UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

UNIDADE ACADMICA DE ENGENHARIA QUMICA

DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA
DOCENTE: LBIA CONRADO

Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de

Neubauer espelhada e Determinao de Acares Redutores (Mtodo
do DNS) e Protenas(Mtodo de Bradford) do Bagao do Caju e do
Extrato Enzimtico do Bagao do Caju, Respectivamente.

Alunas
Deborah Almeida dos Anjos
Mrcia Cristina de Sousa

Campina Grande-Pb, 30 de novembro de 2011

Matrculas
20911697
20911051

SUMRIO

1. OBJETIVO........................................................................................ 3
2. INTRODUO................................................................................. 4
2.1-DETERMINAO DE AR DO BAGAO DE CAJU....................4
2.2-DETERMINAO DO TEOR DE PROTENA DE UM EXTRATO
ENZIMTICO PELO MTODO DE BRADFORD...............................5
2.3-CONTAGEM DO FUNGO FILAMENTOSO TRICHODERMA SP
UTILIZANDO CMARA DE NEUBAUER ESPELHADA...................6
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL............................................7
3.1 MATERIAIS........................................................................................7
3.2 METODOLOGIA................................................................................8
4. RESULTADOS..................................................................................9
5. DISCUSSO DOS RESULTADOS................................................12
6. CONCLUSO...................................................................................13
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.................................................13
8. ANEXOS............................................................................................14

2
1. OBJETIVO

O referente experimento teve como objetivo a determinao de acares redutores

do bagao do caju e a dosagem de protenas utilizando-se o mtodo de Bradford do
extrato enzimtico do bagao do caju provindo de um processo de fermentao semislida. Alm destes, a contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando-se
cmara de Neubauer espelhada, tambm foi uma finalidade desta prtica.

3
2. INTRODUO

Os experimentos realizados tiveram por base anlises microbiolgicas, as quais

determinam a eficincia dos microrganismos a partir de tcnicas laboratoriais. Tais
microrganismos podem ser as bactrias, alguns fungos (leveduras e bolores), os
protozorios, as algas microscpicas e os vrus.
As tcnicas trabalhadas no dia 26/11/2011 s 14:00 foram:
2.1-Determinao de AR do bagao de caju;
2.2-Determinao do teor de protena de um extrato enzimtico pelo mtodo de
Bradford;
2.3-Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de Neubauer
espelhada;
2.1 Determinao de AR do bagao de caju

A determinao de acares redutores (AR) do bagao de caju encontrada pela

equao (1).

(1)
Onde,
AR = concentrao de acares redutores;
Absorbncia= leitura feita no espectrofotmetro;
Fc= fator da curva de glicose para AR;
VA= volume da amostra;
mA= massa da amostra;
A partir da adio do reagente DNS a amostra, teremos o incio da reao a qual
ser acelerada pelo aquecimento da mistura em banho maria a 100C. Aps um tempo
de 5min a reao concluda e a mistura colocada em banho gelado para que aquela
seja cessada. Depois da ocorrncia da reao, observa-se que a cor da mistura (amostra
+ DNS) torna-se mais escura o que significa que h presena de acar, assim, quanto
mais escura estiver a mistura maior ser a concentrao de acar. Esta concentrao
obtida atravs da leitura realizada em espectrofotmetro que fornece a absorbncia a
partir da medio e comparao da quantidade de luz (energia radiante) absorvida pela
soluo. Se a amostra tiver muito acar necessrio fazer uma diluio para tornar
possvel a leitura da absorbncia.
4
2.2 Determinao do teor de protena de um extrato enzimtico pelo mtodo de
Bradford

A concentrao de protenas pode ser obtida por meio de diversos mtodos tais
como:
Kjeldahl:
Determina a concentrao de nitrognio na amostra e a partir desta a de
protenas;
Biureto:
Se baseia na reao do reativo do biureto, que constitudo de uma mistura de
cobre e hidrxido de sdio. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando
um complexo quadrado planar com a ligao peptdica.
Lowry:
Baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico,
(reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com protenas, na
presena do catalisador cobre (II), e produz um composto com absoro mxima em
750 nm.
Bradford:
baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas
que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a
interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o
deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente
em 595 nm.
Smith ou BCA:
Se baseia na reao de cobre (II) com protenas, em meio alcalino, produzindo
cobre ( I ) e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na regio de
560 nm.
Nesta prtica, a determinao da concentrao de protenas foi realizada
utilizando-se o mtodo de Bradford para o qual a equao (2) vlida.
(2)
Onde,
C = concentrao de protenas;
Abs = leitura feita no espectrofotmetro;
F = fator da curva para o reagente de Bradford;
5
d= obtido atravs da anlise da fermentao mais extrao ;

