e 279 nm = 11.150 L mol-1 cm-1)
iguais para ambos os diastereoismeros cis- e trans-iso--cidos.

Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonas isoladas em soluo contendo 10
-1
-5
-1
mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de 4,6 10 mol L .

Caracterizou-se as cis-isohumulonas isoladas por LC-ESI-MSn, obtendo ento


o perfil cromatogrfico apresentado na Figura 17. Neste, possvel observar a
sobreposio do primeiro pico do cromatograma de ons total inerente soluo
comercial de iso--cidos (em vermelho) com o pico 1 do cromatograma de ons
total dos diastereoismeros cis- isolados (em azul). Conforme j mencionado no
texto, estes picos, cujo tempo de reteno 10,5 minutos, so referentes s formas
cis-, sendo que as formas trans- eluem em 11,4 minutos, representado pelo pico 2.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x105

soluo comercial de iso--cidos


cis-isohumulonas isoladas

(a)

4
2

 

0
0

10

Intens.
x104

15

20

25

30

Time [min]

-MS, 10.2-10.3min #(1018-1026), Background Subtracted

(b)
-

[M-H]

347.1

[M-H-isohexenoila]

[M-H-prenilaisohexenoila]

[M-H-isohexenoilaH2O]251.0

182.0

[M-H-H2O]

[M-H-prenila]

329.1

278.1

233.1

0
100

150

200

Intens.
x105

250

300

350

m/z

-MS, 14.6-14.8min #(1456-1475), Background Subtracted

1.2

(c)
-

[M-H]
1.0

361.1

0.8


0.6

0.4

[M-H-prenilaisohexenoila]-

0.2

[M-H-H2O]

[M-H-isohexenoila]

343.1

265.1

196.0
0.0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formas
cis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr = 10,5 min. (c) Espectro de massas
(ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr = 14,7 min.
Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Pelo espectro de massas do pico 1 contido cromatograma das cisisohumulonas isoladas, nota-se o on [M-H]- 347 m/z respectivo molcula
desprotonada referente forma cis-isocohumulona, Figura 17b. Por outro lado, o
espectro de massas do pico 3, Figura 17c, cujo tempo de reteno 14,7 minutos,



RESULTADOS E DISCUSSO


aponta o on 361 m/z como sendo o on das molculas desprotonadas. Este


referente s formas cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona.
Por fim, as cis-isohumulonas isoladas foram caracterizadas por 1H RMN,
sendo possvel identificar alguns sinais caractersticos destes compostos9,13,
conforme consta na Figura 18. Pela leitura do espectro, pode-se identificar alguns
sinais caractersticos das espcies cis-, cujos deslocamentos qumicos () so:
2,43 ppm (2H, m); 3,30 ppm (2H, d, J = 6,5 Hz); 5,01 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz);
5,19 ppm (1H, t, J = 6,5 Hz). Ainda, podem ser notados alguns sinais referentes a
impurezas presentes na amostra, os quais esto marcados no espectro e so
referentes a possveis produtos de oxidao advindos do extrato de lpulo.

Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinais
marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Logo, constata-se que as cis-isohumulonas foram isoladas de forma eficaz ao


empregar a complexao seletiva com a -ciclodextrina, obtendo uma pureza
estimada de 90%.



RESULTADOS E DISCUSSO


Empregando a mesma metodologia utilizada ao buscar isolar cada anlogo


das trans-isohumulonas isoladas, os anlogos dos diastereoismeros cis- foram
tentativamente isolados atravs do sistema HPLC semi-preparativo. Pela leitura do
cromatograma contido na Figura 19, verifica-se que os picos P.2 e P.3 referem-se
eluio dos homlogos cis-iso-n-humulona e cis-isoadhumulona da coluna, em 16,9
e 18,6 minutos (tr), respectivamente. O pico P.1 remete a cis-isocohumulona, cujo
tempo de reteno 13,9 minutos.

-3

-1

Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meio alcolico (1,0 10 mol L )
submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da
-1
fase mvel 2,5 mL min. Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento = 270
nm.

O espectro de massas do pico P.1, Figura 20, apresenta os ons majoritrios


das molculas desprotonadas [M-H]- 361 m/z, [Mb-H]-, e 347 m/z, [Ma-H]-, os quais
so referentes cis-iso-n-humulona e cis-isocohumulona, respectivamente. Logo, o
percentual verificado da cis-isocohumulona foi estimado em 60% com relao aos
demais

compostos

presentes;

portanto,

no

se

obteve

uma

separao

cromatogrfica eficiente.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x105

[Ma-H]

-MS, 3.9-6.8min #(462-815)

347.1

[Mb-H]
361.1
2


-

[Ma-H-isohexenoila]

[Mb-H-isohexenoila]

[Ma-H-H2O]
329.1

251.1
265.1
0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo cisisohumulonas.

No espectro de massas dos picos P.2 e P.3, Figura 21, o on 361 m/z
consiste no on das molculas desprotonadas, o qual referente aos homlogos cisisoadhumulona e cis-iso-n-humulona. De fato, a amostra apresentou uma pureza
estimada em 95%, verificando uma boa separao cromatogrfica.
Intens.
x105

-MS, 4.3-7.2min #(518-870)

[M-H]-

361.1


2

[M-H-H2O]-

[M-H-isohexenoila]

343.1

265.1
0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo cisisohumulonas.

4.3.3. Caracterizao qumica das dihidro-isohumulonas.

Conforme j exposto, a reduo da funo carbonila do isohexenoila dos iso-cidos conduz a formao dos dihidro-iso--cidos. Logo, verifica-se que estes



RESULTADOS E DISCUSSO


compostos reduzidos apresentam um centro quiral a mais na molcula, o qual se


situa no carbono contendo o grupo hidroxila formado.
Pela leitura do espectro eletrnico de absoro dos dihidro-iso--cidos,
contido na Figura 22, nota-se uma similaridade com os espectros apresentado pelos
precursores, iso--cidos. Este resultado est de acordo com relatos na literatura9,
sendo ento os coeficientes de absortividade molar 10.200 e 11.150 L mol-1 cm-1
respectivos s bandas centradas em 227 e 279 nm.

Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
-1
soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de
-5
-1
2,3 10 mol L .

O perfil cromatogrfico resultante da caracterizao dos derivados reduzidos


dos iso--cidos por LC-ESI-MSn est apresentado na Figura 23. Nota-se a
presena de 6 picos majoritrios, cujos tempos de reteno so: 6,3 minutos, pico 1;
7,6 minutos, pico 2; 8,2 minutos, pico 3; 10 minutos, pico 4; 11,7 minutos, pico 5;
15,1 minutos, pico 6.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x10 7

(a)

3
2

1
1

0
0

10

20

Intens.
x10 6

30

40

50

T i me [min]

-MS, 7.6-7.7min #(684-693), Background Subtracted

[M-H]-

349.1

(b)


1

[M-H-prenila-HCOH]251.0

381.1

0
50

100

150

Intens.
x10 6

200

1.5

350

m/z

[M-H]

363.1

(c)

+2
+2

300

-MS, 8.1-8.3min #(737-751), Background Subtracted

250

+2
2+

+2

2+

1.0

FLVGLKLGURLVRQKXPXORQDV
5

WUDQVGLKLGURLVRQKXPXORQDV

&+&+ &+ 

0.5

[M-H-prenila-HCOH]
265.0
0.0
50

100

Intens.
x10 5

150

200

250

300

350

m/z

-MS, 15.1-15.2min #(1431-1441), Background Subtracted

[M-H]

363.1

(d)

[M-H-prenila-HCOH]
265.1
0
50

100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr = 6,3 e 7,6 min.
(c) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-iso-n-humulona referente aos picos
3 e 4, tr = 8,2 e 10,0 min. (d) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-dihidroisoadhumulona referente aos picos 5 e 6, tr = 11,7 e 15,1 min.




