UNIVERSIDAD TCNICA DE MANAB

FACULTAD DE CIENCIAS MATEMTICAS FSICAS Y QUMICAS

7mo DE INGENIERA QUMICA

FUNDAMENTO DE MICROBIOLOGA Y
LABORATORIO II
ING. VIRGINIA SNCHEZ
PROYECTO DE 2DO PARCIAL
TEMA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LA
BACTERIA ENTEROBACTER
INTEGRANTES

CEDEO MACAS CARLA

LVAREZ WILLIAM
SABANDO MOLINA CRISTINA
SALTOS GARCA FABIAN
SOLRZANO CHVEZ MARIELA
TOASA VIZUETE EDISSON

TEMA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LA BACTERIA
ENTEROBACTER

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Aislar la bacteria ENTEROBACTER en muestras especficas utilizando medios
de cultivos para identificar el gnero y especie, aplicando pruebas bioqumicas.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Reconocer las caractersticas de la bacteria Enterobacter para poder realizar las
prcticas respectivas.
Determinar la presencia de bacteria Enterobacter en las muestras escogidas.
Analizar las respectivas pruebas necesarias correctamente para obtener los
resultados requeridos.

INTRODUCCIN
En el presente trabajo investigativo consisti en la implementacin de pruebas
microbiolgicas para el anlisis, afirmacin y confirmacin de la presencia de la bacteria
Enterobacter en muestras una en alimento (queso) y la otra de agua residual.
Los sistemas ms importantes para la identificacin de microrganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en los laboratorios.
Enterobacter se nombra para el hbitat natural predominante de los organismos, los
intestinos de los animales (del griego enteron, que significa "delgado").
Enterobacter (gnero Enterobacter), cualquiera de un grupo de forma de varilla bacterias
de la familia Enterobacteriaceae.
Enterobacter son bacterias gram-negativas que se clasifican como anaerobios
facultativos, lo que significa que son capaces de prosperar en entornos tanto aerbicas y
anaerbicas. Muchas especies poseen flagelos y por lo tanto son mviles.
Caractersticas tales como la motilidad, as como ciertas propiedades bioqumicas,
incluyendo la capacidad de sintetizar una enzima conocida como la ornitina
descarboxilasa, se utilizan para distinguir Enterobacter desde los muy similares y
estrechamente relacionados Klebsiella bacterias.
El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa
con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est
conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y
Klebsiella.
Las bacterias Gram-negativas aparecen rosadas o rojas bajo el microscopio. Incluyen E.
coli, Campylobacter, E. aerogenes forma parte del endgeno humano gastrointestinal (GI)
microflora. Tambin reside en el suelo, el agua y en los productos lcteos.
Existe un conjunto de medios de cultivo que son muy usados para la identificacin de
bacterias. La siembra de este conjunto o batera de pruebas bioqumicas debe realizarse a
partir de colonias aisladas.

MATERIALES Y SUSTANCIAS

EQUIPOS Y MATERIALES
Balanza analtica
Pipetas
Autoclave
Peras
Incubadora
Porta objetos
Calentador- agitador Asas (en punta y
redonda)
Cabina de flujo
laminar
Pastilla agitadora
Mechero
Campana de
Durham
Mortero
Algodn
Matraz Erlenmeyer
Gasa
Caja Petri
Papel kraft
Cuchara metlica
Piola nailn
Tubos de ensayo
Cinta adhesiva de
Gradilla
papel.
Vidrio reloj
Probeta

SUSTANCIAS Y REACTIVOS

Agua residual (Muestra #1)

Queso macerado (Muestra#2)
Agua destilada
Agua peptonada
Agar verde brillante.
(Muestra #1)

Agar Mc Conkey (Muestra #1

y #2 )

Agar EMB (Muestra # 2)

Caldo Billis verde brillante
Agar TSI
Cristal violeta
Reactivo de kovac

Muestra # 1
(Agua Residual)