2.3 Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de Neubauer

espelhada

A Cmara de Neubauer utilizada para a contagem de esporos. Esta feita

apenas em cinco regies principais da Cmara. Dessas regies tirada a mdia dos
esporos contados e esta ser aplicada na equao (3).
25 104 F d
C esporos = E

(3)

Onde,
Cesporos= concentrao de esporos;

E
= mdia dos esporos contados na Cmara de Neubauer;
Fd= fator de diluio;
Nesta prtica, na qual se objetiva a contagem do fungo filamentoso Trichoderma
sp, os fungos esto sob a forma de esporos utilizando-se o sabugo de milho como meio
de cultivo. Para que haja o desprendimento dos esporos necessrio adicionar uma
soluo de Tween e aps realizada uma filtrao. Se necessrio, faz-se uma diluio
para que seja possvel a visualizao dos esporos atravs do microscpio utilizando-se
uma lente de 20.

FIGURA 1-Cmara de Neubauer.

6
3. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.1 Materiais
Vidrarias e Outros

Becker;
Erlenmeyer;
Estantes;
Gases;
Gelo;
Papel Alumnio;
Papel de Filtro;
Papel Manteiga;
Pipetadores;
Pipetas de 1, 5 e 10 ml;
Proveta de 50 ml;
Recipiente para aquecimento dos tubos de ensaio;
Tubos de Ensaio;

Aparelhos

Autoclave;
Balana Analtica;
Espectrofotmetro (Marca: Bel photonics; Leitura Mxima: 2000UV);
Aparelho para aquecimento da amostra ( neste experimento utilizou-se
um fogo);
Vrtex (Marca: Biomixer; Modelo: QL-901);

Reagentes e Solues

gua Destilada;
Cromassie Blue G-250 (reagente de Bradford);
DNS para AR;
Meio de cultivo para o crescimento dos esporos do fungo filamentoso
Trichoderma sp;
Soluo de Tween;

7
3.2 Metodologia
Determinao de Acares Redutores pelo Mtodo do DNS

Pesou-se 0,5g do bagao do caju em um Becker adicionando-se 200ml de gua

destilada. Deixou-se por 30min agitando-se sempre;
Aps o tempo de 30min filtrou-se a amostra, utilizando-se papel de filtro, em um
erlenmeyer ;
Adicionou-se 1ml do filtrado mais 1ml de DNS em tubo de ensaio colocando-se
em banho Maria a 100 oC por 5 min;
Aps os 5 min retirou-se os tubos colocando-os em banho gelado. Depois da
amostra ser resfriada colocou-se 8 ml de gua destilada nos tubos;
Agitou-se os tubos em Vrtex e em seguida realizou-se a leitura em
espectrofotmetro a 540nm e luz visvel;
Preparou-se uma amostra em branco para zerar o espectrofotmetro contendo
1ml de gua destilada e 1ml de DNS.

Determinao de Protenas pelo Mtodo de Bradford

Cobriu-se os tubos de ensaio com papel alumnio adicionando-se a este

0,5ml do extrato enzimtico do bagao de caju;
Adicionou-se 5ml do reagente de Bradford cobrindo-se os tubos com
pedaos de papel alumnio;
Deixou-se reagir por 10 min;
Leu-se em espectrofotmetro a 595nm e luz visvel;
O branco foi preparado com 0,5ml de gua destilada e 5ml do reagente de
Bradford;
Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de Neubauer
espelhada

Adicionou-se 40 mL de uma soluo de Tween 80 a 0,3% (v/v) nos frascos de

sabugo com esporos(terceiro repique);
Esterilizou-se dois beckers, uma proveta de 50ml, uma pipeta de 1ml e um funil
em autoclave;
Agitou-se o frasco contendo o sabugo e a soluo de tween e em seguida filtrouse com o auxilio de gases para um becker estril;
Em seguida tranferiu-se 1ml da suspenso de esporos para outro becker estril e
adicionou-se 39ml Tween 80 a 0,3% (v/v) (diluio da concentrao de esporos
para leitura);
Pegou-se essa soluo de microrganismos e colocou-se na Cmara de Neubauer
para ser feita a contagem dos esporos;
8
4. RESULTADOS

Determinao de Acares Redutores pelo Mtodo do DNS

Primeiramente feita uma mdia entre os valores das absorbncias obtidas para
os outros grupos e, a partir dela, determinada a concentrao de acares atravs da
equao (1).