RESULTADOS E DISCUSSO


Os espectros de massas dos picos 1 e 2 encontram-se na Figura 23b. De


fato,

os

picos

supracitados

apresentaram

mesmo

on

das

molculas

desprotonadas [M-H]- 349 m/z, sendo estes resultantes das eluies das dihidroisocohumulonas, cuja massa molecular igual a 350 g mol-1. Ainda, pela
comparao das reas referentes aos picos, constatou-se que o primeiro pico
remete a trans-dihidro-isocohumulona, pois a rea relativamente menor que a rea
apresentada pelo segundo pico, sendo este decorrente da eluio da espcie cis-.
Os espectros de massas referentes aos demais picos, contidos na Figura
23c-d, apresentaram perfis similares, cujo on das molculas desprotonadas igual
a 363 m/z. Logo, constata-se que os picos 3, 4, 5 e 6 so inerentes aos homlogos
dihidro-iso-n-humulonas e dihidro-isoadhumulonas, os quais possuem massa
molecular igual a 364 g mol-1. Atravs da comparao entre as reas dos picos e
sabendo que os derivados das iso-n-humulonas esto presentes em maior
concentrao, constatou-se que os picos 3 e 4 so referentes aos diastereoismeros
trans-dihidro-iso-n-humulona e cis-dihidro-iso-n-humulona, respectivamente. Por
outro lado, os picos 5 e 6 remetem aos compostos cis-dihidro-isoadhumulona e
trans-dihidro-isoadhumulona.
O espectro de ressonncia magntica nuclear (1H RMN) obtido do produto da
reao decorrente da reduo dos iso--cidos est apresentado na Figura 24.
Apesar da baixa resoluo do espectro, verifica-se uma diferena ntida entre o
presente espectro e o apresentado pelos precursores iso--cidos. Esta diferena
diz respeito a sinal alargado em 6,3 ppm, o qual est diretamente relacionado com a
nova funo hidroxila presente na molcula, uma vez que tomos de hidrognios
ligados alcois so, no geral, facilmente trocveis com tomos de deutrio
presentes no meio (CDCl3). Todavia, outro aspecto que contribui para o alargamento



RESULTADOS E DISCUSSO


do sinal a presena de 12 compostos em soluo, os quais apresentam


deslocamentos qumicos ligeiramente distintos. Este resultado est de acordo com o
relatado por Verzele e De Keukeleire9.

Figura 24. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Como um todo, atravs das anlises dos produtos da reao de reduo dos
iso--cidos, constatou-se que o preparo das dihidro-isohumulonas foi bem
sucedida, obtendo uma pureza estimada de 98%.

4.3.4. Caracterizao qumica das tetrahidro-isohumulonas.

As tetrahidro-isohumulonas foram preparadas a partir da hidrogenao das


olefinas das cadeiras laterais conectadas aos carbonos C5 e C4, referentes aos
grupos prenila e isohexenoila dos iso--cidos. Os produtos da reao foram



RESULTADOS E DISCUSSO


primeiramente caracterizados por espectrofotometria UV-vis. Assim, pela leitura


direta da soluo alcolica contendo os derivados hidrogenados, obteve-se o
espectro contido na Figura 25, o qual apresenta uma banda centrada em 254 nm e
um ombro em 273 cujos coeficientes de absortividade molar so 17.690 e
13.730 L mol-1 cm-1, respectivamente. Este conjunto de dados est de acordo com o
relatado por Verzele e De Keukeleire9.

Figura 25. Espectro eletrnico de absoro das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
-5
-1
meio etanol. Concentrao de 2,3 10 mol L .

Em seguida, as tetrahidro-isohumulonas foram analisadas por LC-ESI-MSn.


Assim, conforme pode ser verificado na Figura 26a, o cromatograma obtido
apresenta 4 picos, cujos tr so: 19,2 minutos - pico 1; 21,5 minutos - pico 2;
26,0 minutos - pico 3; 29,6 minutos - pico 4.
Atravs da leitura dos espectros de massas de cada pico em questo,
observou-se que os espectros dos picos 1 e 2 apresentam o mesmo on das
molculas desprotonadas [M-H]- 351 m/z, conforme est apresentando na Figura
26b. De fato, este on referente s tetrahidro-isocohumulonas, cuja massa
molecular 352 g mol-1. Ainda, pelo clculo das reas destes picos, constatou-se




RESULTADOS E DISCUSSO


que o primeiro pico refere-se aos distereoismeros cis-, ao passo que a transtetradhidro-isocohumulona elue da coluna em 21,5 minutos, pico 2.
Analogamente, os picos 3 e 4 apresentam espectros de massas similares,
Figuras 26c-d, sendo o on 365 m/z o on das molculas desprotonadas [M-H]-.
Estes picos referem-se aos homlogos tetrahidro-iso-n-isohumulonas e tetrahidroisoadhumulonas, os quais apresentam massa molecular igual a 366 g mol-1. Atravs
do clculo das reas, verificou-se que o pico 3 remete mistura das tetrahidro-iso-nhumulonas, cis- e trans-, as quais so majoritrias no extrato de lpulo utilizado. Por
outro lado, o ltimo pico resultado da eluio da mistura cis- e trans-tetrahidroisoadhumulona, minoritrias no extrato de lpulo pr-isomerizado.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x106

(a)
6

2
0
0

10

Intens.
x105
6

20

30

40

50

T ime [min]

-MS, 19.0-19.3min #(1915-1941), Background Subtracted

[M-H]

(b)

350.7
5

[M-H-CO2]306.8
0
100

150

Intens.
x105

200

250

300

350

m/z

-MS, 25.9-26.2min #(2646-2688), Background Subtracted

[M-H]

364.8

(c)


2

[M-H-CO2]
320.8
0
100

150

Intens.
x105

200

250

300

350

m/z

-MS, 29.4-29.7min #(3037-3065), Background Subtracted

[M-H]

364.8

(d)

1.5

1.0


0.5

394.7
0.0
100

150

200

250

300

350

m/z

Figura 26. (a) Cromatograma de ons total das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-. (b)
Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-tetrahidro-isocohumulona referente aos picos
1 e 2, tr = 19,2 e 21,5 min., respectivamente. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies cis- e
trans-tetrahidro-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr = 26,0 min. (d) Espectro de massas (ESI(-)MS)
das espcies cis- e trans-tetrahidro-isoadhumulona referente ao pico 4, tr = 29,6 min.




RESULTADOS E DISCUSSO


Por fim, caracterizou-se as tetrahidro-isohumulonas por 1H RMN, obtendo o


espectro apresentado a seguir, Figura 27. Neste, apesar da baixa resoluo, notase a ausncia do duplo tripleto na regio de 5,00 e 5,17 ppm, referentes aos
hidrognio das olefinas das cadeiras laterais em C4 e C5, presentes inicialmente nos
precursores isohumulonas. Desta forma, constatou-se que a sntese foi bem
sucedida, havendo a hidrogenao das olefinas das cadeiras laterais referentes aos
grupos prenila e isohexenoila.

Figura 27. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.

Em suma, verificou-se que as tetrahidro-isohumulonas foram preparadas a


partir da hidrogenao dos iso--cidos, resultando em uma pureza estimada de
90%.




RESULTADOS E DISCUSSO


4.3.5.

Estudo eletroqumico das isohumulonas.

Sabe-se que o cromforo -tricarbonlico dos iso--cidos suscetvel a


sofrer oxidao12. Este grupo contm um nmero significativo de eltrons e
orbitais p deslocalizados em um sistema conjugado, o qual compostos por 3
tomos de oxignio e 4 tomos de carbono, comum a todos os cidos amargos
derivados do lpulo. Desta forma, aparte dos processos oxidativos verificados nos
iso--cidos, a degradao destes via transferncia de eltrons se deve a oxidao
do grupo -tricarbonlico, sendo o mesmo potencial de oxidao verificado para
ambas as espcies trans- e cis-isohumulonas em suas formas aninicas.
Analogamente, o mesmo potencial foi verificado para os derivados dihidroisohumulonas e tetrahidro-isohumulonas, em sua forma desprotonada12.
No entanto, o potencial de oxidao da forma molecular destes compostos
no foi ainda relatado devido ao alto potencial de oxidao destas espcies e a
limitao da janela dos eletrodos comumente utilizados. Desta forma, o intuito
principal do estudo eletroqumico foi determinar o potencial de oxidao dos
iso--cidos em sua forma molecular. Para tanto, o potencial de oxidao das transisohumulonas foi obtido utilizando-se o eletrodo de diamante dopado com boro como
eletrodo de trabalho. Ainda, experimentos foram direcionados para comprovar o
potencial de oxidao das formas aninicas da configurao trans-. Neste contexto,
realizaram-se experimentos de voltametria cclica em uma janela de potencial de 0,0
a 2,2 V vs. NHE, obtendo voltamogramas em diferentes velocidades de varredura
(10, 50, 100 e 200 mV s-1).
Nos experimentos eletroqumicos utilizando as trans-isohumulonas em sua
forma aninica, obteve-se o voltamograma apresentado na Figura 28, cujo potencial



RESULTADOS E DISCUSSO


de oxidao foi igual a 1,4 V vs. NHE. Ainda, verificou-se a existncia de um


processo irreversvel decorrente da oxidao de 1 eltron, pela ausncia de onda de
varredura catdica. Estes resultados esto de acordo com o descrito na literatura12.

