INSTITUTO TECNOLOGICO METROPOLITANO

ELECTROFORESIS DE ADN GEL DE AGAROSA

INFORME DE LABORATORIO

SINDY PAOLA RAMIREZ CUESTA

/11/2014

DANIEL AGUDELO RIVERA

INFORME
5.1. QU DIFERENCIAS EXISTEN ENTRE UNA ELECTROFORESIS EN
GEL Y UNA CAPILAR? MENCIONE VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE
CADA UNA? UTILIDAD?
R/ diferencia de

electroforesis de capilar:

Es una poderosa tcnica para la separacin eficiente de pequeas y grandes

molculas
Tiempo rpido de anlisis
Utiliza pequeas cantidades de muestra
incluye una familia de tcnicas que involucran una gradiente diferencial o de
equilibrio, que estn basadas principalmente en los siguientes modos:

Electroforesis Capilar de Zona

Isotacoforesis Capilar
Enfoque Isolctrico Capilar
Electroforesis capilar en gel (CGE)

Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC)

VENTAJAS

electroforesis en capilar la eficacia y la velocidad de la separacin se pueden

mejorar mediante la optimizacin de diferentes factores como son la
temperatura, el voltaje aplicado, el medio de separacin, el disolvente en el
que se encuentra disuelta la muestra
Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales,en un
mbito capilar, que adems ofrece ms facilidad y velocidad que la
cromatografa lquida de alta performance
la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con
volmenes de muestra extraordinariamente pequeos (de 0,1 a 10 nL), en

contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volmenes

de muestra en el orden de los L, con una elevada resolucin y rapidez
DESVENTAJAS: Se obtienen tiempos de anlisis bajos y si

lo comparamos

con otras tcnicas como la cromatografa de gases y lquidos

Depende de la aplicacin o de la muestra.
Vulnerabilidad en el cambio de sus componentes.
UTILIDAD: La electroforesis de capilar es de gran utilidad en el

rea

biomdica, en el campo de las protenas, pptidos, ADN, anlisis de lquidos

de perfusin, monitoreo de drogas, marcadores genticos tumorales y
neurobioqumicos, drogasxenobiticas, de abuso, y pericias forenses. En el
rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos y
biotecnolgicos, quimioterpicos y de estructura quiral. En el rea de
alimentos, se le aplica al fraccionamiento y cuantificacin de aminocidos,
hidratos de carbono, cidos orgnicos, aditivos y contaminantes. En el rea
de control ambiental, permite la identificacin de contaminantes y sus
metabolitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos. Como todo
desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas acopladas
como la espectroscopia de masa, fluorescencia inducida por lser y otras
variantes permiten augurar un promisorio futuro.
DIFERENCIA DE ELECTROFORESIS DE UN GEL:
Es un proceso para separar cepas de ADN empujndolas a travs de un gel
colocado en una mesa que es calentada (y cubierta).Es un grupo de tcnicas
empleadas

por

los

cientficos

para

separar

molculas

basndose

en

propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico

La distancia se mide como la va ms corta entre los electrodos, no es
simplemente la longitud misma del gel.
Separar especies complejas de elevado peso molecular de inters biolgico y
bioqumico.Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana
o placa de un gel semislido y poroso que contiene un tampn acuoso en el
interior de sus poros. Esta ser la sustancia encargada de ofrecer resistencia

al

movimiento

uniforme.Mediante

de

las

esta

molculas,
tcnica

se

controlando
pueden

as

separar

su
varias

migracin
muestras

simultneamente
VENTAJAS

La porosidad del gel ocasiona que los fragmentos ms grandes se separen

primero mientras que los fragmentos ms pequeos continan a travs del
gel. la electroforesis en gel ha sido refinada a travs del uso de diferentes
tipos de gel. Comenzando con la sacarosa y luego con los geles de almidn,
la separacin de ADN mediante la electroforesis increment enormemente
con el uso moderno de los geles de agarosa y acrilamida.
DESVENTAJAS
Los geles pueden fundirse durante la electroforesis, el buffer puede agotarse,
y diferentes formas del material gentico puede tratarse cuando su forma no
es predecible.
UTILIDAD: LaElectroforesis en gel

se usa en

es la identificacin de

molculas ADN particulares por los patrones de banda que ellos producen en
la electroforesis en gel despus se der cortado con varias enzimas de
restriccin.