(1)
Para a qual temos:
F = 1,6689;
VA = 200ml;
mA = 0,5g;

TABELA 1-Mdia entre as absorbncias lidas de cada grupo e a concentrao de acares redutores.

Grupo
Cyntia/Cristiane
Pedro/Edsio
Adriano/Hebert
Jaqueline/Ruan
Monasa/Danilo
Adriana/Deny
Mdia
AR(gAR/gA)

ABS
0,412
0,416
0,408
0,409
0,408
0,42
0,412
0,275

Aps, encontra-se a concentrao de acares redutores presentes somente na

amostra com a qual nosso grupo trabalhou, neste caso o grupo composto por
Deborah/Mrcia. Dessa forma, comparam-se os resultados obtidos atravs do clculo do
erro percentual.
TABELA 2-Valor da concentrao de acares redutores para a amostra do grupo Deborah/Mrcia e o
erro percentual em relao a concentrao determinada a partir da mdia das absorbncias obtidas para os
outros grupos.

Grupo
ABS
Deborah/Mrcia 0,406

AR(gAR/g
A)
0,271

Erro
(%)
1,45

9
Determinao de Protenas pelo Mtodo de Bradford
A concentrao de protenas obtida a partir da equao 2

(2)
Para a qual temos:
F = 0,2203;
D = esse valor desconsiderado para este caso;
Como para a determinao de acares redutores, ser feita a mdia entre os
valores de absorbncia obtidos para os outros grupos e a partir dela, ser determinada a
concentrao de protenas. Em seguida, determinada a concentrao para a
absorbncia obtida pelo nosso grupo ( Deborah/Mrcia ) e feita a comparao entre os
resultados.
TABELA 3-Mdia entre os valores de absorbncias dos outros grupos e concentrao de protenas a
partir dessa mdia.

Grupo
Cyntia/Cristiane
Pedro/Edsio
Adriano/Hebert
Jaqueline/Ruan
Monasa/Danilo
Adriana/Deny
Mdia
C(mg/m
l)

ABS
0,035
0,036
0,023
0,029
0,033
0,019
0,029
0,00638
87

TABELA 4-Valor da concentrao de protenas para a amostra do grupo Deborah/Mrcia e o erro

percentual em relao a concentrao determinada a partir da mdia das absorbncias obtidas para os
outros grupos.

Grupo
Deborah/Mrcia

C(mg/ml
ABS
)
0,047 0,010354

Erro
(%)
62,07

10
Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de Neubauer
espelhada

A concentrao de esporos na suspenso obtida atravs da equao ( 3 )

25 10 F d
C esporos = E
4

(3)

Para a qual temos:

Fd =40 ml ;
Abaixo est representada a quantidade de esporos em cada quadrado para o qual
foi realizada a contagem.
7

27
23

14

35

TABELA 5-Mdia entre a contagem dos esporos nos cinco quadrados principais da Cmara de Neubauer
e a concentrao de esporos na mesma.

Mdia

Espor
os
7
14
23
27
35
21,2
212x1
6

C(esporos/ml)