Figura 28. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma aninica, em acetonitrila
-1
contendo 0,2 mol L de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante
dopado com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). A velocidade de
-1
varredura foi 50 mV s .

Utilizando a forma protonada das trans-isohumulonas, experimentos de


voltametria cclica foram conduzidos, obtendo voltamogramas em diferentes
velocidades de varredura (10, 50, 100 e 200 mV s-1), os quais se encontram na
Figura 29. Aqui, verificou-se que o pico de oxidao para os compostos foi 1,8 V vs.
NHE, bem como a presena de um processo irreversvel. Tambm, observou-se que
os potenciais de pico deslocam com o aumento da velocidade de varredura. Neste
caso, atravs do grfico da corrente de pico andico vs. a raiz quadrada da
velocidade de varredura (v1/2) presente na Figura 29, constatou-se uma
dependncia linear, cujo coeficiente de correlao igual a 0,9987. Desta forma, foi
evidenciado um processo difusional, no qual o transporte de massa na oxidao das
trans-isohumulonas controlado cineticamente por transferncia heterognea de
eltrons do substrato para o eletrodo.



RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 29. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma molecular, em acetonitrila
-1
contendo 0,2 mol L de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante
dopado com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). As velocidades
-1
-1
-1
-1
de varredura foram: a = 10 mV s ,b = 50 mV s , c = 100 mv s , d = 200 mV s .

De fato, constatou-se que as isohumulonas em sua forma aninica so mais


suscetveis a sofrerem oxidao que os compostos em sua forma molecular.
Conforme mencionado anteriormente no texto, as iso--cidos esto presentes na
cerveja, em sua maioria, na forma desprotonada, o que deixa patente a deteriorao
destes compostos na bebida.




RESULTADOS E DISCUSSO


4.4.

Reatividade dos iso--cidos e seus derivados e alguns fenis frente o

radical 1-hidroxietila.

4.4.1. Estudos com o radical 1-hidroxietila: formao do aduto radical


[4-POBN/CH(CH3)OH].

Primeiramente, avaliou-se a influncia do oxignio dissolvido no meio


reacional quanto captao do radical 1-hidroxietila pela armadilha qumica
4-POBN. Conforme pode ser observado no cromatograma contido na Figura 30a,
apenas um composto foi detectado, em 6 minutos (tr), o qual, pelo espectro de
massas (ESI-MSn), referente eluio do 4-POBN da coluna, cujo on da molcula
protonada [M+H]+ igual a 195 m/z, Figura 30b. Observa-se tambm os ons
fragmentos em 139, 122 e 95 m/z referentes perda do grupo tert-butil, tert-butil e
H2O e dos fragmentos C(CH3)3 e H2CNO+ respectivamente.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x107
5

P.1

(a)

0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

Intens.
x106

20.0

22.5

[M+H-C(CH3)3]

(b)

139.0

Time [min]

+MS, 6.0-6.1min #(250-259), Background Subtracted

[M+H-C(CH3)3-H2O]

[M+H]
2

195.1

[M+H-C(CH3)3+
H2CNO]
95.1

[M+Na]
122.1

217.0

408.2

0
100

200

300

400

500

m/z

Figura 30. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da reao de formao do aduto

0
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob atmosfera de O2. T = 25 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) do eluato em tr = 6 min referente espcie 4-POBN.

Segundo a literatura25,41, o oxignio reage com o radical 1-hidroxietila com


constante de velocidade prxima ao limite difusional, gerando acetaldeido como
produto principal, conforme ilustrado no Esquema 3. Consequentemente, a
formao do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] no foi observada em condies
aerbicas em funo desta reao paralela.
Por outro lado, ao analisar a mistura reacional aps 5 minutos de amostragem
e sob atmosfera de argnio, observa-se a formao de quatro novos picos
decorrentes da reao entre a armadilha qumica e o radical 1-hidroxietila,
denominados pico 2 (P.2), pico 3 (P.3), pico 4 (P.4) e pico 5 (P.5) na Figura 31a.
O pico 2, tr = 7,9 minutos, refere-se forma oxidada do aduto, resultando no
on da molcula protonada [M+H]+ 239 m/z, conforme pode ser observado no



RESULTADOS E DISCUSSO


fragmentograma contido na Figura 31b. Adicionalmente, o espectro de massas por


CID (Colision Induced Dissociation) deste on encontra-se na Figura A1 do
Apndice A.
O pico 3 consiste na eluio do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] em 8,6
minutos (tr). Pela leitura do espectro de massas referente a este pico, Figura 31c,
nota-se o on da molcula protonada [M+H]+ 240 m/z. O espectro de massas por CID
deste on est apresentado no Apndice A Figura A2.
O pico 4, referente ao eluato em 9,2 minutos (tr), remete ao 4-POBN ligado a
duas molculas do radical 1-hidroxietila, cujo on da molcula protonada [M+H]+
apresentado 285 m/z, Figura 31d. Pelo espectro de massas por CID,
fragmentograma, deste on referente a este pico, Apndice A Figura A3, observase que a fragmentao do on da molcula protonada gera o on secundrio
241 m/z, o qual consiste no aduto em sua forma reduzida.
Da mesma forma, o fragmentograma obtido para o pico 5, tr = 12,8 minutos,
contido na Figura 31e, apresenta o on da molcula protonada [M+H]+ 285 m/z.
Conforme citado anteriormente, este on remete ao 4-POBN contendo duas
molculas do radical 1-hidroxietila. Neste espectro, verifica-se a presena do on
secundrio 241 m/z decorrente da fragmentao secundria do on da molcula
protonada, conforme pode ser observado na Figura A4 do Apndice A.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x10 7

P.1

(a)
4

P.2 P.3 P.4

P.5

0
0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

Intens.
x105

22.5

Time [min]

+MS, 7.9-7.9min #(639-646), Background Subtracted

2.0

(b)

[M+H]+
239.1

1.5

1.0

[M+H-C(CH3)3]+

0.5

[M+K]+

[M+H-C(CH3)3-H2O]+
165.0

0.0

[2M+Na-CH3CHOH]+

[M+Na]

183.0

100

[2M+Na]

[2M+H-CH3CHOH]+

261.1277.0

455.2

433.1

200

300

499.1

400

500

Intens.
x105

m/z

+MS, 8.6-8.7min #(707-714), Background Subtracted

1.5

(c)

[M+H-NOC(CH3)3]
153.0

1.0

[M+H]

[2M+Na-CH3CHOH]+

240.1

0.5

[M+H-CH3CHOH+
C(CH3)3]
[4-piridil-1-xido]+

[M+H-CH3CHOH+
H2O]

[M+Na]+

[2M+H-CH3CHOH]

[2M+H]+
479.2

434.2

179.1

[M+K]+

138.0

96.1

456.2

262.0278.0

[2M+Na]

+
501.2
517.1[2M+K]

0.0
100

200

300

400

Intens.
x10 5

500

m/z

+MS, 9.1-9.2min #(451-457), Background Subtracted

(d)

[M+H-2CH3CHOH-H2O]+
179.1

1.5

[M+H-2CH3CHOH-H2O-O]
1.0

[M+H-2CH3CHOH-H2O4-piridil-1-xido]+
[M+H]+

0.5

0.0

285.2

[M+H-2CH3CHOH147.1163.1
H2O-O-C(CH3)3]+

[M+Na]
307.1

[4-piridil-1- 107.1
+
xido] 96.1
100

[2M+Na]+
[2M+H]+ 591.3

[M+K]

323.1

569.3

200

300

400

500

m/z

(continua na pgina 77)




RESULTADOS E DISCUSSO

(concluso da figura)
Intens.
x10 5

+MS, 12.7-12.8min #(654-658), Background Subtracted

2.0

(e)

[M+H-2CH3CHOH-H2O]+
179.1

1.5

1.0

0.5

[M+H-2CH3CHOH-H2O-O]+
+

[M+H-2CH3CHOH-H2O+
4-piridil-1-xido]
[M+H-2CH3CHOHH2O-O-C(CH3)3]+

[M+H]
285.1

[M+Na]

[2M+Na]+

[M+K]+
147.1

163.1

107.1

591.3

[2M+H]+

323.1

[M+H-CH3CHOH]

307.2

569.3

241.1

501.2

0.0
100

200

300

400

500

m/z

Figura 31. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da reao de formao do aduto

0
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob atmosfera de Ar. T = 25 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr = 7,9 min. (c) Espectro de massas (ESI(+)MS)
com atribuio dos ons do eluato em tr = 8,6 min. (d) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio
dos ons do eluato em tr = 9,2 min. (e) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons do
eluato em tr = 12,8 min.

