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I - Introduo

O termo cromatografia atribudo ao botnico russo Mikhail Tswett, que, em 1906,


empregou este termo em dois de seus trabalhos, descrevendo suas experincias na separao
dos componentes de algumas misturas. Num desses trabalhos, ele separou vrios pigmentos de
planta, como a clorofila e a xantofila, passando solues destes compostos atravs de uma coluna
de vidro recheada com carbonato de clcio finamente dividido. As espcies separadas
apareceram como bandas coloridas na coluna, o que levou a escolha do nome para o mtodo (do
grego, chroma = cor e graphein = escrever).
A cromatografia um mtodo que utiliza diversas tcnicas e tem como objetivo principal a
SEPARAO de substncias de uma mistura, com fins analticos ou preparativos. Os
componentes da mistura so distribudos por duas fases imiscveis, uma estacionria (slida ou
lquida) e outra mvel (gasosa ou lquida), que esto em contato. A separao resulta das
diferentes velocidades com que os componentes so arrastados pela fase mvel de acordo com
as diferentes interaes com a fase estacionria e, em alguns casos, com a fase mvel tambm.
A tabela abaixo mostra algumas combinaes de fases estacionrias e fases mveis:
Fase Mvel
lquido
gs
lquido
gs

Fase
Estacionria
slido
slido
lquido
lquido

Abreviatura
CLS
CGS
CLL
CGL

Mecanismo de
separao
adsoro
adsoro
partio
partio

Tipo de cromatografia
cromatografia lquida
cromatografia gasosa
cromatografia lquida
cromatografia gasosa

Cada uma dessas combinaes envolve diferentes mecanismos de separao. Por


exemplo, na CLS acontece, em geral: adsoro na superfcie do slido e interao resultante da
troca inica ou da formao de complexos. Na CGS tambm ocorre, de maneira geral, o
fenmeno da adsoro. Na CLL ocorre a partio definida pela solubilidade relativa do soluto nos
dois lquidos. Na CGL d-se a partio do soluto definida pela presso parcial de vapor do soluto
na soluo.
A fase estacionria, de forma geral, acondicionada nas chamadas colunas
cromatogrficas, que na sua maioria so tubos de vidro ou metal de dimenses diversas. Quando
essa fase um slido, basta que a coluna seja preenchida com o mesmo, de acordo com tcnicas
especiais. Por outro lado, quando a fase estacionria um lquido, esse pode tanto revestir as
paredes da coluna, no caso de colunas capilares, quanto estar aderido a um suporte slido com o
qual se enche a coluna.
A amostra introduzida na coluna e a fase mvel carreia os diversos componentes dessa
amostra atravs da coluna e, dependendo do tipo de cromatografia, pode participar ou no da
separao. Assim, a separao dos diversos componentes ser dada em funo de uma maior ou
menor afinidade de cada um deles, por cada uma das fases. Logo, o componente com maior
afinidade pela fase estacionria fica mais tempo retido na coluna, enquanto aquele que tiver mais
afinidade pela fase mvel percorrer a coluna com mais rapidez (fig. 1). Outras caractersticas
importantes na separao sero o tamanho da molcula, sua massa e, no caso da cromatografia
em fase gasosa, sua presso de vapor (ou ponto de ebulio).

FIGURA 1 - Desenvolvimento da cromatografia: (a,b,c) - ilustrao esquemtica de uma separao


utilizando cromatografia lquida; (d) - grfico representativo de fraes coletadas durante a eluio.

II As Classificaes da Cromatografia
Segundo o sistema fsico empregado

cromatografia em coluna - fase estacionria colocada dentro de um tubo cilndrico;

cromatografia planar - fase estacionria disposta sobre uma superfcie planar.

Segundo o estado fsico da fase mvel

cromatografia (em fase) gasosa a fase mvel um gs.

Cromatografia (em fase) lquida a fase mvel um lquido.