ADN

viral,

plasmdico

segmentos

particulares

de

ADN

cromosomal puede ser identificados por esta tcnica.Uso es la separacin y

purificacin de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los
cuales

pueden

ser

recuperados

del

gel

con

actividad

biolgica

completa.Usando esta tecnologa es posible separara e identificar las

protenas que difieren en por lo menos en un solo aminocido.
5.2) REALICE UN COMPARATIVO ENTRE LA ELECTROFORESIS Y LA
CROMATOGRAFA DE CAPA FINA A NIVEL DE LA METODOLOGA Y LA
UTILIDAD.
R/ A nivel metodolgico:

LA ELECTROFORESIS:es una tcnica para la separacin de molculas segn

la movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse
sobre la superficie hidratada de un soporte slido o bien a travs de una
matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis
libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en
distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa.
CROMATOGRAFIA: Es un Mtodo de anlisis que permite la separacin de
gases o lquidos de una mezcla por adsorcin selectiva, produciendo
manchas diferentemente coloreadas en el medio adsorbente; est basado en
la diferente velocidad con la que se mueve cada fluido a travs de una
sustancia porosa
A NIVEL DE UTILIDAD: LA ELECTROFORESIS: Se usa para el

DNA

recombinante y permite saber la carga que poseen los poli pptidos y

separar los diferentes poli pptidos resultantes de las variaciones del
experimento del DNA recombinante.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA: Se utiliza una capa de cromatografa
inmersa verticalmente en un eluyente a polar, la placa cromatografa consiste
en una fase estacionaria polar (comnmente se utiliza en silica gel) adherida
a una superficie solida con algn agente cementante.
5.3) CUAL ES EL TAMAO DEL DNA?
R/ el DNA tiene aproximadamente 6.4 mil millones pares de bases en
eucariotas. el marcador molecular que utilizamos en la actividad de
electroforesis iba de 100 en 100 hasta 1000bp. Si comparamos el peso
molecular del DNA humano, con el marcador molecular, sera imposible poder
determinar el DNA humano, porque es este en grandsimo, por lo cual no es
probable que se logre observa una franja en el gel de agarosa de est.El ADN
est formado por dos cadenas muy largas de polinucletidos unidas entre s

por puentes de hidrgeno especficos entre las bases de las dos cadenas. Las
dos cadenas se encuentran arregladas en una estructura helicoidal alrededor
de un eje comn por lo que recibe el nombre de doble hlice. Las bases se
encuentran acomodadas hacia el eje de la doble hlice, mientras que el
azcar y los fosfatos se encuentran orientados hacia el exterior de la
molcula. Alrededor de la doble hlice se forman dos surcos de diferente
tamao, denominados "surco mayor" y "surco menor"
5.5) EN ESTA PRCTICA SE US COMO BUFFER ELECTROFORTICO
TBE 5X SOLUCIN MADRE Y TBE 0.5X COMO BUFFER DE TRABAJO,
REALICE LOS CLCULOS RESPECTIVOS SI SE QUISIERA TRABAJAR A
PARTIR DE UNA SOLUCIN MADRE TBE 10X Y LA RESPECTIVA
DILUCIN PARA UNA SOLUCIN DE TRABAJO TBE 1X.
R/Solucin madre TBE 10x y la respectiva dilucin para una solucin de
trabajo TBE 1x
C1=10X (CONCENTRACION SOLUCION MADRE)
V1=?
C2=1X (CONCENTRACION SOLUCION DE TRABAJO)
V2=50 ml
LUEGO
C1V1=C2V2
10X.V1=1X.50ml
V1= (1X50ml)

