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GE J Port Gastrenterol.

2013;20(6):250---254

www.elsevier.pt/ge

ARTIGO ORIGINAL

Determinac
o das diferentes estirpes de Clostridium difcile num
grupo de doentes com infecc
o causada por esta bactria
Cludia Cardoso a, , Ricardo Freire a , Jesuna Duarte b , Mnica Oleastro c ,
Andrea Santos c , Joo Carlos Rodrigues c , Isabelle Cremers a e Ana Paula Oliveira a
a

Servico de Gastrenterologia, Centro Hospitalar de Setbal, Setbal, Portugal


Servico de Patologia Clnica, Centro Hospitalar de Setbal, Setbal, Portugal
c
Departamento de Doencas Infecciosas, Instituto Nacional de Sade Doutor Ricardo Jorge, Lisboa, Portugal
b

Recebido a 28 de agosto de 2012; aceite a 17 de janeiro de 2013


Disponvel na Internet a 12 de novembro de 2013

PALAVRAS CHAVE
Clostridium difcile;
Ribotipagem;
Electroforese em gel
por capilaridade

Resumo
Introduco: Nos ltimos anos tem-se vericado uma incidncia crescente da doenc
a associada
a Clostridium difcile (DACD). A caracterizac
o molecular das vrias estirpes tem permitido o
reconhecimento de determinados ribotipos da bactria associados a uma maior virulncia.
Objetivo: Isolamento e caracterizac
o molecular das estirpes de Clostridium difcile responsveis por DACD e a sua correlac
o clnica numa srie hospitalar.
Material e mtodos: Anlise prospetiva de doentes consecutivos com DACD, includos durante
um perodo de 18 meses. Foi realizada a colheita de dados epidemiolgicos, clnicos e laboratoriais. Aps exame cultural das fezes, todas as estirpes da bactria foram caracterizadas
geneticamente, por detec
o do gene gluD, especco da espcie, e dos genes codicantes das
toxinas A e B. Posteriormente, as estirpes foram genotipadas, com determinac
o do ribotipo,
por amplicac
o por PCR da regio intergnica RNAr16S-23S e separac
o por eletroforese em
gel por capilaridade.
Resultados: Foram includos 20 doentes, 65% do sexo feminino, com uma idade mdia de
73 anos. A maioria dos doentes adquiriu a infec
o em contexto nosocomial e apresentava
histria de antibioterapia prvia. O diagnstico de DACD ocorreu, em mdia, ao 7. dia de
internamento. Todas as estirpes foram conrmadas como sendo Clostridium difcile, produtoras das toxinas A e/ou B. Foi possvel obter um perl de ribotipo em 17 estirpes, no tendo sido
identicada nenhuma dominante. Os ribotipos mais observados foram o R014, o R027, o R126 e
o R501, cada um detetado em 2 doentes. Foram ainda isolados 3 novos pers, sem homologia na
base de dados. No houve correlac
o entre a gravidade da doenc
a e os ribotipos identicados.
Concluses: Na nossa casustica no se isolou nenhum ribotipo dominante, observando-se 2
casos causados pela estirpe hipervirulenta R027. No se vericou associac
o entre a gravidade
da doenc
a e os ribotipos isolados.
2012 Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos os
direitos reservados.

Autor para correspondncia.


Correio eletrnico: claudiamarcal@gmail.com (C. Cardoso).

0872-8178/$ see front matter 2012 Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos os direitos reservados.

http://dx.doi.org/10.1016/j.jpg.2013.01.002

Determinao das diferentes estirpes de Clostridium difcile

KEYWORDS
Clostridium difcile;
Ribotyping;
Pulsed eld gel
electrophoresis

251

Clostridium difcile strain stypes determination in patients infected with this


bacteria
Abstract
Introduction: The incidence of Clostridium difcile- associated disease (CDAD) has increased in
the last years. Molecular analysis of the different strains of this bacteria has identied specic
ribotypes associated with a more severe disease.
Aim: Molecular characterization of Clostridium difcile strains isolated from consecutive inpatients with CDAD and its correlation with clinical outcome.
Material and methods: A prospective analysis of consecutive patients with CDAD recruited
during 18 months. Epidemiological, clinical and laboratory data were collected. After stool
culture, the isolates were genetically characterized with primers for gluD, tcdA and tcdB
genes. The strains were then typed by PCR ribotyping, with primers for rRNA16S-23S genes,
and capillary gel electrophoresis analysis.
Results: 20 patients were included, 65% were female. Their mean age was 73 years. In the
majority of cases the infection was nosocomial and there was a history of antibiotic therapy
intake. All strains were conrmed as toxins A and/or B producing Clostridium difcile. Ribotypes
R014, R027, R126 and R051 were the most common strains. There was no correlation between
isolated strains and the severity of the disease.
Conclusions: In our series, there was a lack of association between clinical outcome of Clostridium difcile-associated diarrhea and the several strains identied.
2012 Sociedade Portuguesa de Gastrenterologia. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights
reserved.