PROCEDIMIENTO
1. Se esterilizaron todos los materiales y equipos previos a la prctica, esto se lo
realiz en la autoclave y en la estufa.
Etapa N1 Obtencin De La Muestra Agua Residual.
2. La Muestra #1 fue obtenida de la poza de oxidacin de Santa Ana, de la cual
hemos utilizado 90ml.
Etapa N2 Preparacin de las soluciones.
3. Preparamos 250ml de nuestro medio de enriquecimiento que es el agua de
peptona.
4. Cada tubo enroscable se llen con 10 ml de agua peptonada para las disoluciones
en serie de cada muestra con sus respectivas replicas.
5. Para la prctica se utiliz Agar Mc Conkey 12.5 gr en 250ml de agua destilada y
el Agar Verde Brillante 17.4 gr en 300ml de agua destilada.
6. Luego se lo lleva a la autoclave por 15min a una temperatura de 121 C tanto los
tubos enroscables y los agares para el cultivo.
Etapa N 3 Pre-Enriquecimiento
7. Luego se procede a llenar los tubos enroscables que con 10 ml de agua peptonada,
esto se lo hace en 2 series de 4
8. Para la primera serie, se procedi a llenar 2 tubos con 10 ml de la muestra lquida
de agua residual en 10 de agua peptonada, luego se agita cada muestra y se rotula
el tubo.
9. Para la siguiente serie de 10-1 se procede a llenar 1 ml de la muestra en los tubos
que contienen agua peptonada.
10. Para la muestra de 10-2 se toma 1ml de la muestra anterior (la de 10-1) y se la
coloca en el siguiente tubo.
11. Para las siguientes series se procede igual que en la muestra anterior de 10-2 con
10-1, hasta llegar a la serie 10-4.
12. Estas muestras se la llevan a la incubadora a una temperatura de 37C por 24h.
Etapa N 4 Siembra En Los Medios De Cultivo
13. Una vez llenado cada tubo se procede a coger inculos del caldo pre-enriquecido
(mezcla de agua peptona y el agua residual) con una asa redonda y se siembra
haciendo estras (con el fin de llevar a cabo el aislamiento) en los medios Agar
Verde Brillante y McConkey ya llenos y gelificados dentro de la cabina de flujo
laminar.
14. Estas muestras se la llevan a la incubadora a una temperatura de 37C por 24h.
15. Se observa los resultados a las constantemente, para observar la formacin y
desarrollo de bacterias.

Etapa N 5 Pruebas Bioqumicas

16. Se prepara el Triple Sugar Iron Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada, el SIM
Medium Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada y Simmons Citrato Agar 2.3
gr en 100 ml de agua destilada. Revuelva para mezclar bien.
17. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente.
18. Esterilizar en la autoclave a 121 grados C durante 15 minutos.
19. Enfriar a 45-50 grados C.
20. Una vez que hemos tenido la siembra con nuestros respectivos medios de cultivo
tomamos una muestra de nuestra bacteria procedemos a llevar nuestro medio
identificador como es el agar TSI, SIM Medium y SIM
21. Flamear el asa de platino en el mechero de bunsen.
22. Enfriarlo y pasarlo por encima de la caja Petri.
23. Sacar los tapones de los tubos de TSI y SIM
24. Introducir al fondo del tubo el asa de platino.
25. Llevarlos a la incubadora a una temperatura de 37 C.
26. Observar los resultados a las 18 horas.
El TSI nos permite la diferenciacin de Enterobacteriaceae por su capacidad para
fermentar la glucosa, lactosa y sacarosa, y producir sulfuro de hidrgeno.
El SIM se recomienda para su uso en la diferenciacin de bacilos entricos gram-negativa
basada en la utilizacin de citrato. Nos permite ver una coloracin azul oscuro con su
resultado positivo y si no hay coloracin y hay un desnivel de este tambin significa que
hay presencia de nuestra bacteria enterobacter.
El SIM Medium se recomienda para la diferenciacin de bacilos entricos gramnegativas, sobre la base de la produccin de sulfuro, formacin de indol, y la motilidad.

CLCULOS
Agua Peptonada Agar
15 gr
?

1000 ml
250 ml

= 3.75 gr

50 gr
?

1000 ml
250 ml

= 12.5 gr

58 gr
?

1000 ml
300 ml

= 17.4 gr

60 gr
?

1000 ml
100 ml

= 6.5 gr

Mc Conkey Agar

Verde Brillante Agar

Triple Sugar Iron Agar

Sim Medium Agar

30 gr
?