V1=5ml

10X
5.6. EXPLIQUE QU BENEFICIOS TRAE USAR BUFFER TRIS ACETATO
Y EDTA (TAE), TRIS-BORATO (TBE), O TRIS-FOSFATO (TPE) COMO

BUFFERS ELECTROFORTICOS Y CULES SON LAS DIFERENCIAS EN

UTILIDAD DE ESTOS BUFFERS.
R/ BUFFER TRIS ACETATO Y EDTA (TAE),
En la biologa molecular que se utiliza en la electroforesis de agarosa
tpicamente para la separacin de cidos nucleicos tales como ADN y ARN.
Tambin

se

puede

decir

comnmenteutilizadopara

la

que

el

electroforesisen

TAEes

gel

de

eltampnms

agarosade

ADN,

perotambin se utiliza parano desnaturalizanteARNelectrophoresis.1gel de

agarosade ADNde doble cadenatiende acorrer ms rpidoen TAEque enotros
tamponesperotambinpuede

llegar

seragotadodurante

la

electroforesisextendida. Tampn decirculacino tampnde reemplazodurante

la

electroforesisextendidapuedenremediar

taponamientocapacity.2La

dilucin

lainferiorde
de

latampn

TAEconcentradoproducetampn A1TAEcon40mM deTris-acetatoy EDTA1mM,

pH8,3. El1tampn TAEse utilizatantoen el gelde agarosay comotampn de
ejecucin.

Se

recomiendantensiones

cm(distanciaentre

los

aplicadasdemenos

electrodosdela

unidad)

para

de5V
obtener

/
la

mximaresolucin. Unasolucin de EDTA(cido etilendiaminotetraactico) se

preparaantes

de

tiempo.

EDTAnose

quedar

completamenteen

la

solucinhasta que el pHse ajusta a aproximadamente8,0.

TRIS-BORATO (TBE), O TRIS-FOSFATO (TPE): Listo para su usoen la
electroforesisen geldespus de la dilucinaconcentraciones de trabajo.
TBEtampn de ejecucines eltampnms comnmenteutilizadopara el ADNy
electroforesis

en

desnaturalizacin

gelde
o

la

utilizarutinariamentepara

poliacrilamidaARN.
desnaturalizacin(7
el

TBEse

utilizacon

los

Murea)geles.Tambin

ADNautomatizadogel

de

nose

secuenciacin.

TBEtambinse puede utilizar parageles de agarosa, pero no se recomienda

paragelespreparativospara
La

dilucin

dela

la

recuperacindecidosnucleicos.
poblacin

deTBEse

concentraa

un1TBEcorriendoresultadosde tampnenun tampn que contiene89mM de

Tris-borato y EDTA2mM, pH8,3. Los510oacciones tambinpueden ser
aadidos auna solucinde stockde acrilamida /bis-acrilamida para hacerelgel
dePAGE.Se

recomiendantensiones

cm(distanciaentre

los

aplicadasdemenos

electrodosdela

unidad)

para

de5V

obtener

la

mximaresolucin.
DIFERENCIA DE TAE Y TBE
TBEes eficazpara obtener una altaresolucinde los fragmentosde ADN ms
pequeos, ytampn TAEestil parafragmentos de ADNms grandes. En
elsistema decmara de mini (MupidTM-21). Eltampnconvencional, TAE, no
siempre esla mejor opcin parala electroforesis en gel. Teniendo en cuenta
eltamao

de

los

fragmentosdeADN,

una

condicinelectroforticaadecuadatiene que ser elegido, es decir, tampn

TAEes paralos ADNms grandes, yTBEparalos ADNms pequeos. Cualquiera
debuffer,TBEoTAE, es aplicable parael tamaomediode losfragmentos de
ADN. Lamovilidad relativavariar de acuerdo conel tamaode fragmentos de
ADN,

la

concentracin

deagarosa,

yla

composicin

deltampn

de

electroforesis.
5.7. EXPLIQUE POR QU ES NECESARIO USAR UN BUFFER DE CARGA
EN LA ELECTROFORESIS Y CUL ES LA FINALIDAD DE CADA UNO DE
SUS COMPONENTES.
R/

Los buffers de carga facilitan la visualizacin y sedimentacin del

producto de PCR o de cidos nucleicos en los pozos para lo cual emplean

distintos tipos de colorantes, cada uno de ellos exhibe un patrn de
migracin diferente.
Componentes
GLICEROL SUCROSA: es lo que le da peso a la muestra para que el ADN se
precipite al fondo de los pozos de siembra

COLORANTES azul de bromofenol xylene cyanol, etc. permiten identificar el

frente de corrido.
MARCADORES DE PESO MOLECULAR = se utilizan para tener una referencia
del tamao de los fragmentos por separar e identificar.