De fato, pelo cromatograma apresentado na Figura 31a, observa-se que as


espcies que eluem em 9,2 e 12,8 minutos no so quimicamente idnticas, pois
possuem

tempos

de

reteno

bem

distintos,

apesar

de

apresentarem

fragmentogramas similares. No entanto, no se pode afirmar a estrutura qumica


exata referentes a cada pico somente utilizando-se a tcnica LC-MS/MS.
A ttulo ilustrativo, as estruturas qumicas dos compostos supracitados esto
apresentadas na Figura 32.
2+

2
+




(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

Figura 32. Estruturas qumicas das quatro espcies formadas da reao entre 4-POBN e o radical
1-hidroxietila: (a) aduto oxidado; (b) aduto radical; (c) e (d) 4-POBN ligado a duas molculas do
radical 1-hidroxietil; (e) aduto reduzido.




RESULTADOS E DISCUSSO


Em suma, verifica-se a existncia de 4 espcies em soluo decorrentes da


reao entre a armadilha qumica e o radical 1-hidroxietila: a forma oxidada do
aduto, dois compostos relacionados ao 4-POBN ligado a duas molculas do radical,
alm do prprio aduto radical. interessante ressaltar que, exceto o aduto radical,
os demais compostos verificados no foram ainda relatados na literatura, uma vez
que os produtos da reao foram analisados utilizando-se somente a tcnica RPE, a
qual detecta apenas substncias paramagnticas. Desta forma, o mtodo tradicional
descrito na literatura para se detectar e dosar radicais consiste em utilizar
espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE). Assim, o aduto
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] foi monitorado atravs desta tcnica, cujo espectro
est apresentado na Figura 33.

Figura 33. Espectro de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) registrado em banda-X

(9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] obtido em soluo aquosa gua/etanol ( 5%) a
0
temperatura de 25 C.

Conforme pode ser observado, o espectro trata de um triplo dubleto


decorrente do acoplamento hiperfino (contato de Fermi) do eltron desemparelhado
com o tomo de nitrognio (I = 1) e o desdobramento deste tripleto em dubleto pelo
acoplamento super hiperfino com o tomo de hidrognio beta (H) (I = ). Do



RESULTADOS E DISCUSSO


espectro, obteve-se uma constante de acoplamento entre o eltron desemparelhado


e o ncleo do tomo de nitrognio (aN) igual a 15,6 G, bem como uma constante de
acoplamento entre este mesmo eltron com o ncleo do tomo de hidrognio (aH)
igual a 2,6 G. Estas constantes de acoplamento e padro de desdobramento
hiperfino esto de acordo com a literatura25 e corroboram com a comprovao da
existncia do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH].

4.4.2. Estudos com o radical 1-hidroxietila: estabilidade do aduto radical


[4-POBN/CH(CH3)OH].

Avaliou-se tambm a estabilidade do aduto radical por ESI-(+)-MS/MS em


soluo com o intuito de verificar o decaimento cintico deste, bem como para
ajustar o tempo de amostragem da reao. Neste contexto, investigou-se a
influncia da adio de catalase no decaimento do radical ao analisar o tempo de
meio vida (t1/2) deste na presena e ausncia da enzima. Assim, constatou-se que,
de fato, a catalase tem efeito sobre a estabilidade do aduto radical, uma vez que
esta consome o excesso de perxido de hidrognio em soluo, o qual se supe
estar envolvido em reaes paralelas que ocasionam um decaimento mais
acentuado do aduto radical, conforme pode ser observado na Figura 34.




RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 34. Decaimento do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] na presena e ausncia de catalase


-1
0
(47,4 mg mL ). T = 25 C.

Na Tabela 2 so apresentadas as constantes de decaimento do aduto radical,


bem como os respectivos tempos de meia vida (t1/2) obtidos na presena e ausncia
de catalase. Aqui, observa-se tempos de meia vida bem distintos, o que leva a
concluir que o uso da catalase de suma importncia neste tipo de reao,
principalmente quando se deseja quantificar o aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH]
formado, como no caso da utilizao da cintica de competio.

Tabela 2. Dados cinticos com respeito ao decaimento do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] no


0
meio reacional e a temperatura de 25 C.

Sem Catalase

Com Catalase

kobs (s-1)

1,6 10-3

9,0 10-4

t1/2 (s)

432

774

Desta forma, avaliou-se o comportamento dos ons das molculas protonadas


[M+H]+ 239, 240 e 285 m/z adicionando-se catalase ao final do tempo de
amostragem estabelecido para a reao. Assim, estes ons foram monitorados
durantes os 5 primeiros minutos de reao, obtendo o grfico presente na Figura



RESULTADOS E DISCUSSO


35. Observa-se uma evoluo em funo do tempo de reao da forma oxidada do


aduto ([M+H]+ = 239 m/z) e das espcies formadas pela ligao do 4-POBN com
duas molculas do radical 1-hidroxietila ([M+H]+ = 285 m/z), ao passo que a
concentrao do aduto radical ([M+H]+ = 240 m/z) manteve-se praticamente
constante durante os 5 minutos. sabido que, nas condies experimentais
utilizadas, era esperado que houvesse um acrscimo da concentrao do aduto
radical em soluo. Assim, este comportamento est provavelmente relacionado s
reaes subseqentes envolvendo o aduto radical, as quais geram as espcies
referentes aos ons das molculas protonadas [M+H]+ 239 e 285 m/z pelo consumo
do aduto radical.

Figura 35. rea dos picos cromatogrficos referentes s espcies aduto oxidado, aduto radical

[4-POBN/CH(CH3)OH] e 4-POBN contendo duas molculas do radical 1-hidroxietila em funo do


tempo de reao e na presena de catalase.

Neste caso interessante notar que em 1 minuto de reao as concentraes


das espcies do aduto oxidado e 4-POBN ligado as duas molculas do radical so
significativamente inferiores concentrao do aduto radical. Isto indcio de que
neste tempo de amostragem, as reaes subsequentes podem ser, em parte,
consideradas desprezveis. Desta forma, para a obteno das constantes de



RESULTADOS E DISCUSSO


velocidade aparentes da reao dos compostos de interesse frente o radical


1-hidroxietila, atravs da abordagem cintica de competio, o tempo de
amostragem utilizado foi 1 minuto.
O mecanismo de reao proposto para as reaes subsequentes observadas
encontra-se no Esquema 7, onde aduto radical oxidado pelo meio, cuja constante
de velocidade est representada por k2ox. Por outro lado, a segunda reao
subsequente se d pela ligao de uma molcula do radical 1-hidroxietila ao aduto
radical, com a constante de velocidade k2rad. Aqui, cabe ressaltar que as constantes
de velocidades decorrentes das reaes de formao do aduto oxidado e 4-POBN
ligado a duas molculas do radical, k2ox e k2rad respectivamente, no so conhecidas.

Esquema 7. Reao de formao das espcies aduto oxidado e 4-POBN ligado a duas molculas de
radical 1-hidroxietila.




RESULTADOS E DISCUSSO


4.4.3. Estudos com o radical 1-hidroxietila: determinao das constantes


de velocidades aparentes da reao entre o radical 1-hidroxietila e os compostos de
interesse.

A reatividade dos cidos amargos presentes na cerveja, derivados do lpulo,


bem como alguns fenis presentes na bebida frente o radical 1-hidroxietila foi
obtidada pela determinao das constantes de velocidade de segunda ordem das
reaes. Assim, conforme j mencionado no texto, as constantes de velocidade
foram determinadas atravs de uma abordagem cintica de competio, obtendo
ento constantes de velocidade aparentes.
Desta forma, atravs da Equao 1:
F
1-F

* k2 * [4-POBN] = k2 * [IAA]

(1)

possvel estimar as constantes de velocidade da reao entre o radical


1-hidroxietila e os compostos em estudo - isohumulonas e derivados, bem como os
fenis de interesse.
Na expresso, (F) representa o percentual de captao do radical pelos
iso--cidos, [4-POBN] e [IAA] consistem nas concentraes da armadilha qumica
4-POBN e do composto de interesse aqui representado pelos iso--cidos,
respectivamente. k2 representa a constante de velocidade especfica da reao entre
o radical e a armadilha qumica 4-POBN e k2 consiste na constate de velocidade
aparente da reao envolvendo o radical e iso--cidos. A deduo para a Equao
1 encontra-se no Apndice B.
Assim, variando-se a concentrao dos compostos de interesse na reao, no
caso

representado

pelos

iso--cidos,

um

grfico

(F/F-1)*k2*[4-POBN]

vs.