Segundo o mecanismo de separao (processos fsicos, qumicos ou mecnicos)

cromatografia por adsoro (lquido-slido, CLS) - a adsoro do soluto ocorre na interface


entre a fase estacionria slida e a fase mvel, devido presena de grupos ativos na sua
superfcie (figura 2-a);

cromatografia por partio (lquido-lquido, CLL) - quando a fase estacionria um lquido,


espalhado na superfcie de um suporte slido inerte, ou nas paredes do tubo
cromatogrfico. O processo baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da
amostra na fase estacionria e na fase mvel (figura 2-b);

cromatografia por troca inica (CTI) - a fase estacionria constituda de uma matriz onde
so adicionados grupos funcionais ionizveis. Assim so obtidos os trocadores aninicos
que tm stios ativos carregados positivamente, retendo nions, e os trocadores catinicos
que tm stios ativos carregados negativamente, retendo ctions. A fase mvel ,
geralmente, uma soluo inica com propriedades tamponantes e compatvel com o tipo
de trocador utilizado. Dessa forma, se a fase estacionria retm ctions, a fase mvel deve
conter ctions capazes de substitu-los preferencialmente (figura 2-c);

cromatografia por bioafinidade - a fase estacionria apresenta grupos com especificidade


biolgica (antgeno, enzimas, etc.) quimicamente ligados a uma matriz. A eluio dos
componentes retidos pode ocorrer com uma mudana nas propriedades da fase mvel,
2

como fora inica e pH, ou por deslocamento, usando outro grupo fortemente atrado
(figura 2-d);

cromatografia por excluso (permeao em gel ou peneira molecular) - baseia-se em


processo puramente mecnico. A fase estacionria uma matriz de composio inerte,
com partculas com forma, tamanho e porosidade uniformes. As diferentes molculas da
amostra so separadas de acordo com sua capacidade de penetrar nos poros da matriz,
conforme seu tamanho e sua forma; as menores ficam mais tempo retidas porque entram
nos poros (figura 2-e).

FIGURA 2 - Esquema dos mecanismos cromatogrficos de a: adsoro; b: partio; c: troca inica; d:


bioafinidade e e: excluso.

III Cromatografia Planar


Na cromatografia planar, a fase mvel, proveniente de um reservatrio, passa atravs do
ponto de partida da amostra ("spot") e arrasta seus componentes durante o processo de
desenvolvimento. Define-se por dr a distncia percorrida pelos componentes e por dm a distncia
percorrida pela fase mvel.

FIGURA 3 - Cromatograma tpico desenvolvido por cromatografia planar.

A anlise qualitativa de uma substncia realiza-se atravs de seu fator de reteno (Rf)
que se determina utilizando-se a expresso:
Rf = dr / dm
O Rf uma constante fsica de uma determinada substncia desde que permaneam
constantes as condies da anlise cromatogrfica.
Existem dois tipos de cromatografia planar:

Cromatografia em Papel - uma tcnica simples, que utiliza pequena quantidade de


amostra, de fcil reproduo de Rf e aplica-se, principalmente, na separao e
identificao de compostos polares. Classifica-se como cromatografia planar por partio
lquido-lquido.
A gua, um lquido bastante polar, tem grande afinidade pelas hidroxilas da estrutura da
celulose, formando pontes de hidrognio. Por isso fica retida, funcionando como fase
estacionria. Os lquidos menos polares (solventes orgnicos) so repelidos por essa
estrutura e funcionam como fase mvel (partio entre a gua e o solvente orgnico).
Normalmente, as substncias separadas so incolores, necessitando artifcios externos
para serem observadas. So utilizados mtodos qumicos e fsicos para detectar as
substncias separadas.
QUMICOS: soluo reveladora ou agente cromognico.

FSICO: muitas substncias orgnicas absorvem radiaes de luz ultravioleta tornando-se


fluorescentes.