1000 ml
250 ml

= 8.75 gr

23 gr
?

1000 ml
100 ml

= 2.3 gr

Simmons Citrato Agar

RESULTADOS
En el Control microbiolgico para observar os siguientes resultados fueron obtenidos a
partir de cepas patrn, despus de incubacin a temperatura de 37C y observados a las
24 horas.
MacConkey Agar
MICROORGANISMO

DESARROLLO

Enterobacter

Bueno

COLOR DE
COLONIA
Rosa-rojo

CONFIRMACIN

COLOR DE
COLONIA
Amarillo verdoso

CONFIRMACIN

Positivo

Verde Brillante, Agar

MICROORGANISMO

DESARROLLO

Enterobacter

Bueno

Positivo

En las Pruebas Bioqumicas se va observar si hay presencia de la bacteria Enterobacter

y si hay fermentacin de lactosa o sacarosa, productora de gas y viraje por cambio de
color.

PRUEBAS BIOQUMICAS

TSI
ENTEROBACTER
Aislamiento en MacConkey Agar
1era Muestra

Replica

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

Fermentacin de Glucosa

Fermentacin de Lactosa

Fermentacin de Sacarosa

Produccin de SH2

PRUEBAS BIOQUMICAS

TSI
ENTEROBACTER
Aislamiento en Verde Brillante, Agar
1era Muestra

Replica

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

Fermentacin de Glucosa

Fermentacin de Lactosa

Fermentacin de Sacarosa

Produccin de SH2

Presencia de gas

PRUEBAS BIOQUMICAS

Sim Medium Agar

ENTEROBACTER

10-1

Fermentacin de Glucosa
Fermentacin de Lactosa
Fermentacin de Sacarosa
Produccin de SH2

Aislamiento en MacConkey Agar

1era Muestra
Replica
10-2
10-3
10-4
10-1
10-2
10-3

PRUEBAS BIOQUMICAS

10-4

SIM
ENTEROBACTER
Aislamiento en Verde Brillante, Agar
1era Muestra

Fermentacin de Glucosa
Fermentacin de Lactosa
Fermentacin de Sacarosa
Produccin de SH2

Replica

10-1

10-2

10-3

10-4

10-1

10-2

10-3

10-4

+
+
+

*
*
*
*

+
+
+

*
*
*
*

+
+
+

+
+
+

*
*
*
*

*
*
*
*

Muestra # 2
(Queso Macerado)

PROCEDIMIENTO
1. Se esterilizaron todos los materiales y equipos previos a la prctica, esto se lo
realiz en la autoclave y en la estufa.
Etapa N1: Obtencin De La Materia Prima
2. Nuestra materia prima fue el queso comprado en un local (tienda), ubicada en la
parroquia primero de mayo en la calle nueva y av. Universitaria.
Etapa N2 Preparacin De La Muestra y Agares
3. Nuestra muestra que es el queso fue cortado en rodajas pequeas, se lo coloca en
el recipiente estril, luego fue llevada a maceracin en temperatura ambiente
durante aproximadamente 3 das esto es para que la flora bacteriana se propague.
4. Para la prctica se utiliz Agar Mc Conkey 12.5 gr en 250ml de agua destilada y
el Agar EMB 11.25 gr en 300ml de agua destilada.
5. Luego se lo lleva a la autoclave por 15min a una temperatura de 121 C tanto los
tubos enroscables y los agares para el cultivo.
Etapa N 3 Pre-Enriquecimiento
6. Se pesan 10g de queso macerado luego se le coloca los 90ml de agua de peptona
esto se lo agito manualmente y luego se lo lleva a incubar por 24h a una
temperatura de 37 C.
Etapa N 4 Siembra En Los Medios De Cultivo
7. Se tomaron inculos del caldo pre-enriquecido (mezcla de agua peptona y queso)
con una asa redonda y se sembr por el mtodo de estras (con el fin de llevar a
cabo el aislamiento) en los medios EMB y McConkey, sometindolos a
incubacin posteriormente a 37C por 24h.
Etapa N 5 pruebas bioqumicas
8. Se prepara el Triple Sugar Iron Agar 6.5 gr en 100 ml de agua destilada,
Simmons Citrato Agar 2.3 gr en 100 ml de agua destilada. Revuelva para
mezclar bien.
9. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente.
10. Esterilizar en la autoclave a 121 grados C durante 15 minutos.
11. Enfriar a 45-50 grados C.
12. Una vez que hemos tenido la siembra con nuestros respectivos medios de cultivo
tomamos una muestra de nuestra bacteria procedemos a llevar nuestro medio
identificador como es el agar TSI y SIM
13. Flamear el asa de platino en el mechero de bunsen.
14. Enfriarlo y pasarlo por encima de la caja Petri.
15. Sacar los tapones de los tubos de TSI y SIM
16. Introducir al fondo del tubo el asa de platino.
17. Llevarlos a la incubadora a una temperatura de 37 C.
18. Observar los resultados a las 18 horas.