Introduc
o
O Clostridium difcile (C. difcile) uma bactria gram
positiva anaerbia que se encontra presente na ora intestinal de 3% da populac
o adulta saudvel.
Existem, no entanto, vrias condic
es que podem afetar
a ora intestinal e predispor a doenc
a associada a C. difcile
(DACD) no Homem.
O espectro clnico da DACD varia desde o portador
assintomtico (cuja prevalncia atinge os 35% em doentes
hospitalizados) at colite pseudomembranosa grave com
megaclon txico associado, cuja mortalidade se situa entre
6-30%1---3 .
Tradicionalmente, a DACD ocorre em contexto nosocomial, associada utilizac
o de antibiticos (principal factor
de risco para a infec
o), idade avanc
ada e estados de
imunossupresso. Existem, contudo, na literatura, casos
descritos de infec
o por esta bactria em populac
es da
comunidade consideradas de baixo risco4 .
A sua virulncia mediada, na maioria dos casos, pela
produc
o em simultneo de 2 toxinas, A e B, ambas codicadas por genes do locus de patogenicidade, ocorrendo a sua
transmisso por via fecal-oral e a sua disseminac
o atravs
do contacto com doentes infetados, prossionais de sade
ou superfcies contaminadas5,6 .
Nos ltimos anos, tem-se assistido, a nvel mundial, a
um aumento do nmero de casos de infec
o por C. difcile associados a doenc
a mais grave, maior resistncia aos
antibiticos, com mortalidade e taxa de recidivas mais elevadas. So conhecidos atualmente mais de 150 ribotipos e 24
toxinotipos da espcie7 . A emergncia de uma nova estirpe
de C. difcile, designada de NAP1 ou ribotipo 027, tem
sido implicada em vrios surtos de doenc
a grave na ltima
dcada quer em contexto hospitalar quer em populac
es
saudveis da comunidade. A produc
o de nveis mais

elevados de toxinas A e B, para alm de uma toxina adicional conhecida como a toxina binria, parecem conferir
uma maior virulncia8---10 .
No Centro Hospitalar de Setbal assistiu-se, em determinada altura, a um aumento da incidncia de DACD com
critrios de gravidade e com uma percentagem de recidiva
mais elevada, o que motivou o incio deste estudo inovador com o intuito de caracterizar as estirpes circulantes na
nossa Instituic
o e melhorar as recomendac
es diagnsticas,
teraputicas e preventivas na DACD.

Objetivo
Isolamento e caracterizac
o molecular das estirpes de
C. difcile responsveis por DACD e a sua correlac
o clnica
numa srie hospitalar.

Material e mtodos
Anlise prospetiva de doentes consecutivos com DACD,
includos durante um perodo de 18 meses (marc
o de 2010agosto de 2011). O estudo foi aprovado pela Comisso de
tica Hospitalar, tendo sido obtido o consentimento informado em todos os casos.
Foram includos doentes seguidos em internamento nos
Servic
os de Medicina Interna, Gastrenterologia e Nefrologia
do Centro Hospitalar de Setbal.
O diagnstico de DACD baseou-se no quadro clnico complementado por um dos seguintes achados:
- Presenc
a de toxinas A e/ou B nas fezes detetadas atravs
do mtodo de imunocromatograa (sensibilidade de 8792%).