Cromatografia em Camada Delgada - consiste na separao dos componentes de uma


mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido
sobre uma superfcie plana. uma tcnica de fcil execuo, que fornece separaes em
breve espao de tempo, verstil, de boa reprodutibilidade e de baixo custo.
O processo de separao est fundamentado, principalmente, no fenmeno de adsoro.
Entretanto, usando fases estacionrias tratadas, pode ocorrer tambm por partio ou
troca inica, o que permite maior versatilidade.
Os adorventes mais usados so slica, alumina, celulose e poliamida.
Aps o desenvolvimento do cromatograma as placas so secas e reveladas. Assim como
na cromatografia em papel, tambm podem ser utilizados agentes cromognicos ou luz
UV, de acordo com a amostra analisada. Para compostos orgnicos muito utilizada a
exposio da cromatoplaca a vapores de iodo em recipiente fechado, resultando em
manchas marrons (iodo adsorvido por compostos orgnicos). A grande vantagem desse
mtodo que o iodo, na maioria dos casos, pode ser eliminado posteriormente atravs de
aquecimento brando.

IV Cromatografia em Coluna
Para facilitar o entendimento dos parmetros aplicados cromatografia em coluna,
usaremos como exemplo a cromatografia clssica em fase lquida. No entanto, os mesmos podem
ser aplicados a qualquer tcnica cromatogrfica realizada em coluna.
Os mtodos lquido-slido (adsoro), lquido-lquido (partio), troca inica e excluso
podem ser realizados numa coluna recheada. A cromatografia em coluna por adsoro , em
geral, a primeira a ser realizada porque tecnicamente mais simples, no exigindo
instrumentao esmerada. Dependendo do tamanho da coluna usada facilmente aplicada para
fins preparativos, devendo ser monitorada, principalmente, por cromatografia em camada delgada.

FASE MVEL

AMOSTRA
FASE
ESTACIONRIA

DIREO DO
FLUXO DA
FASE MVEL

COLUNA (METAL
OU VIDRO)

BANDAS
SEPARADAS

MATERIAL DE
RETENO

ELUIO DAS
BANDAS
SEPARADAS

r
e
s
p
d
e
t
e
c
t
o
r
tempo ou volume

Ordem de reteno: C>B>A


FIGURA 4 - Eluio de trs compostos em mistura por cromatografia em coluna e cromatograma tpico de
cromatografia em coluna.

A cromatografia clssica em coluna tem a desvantagem de produzir cauda (efeito de


difuso, resultando num pico no simtrico) e, alm disso, no apresenta boa reprodutibilidade.
Na cromatografia lquida a escolha do eluente (fase mvel) um dos passos mais
importantes, pois este no deve interagir com a fase estacionria e deve promover a separao
dos componentes da amostra. Muitas vezes necessria a utilizao de misturas de solventes ou
de diferentes solventes em seqncia.
No caso da cromatografia por adsoro, deve-se seguir uma srie gradual de eluentes, do
menos polar para o mais polar, e as substncias eluiro da coluna segundo a sua polaridade. Se o
eluente mais polar for utilizado primeiro, este ser capaz de eluir todas as substncias do interior
da coluna.

Parmetros Cromatogrficos
Coeficiente de Partio
O equilbrio de distribuio que ocorre durante o processo cromatogrfico descrito por
uma simples equao que envolve a transferncia do analito entre uma fase mvel e uma
estacionria. Para o analito A, tem-se:
AFM AFE
A constante K para esse equilbrio chamada de coeficiente de partio e definida como:
K = [A]FM / [A]FE

Tempo de Reteno - tR
O tempo de reteno o tempo que cada soluto leva para percorrer a coluna e no qual o
pico correspondente ao soluto vai aparecer. a soma do tempo gasto entre a fase estacionria e
a fase mvel. Quanto mais forte a interao entre o soluto e a fase estacionria, maior ser seu
tempo de reteno.

Tempo Morto (tempo de reteno para um composto no retido) tM


O tempo morto o tempo que um composto que no interage com a fase estacionria leva
para percorrer a coluna, fazendo isto mesma velocidade que a fase mvel. Esse valor o
mesmo para todos os compostos numa mesma corrida cromatogrfica.

