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DETERMINACION CUANTITATIVA DE PROTEINAS

INTEGRANTES

CLAUDIA VANESA SOLARTE


CARLOS ALBERTO MARTINEZ
CHRISTIAN DAVID MUOZ MOSCOSO

PRESENTADO A
CLARA INES HURTADO SANCHEZ

UNIVERSIDAD DEL CAUCA


POPAYAN, CAUCA 15 DE ABRIL DE 2013
DETERMINACION CUANTITATIVA DE PROTEINAS

RESUMEN
Durante la prctica se realiz la prueba con el Reactivo de Lowry, con el fin de
determinar la concentracin de una protena (albmina bovina), presente en
las distintas muestras problemas. Despus de preparar el reactivo de Lowry se
procede a medir la absorbancia, (tambin la transmitancia porque sus valores
en el espectrofotmetro son ms exactos y posteriormente se hace una
conversin a absorbancia para as evitar un alto porcentaje de error) de cada
una de las muestras en el espectrofotmetro a una determinada longitud de
onda. Se grafica absorbancia vs. Concentracin encontrando la concentracin
para la muestra problema de: MP=0.0156 en g/ml.
DATOS
Tabla N1: datos obtenidos experimentalmente
Muestra

Absorbancia

Transmitancia

Concentracin
( g/ml)
0

Blanco
1

0.03
0.11

92
78

0.14

73

9.23103

0.21
0.30
0.38
0.42
0.253

62
51
42
38
56

0.0138
0.0185
0.0231
0.0277

3
4
5
6
Muestra Problema

CALCULOS Y RESULTADOS
Grafica N1: Absorbancia vs Concentracin

4.6110

Absorvancia vs concentracion
0.5
0.4

f(x) = 14.46x + 0.03


R = 0.99

0.3
Absorvancia

0.2

Absorvancia
Linear (Absorvancia)

0.1
0
0

0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03


Concentracion

Calculo de la concentracin de la muestra problema:


Absorbancia = 0.253 = Y

Concentracin = X

Y=mx + b
De la grafica tenemos que y = 14,459x + 0,0269 y reemplazando absorbancia
en la ecuacin obtenemos que la concentracin es:

X=

0.2530.0269
=0.0156
14.459

Valor terico de la muestra problema = 1.85*10^-2

Porcentaje de error

experimental
|valor teoricovalor
|100
valor teorico

|0.01850.0156
|100 =15.67
0.0185

DISCUSION DE RESULTADOS
Las protenas son los compuestos bioqumicos ms abundantes en los seres
vivos. Son verdaderamente especiales por ser las sustancias centrales en casi
todos los procesos biolgicos Presentan numerosas funciones. Por ejemplo, casi
todas las enzimas estn compuestas de estructuras proteicas. Las enzimas son
los catalizadores que permiten que ocurran casi todas las reacciones qumicas
en los seres vivos.

Las protenas pueden dar reacciones caractersticas con ciertos reactivos de


acuerdo a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este
tipo se caracterizan por la formacin de productos coloreados; Como es el caso
del mtodo de Lowry (mtodo espectrofotomtrico), uno de los ms sensibles
(1 200 g de protenas por ensayo) y precisos para la cuantificacin de
protenas con muestras diluidas que tiene como principio usar un reactivo de
folin en la que los grupos OH reducen los aminocidos tirosina y triptfano,
junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin dando una
coloracin azul caracterstica de esta prueba, siendo la intensidad de color de
la disolucin resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la
ley de Lambert-Beer (A= .l.c).
El mtodo de Lowry consta de dos etapas: en la primera, los iones Cu2+, en
medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de
nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un
color azul claro que se observo en la muestras. Adems, provocan el
desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose
los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la
reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo
con tartrato.
En la segunda etapa, el cobre acta como catalizador de la reduccin, tambin
en medio bsico, del reactivo de Folin, por parte de los grupos fenlicos de los
residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal
constituyente del reactivo de Folin es el cido fosfomolibdotngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los fenoles da lugar a un complejo de color
azul intenso.
Como se tiene que formar el complejo Protena-Cu2+ para que se lleve a cabo
la segunda fase, es importantsimo formar estos complejos, para favorecer la
formacin hay que agitar vigorosamente. Posteriormente reacciona este
complejo con el reactivo Folin, dando una coloracin azul, con un mximo de
absorcin a 650 nm. Esta coloracin se atribuye a la reduccin del cido
fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de heteropolimolibdeno, por medio de los
residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las
protenas que forman el complejo con el Cu2+.

LEY DE LAMBERT-BEER
La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin de luz a
travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia, as como tambin
entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos
Io y Is, la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la
cantidad de luz transmitida. Considrese un rayo de energa radiante con una
intensidad inicial Io que se hace pasar a travs de una celda de vidrio cuadrada
contiendo una solucin homognea de una sustancia que absorbe luz de cierta
longitud de onda. La intensidad de la energa radiante transmitida Is es menor
a la intensidad inicial Io. Debido precisamente a que la solucin fue capaz de
absorber cierta cantidad de energa radiante.

Mtodo UV
Las protenas muestran un fuerte grado de absorcin a 280nm en UV,
principalmente por los residuos de triptfano y la tirosina. Ya que las
concentraciones de estos aminocidos en las protenas son francamente
constantes se puede utilizar la absorbancia a 280nm para estimar la
concentracin de protenas.