11
5. DISCUSSO DOS RESULTADOS

Para a primeira parte da prtica, ou seja, na determinao de acares redutores

o erro obtido em relao a mdia das leituras dos outros grupos foi muito pequeno,
mostrando que a leitura obtida para o nosso grupo bastante confivel.
A existncia de erro pode ser explicada pela medio irregular dos volumes da
amostra e do reagente DNS, na qual observou-se,para alguns grupos, a formao de
bolhas de ar e uma medida de volume maior ou menor que o requerido. Outro possvel
fator de erro est no tempo em que a mistura (amostra junto com o DNS) passou
exposta a luz antes de ser aquecida, pois o DNS bastante voltil motivo pelo qual o
frasco onde se coloca o reagente deve ser do tipo mbar e ainda ser coberto para evitar o
contato do mesmo com a luz.
Na segunda parte da prtica ( determinao da concentrao de protenas no
extrato enzimtico) observou-se uma concentrao de protenas muito pequena devido a
desconsiderao do D por este ser obtido atravs da anlise da fermentao mais
extrao que no foi realizada. O erro obtido nesta parte considervel, tambm devido
a m medio dos volumes da amostra e o contato, em vrios momentos, do reagente
Cromassie com a luz. Este contato provoca, assim como para o DNS, a volatilizao do
reagente interferindo, dessa forma, nos resultados.
A terceira parte da prtica est relacionada determinao da concentrao de
esporos da amostra de Trichoderma SP a qual feita a partir da contagem dos esporos
em cinco regies principais da Cmara de Neubauer. O resultado obtido mostra uma elevada
concentrao de esporos a qual seria no mnimo trabalhosa para se determinar atravs da
contagem em todos os quadrados da Cmara.

12
6. CONCLUSO

Ao final do experimento observa-se que algumas fontes de erro interferiram nos

resultados, principalmente na segunda parte para a qual se determinaria a concentrao
de protenas na amostra de extrato enzimtico do bagao do caju, resultando em um erro
considervel. Apesar destes, pode-se concluir que o objetivo da prtica foi alcanado
visto que foi possvel a contagem dos esporos atravs da Cmara de Neubauer e a
determinao das concentraes de acares redutores e protenas das amostras
utilizadas em cada procedimento.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA:

VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MTODOS EXISTENTES. Disponvel
em :< http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf> Acesso em: 30 de novembro de
2011.

EMPREGO DO BAGAO SECO DO PEDNCULO DO CAJU PARA POSTERIOR

UTILIZAO EM UM PROCESSO DE FERMENTAO SEMI-SLIDA. Revista
Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.9, n.2, p.137-142, 2007.
Disponvel em:< http://www.deag.ufcg.edu.br/rbpa/rev92/Art925.pdf> Acesso em: 30
de novembro de 2011.

OBTENO DE CURVAS PADRO PARA ACARESREDUTORES, ACARES

SOLVEIS TOTAIS,PROTENAS E AMINOCIDOS. Disponvel em: <
http://pt.scribd.com/doc/50299135/relatorio1-DNS-acucares> Acesso em: 30 de
novembro de 2011.

13
8. ANEXOS

Faz-se a mdia dos grupos dos dados da absorbncia;

Calcula-se separadamente a absorbncia para nossos dados e para os dados da
mdia dos outros grupos;
Calcula-se o erro percentual (%);

Na determinao de AR pelo mtodo DNS

Mdia dos grupos = (0,412+0,416+0,408+0,409+0,408+0,402)/6 0,412
Deborah/Mrcia = 0,406
Fc=1,6689;
VA= 200ml;
mA = 0,5g;
Equao 1

AR

0,412 * 1,6689 * 200

0,275 g AR / g A
0,5 * 1000

AR

Mdia dos grupos

0,406 * 1,6689 * 200
0,271g AR / g A
0,5 *1000

Deborah/Mrcia

ARterico ARreal
0,275 0,271
*100
* 100 1,45
ARreal
0,275

Erro%

Erro% = 1,45

Na determinao do teor de protena de um extrato enzimtico

pelo mtodo de Bradford.
Mdia dos grupos = (0,035+0,036+0,023+0,029+0,033+0,+0,019)/6 = 0,029
Deborah/Mrcia = 0,047
14
F = 0,2203

Equao 2

Mdia dos grupos C = 0,029*0,2203 = 0,0063887mg/ml

Deborah/Mrcia C = 0,047*0,2203= 0,0103541mg/ml

0,0063887 0,0103541
Cterico Creal
*100
* 100 62,07
Creal
0,0063887
Erro% =

Erro% = 62,07

Contagem do fungo filamentoso Trichoderma sp utilizando Cmara de Neubauer

espelhada
Contagem dos esporos: 7+14+23+27+35 = 106
Mdia = 106/5 = 21,2
E = 21,2
F = 40 ml

Equao 3

C = 21,2*25*10^4*40 = 212000000esporos/ml

15