El TSI nos permite Capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa
y lactosa en un nico medio y tambin nos Permite la identificacin de la produccin de
SH2.
El SIM nos permite ver una coloracin azul oscuro con su resultado positivo y si no hay
coloracin y hay un desnivel de este tambin significa que hay presencia de nuestra
bacteria Enterobacter.

CLCULOS
Agua Peptonada Agar
15 gr
?

1000 ml
250 ml

= 3.75 gr

50 gr
?

1000 ml
250 ml

= 12.5 gr

37.5 gr
?

1000 ml
300 ml

= 11.25 gr

60 gr
?

1000 ml
100 ml

= 6.5 gr

23 gr
?

1000 ml
100 ml

= 2.3 gr

Mc Conkey Agar

EMB Agar

Triple Sugar Iron Agar

Simmons Citrato Agar

RESULTADOS
En el Control microbiolgico para observar os siguientes resultados fueron obtenidos a
partir de cepas patrn, despus de incubacin a temperatura de 37C y observados a las
24 horas.
MacConkey Agar
MICROORGANISMO

DESARROLLO

Enterobacter

Bueno

COLOR DE
COLONIA
Rosa-rojo

CONFIRMACIN

COLOR DE
COLONIA
verde brillante

CONFIRMACIN

Positivo

EMB, Agar
MICROORGANISMO

DESARROLLO

Enterobacter

Bueno

Positivo

En las Pruebas Bioqumicas se va observar si hay presencia de la bacteria Enterobacter

y si hay fermentacin de lactosa o sacarosa, productora de gas y viraje por cambio de
color.
PRUEBAS
BIOQUMICAS

TSI
ENTEROBACTER
Aislamiento en MacConkey Agar

Fermentacin de
Glucosa
Fermentacin de
Lactosa
Fermentacin de
Sacarosa
Produccin de SH2
Presencia de gas

Aislamiento en EMB Agar

2da Muestra

Replica

2da Muestra

Replica

PRUEBAS
BIOQUMICAS

Sim Medium Agar

ENTEROBACTER
Aislamiento en MacConkey Agar

Aislamiento en EMB Agar

2da Muestra

Replica

2da Muestra

Replica

Produccin de SH2

Presencia de gas

Formacin de Idol

Motilidad

PRUEBA CONFIRMATIVA DE
MICROORGANISMOS COLIFORMES
TOTALES
1. Llenar los tubos de ensayos enroscable con campanas de Durham dentro de cada
uno.
2. Pesar y disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos
se parte de un preparado comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante
aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin deseada de
los mismos.
3. Llenar los tubos con 10 ml de la sustancia (Caldo de Lactosa).
4. Esterilizar las disoluciones en el autoclave a 121C en un tiempo de 15 minutos,
una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de
contaminantes esto depender de la forma en que vaya a utilizarse el medio.
5. Retirar los materiales del autoclave y los llevamos a la cabina de flujo laminar es
aqu donde se realiza la manipulacin, esperamos que todas las sustancias estn
en la temperatura deseada.
6. Observar que ningunos de los tubos de ensayos tengan gases dentro de la campana
de Durhan.
7. Procedemos a colocar la muestra de agua residual en los tubos que contienen las
sustancia del caldo de Lactosa con una cantidad de 1ml, 0.1 ml y 0.01ml de la
concentracin de la muestra.
8. Las llevamos a la incubadora por 24 horas pasado ese tiempo se observa los
coliformes totales que se formaron en cada una de las muestras.