5.8. EN GENERAL PARA ENSAYOS ELECTROFORTICOS DE ADN, SE

USA BUFFER DE CARGA 6X CON LOS COMPONENTES DESCRITOS EN
LA TABLA 1, PERO DURANTE LA PRCTICA SE UTILIZ EL BUFFER DE
CARGA 5X GREEN GOTAQ-FLEXI BUFFER USADO PARA ENSAYOS DE
PCR, INDIQUE LOS COMPONENTES DE ESTE Y QUE IMPLICACIONES
TRAE EL REMPLAZO POR BUFFER DE CARGA 6X.
R/ Buffer de corrida TBE 5X 1000 ml
Tris 54 g
cido Brico 27.5 g
EDTA (0.5M; pH 8) 20 ml
Agua destilada llevar a 1000 ml
Componentes

Caracterstica

Utilidad
Incrementan la densidad

Sacarosa o Glicerol

Otorgan densidad

de

la

muestra

aseguran

que

baje

forma

en

el

y
ADN

pareja

dentro del pocillo.

Migra en una corrida Permite
evidenciar
Azul de bromofenol

electrofortica a

simple vista la

una velocidad similar a corrida electrofortica de

un ADN

los

helicoidal

sper Fragmentos

enrollada (300 pb

de

ADN

compactos.

Aprox.)
Migra en una corrida Permite
Xylen cyanol

electrofortica

evidenciar

una simple vista la

velocidad similar a un corrida electrofortica de

ADN doble de cadena los
lineal (4.000 pb aprox.)

Fragmentos

de

ADN

laxos.
1. cuando las soluciones concentradas se guardan por perodos prolongados
suelen observarse precipitados. Para evitar problemas, preservar la solucin
5X en botellas de vidrio a T ambiente y descartarla cuando se observen
precipitados. Originalmente el TBE se utilizaba al 1X para electroforesis de
geles de agarosa. Aunque una solucin al 0.5X provee suficiente poder de
buffer. TBE al 1X generalmente se utiliza para geles de poliacrilamida, pues
los reservorios para el buffer son pequeos y la cantidad de corriente es
considerable, por tanto se requiere un poder de buffer adecuado.
2. el buffer para electroforesis alcalina debe prepararse fresco.Los buffers
tienen tres propsitos:
a) Incrementan la densidad de la muestra,
b) Aseguran que el ADN caiga directamente dentro de la muesca del gel,
c) Otorgan color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo elctrico
migran hacia el nodo a tasas predecibles.
El azul de Bromofenol migra a travs de geles de agarosa aproximadamente
2.2 veces ms rpido que el xylencyanolff, independientemente de la
concentracin de la agarosa.

5.9 . Dibuje un gel con su respectivo marcador de peso molecular,

luego de que hiciera la digestin de una muestra con la enzima
EcoRI. El amplificado digerido tena una longitud de 738 pares de
base, con punto de corte en la posicin 100 y 200.
5.10
738pb
600pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb

5.10. CUL ES LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO DE LA ENZIMA

ECORI. CORTA UNA SOLA DE LAS CADENAS? CUL ES EL ENLACE QUE
DIGIERE?

QU

TIPO

DE

REACCIN

QUMICA

EFECTA?

QU

DIFERENCIA HAY ENTRE ENDONUCLEASA Y EXONUCLEASA?

R/ Secuencia de reconocimiento EcoRl
5 GAATTC
3 CTTAAG
La enzima EcoRl o enzima de restriccin corta las 2 cadenas de diferentes
formas
1. Forma escalonada: da lugar a la formacin de fragmentos de ADN cuyos
extremos

tienen

una

corta

regin

monocateriana

que

resultan

complementaria a las de los otros fragmentos ,produciendo entonces

segmentos independientes que se relacionan muy fcilmente ,por lo que
tales extremos reciben el nombre de extremos cohesivos o pegajosos.
2. Forma abrupta: es cuando corta la cadena en un solo punto.
Diferencias entre endonucleasa y exonucleasa:
Endonucleasa de restriccin son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos
rompiendo

enlaces

internucleotidos

del

interior

de

la

cadena,

las

endonucleasa de tipo 2 son las ms usadas en mtodos de DNA, mientras

que las exonucleasas son las que hidrolizan el ADN por su extremos, esto
corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple.
5.11.