252

C. Cardoso et al.

- Exames endoscpico e histolgico com achados sugestivos


de infec
o.
1

Foram considerados critrios de gravidade da doenc


a
a presenc
a de febre ( 38 C), leucocitose > 15.000 clulas/mL, hipoalbuminmia de novo < 3,5 g/dL, megaclon
txico, spsis grave/choque sptico, perfurac
o intestinal
e morte.
Aps exame cultural das fezes em meio seletivo Oxoid
todas as estirpes da bactria foram caracterizadas geneticamente, por detec
o do gene gluD, especco da espcie,
e dos genes codicantes das toxinas A e B. Posteriormente,
as estirpes foram genotipadas, com determinac
o dos ribotipos por amplicac
o por PCR da regio intergnica RNAr16S23S e separac
o por eletroforese em gel por capilaridade.
A denominac
o de cada estirpe foi realizada atravs da
homologia com os padres de migrac
o das estirpes inseridas
na base de dados europeia (http://webribo.ages.at), onde
se encontram registados todos os ribotipos conhecidos at
ao momento.
O estudo decorreu em parceria com o Instituto Nacional
de Sade Doutor Ricardo Jorge.

Resultados
Foram includos 20 doentes, 65% do sexo feminino, com uma
idade mdia de 73 anos (32-89).
A infec
o foi adquirida em contexto nosocomial em 85%
dos casos. Todos os doentes se encontravam sob antibioterapia. As principais doenc
as infeciosas que motivaram a
necessidade de antibioterapia foram a respiratria e a urinria (g. 1). As classes de antibiticos mais utilizadas foram
as penicilinas, carbapenems, quinolonas e cefalosporinas
(g. 2). O nmero mdio de antibiticos por doente foi de 2.
Trs doentes adquiriram a doenc
a em ambulatrio, sem
fatores de risco identicados para infec
o.
O diagnstico de DACD ocorreu em mdia ao 7. dia de
internamento. A diarreia aquosa foi a forma de manifestac
o
da doenc
a em todos os casos, com um nmero mdio de
7 dejec
es/dia. As principais alterac
es analticas foram
a leucocitose (55%), com valores inferiores a 15.000 clulas/mL, e a hipoalbuminmia (85%), com um valor mdio de

Penicilina

Carbapenem
10

Quinolona

4
Cefalosporina
Aminoglicosdeo
4
4

Macrlido
Metronidazol

Figura 2

Classe de antibitico.

2,7 g/dL (g. 3). No entanto, os baixos nveis de albumina j


se vericavam previamente ao incio da DACD, em relac
o
provvel com as intercorrncias infeciosas que motivaram o
incio de antibioterapia e a baixa ingesta alimentar.
No se registaram casos de DACD com critrios de gravidade.
Todas as estirpes eram produtoras de toxina A e, na maioria dos casos, de toxina B em simultneo.
Onze doentes foram submetidos a rectossigmoidoscopia,
a qual revelou aspetos sugestivos de colite pseudomembranosa, caracterizada por placas esbranquic
adas a recobrir
a mucosa do reto e/ou sigmide, conrmada histologicamente, em 6 casos, e eroses, em 3 casos, no se vericando
alterac
es da mucosa na extenso observada em 2 doentes.
O metronidazol foi a antibioterapia de primeira linha utilizada em todos os doentes na dose de 500 mg 8/8 h, na
maioria dos casos administrada por via oral (n = 16) e,
na sua ausncia, por via endovenosa (n = 4). Dada a ausncia
de melhoria nas primeiras 72 h em 3 doentes sob antibioterapia por via endovenosa, o esquema antibitico foi
alterado para vancomicina, com resoluc
o do quadro (g. 4).
A durac
o do esquema teraputico foi de 10 dias.
A caracterizac
o gentica conrmou que todas as estirpes eram produtoras de toxina A e, em 85% dos casos, de
toxina B. A produc
o de toxina binria documentou-se em
25% dos casos, nomeadamente nos ribotipos 027, 126, 203 e
novo ribotipo 3 (g. 5).
Foi possvel obter um perl de ribotipo em 17 estirpes,
tendo sido identicados 13 pers distintos. Os mais frequentes foram os ribotipos 014, 027, 126 e 501, cada um detetado
em 2 doentes (g. 6).

Infeco
respiratria

Figura 1

Pontos de partida da infec


o.

Diarreia

100%

Dor abdominal

35%

Leucocitose

55%

Hipoalbuminmia

85%

Complicaes

0%

Figura 3

Caracterizac
o clnica/analtica.

Determinao das diferentes estirpes de Clostridium difcile

253

1
3

1
2
1
Metronidazol
2
Vancomicina

17
1
2

Figura 4

Antibioterapia para a DACD (n).


2

1
Gel agarose 2%
1

014

027

501

126

005

017

019

241

400

203

Figura 6

tcdA

Ribotipos isolados.

tcdB
cdtB
cdtA
gluD

Figura 5

Perl de migrac
o em gel de agarose.