RESULTADOS E DISCUSSO


concentrao

do

composto

em

estudo

[IAA]

foi

construdo

obtendo

um

comportamento linear, no qual cada ponto da curva foi obtido a partir da mdia da
anlise em triplicata do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] para cada concentrao
do composto adicionado. Consequentemente, sabendo a concentrao da armadilha
qumica [4-POBN] e k2 (3,1 107 L mol-1 s-1)37, calculou-se as constantes de
velocidade aparente de segunda ordem (k2).
Como um todo, os compostos de interesse no estudo da reatividade com o
radical 1-hidroxietila englobaram em primeira instncia os iso--cidos e os
derivados dihidro-iso--cidos e tetrahidro-iso--cidos, dada a importncia na
qualidade sensorial da cerveja destes. Em uma segunda etapa, buscou-se avaliar a
reatividade de alguns fenis presentes tambm na cerveja. Adicionalmente, avaliouse a reatividade de cada diastereismeros cis- e trans-isocohumulonas, bem como
dos anlogos iso-n-humulonas e isocohumulonas, nas formas cis- e trans-, frente ao
radical de interesse, isolando os cidos amargos do lpulo atravs de um sistema
HPLC semi-preparativo.
Um estudo comparativo foi desenvolvido utilizando as tcnicas RPE e
ESI-(+)-MS/MS com o intuito de analisar a reatividade do radical 1-hidroxietila
perante os compostos em estudo. Desta forma, as reaes foram monitoradas por
estas duas tcnicas, sob as mesmas condies reacionais e instrumentais.
Da cintica de competio e pela anlise da Equao 1, sabe-se que o
coeficiente angular da reta fornece a constante de velocidade de interesse. A ttulo
de exemplificao, a Figura 36 apresenta o grfico obtido na cintica da reao
entre as trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila.




RESULTADOS E DISCUSSO



Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de trans-isohumulonas. Medidas obtidas por
espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de
o
eltrons (EPR). T = 25 C; 1 minuto de reao.

De fato, verificou-se que as tcnicas ESI-(+)-MS/MS e RPE mostraram-se


bastantes compatveis para tal finalidade, pois os perfis de captao do radical foram
similares. Consequentemente, as constantes de velocidade aparentes obtidas foram
estatisticamente iguais no intervalo de confiana de 95% (p = 0,05).

4.4.3.1. Reatividade dos iso--cidos e seus derivados frente o radical


1-hidroxietila.

Um

estudo

inerente

reatividade

das

formas

naturais

reduzidas/hidrogenadas dos iso-- frente o radical 1-hidroxietila foi efetuado com o


intuito de verificar o grau de degradao destes compostos perante as reaes
radicalares, bem como verificar o mecanismo e stio de reao envolvido na
processo.




RESULTADOS E DISCUSSO


Conforme j mencionado, o radical 1-hidroxietila pode reagir com o oxignio


dissolvido (O2); por conseguinte, no teramos uma cintica de competio do
radical entre apenas dois compostos, que no caso consiste no 4-POBN e as
isohumulonas. Portanto, as reaes foram conduzidas sob atmosfera inerte de
argnio, suprimindo o oxignio no meio reacional e eliminando desta forma
quaisquer reaes paralelas decorrentes deste.
Assim, atravs da cintica de competio, obteve-se as constantes de
velocidades aparentes da reao. Neste contexto, a Tabela 3 apresenta as
constantes de velocidade aparentes obtidas da reao do radical 1-hidroxietila
envolvendo os diastereoismeros cis- e trans-isohumulonas, bem como as misturas
cis- e trans-dihidro-isohumulonas, e cis- e trans-tetrahidro-isohumulonas, todos em
sua forma aninica.

Tabela 3. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical 1-hidroxietila e os


iso--cidos e seus derivados, em sua forma aninica, determinadas por EPR e ESI-(+)-MS/MS, em 1
minuto de amostragem.

EPR
(L mol-1 s-1)

ESI-(+)-MS/MS
(L mol-1 s-1)

trans-isohumulonas

9,7 109

8,6 109

cis-isohumulonas

1,8 108

1,7 108

isohumulonas
(cis- e trans-)

1,3 109

1,2 109

dihidro-isohumulonas
(cis- e trans-)

1,5 109

1,4 109

tetrahidro-isohumulonas
(cis- e trans-)

reao no observada

Conforme pode ser observado, as trans-isohumulonas apresentaram maior


reatividade perante o radical 1-hidroxietila que os demais compostos apresentados,
sendo as constantes de velocidade aparentes destas 50 vezes maior que as



RESULTADOS E DISCUSSO


apresentadas pelos diastereoismeros cis-. Considerando os percentuais de


iso--cidos presentes no extrato de lpulo utilizado, bem como as constantes de
velocidade aparentes obtidas para cada diastereoismero cis- e trans-iso--cidos,
pode-se inferir matematicamente a constante de velocidade aparente (kobs)
verificada para a reao decorrente da mistura destes compostos, mantendo a
mesma razo cis-/trans- presente no extrato de lpulo isomerizado.

kobs =

(ktrans- * %trans-) + (kcis- * %cis-)

Assim, pela Equao 2 e sabendo os teores (%) de diastereismeros cis- e


trans- presentes no extrato de lpulo, 70% e 30% respectivamente, o valor de kobs
calculado foi aproximadamente 1,4 109 L mol-1 s-1. Este valor est de acordo com as
constantes de velocidade aparentes verificadas na reao entre o radical e as
isohumulonas, formas cis- e trans-, advindas no extrato de lpulo.
Em adio, foi efetuado um estudo com respeito reatividade dos derivados
reduzidos e hidrogenados dos iso--cidos frente o radical 1-hidroxietila. Neste
contexto, da cintica de competio, verificou-se que as constantes de velocidades
aparentes determinadas na reao entre as dihidro-isohumulonas, contendo a
mistura distereisomrica, e o radical 1-hidroxietila foram estatisticamente iguais
(p = 0,05) s constantes obtidas utilizando a mistura cis- e trans-isohumulonas. No
entanto, as tetrahidro-isohumulonas, contendo mistura cis- e trans-, no se
mostraram reativas frente o radical 1-hidroxietila. Isto um indcio de que o stio
reacional envolvido na reao apresenta uma dependncia com as insaturaes
presentes nas cadeias laterais em C5 e C4 referentes aos grupos prenila e
isoxehenoila, uma vez que os derivados hidrogenados dos iso--cidos possuem
suas cadeias laterais saturadas.



RESULTADOS E DISCUSSO


Paralelamente, a reatividade das fraes 2 isoladas do sistema HPLC semipreparativo contendo os diastereoismeros, cis- e trans-iso--cidos, foi investigada
frente

radical

1-hidroxietila

utilizando-se

espectrmetro

de

massas

(ESI-(+)-MS/MS). Conforme mencionado no texto, estas fraes continham as iso-nhumulonas em considervel grau de pureza (95% para cis-iso--cidos e 85% para
trans-iso--cidos). Entretanto, no se testou a reatividade da frao 1 de cada
configurao devido ao fato destas apresentarem elevado grau de impurezas. Ainda,
interessante salientar que as iso-n-humulonas contidas nas fraes 2 esto
presentes em sua forma molecular, uma vez que os solventes de eluio utilizados
estavam acidificados com cido frmico (1 %), conforme pode ser constatado no
procedimento experimental.
Desta forma, de acordo com a Tabela 4, verifica-se que, de fato, as
constantes de velocidade aparentes obtidas utilizando os iso--cidos protonados
so estatisticamente iguais (p = 0,05) s constantes de velocidade aparentes
verificadas para estes compostos em sua forma desprotonada. Sendo assim, podese inferir que o mecanismo da reao em questo independe dos grupos
substituintes R (isobutila, isopropila, sec-butila).