Fator de Capacidade ou Fator de Reteno - k


um importante parmetro empregado para descrever as velocidades de migrao dos
analitos nas colunas. a razo entre o tempo gasto pelo soluto na fase estacionria e na fase
mvel, calculado pela equao:
k = (tR - tM) / tM = t'R / tM

Quando k muito menor que 1, a eluio ocorre to rapidamente que pode no ser
possvel a determinao do tempo de reteno. Quando k muito grande, o tempo de eluio ode
ser muito longo. Um composto no retido apresenta k = 0.

Fator de Seletividade -
O fator de seletividade de uma coluna para duas espcies A e B definido como:
= kB / k A
Onde kB o fator de capacidade da espcie mais fortemente retida, B, e kA o fator de
capacidade da espcie mais rapidamente eluda, A. Por definio sempre maior que 1.
Quanto maior que 1, mais seletivo o sistema.

= k2 / k1
= tr2 t0 / tr1 t0
FIGURA 5 - Esquema para o clculo da seletividade de um sistema cromatogrfico para dois compostos.

Eficincia da Coluna
A eficincia de uma coluna cromatogrfica medida em termos de pratos tericos. Um
prato terico pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilbrio entre as duas fases,
anlogo aos pratos tericos da teoria de destilao, e definido como:
N = L/H
onde N o numero de pratos, H a altura do prato e L a altura da coluna (geralmente em cm).
Quanto maior o nmero de pratos e/ou quanto menor a altura do prato, mais etapas de equilbrio
existiro, maior ser a eficincia e, portanto, melhor a separao. A eficincia de uma coluna est
relacionada obteno de picos estreitos no menor tempo possvel.
A coluna cromatogrfica tratada como se fosse composta de numerosas estreitas
camadas, dispostas de maneira contnua, chamadas pratos tericos. Em cada prato, o equilbrio
das espcies entre as fases mvel e estacionria acontece. O movimento do analito atravs da
coluna tratado como se ele fosse transferido da fase mvel de um prato terico para outro.
Avaliao experimental de N e H:

N = 16(tR/W)2

H=L/N

onde W a largura da base do pico cromatogrfico correspondente. Para que esses nmeros
tenham significado comparando-se duas colunas, essencial que eles sejam determinados para
um mesmo composto.

Resoluo (Rs)
A resoluo de um sistema cromatogrfico uma medida da habilidade de separar dois
analitos. Quanto maior a resoluo, menor ser a sobreposio entre dois picos. A resoluo leva
em conta a posio (tR) e a largura dos picos (w).
FIGURA 6 - Esquema para o clculo da resoluo entre dois picos.

Rs = 2[(tR)2 - (tR)1]
W1 + w2
A finalidade mais importante de qualquer separao cromatogrfica a de resolver os
componentes da amostra. Portanto, deve-se considerar os parmetros experimentais que
influenciam a resoluo. A figura 8 mostra trs cromatogramas, destacando as contribuies da
eficincia e da seletividade na resoluo. Assim, m eficincia e m seletividade resultam em m
resoluo (figura 7-a). Quando a seletividade boa, pode-se compensar a m eficincia (figura 7b). O ideal boa resoluo conquistada com boa eficincia e boa seletividade, (figura 7-c).

FIGURA 7 - Cromatogramas ilustrando a relao entre resoluo, seletividade e eficincia.

A resoluo de um sistema cromatogrfico pode ser considerada adequada para Rs 1,5.


Para a otimizao da resoluo, algumas atitudes podem ser tomadas:

aumentar N aumento no tamanho da coluna aumenta tempo.

diminuir H diminuindo o tamanho das partculas que constituem a fase estacionria.

otimizao do fator de capacidade valores para relao tima entre resoluo e tempo
gasto: k = 1 a 5.

otimizao do fator de seletividade pode ser otimizado por mudanas na composio da


fase mvel, incluindo pH e fora inica, temperatura da coluna, etc.