Foram ainda identicados 3 novos pers de ribotipos,


designados no estudo como novos ribotipos 1, 2 e 3, sem
homologia na base de dados europeia e que aguardam
denominac
o.

Discusso
A diarreia associada a C. difcile constitu a causa mais
frequente de diarreia infeciosa nosocomial no mundo ocidental. A apresentac
o clnica e a gravidade da doenc
a so
variveis, com um espectro clnico que vai desde a diarreia
ligeira at colite grave complicada de megaclon txico,
perfurac
o intestinal, spsis e morte.
A virulncia da bactria mediada pelas enterotoxina
A e a citotoxina B, ambas codicadas por genes do locus de
patogenicidade e cuja expresso regulada pelo gene TcdR,
estimulador da expresso, e reprimida pelo gene TcdC11,12 .
Atualmente so conhecidos mais de 150 ribotipos da bactria, mas apenas alguns so enteropatogneos humanos.
A amplicac
o por PCR da regio intergnica RNAr16S-23S
e separac
o por eletroforese em gel por capilaridade o
mtodo mais utilizado a nvel europeu na identicac
o dos

vrios ribotipos, permitindo a homologia da tcnica de ribotipagem entre os vrios laboratrios13 .


Na ltima dcada, a estirpe NAP1/027 tem sido associada a surtos de doenc
a em vrios pases Europeus, Canad e
Estados Unidos, caracterizados por maior gravidade do quadro clnico, com taxas de recidivas e de mortalidade mais
elevadas. A presenc
a de mutac
es em genes que suprimem
a produc
o das toxinas A e B, como o caso do gene TcdC,
levando a uma maior produc
o de ambas, tem sido implicada
na sua maior virulncia14,10 . Para alm disso, esta estirpe
produz a toxina binria, que se pensa promover a adeso s
clulas do clon, embora o seu papel no se encontre ainda
totalmente estabelecido15 . A maior taxa de esporulac
o e
a consequente promoc
o da disseminac
o e persistncia no
meio hospitalar, bem como a resistncia s uoroquinolonas, tm sido outras das caractersticas inerentes a esta
estirpe descritas em vrios estudos. Contudo, vrias sries
mais recentes tm sugerido que, em contexto no epidmico, esta estirpe no se associa a doenc
a mais grave16---18 .
A epidemiologia molecular do C. difcile na nossa
instituic
o revelou ser diversa, com a identicac
o de
13 estirpes diferentes.
Na nossa srie o ribotipo 027 foi isolado em apenas
2 casos, ambos produtores de toxina binria. Embora seja um
nmero reduzido, os doentes infetados no apresentaram
critrios de gravidade da doenc
a, suportando a ausncia de
uma maior virulncia desta e das restantes estirpes isoladas
em contexto no epidmico.
Este o primeiro estudo a nvel nacional sobre a epidemiologia molecular da infec
o por C. difcile numa
instituic
o hospitalar e que permitiu identicar 3 ribotipos
no conhecidos a nvel mundial. Como limitac
es ao estudo
temos a amostra reduzida de doentes includos. Um estudo

254
prospetivo multicntrico que permitisse a incluso de um
maior nmero de doentes seria desejvel, com o intuito de
se determinar os ribotipos circulantes a nvel nacional e o
seu impacto clnico.
Concluindo, embora com um nmero reduzido de doentes
includos, na nossa casustica no se isolou nenhum ribotipo dominante, observando-se 2 casos causados pela estirpe
027. No se vericou associac
o entre a gravidade da doenc
a
e os ribotipos isolados. Foram detetados 3 novos pers de
ribotipos sem homologia na base de dados europeia e que
aguardam denominac
o.

C. Cardoso et al.

5.

6.

7.

8.

Responsabilidades ticas
Protec
o de pessoas e animais. Os autores declaram que
para esta investigac
o no se realizaram experincias em
seres humanos e/ou animais.
Condencialidade dos dados. Os autores declaram ter
seguido os protocolos do seu centro de trabalho acerca da
publicac
o dos dados de pacientes e que todos os pacientes includos no estudo receberam informac
es sucientes
e deram o seu consentimento informado por escrito para
participar nesse estudo.

9.

10.

11.

12.

Direito privacidade e consentimento escrito. Os autores declaram que no aparecem dados de pacientes neste
artigo.

13.

Conito de interesses

14.

Os autores declaram no haver conito de interesses.

15.

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