Tabela 4. Constantes de velocidade aparentes da reao entre o radical 1-hidroxietila e as


iso-n-humulonas, em sua forma molecular, determinadas ESI-(+)-MS/MS, em 1 minuto de
amostragem.

ESI-(+)-MS/MS(L mol-1 s-1)


trans-iso-n-humulonas

8,7 109

cis-iso-n-humulonas

1,6 108




RESULTADOS E DISCUSSO


As constantes de velocidade obtidas da reao entre as isohumulonas e o


radical 1-hidroxietla esto prximas ao limite da difuso em meio aquoso, no qual as
constantes de velocidade so da ordem de 1010 L mol-1 s-1, sendo o encontro das
espcies em soluo suficiente para que a reao se processe. Portanto, os dados
demonstram a alta reatividade destes compostos frente ao radical estudado.
Para um maior entendimento do mecanismo envolvido neste tipo de reao,
principalmente no que se refere diferena de reatividade verificada entre os
diastereismeros com o radical de interesse, efetuou-se clculos qunticos ab initio
com as estruturas qumicas dos iso--cidos com o intuito de determinar as
propriedades eletrnicas dos compostos. Desta forma, os dados obtidos encontramse na Tabela 5.

Tabela 5. Propriedades eletrnicas dos diastereismeros cis- e trans-iso--cidos, em sua forma


molecular, calculadas usando o mtodo M06/6-31+G(d).

cis-

trans-

Momento Dipolo (Debye)

2,2

2,4

Energia do orbital HOMO (EHOMO)


(u.a.)

-0,2453

-0,2394

Entalpia de Dissociao da Ligao


C-HCa (BDE) (kcal mol-1)

75,1

75,5

Entalpia de Dissociao da Ligao


C-HCb (BDE) (kcal mol-)

77,6

75,5

Neste contexto, atravs da leitura da Tabela 5, verifica-se que as transisohumulonas apresentam um maior dipolo eltrico que os diastereoismeros cis-,
sugerindo uma maior influncia do solvente nas reaes envolvendo as espcies
trans-. A Figura 37 apresenta as configuraes espaciais mais estveis para as
molculas dos iso--cidos, bem como uma representao vetorial dos momentos
de dipolo eltrico verificados.



RESULTADOS E DISCUSSO


(a)

(b)

Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e trans-isohumulonas (b), com os
respectivos momentos de dipolo eltrico.

Ainda,

constatou-se

que

conformao

cis-

mais

estvel

termodinamicamente que a forma trans-, pois a diferena entre as energias totais


verificadas para as molculas de cis- e trans-iso--cidos foi 3,8 kcal mol-1.
Todavia, pela anlise dos orbitais de fronteira, verificou-se que as energias
dos orbitais moleculares HOMO (orbital molecular ocupado de maior energia) das
espcies cis- e trans- apresentam valores prximos, no justificando, desta forma, a
diferena na reatividade destes compostos frente ao radical. O grfico do contorno
dos

orbitais

moleculares

HOMO

para

as

estruturas

otimizadas

dos

diastereoismeros esto ilustrados na Figura 38. Aqui, verifica-se uma contribuio


dos mesmos tomos para o orbital HOMO das cis- e trans-isohumulonas, estando
estes localizados no cromforo -tricarbonlico e principalmente sobre a cadeia
lateral conectada ao carbono C5, referente ao grupo prenila.




RESULTADOS E DISCUSSO


(a)

(b)

Figura 38. Ilustrao dos orbitais moleculares ocupados de maior energia (HOMO) calculados para
os diastereoismeros cis- (a) e trans-isohumulonas (b).

Em estudo recente42, constatou-se que reaes de oxidao de alguns metil


steres derivados de cidos graxos insaturados, tais como metil oleato, metil
linoleato e metil linolenato (Eox ~ 2,0 V vs. NHE), ocorrem preferencialmente via
transferncia de tomo de hidrognio (BDE = 328,9, 291,5, 290,5, respectivamente)
em detrimento ao processo de transferncia de eltron. Este fato pode ser estendido
reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila ao eliminar a possibilidade de
oxidao do grupo prenila por transferncia de eltron.
Ainda, sabe-se que a oxidao do cromforo -tricarbonlico dos iso--cidos
pelo radical por transferncia de eltron termodinamicamente inviabilizada. De
fato, analisando os potenciais dos compostos envolvidos, verifica-se que o potencial
de reduo do radical (E= + 0,98 V vs. NHE)43 significativamente menor que o
potencial de oxidao dos compostos envolvidos, considerando tanto a forma
molecular (1,8 V vs. NHE) quanto a forma aninica (1,4 V vs. NHE). Logo, a partir
destes dados, verifica-se a no dependncia estereoqumica do potencial de
oxidao na reao em questo, sendo esta governada pelo processo de oxidao
via transferncia de tomo de hidrognio allico.



RESULTADOS E DISCUSSO


No entanto, pela leitura das entalpias de dissociao das ligaes C-H


referentes aos grupos prenila e isohexenoila, Ca e Cb, Figura 39, constata-se que
este parmetro no justifica a diferena na reatividade apresentada pelas
isohumulonas. Conforme nota-se na Tabela 5, estes dados no diferem
significativamente, sendo um forte indcio de que a abstrao do tomo de
hidrognio ocorra tanto na cadeia lateral do carbono C4 referente ao grupo
isohexenoila, quanto na cadeia lateral do carbono C5, grupo prenila.

%'(

 &E

%'(

 &E

2
2+

2+

2+

&D %'( 

2+

&D %'( 

(a)

(b)

Figura 39. Representao das ligaes C-H envolvidas na abstrao do tomo de hidrognio na
reao. (a) trans-isohumulonas; (b) cis-isohumulonas.

Portanto, possvel inferir que a reao dos iso--cidos com o radical


1-hidroxietila ocorre preferencialmente via abstrao de tomo de hidrognio allico
tanto nas molculas das cis-isohumulonas, quanto nas molculas das espcies
trans-. Ainda, diante deste conjunto de dados, constata-se que o aumento da
reatividade decorrente de um fator entrpico, j que a reao com a espcie transisohumulonas

ocorre

no

mesmo

plano

espacial

enquanto

que

para

os

distereoismeros cis- os grupos encontram-se em diferentes planos.




RESULTADOS E DISCUSSO


4.4.3.2. Reatividade de alguns fenis frente ao radical 1-hidroxietila.

Determinou-se tambm a constante de velocidade aparente da reao entre o


radical 1-hidroxietila e a quercetina por ESI-(+)-MS/MS para fins de validao do
mtodo ao comparar a constante obtida com a constante reportada na literatura31.
Neste caso, as mesmas condies experimentais foram mantidas, exceto pelo fato
de que as medidas foram realizadas em soluo alcolica (90%) devido baixa
solubilidade da quercetina em meio aquoso. Assim, a constante de velocidade
aparente obtida foi 3,1 104 L mol-1 s-1, sendo a constante de velocidade especfica da
reao em questo igual a 4,0 104 L mol-1 s-1, segundo determinado por radilise de
pulso por Marfak e Trouillas30. De fato, apesar da constante de velocidade obtida
pela cintica de competio aparentar ser diferente da constante de velocidade
especfica, esta diferena no significativa, uma vez que a constante aqui
determinada apresenta um erro relativamente grande. Assim, a constante de
velocidade especifica est contida na faixa abordada pela constante de velocidade
aparente. Portanto, a nova metodologia desenvolvida (ESI-(+)-MS/MS) est validada
para este fim.
Logo, uma vez validada a determinao das constantes de velocidade
aparentes da reao do radical 1-hidroxietila com os compostos em estudo
utilizando o detector espectrmetro de massas (ESI-(+)-MS/MS), a reatividade do
radical perante os cidos p-cumrico, cafeico e clorognico foi determinada com o
intuito de avaliar o grau de competio destes compostos fenlicos comparada aos
iso--cidos na captao do radical 1-hidroxietila. Para tanto, seguiu-se a mesma
metodologia utilizada nas reaes em que as isohumulonas foram empregadas.