V - Exerccios
1) (Sec. de Estado de Sade - RJ 1995)
Duas substncias X e Y foram submetidas
cromatografia de partio em papel, usandose tiras de 20cm de comprimento. O
deslocamento do eluente foi de 16cm e os
valores encontrados de Rf foram 0,5 e 0,3,
respectivamente. Logo, as presenas de X e
Y foram observadas a uma distncia do
"spot" igual a:
(a) 2,5 e 1,5.
(b) 5 e 3.
(c) 8 e 4,8.
(d) 10 e 6.
(e) 16 e 9,6.
2) (Sec. de Estado de Sade - RJ 1995) As
substncias A e B foram submetidas
anlise cromatogrfica em camada fina e
apresentaram valores de Rf iguais a 0,38 e
0,62, respectivamente. Com esse resultado,
chega-se concluso de que:
(a) B menos retida que A.
(b) A menos retida que B.
(c) A e B tm igual polaridade.
(d) A e B pertencem mesma funo
qumica.
(e) A ficou no "spot" e B localizou-se no
"front".
3) (Prefeitura Municipal de Campos dos
Goytacazes 1996) A anlise cromatogrfica
em camada fina de uma soluo contendo as
substncias A e B foi feita utilizando-se placa
de 20cm. O eluente deslocou-se a uma

distncia de 18cm e as substncias A e B


foram observadas distantes do "spot" a 4,5 e
5,4cm, respectivamente. O Rf medido para
as referidas substncias apresentou como
respectivos valores:
(a) 0,225 e 0,27.
(b) 0,25 e 0,30.
(c) 0,775 e 0,73.
(d) 1,12 e 1,17.
(e) 4,0 e 3,33.
4) (PETROBRAS) Utilizando-se uma anlise
qualitativa por cromatografia em fase gasosa,
de uma amostra de hidrocarbonetos, obtevese o seguinte cromatograma:

10

min
12

Em relao a essa anlise, podemos afirmar


corretamente que:
(a) o cromatograma revela a presena de
quatro componentes na amostra e o
tempo de reteno dado pela altura de
cada pico correspondente.
(b) os componentes presentes na amostra
podem ser identificados com absoluta

10

certeza, comparando-se seu tempo de


reteno com os registros na literatura.
(c) os tempos de reteno dependem da
temperatura e da reprodutibilidade das
condies de anlise. Em conseqncia,
no podem ser identificados com
absoluta certeza os componentes da
amostra
somente
com
um
cromatograma.
(d) o mtodo absoluto na comprovao da
presena de determinada substncia,
devido ao tempo de reteno e forma
do pico.
(e) o mtodo no absoluto para a
comprovao
da
ausncia
de
determinada substncia, porque os
tempos de reteno e formas dos picos
podem coincidir.
5) (Casa da Moeda do Brasil 1997) A
caracterstica fundamental da cromatografia
por permeao em gel a:
(a) distribuio das molculas do soluto
entre duas fases lquidas imiscveis,
de acordo com as solubilidades
relativas.
(b) separao das substncias em
virtude dos respectivos tamanhos e
formas moleculares.
(c) partio de uma amostra entre uma
fase gasosa mvel e uma delgada
camada de lquido no voltil.
(d) partio de uma amostra entre uma
fase gasosa mvel e um slido com
grande rea superficial como fase
estacionria.
(e) fase estacionria ser apolar e a fase
mvel polar.

7)

A figura acima mostra dois mtodos


para melhorar a separao de uma mistura
hipottica de dois componentes, onde em (a)
temos o cromatograma original, com os picos
sobrepostos. Com relao cromatografia e
figura acima, julgue os itens abaixo (certo
ou errado).
(__) Em (b) as condies foram alteradas de
modo que o primeiro componente migrasse
mais lentamente e o segundo mais
rapidamente atravs da coluna.
(__) Em (b) houve melhora na separao em
conseqncia de uma melhor seletividade.
(__) Em (c) houve diminuio no
espalhamento das bandas.
(__) Somente em (b) os picos esto
resolvidos.
(__) Em (c) uma boa resoluo foi obtida com
boa eficincia e boa seletividade.
8)

6) (Skoog - p.594) As substncias A e B


apresentaram tempos de reteno de 16,40 e
17,56min, respectivamente, em uma coluna
de 30,0cm de altura. Espcies no retidas
saram da coluna em 1,30min. As larguras
dos picos (na base) so 1,11 e 1,21min,
respectivamente. Calcule:
(a) a resoluo da coluna;
(b) a altura do prato, supondo o nmero
mdio de pratos da coluna igual a 3,0
x 103.