En nuestra prctica utilizamos instrumentos como el espectrofotmetro que mide la


transmitancia o absorbancia de una muestra, en funcin de la longitud de onda de la radiacin
electromagntica. Para poder determinar la concentracin de protenas en la muestra problema se
requiere de una curva patrn o de calibrado que relaciona la concentracin de albmina bovina
presente en cada tubo con la Absorbancia determinada en el espectrofotmetro, donde un tubo con
agua, sirve de blanco para el ajuste del equipo a cero de absorbancia.
La magnitud de los diferentes valores de absorbancia obtenidos para las diferentes muestras
analizadas, dependen de su concentracin y de otros factores como: la distancia que recorre la
radiacin a travs de la solucin, la longitud de onda de la radiacin, la naturaleza de las especies
moleculares en solucin y la excitacin que sufren sus electrones.
La longitud de onda a la cual se trabajo fue de 750 nm, ya que el espectrofotmetro manual esta
diseado para la regin visible del espectro. El funcionamiento se puede representar
esquemticamente de la siguiente manera:

Una vez determinados los valores de absorbancia para cada concentracin de protena patrn para
los mtodos establecidos de Biuret y Lowry, el desarrollo de los mismos pasa por optimizar una
serie de parmetros, tales como, linealidad, sensibilidad, precisin, exactitud, rango, selectividad y
robustez, mediante el uso de herramientas estadsticas.
La linealidad es la capacidad del mtodo para producir resultados proporcionales, directamente o
mediante una transformacin matemtica, a la concentracin del analito en las muestras, dentro de
un determinado rango. Una curva de calibracin lineal que relacione la absorbancia con la
concentracin tiene la forma: Y= mx+b
Tericamente solo se requiere la medida de absorbancia de un patrn de concentracin conocida,
como calibrado para la cuantificacin. Sin embargo, en la prctica se pueden causar desviaciones
de la Ley de Beer en funcin de parmetros instrumentales y de la muestra, y que pueden resultar
en errores cuantitativos significativos si la curva de calibracin no est caracterizada con exactitud.

Para construir la curva de calibracin, las concentraciones de los patrones


deben de abarcar el rango de concentracin esperado de las muestras de
anlisis. Todos los valores patrn medidos deberan estar sobre una lnea recta,
pero en la prctica, los valores siempre presentan cierta dispersin, por lo
tanto se debe de aplicar un mtodo estadstico para encontrar el mejor ajuste

de los datos a la curva de calibracin. El mtodo estadstico ms frecuente es


la regresin lineal, conocido como el mtodo de mnimos cuadrados. Al hacer
ese tipo de ajuste obtenemos la ecuacin de una recta que nos permitir
calcular la concentracin de la muestra problema; es importante aclarar que la
dispersin de los datos nos da un valor de R = 0,9888 indicando as que los
datos obtenidos experimentalmente son aceptables para trabajar.
De la grfica N1 se obtuvo la ecuacin y = 14,459x + 0,0269, donde el eje
Y representa la absorbancia y el eje X la concentracin. Despejando el valor
de la concentracin y reemplazando la absorbancia de la muestra problema
encontrada en la Tabla N1, se determino su concentracin en (g/ml):
MP1=0.0156. La pendiente de la recta es la sensibilidad (respuesta obtenida
para una determinada cantidad de analito.) del mtodo de Lowry, y su valor
tambin corresponde a los coeficientes de absorcin de los complejos protenareactivo.
La concentracin hallada por este mtodo presenta un porcentaje de error del
15.67% con respecto al valor real lo cual indica que se realizo un trabajo
aceptable puesto que el valor de error es bajo. Aunque al ser este un mtodo
gravimtrico tendramos que haber esperado mejores resultados, las causas de
error radican en la toma de las mediciones exactas y dems errores
personales.
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Que es la curva de calibracin y como se grafica
La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para
medir la concentracin de una sustancia en una muestra por
comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se
basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter
medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques
de espectrofotometra) y la variable a determinar (la concentracin).
Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido
conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de
una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo
carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable
independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se
dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y,
empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la
muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito.

2. Determinar la concentracin de las muestras problema en funcin de la


curva de calibracin

0.0156 g/ml

CONCLUSIONES

La relacin entre la concentracin y la medida de absorbancia es


directamente proporcional, es decir que a mayor concentracin mayor
ser la absorbancia de la muestra.

La reaccin de Lowry es una de las pruebas mas utilizadas para la


cuantificacin de protenas por absorbancia, que permite trabajar con
mayor sensibilidad y muestras ms diluidas.

La espectrofotometra ultravioleta (UV) a 200 nm se basa en el principio


de que las soluciones de protenas muestranuna absorbancia intensa
entre 210 y 220 nm, lo cual refleja la presencia del enlace peptdico.

El mtodo de Lowry con el reactivo de Folin-Ciocalteau se utiliza mucho.


Este mtodo comporta dos reacciones: a) una reaccin inicial de la
protena y el cobre, relacionada con la reaccin del biuret; b) una
segunda reduccin de los cidos con el complejo de cobre-protena,
as como con tirosina y triptfano

BIBLIOGRAFIA
Guia de laboratorio de bioqumica general Universidad del Cauca
http://estudiarfarmacia.blogspot.com/2011/04/metodo-de-lowry.html 13/04/13
[PPT] cuantificacion de proteinas.ppt

13/04/13