RESULTADOS E DISCUSSO


Assim, da cintica de competio, obteve-se uma constante de velocidade


aparente da reao do cido p-cumrio frente o radical igual a 1,0 107 L mol-1 s-1.
Entretanto, para o cido cafeico e clorognico um comportamento distinto foi
verificado. Neste caso, pela anlise das reas do on 240 m/z isolado (aduto radical),
Figura 40, inerente s reaes, verifica-se que as reas dos picos 2 e 3, referentes
as reaes processadas na presena dos cidos clorognico e cafeico,
respectivamente, mostraram-se maior que a rea do pico 1, o qual remete reao
do 4-POBN com o radical 1-hidroxietila.
Intens.
x10 5

21

1
1

0
0

10

Time [min]

Figura 40. Espectro de on isolado 240,1 m/z decorrente da reao do radical 1-hidroxietila e 4-POBN
(pico 1), na presena de cido clorognico (pico 2) ou cido cafeico (pico 3). As injees foram
realizadas em batelada.

Estas ltimas reaes foram analisadas tambm por RPE. Analogamente,


notrio o acrscimo das reas referentes deteco do aduto radical
[4-POBN/CH(CH3)OH] nas reaes conferidas na presena dos cidos clorognico
e cafeico, Figura 41. Consequentemente, estes dados corroboraram com os
resultados observados por ESI-(+)-MS/MS.




RESULTADOS E DISCUSSO


Figura 41. Espectros de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) registrados em banda-X

(9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] decorrente da reao controle (em preto), reao
processada na presena cido clorognico (em vermelho) e reao processada na presena do cido
o
cafeico (em azul). Os espectros foram obtidos a temperatura de 25 C.

De fato, aqui no se verifica uma cintica de competio propriamente dita,


uma vez que os cidos envolvidos no reagem exclusivamente com o radical.
Todavia, segundo Sakihama et. all.44 os cidos cafeico e clorognico reagem
facilmente com ons de Fe(III) (E = + 0,77 Vvs. NHE)45 reduzindo-o a espcie Fe(II).
Este feito suportado pelos baixos potencias de reduo dos cidos clorognico e
cafeico, 0,59 e 0,55 V vs. NHE46,47, respectivamente.
Em estudo recente foi demonstrado que polifenis contendo o grupo catecol
atuam no processo de oxidao do vinho48. Neste contexto, os fenis reduzem o
Fe(III) a espcie Fe(II), o qual reagem como o oxignio molecular para formar o
radical hidroperoxila (OOH; pKa ~ 4,7)49. No entanto, este radical rapidamente
extinto pelos fenis ao gerar perxido de hidrognio na bebida que, pela Reao de
Fenton, culmina na formao do radical hidroxila (OH). Portanto, estes compostos
fenlicos atuam como pr-oxidantes no sistema, acentuando a formao do radical




RESULTADOS E DISCUSSO


1-hidroxietila, conforme demonstrado no Esquema 8, e, consequentemente,


induzem a deteriorao da bebida.

Esquema 8. Esquema de reao propondo o efeito de polifenis contendo o grupo catecol na


48
oxidao do etanol no vinho e na cerveja. Adaptado de Elias e Andersen .

Ainda, de acordo com os dados, um maior efeito pr-oxidante foi conferido ao


cido cafeico, uma vez que as reas referentes deteco do aduto radical, por
ambas as tcnicas, foram significativamente maior para a reao contendo este
cido. Este conjunto de dados corrobora com o relatado na literatura44.

4.5. Identificao dos produtos de reao.

Os produtos da reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila foram


identificados por LC-ESI-MSn utilizando as trans-isohumulonas como substrato.
Desta forma, a Figura 42a apresenta o cromatograma resultante da mistura
reacional obtido aps 1 minuto de reao (em azul), bem como o perfil
cromatogrfico de ons total de uma soluo alcolica (etanol) contendo os
diastereoismeros trans- (em vermelho). Aqui, pode-se notar que, na mistura



RESULTADOS E DISCUSSO


reacional, as espcies trans- no foram completamente consumidas na reao,


sendo os picos 3, 4, 5 e 6 referentes as eluies dos anlogos das trans-humulonas,
em (tr) 26,1, 27,7, 29,6 e 31,9 minutos, respectivamente. Ainda, do cromatograma de
ons total respectivo mistura reacional, verificou-se a formao de dois novos picos
em (tr) 17,7 minutos, pico 1, e 21,5 minutos, pico 2. O primeiro pico apresentam o on
[M-H]- 363 m/z referente s molculas desprotonadas, Figura 42b, ao passo que o
on das molculas desprotonadas [M-H]- do segundo pico foi 377 m/z, Figura 42c.




RESULTADOS E DISCUSSO

Intens.
x10 7

Intens.
x106

1.5

1.50

1.25

Soluo alcolica de trans-isohumulonas


1 minuto de reao

1.00

(a)

0.75

0.50

0.25

1.0

17

18

19

20

21

22

T ime [min]

0.5

0.0
0

10

20

Intens.
x10 4

30

40

50

T im e [mi n]

-MS, 17.7-17.8min #(1197-1204), Background Subtracted

[M-H]

(b)

363.1
5


1

191.0

395.0

0
100

200

300

Intens.
x10 4
8

400

[M-H]

500

600

700

800

m/z

-MS, 21.3-21.5min #(1477-1495), Background Subtracted

377.1

(c)
-

[M-H-(H3C)2CHCO(H3C)2COHCHCHCO]-

279.0

0
100

200

300

400

500

600

700

800

m/z

Figura 42. (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo as trans-isohumulonas (em
vermelho) e dos produtos decorrentes da reao das trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila
0
(em azul),sob atmosfera de Ar, T = 25 C, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de massas (ESI(-)MS)
com atribuio do on do eluato em tr = 17,7 min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio
do on do eluato em tr = 21,5 min.

De fato, Intelmann et. all.17 e Haseleu et. all.18 apontaram recentemente


compostos presentes na cerveja decorrentes da degradao dos iso--cidos, cujas
massas moleculares so 364 e 378 g mol-1. Estes compostos so gerados a partir da
oxidao de ambos os diastereoisemeros cis- e trans- na ausncia de luz e
presena de traos de oxignio molecular e metais de transio, tais como Fe(II).



RESULTADOS E DISCUSSO


Ainda, conforme consta na literatura, os produtos de degradao em questo


apresentam a estrutura qumica dos iso--cidos contendo um grupo hidroxila na
cadeia lateral conectada ao carbono C4, grupo isohexenoila, recebendo a
denominao hidroxi-allo-isohumulonas.
Todavia,

pelos

espectros

de

massas

referentes

fragmentaes

secundrias dos ons das molculas desprotonadas apresentados, 363 e 377 m/z,
contidos no Apndice C, no foi possvel inferir a estrutura qumica exata dos
compostos. Neste contexto, admissvel tanto a cadeia lateral conectada ao
carbono C4 quanto a cadeia lateral em C5 apresentar o grupo hidroxila adicionado.
Conforme j exposto no texto, constatou-se pelos clculos das entalpias de
dissociao das ligaes C-HCa e C-HCb que ambos os tomos de hidrognios
pertencentes aos grupos isohexenoila e prenila so suscetveis a serem abstrados.
Logo, pode-se inferir que o on 363 m/z referente a dois compostos derivados das
isocohumulonas, os quais um contm um grupo hidroxila adicionado cadeia lateral
em C4 - isohexenoila, sendo o outro composto resultante da adio de um grupo
hidroxila cadeia lateral conectada ao carbono C5 - prenila. O mesmo feito foi
verificado para os compostos decorrentes da degradao dos homlogos iso-nhumulonas e isoadhumulonas, os quais apresentam o on das molculas
desprotonadas [M-H]- 377 m/z.

4.6. Mecanismo da reao.

O mecanismo da reao proposto, no presente trabalho, envolvendo os


iso--cidos e o radical 1-hidroxietila est contemplado no Esquema 9. Neste



RESULTADOS E DISCUSSO


contexto, a reao iniciada pela abstrao de um tomo de hidrognio contido no


grupo prenila ou e isohexenoila pertencentes s cadeias laterais das isohumulonas.
Esta abstrao se d pelo radical 1-hidroxietila, resultando em um radical tercirio
estabilizado por ressonncia.
Sabe-se que o nvel de oxignio residual dissolvido na cerveja (garrafa) gira
em torno de 0,1 mg L-1

14

, o qual responsvel por causar vrias reaes de

degradao da bebida durante a sua estocagem. Desta forma, o oxignio tripleto


reage com o radical tercirio supracitado gerando o radical peroxil, o qual
posteriormente abstrai um tomo de hidrognio de substratos passveis de sofrer
oxidao, tais como etanol ou iso--cidos, culminando na formao dos
hidroperxidos, chamados de hidroperoxi-alloisohumulonas. Ainda, a presena de
traos de ons metlicos tais como ferro (Fe(II)) conduz a clivagem dos grupos
hidroperxidos e, aps a abstrao de mais um tomo de hidrognio de substratos,
os hidrxidos so formados, sendo estes denominados hidroxi-alloisohumulonas.
Outro caminho reacional consiste na reao entre o radical hidroxila, gerado
constantemente na soluo, e o radical tercirio derivado das isohumulonas. Como
resultado, temos a formao direta dos hidrxidos identificados. Este mecanismo
suportado pelo fato da constante de velocidade da reao entre os radicais
supracitados ser prxima ao limite difusional.