CUL

ES

LA

UTILIDAD

DE

LA

TCNICA

RFLP

COMO

RELACIONA CON LA ELECTROFORESIS?

R/ La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares
de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genticas, en ciencia
forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar
la relacin gentica entre individuos.se relaciona con la

electroforesis

mediante huella gentica (tambin llamada prueba de ADN o anlisis de

ADN) es una tcnica que se utiliza para distinguir entre los individuos de una
misma especie utilizando muestras de su ADN.Esta tcnica es til porque
podemos utilizar esta caracterstica de la secuencia de ADN donde se une la
enzima de restriccin o no para observar las diferencias de otras personas,
es decir si tienen ese sitio o no, las diferencias producen el cambio de una
sola base entre dos personas podran resultar en la presencia o ausencia de
este sitio de corte, entonces si se asla este pedazo de ADN que rodea la
enzima cortada y en la otra no,

esto refleja un polimorfismo o diferencia

entre estas dos personas, podemos observar esto asilando el ADN cortndolo
con una enzima de restriccin bacteriana y corriendo con electroforesis en
gel.
5.12. A CUL GRUPO QUMICO PERTENECE LA AGAROSA Y CUL ES
EL ENLACE QUE PERMITE SU POLIMERIZACIN.
R/ La agarosa es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se
extrae de las algas de los gneros Gellidium y Gracillaria.
La estructura de un polmero de agarosa es la siguiente:

Se observa que un enlace covalente formado entre

dos monmeros me

forman un polmero de agarosa, este sera el enlace que permite la

polimerizacin de la agarosa.

5.13. ES PLAUSIBLE EL USO DE ESTE TIPO DE POLMEROS EN LA

ENTREGA CONTROLADA DE FRMACOS? EXPLIQUE SU RESPUESTA.
R/ S, porque la agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte
y no toxica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de
tcnicas de biologa molecular, bioqumica y biologa celular. Su uso ms
extendido es para construir geles que permitan separar molculas de ADN
mediante electroforesis, adems de ser utilizada para fijar molculas a su
estructura como anticuerpos, antgenos y enzimas. Igualmente se utiliza
para el cultivo celular y microbiologa. Otros usos menos extendidos son la
utilizacin de estos geles como matrices en la reparacin de tejidos daados.
5.14. CULES SON LAS DIFERENCIAS A NIVEL MOLECULAR ENTRE LA
POLIACRILAMIDA
DIFERENCIAS
MOLECULAR

QU
DEL

LA

AGAROSA?

RELACIN

TAMIZ

LA

CON

BASE

ENTRE

LA

RESOLUCIN

DE

HAY

EN

ESTAS

ESTRUCTURA
UN

CORRIDO

ELECTROFORTICO?
R/

LA Poliacrilamida: es un homopolmero de acrilamida, el gel es el

resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bis

acrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se
consiguen distintas porosidades siempre menores que la de los geles de
agarosa. La poliacrilamida no es txica, Sin embargo, la acrilamida que no ha
polimerizado, que es una neurotxica, puede estar presente en muy
pequeas cantidades en la acrilamida polimerizada, de ah que sea
recomendable su manipulacin con precaucin.

Son ms efectivos para separar fragmentos ms pequeos aumentando la

resolucin de corrido, por lo que se pueden separar molculas de ADN que
difieren en tan solo un par de nucletidos.

Los geles de poliacrilamida son ms complicados de preparar, pues se

necesita la polimerizacin de dos molculas diferentes (acrilamida y bis
acrilamida) y ms complejos de manipular pues presenta alta neurotoxicidad.

La Agarosa: es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se

extrae de las algas de los gneros Gellidium y Gracillaria. Su polimerizacin
se debe al enlace covalente formado entre dos monmeros que la
conforman.La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y
no txica.