A figura acima mostra o efeito da


variao dos solventes sobre cromatogramas
11

obtidos para uma mesma amostra. Com


relao cromatografia lquida e a figura
acima, julgue os itens abaixo (certo ou
errado).
(__) Para a maioria das situaes, as
condies utilizadas na obteno do
cromatograma (c) seriam as mais indicadas
porque este apresenta resoluo adequada
num breve tempo de anlise.
(__) Em (c) no podemos afirmar que os
cincos componentes estejam resolvidos.
(__) Modificaes na composio da fase
mvel podem promover melhor seletividade
e, conseqentemente, melhorar a resoluo.
(__) Para separaes envolvendo cidos ou
bases ionizveis, alteraes no pH da fase
mvel podem resultar numa separao mais
eficiente.
(__) Em cromatografia, quando se verifica
melhores resultados com a manipulao da
polaridade da fase mvel, podemos afirmar
que o mecanismo de separao em
desenvolvimento o de troca inica.
9)

A figura acima mostra cromatogramas


hipotticos para uma mistura de seis
componentes, ilustrando um problema geral
de eluio em cromatografia. Com relao
figura acima, julgue os itens abaixo (certo ou
errado).
(__) Nenhuma das condies utilizadas foi
capaz de separar os seis componentes.

(__) No cromatograma (b) as condies


foram
otimizadas
para
separar
os
componentes 5 e 6.
(__) Uma soluo para o problema de
separar os seis componentes em menos
tempo seria utilizar as condies de (a) e,
imediatamente
aps
a
eluio
dos
componentes 1 e 2, utilizar as condies de
(c).
(__) A resoluo em (c) foi melhor que em
(a).
(__) O componente 1 o mais retido na fase
estacionria.
10) O tipo de cromatografia no qual o
mecanismo de separao sempre o de
partio :
(a) cromatografia em coluna.
(b) cromatografia em papel.
(c) cromatografia em camada fina.
(d) cromatografia lquida.
(e) cromatografia gasosa.
11) Sobre a cromatografia por troca inica
correto afirmar que:
(a) a fase estacionria inerte.
(b) ela muito utilizada na separao
dos componentes do petrleo.
(c) os solutos retidos na fase estacionria
podem ser eludos por deslocamento,
utilizando-se outros ons de carga
oposta.
(d) a eluio dos componentes da
mistura se faz com solventes de
diferentes polaridades.
(e) a fase estacionria altamente
carregada.
12) O conhecimento da distribuio de
massas moleculares de um polmero a
melhor
maneira
de
predizer
suas
propriedades fsicas como fora, flexibilidade
e rigidez. O tipo de cromatografia mais
empregado para separao e determinao
da massa molecular de polmeros :
(a) cromatografia por excluso.
(b) cromatografia por bioafinidade.
(c) cromatografia por adsoro.
(d) cromatografia por partio.
(e) cromatografia gasosa.

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VI - Bibliografia
1. Skoog, Douglas A., Principles of instrumental Analysis, 3a. ed., Philadelphia: Saunders
College Publishing, 1985.
2. Collins, Carol H., Braga, Gilberto L. e Bonato, Pierina S., Introduo a Mtodos
Cromatogrficos, 6a ed., Campinas: Editora da UNICAMP, 1995.

VII - Gabarito
1C
4C

2A
5B

7ECCEC
10 B

8CECCE
11 E

3B
6 (a)1,0
(b)0,01cm
9ECCEE
12 A

13

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