RESULTADOS E DISCUSSO


Esquema 9. Mecanismo proposto para a reao entre as isohumulonas e o radical 1-hidroxietila.

Logo, verificou-se que os iso--cidos sofrem degradao via reao radical,


formando hidrxidos. Entretanto, estudos sobre estes compostos de degradao
ainda esto na fase inicial; consequentemente, no se sabe o efeito sensorial que
estes conferem a bebida.




CONCLUSES


5. CONCLUSES

Como um todo, os diastereoismeros trans- e cis-isohumulonas, bem como


as tetrahidro-isohumulonas e dihidro-isohumulonas foram obtidas de forma eficaz
constatada pela posterior caracterizao. A reatividade destes compostos frente o
radical 1-hidroxietila foi estudada atravs de uma abordagem cintica de competio
envolvendo a armadilha qumica 4-POBN, alm dos compostos supracitados. Assim,
analisando a reao entre o 4-POBN e o radical de interesse, verificou-se a
formao

de

quatro

produtos

decorrentes

da

reao:

aduto

radical

[4-POBN/CH(CH3)OH], [M+H]+ 240 m/z; aduto oxidado, [M+H]+ 239 m/z; e duas
espcies cujas estruturas so referente molcula do 4-POBN ligada a duas
molculas do radical 1-hidroetila, [M+H]+ 285 m/z. Ainda, constatou-se que as
espcies referentes aos ons 285 e 239 m/z esto provavelmente relacionadas s
reaes subsequentes envolvendo o aduto radical, a partir do consumo deste.
A partir das constantes de velocidade aparentes determinadas, referentes
reao entre o radical de 1-hidroxietila e os iso--cidos, naturais e sintticos,
verificou-se que as tcnicas espectroscopia de ressonncia paramagntica de
eltrons (RPE) e espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS) foram equivalentes
(p = 0,05) para esta finalidade. Neste contexto, constatou-se uma maior reatividade
por parte dos diastereoismeros trans- (~ 9,2 109 L mol-1 s-1), sendo as espcies cismenos reativas frente ao radical 1-hidroxietila (~ 1,8 108 L mol-1 s-1). Em suma,
verificou-se que a reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila ocorre
preferencialmente via abstrao de tomo de hidrognio allico pertencentes aos
grupos laterais prenila e isohexenoila, em ambos os diastereoismeros cis- e trans


CONCLUSES


iso--cidos. Ainda, diante deste conjunto de dados, constatou-se que o aumento de


reatividade da espcie trans- est provavelmente relacionada ao fator entrpico.
Anlogo

reatividade

apresentada

pelos

iso--cidos,

as

dihidro-

isohumulonas, formas cis- e trans-, apresentaram constantes de velocidade


aparentes (~ 1,5 109 L mol-1 s-1) estatisticamente (p = 0,05) iguais as verificadas para
a mistura diastereoisomrica de iso--cidos (~ 1,3 109 L mol-1 s-1), contendo a
mesma

proporo

cis-/trans-.

Todavia,

os

derivados

hidrogenados

das

isohumulonas, as tetrahidro-isohumulonas, no foram reativos frente o radical


estudado.
A constante de velocidade aparente da reao entre o cido p-cumrico e o
radical foi determinada por ESI-(+)-MS/MS (1,0 107 L mol-1 s-1). Assim, ao comparar
a reatividade do cido p-cumrico e outros compostos fenlicos presentes na
cerveja, j relatada da literatura30, frente o radical 1-hidroxietila com a reatividade do
mesmo radical com os iso--cidos, conclui-se que, apesar das substncias
fenlicas estarem presentes em concentrao mais elevadas, os cidos amargos
derivados do lpulo foram mais reativos perante o radical 1-hidroxietila, o que deixa
patente a degradao destes e a importncia destas reaes no processo de
envelhecimento da cerveja.
Ainda, os cidos cafeico e clorognico mostraram-se pr-oxidantes no
sistema, uma vez que estes induzem a formao do radical 1-hidroxietila e
acentuam a deteriorao da bebida.
Como produto da reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila, foram
identificados compostos contendo um grupo hidroxila ligado cadeia lateral
isohexenoila ou cadeia lateral prenila (hidroxi-allo-isohumulonas). Estes compostos
foram recentemente reportados na literatura17,18 e so decorrentes de reaes de



CONCLUSES


oxidao das isohumulonas seguindo um mecanismo governado por radicais, na


presena de traos de oxignio e ons de metais de transio tais como Fe(II).




REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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APNDICE


APNDICE A

Intens.
x10 5

+MS2(239.1), 7.9-7.9min #(330-332)

239 m/z

1.5

CID

183.0

1.0

165.0

0.5

221.0
0.0
100

200

300

400

500

m/z

Figura A1. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 7,9 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31a.
Intens.
x10 4

+MS2(240.1), 8.6-8.7min #(362-365)

240 m/z
CID

179.0

153.0

96.0

138.0

196.0

0
100

200

300

400

500

m/z

Figura A2. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 8,6 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31b.
Intens.
x10 4

+MS2(285.1), 9.3-9.4min #(393-395)

1.2

285 m/z
179.0

1.0

CID

0.8

0.6

0.4
163.0
0.2
107.0
123.0

241.1

147.0

0.0
100

200

300

400

500

m/z

Figura A3. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 9,3 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31c.




APNDICE

Intens.
x10 5

+MS2(285.1), 13.0-13.0min #(549-551)

2.0

285 m/z
179.0

CID

1.5

1.0

241.1
163.1

0.5

107.0123.0

147.0

0.0
100

200

300

400

500

m/z

Figura A4. Espectro de massas por CID dos ons do eluato em tr = 13,0 min do cromatograma
ilustrado na Figura 31d.




APNDICE


APNDICE B

Primeiramente, assume-se que os processos cinticos das reaes abaixo


(1 e 2) so majoritrios durante a captao do radical 1-hidroxietila.

Pode-se assumir as seguintes equaes para o consumo do radical


1-hidroxietila:


d[H3CHCOH]
= k2 * [4-POBN] * [H3CHCOH]
dt

d[H3CHCOH]
dt

= k2 * [IAA] * [H3CHCOH]

(3)

(4)

Quando a captao do radical pelos iso--cidos (IAA) igual a 50% tem-se


que as taxas de consumo do radical 1-hidroxietila (3) e (4) se igualam. Logo, a
equao abaixo pode ser escrita, a qual expresso a relao entre as constantes de
velocidade das duas reaes envolvidas (k2 e k2).
k2 * [4-POBN] = k2 * [IAA]




APNDICE


Esta equao pode ser generalizada para qualquer percentual de captao do


radical:
F
1-F

* k2 * [4-POBN] = k2 * [IAA]

Assim, a porcentagem de captao do radical (F) obtida atravs do


experimento de controle, o qual apresenta um sinal analtico referente do aduto
radical [4-POBN/CH(CH3)OH], e de experimentos variando a concentrao de
iso--cidos, no qual verifica-se uma reduo do sinal analtico referente ao aduto
radical.




APNDICE


APNDICE C

Intens.

-MS2(363.1), 17.8-17.9min #(718-724)

363 m/z
6000

CID

293.0
275.0

345.0

4000

179.0
205.9
2000

231.0

317.0

0
100

200

300

400

500

600

700

800

m/z

Figura C1. Espectro de massas por CID do on 363 m/z referente ao eluato em tr = 17,8 min do
cromatograma ilustrado na Figura 42a.


Intens.
x10 4

-MS2(377.1), 21.4-21.6min #(865-873)

3.0

377 m/z
2.5

CID

293.0

2.0

1.5

275.0

1.0

0.5
179.0

206.0

359.0

231.1

0.0
100

200

300

400

500

600

700

800

m/z

Figura C1. Espectro de massas por CID do on 377 m/z referente ao eluato em tr = 21,5 min do
cromatograma ilustrado na Figura 42b.




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