Los geles de agarosa poseen menos poder de resolucin del corrido en

comparacin con la poliacrilamida, ya que son ms efectivos para separar
fragmentos ms grandes, por tener una malla o un tamiz ms abierto.

No presentan neurotoxicidad.
Relacin entre estructura molecular del tamiz y la resolucin de un corrido
electrofortico:La agarosa como maneja un tamiz muy grande se pueden
utilizar molculas muy grandes, debido a esto debemos esperar ms
cantidad de tiempo para el corrido (menos poder de resolucin de corrido);
en cambio la poliacrilamida como maneja un tamiz muy pequeo es ms
efectivo para separar fragmentos pequeos, y debido a esto no se va a
demorar mucho el corrido (aumenta la resolucin de corrido).

5.15.

QU

DIFERENCIA

METODOLGICA

HAY

ENTRE

LA

ELECTROFORESIS DE ADN Y DE PROTENAS?

R/La electroforesis es una carrera entre molculas, ya sea fragmentos de
ADN o protenas. Es una carrera de obstculos, ya que los fragmentos han de
atravesar un laberinto en forma de gel. En el caso del ADN la cosa es
sencilla, ya que el ADN es una molcula que en condiciones fisiolgicas est
cargada negativamente. As, en un campo elctrico lineal a pH fisiolgico,
cualquier molcula de ADN se mover hacia el polo positivo del campo,
mientras que para las protenas la cosa se complica un poco ms, ya que una
protena cualquiera puede estar formada por aminocidos cidos y bsicos en
nmero variable, habr protenas ms positivas y otras ms negativas
para un determinado pH. Entonces, en un campo elctrico lineal, puede
ocurrir que unas protenas vayan hacia el polo positivo, otras hacia el
negativo y otras no se muevan en absoluto (aquellas que al pH de la carrera
no estn cargadas, o lo que es lo mismo, estn en su punto isoelctrico).
Adems, las protenas tiene estructuras complejas: pueden ser globulares,
lineales, o estar formadas por varias cadenas.
5.16. CULES SON LOS PASOS DE UN WESTERNBLOT Y PARA QU
SIRVE?
R/ los pasos de Westernblot
PASO 1: Inmovilizacin de protenas sobre la membrana, generalmente
mediante electrotrasnferencia.
PASO 2: Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la
membrana no ocupados para evitar la unin no especifica de anticuerpos.
Bloqueo de la membrana.
PASO 3: Incubacin del blot con anticuerpos primarios contra la(s) protena
(s) de inters: La eleccin del anticuerpo primario para un Western Blot

depender del antgeno que se desee detectar y de los anticuerpos

disponibles para ese antgeno en concreto.
PASO 4: Incubacin del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos que
actan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros
marcadores: Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos
que reconocen la inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario)
PASO 5: Sistema de revelado de las bandas de protenas marcadas con el
complejo de anticuerpos.
La tcnica de Inmunotransferencia (Immunoblotting o Western Blot) es un
sistema rpido y muy sensible que sirve para le deteccin y caracterizacin
de protenas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre
antgeno y anticuerpo. Implica la separacin por electroforesis en geles de
poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana
de las protenas de una mezcla compleja (lisado total celular).
5.17. CULES SON LOS SISTEMAS DE MARCAJE UTILIZADOS PARA LA
DETECCIN DEL ANALITO EN EL WESTERNBLOT?
R/ nitzipperr es una tecnologa de bioconjugacin innovadora que permite el
marcaje directo de anticuerpos, protenas, pptidos u otras biomolculas
para su uso en diversas aplicaciones, el desarrollo de kits de diagnstico,
descubrimiento de nuevos medicamentos y cualquier otra aplicacin que te
puedas imaginar.
Anticuerpo unido a una enzima: mecanismo de deteccin simple y rpido
consiste

en

unir al

anticuerpo

secundario enzimas

que

catalicen

la

transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble, de esta

forma en el posterior anlisis quedar una mancha en donde est la protena
de inters.