RESULTADOS
# SERIE
Serie 1 (1 ml)
Serie 2 (0.1 ml )
Serie 3 (0.01)

TUBO 1

TUBIO 2

TUBO3

TOTAL

+
+
+

+
-

+
+
-

3
2
1

NMP de Coliformes Totales 150/100 ml

CONCLUSIONES GENERALES
De acuerdo con nuestras muestras liquida y slida (agua de canal y de
queso macerado) nos damos cuenta con cada uno de sus anlisis y
resultados que hay presencia de Enterobacter.
Se concluye que debido al anlisis adecuado de nuestro proyecto se
pudo poner en prcticas las tcnicas de siembra aprendidas en clase
para la identificacin y clasificacin de la Enterobacterias.
Se comprob los conceptos ya conocidos de dicha bacteria siendo esta
una bacteria Gram negativa, no mvil, siendo fermentadora de lactosa
y causante patognica la cual puede volverse muy grave y hasta mortal
dependiendo en el cuerpo que use para su reproduccion si no es tratada
a tiempo; y su transmisin es va oral-fecal.
Las pruebas bioqumicas indican el metabolismo microbiano de las
bacterias para vivir y reproducirse, as de esta manera se puede
facilitar su identificacin.
Durante el periodo de incubacin de la bacteria se pudo determinar la
presencia de diferentes UFC de otras bacterias entre ellas la ms
visible la Enterobacter entre otras.

El medio de cultivo utilizado nos permiti identificar las UFC ya que

con (McConkey, verde brillante, EMB Agar) nuestra bacteria de
estudio se torna rosada.

RECOMENDACIONES GENERALES
Se recomienda tomar las debidas precauciones de las reglas del laboratorio
mandil, guantes y mascarilla por la atmosfera no tan estril que se presenta durante
la realizacin del proyecto.
Esterilizar muy bien los materiales.
Al realizar las disoluciones con la mayor exactitud.
Utilizar la debida proteccin y asepsia en los equipos del laboratorio de
Microbiologa.
Emplea los reactivos reveladores en orden y en buen estado.
Tenemos que tomar las precauciones adecuadas en cada prctica sin importar el
grado de peligrosidad que se presenten.
En el momento de preparar el agar y todas las soluciones de la prctica leer las
instrucciones que vienen marcadas en el envase del agar. Ya que hubo muchos
problemas al momento de preparar el agar y no dejar que el medio de cultivo
hierva demasiado ya que se puede subir y ensuciar los equipos lo que puede causar
el dao de los mismos.
Para que nuestra siembra sea de mayor eficacia realizarla dentro de la cabina de
flujo laminar as se evita la contaminacin de las muestras como del medio de
cultivo.
Al momento de terminar la prctica se deben dejar todos los materiales y equipos
limpios y en su debido lugar para su posterior uso.
Avisar cuando se desea la entrada al laboratorio, para que haya la debida
supervisin.

BIBLIOGRAFA
Abbot S (1999) Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, and Berratia. En: Murray P,
Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken (Ed), Manual of Clinical Microbiology.
7th edition. ASM Press, Washington, Estados Unidos de Amrica, p. 475-482.
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/685512/Enterobacter
Sanders E, Sanders C (1997) Enterobacter: a pathogen poised to flourish at the
turn
of
the
century.
Clin.
Microbiol.
Rev.
10:
220241.http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Enterobacterias_Me
dicine2010.pdf
https://books.google.com.ec/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA37&lpg=PA37&
dq=enterobacter+aerogenes+en+a
http://es.slideshare.net/carolinacartagenad/cultivo-y-aislamiento-de-bacterias
http://scholar.google.com.ec/scholar?q=enterobacterias+en+aguas+residuales&h
l=es&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholart
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-enplaca_6527.pdf.
http://www.qo.fcen.uba.ar/quimor/wp-content/uploads/2013/09/GUIA-TPCONTROL-2013.pdf.

ANEXOS
MUESTRA # 1

Preparacin del
medio de cultivo