 Marcaje

fluorescente:

emplea

anticuerpos

unidos

fluorocromos

del

infrarrojo cercano. Furanona o el rojo nilo. Estos compuestos emiten una

cantidad de luz constante cuando se excitan de manera constante permite
una deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta.
Deteccin con oro: esta tcnica es conocida como Golden blot, consiste en la
deteccin de los anticuerpos primarios con protena A unida a partculas de
oro. El resultado es una membrana con manchas rojas causadas por el oro
en donde est la protena.
5.18. CMO SE ASEGURA LA ESPECIFICIDAD DE LA DETECCIN EN EL
WESTERNBLOT?
R/ La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un
anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de
inters. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de
un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de
inters

En este ejemplo, el anticuerpo purificado est funcionalizado con el Linker U

de nitzipper y el marcador est funcionalizado con el Linker T, linkers
complementarios. El protocolo de un solo paso es tan rpido y fcil de usar,
que permite marcar los anticuerpos en menos de 30 segundos. El
investigador simplemente pipetea los anticuerpos funcionalizados con el
Linker U con el marcador de inters funcionalizado con el Linker T
complementario y se incuba unos 15 minutos .Obtienes finalmente tu
anticuerpo marcado listo para usar en tus tcnicas de western blot en menos
de 17 minutos y con una alta pureza (hasta ~ 100% de conjugado
anticuerpo-marcador sin necesidad de purificacin adicional).
5.19. QU DIFERENCIA HAY ENTRE WESTERNBLOT, SOUTHERNBLOT
Y NORTHERNBLOT?
R/ La diferencia entre ellos:

 Westernblot: Es una tcnica analtica muy utilizada para identificar una

protena en una mezcla de protenas complejas gracias a la especificidad de
la interaccin anticuerpo-antgeno.
Southernblot: Es una tcnica que permite la identificacin de secuencias
especficas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin
utilizando sondas especficas.
Northernblot: Es una tcnica

de

deteccin

de

molculas

de

cido

Ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja.

5.20. SI DESEARA DETECTAR UNA MOLCULA ESPECFICA DE ADN
DESPUS DE UN CORRIDO ELECTROFORTICO COMO LO HARA?
MENCIONES LOS PASOS QUE REALIZARA, EL TIPO DE MARCAJE Y LA
INTERPRETACIN DEL RESULTADO.
R/ La extraccin de cierta molcula de ADN se hara mediante Southern blot
PASOS:
Extraccin de ADN: se puede extraer de cualquier tejido humano.
Digestin del ADN: el ADN extrado de la muestra se trata con una
endonucleasa de restriccin, que es una enzima que corta el ADN bicatenario
en donde tenga una secuencia caracterstica.
Electroforesis en gel de agarosa: tras la digestin de ADN, los fragmentos de
ADN resultantes se separan segn su tamao mediante electroforesis en
geles de agarosa. Al avanzar las molculas de ADN su velocidad de migracin
se ve reducida por la matriz de gel de agarosa.
Preparacin de un ensayo Southern blot: las molculas de ADN separadas se
desnaturalizan

mientras

permanecen

en

el

gel

de

agarosa.

Tras

la

neutralizacin de esta, el DNA monocateriano resultante se transfiere a la

superficie de la membrana realizando una copia.
Hibridacin con sonda radioactiva: una sonda de locus nica es una molcula
pequea de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de

restriccin concreta en el ensayo de Southern blot. Las sondas de locus se

marcan con un istopo radioactivo para facilitar su deteccin
Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa: las posiciones de
hibridacin de la sonda radioactivasobre la membrana del ensayo de Suthern
blot se detectan mediante autorradiografa. En esta tcnica la membrana de
Nailon se coloca una vez lavada junto a una pelcula de rayos X dentro de
una caja aislante de luz. La pelcula registra las posiciones donde hay
desintegracin radioactiva.
Reensayar el resultado de Southern blot con sondas adicionales: en un
anlisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios
cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografa, se puede
lavar la radioactividad con una disolucin a elevada temperatura que deja el
ADN en su sitio e hibridarlo con una segunda radioactiva.

BIBLIOGRAFIA
http://agarosabiotecnologia.blogspot.com/p/electroforesis-origen-uso-yaplicacion.html
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdf
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/cel
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http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS
%20GELES%20PAA.pdf
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