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1 AULA PRTICA DE MICROBIOLOGIA GERAL

X
BIOSSEGURANA LABORATORIAL

RECOMENDAES GERAIS
NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
PREPARO DE MATERIAL PARA LABORATRIO PESQUISA-MICROBIOLOGIA

Profa. Dra. ANA LAURA R. ZENI BERETTA

CURSOS REA DE SADE

2014

A. RECOMENDAES GERAIS PARA OS TRABALHOS NO LABORATRIO

estudante

dever

entrar

no

laboratrio

de

aulas

prticas

de

Microbiologia

"OBRIGATORIAMENTE" usando avental de mangas longas. Lembre-se que de alguma forma


voc estar em contato com micro-organismos, e, portanto deve tomar todo cuidado para evitar se
contaminar, ou transmitir infeco s pessoas do seu convvio. A bancada de trabalho deve estar a
mais desimpedida possvel, portanto adequado que no se coloque nela cadernos, bolsas e
apontamentos que no sero utilizados durante a fase experimental, evitando assim acidentes e
deixando o local livre para manuseio do material em estudo.
Em todos os trabalhos prticos, observe os seguintes critrios:
a) Bico de Bunsen com chama azulada. A utilizao deste, visa flambar a ala ou o fio de platina
e propiciar um ambiente assptico ao redor do material que voc manusear, evitando assim
resultados indesejveis e diminuindo o risco de infeco por aspirao de partculas. Para isso, no
entanto, necessrio que voc trabalhe sentado, com a chama a sua frente e no a distncia do seu
manuseio, pois caso contrrio ela somente servir para aquecer o ambiente, ou provocar acidentes
com fogo, e esse fato indesejvel s depende do "seu cuidado".
b) Ala ou fio de platina devem ser flambadas at o rubor, antes e aps cada experimento. Saiba
que antes elas so flambadas, para evitar resultados indesejveis ao seu estudo, pois
microrganismos contaminantes do ar podem estar assentados sobre o material; e depois, a
flambagem obrigatria, pois esse material posteriormente poder contaminar outras pessoas,
como colegas, professores e o pessoal da limpeza.
c) Sempre que voc utilizar pipetas, lminas e outros materiais que no podem ser
esterilizados por calor seco (flambagem), solicitem ao professor ou tcnico presente, a orientao
quanto ao local adequado onde voc dever desprez-los. Nunca os abandone sobre a bancada,
pois voc a estar contaminando e pessoas desavisadas pagaro pelo seu descuido.
d) Sempre que houver algum acidente, como quebra de tubos ou placas com micro-organismos,
contato com material contaminado, etc..., no se desespere, pois saiba que o objetivo dos seus
instrutores de prepar-los adequadamente para os seus futuros compromissos profissionais, e no
de submet-los a riscos de infeco, o que significa dizer que voc estar trabalhando com
microrganismos vivos, porm com baixo poder patognico. No entanto, no se esquea de avisar o
instrutor presente no local, para que ele tome providncias imediatas, dependendo do caso ou
acidente, e jamais seja relaxado com os cuidados pessoais.

e) Ao final de todo trabalho prtico, no se esquea de higienizar as mos com gua e sabo
lquido e posteriormente, e se necessrio lcool 70%. Alm de ser um critrio bsico de higiene,
voc poder notar o quanto isto importante.
f) Todas as vezes que voc utilizar o microscpio, no final no se esquea de limpar as objetivas
e mant-lo livre do alcance de p. Foi atravs da manuteno adequada de instrumentos, por
colegas que lhe antecederam, que permitiu que voc hoje os utilizasse. No quebre essa cadeia.
PROCEDIMENTOS TCNICOS GERAIS
a) Como Flambar ala ou fio de platina: Procure executar esse procedimento colocando o
instrumento sobre a chama, numa inclinao aproximada de 45 e nunca em posio horizontal,
pois desta ltima forma voc estar esterilizando apenas a poro final, e geralmente voc
contamina muito mais do que isso ao introduzir a ala num tubo contaminado.
b) Como abrir o tubo de cultura: Para os destros: segure o tubo com a mo esquerda e retire o
tampo de algodo com os dedos mnimos e anelares da mo direita, deixando livre o dedo mdio,
indicador e polegar para manuseio da ala bacteriolgica ou pipeta, evitando assim deixar o
tampo sobre a bancada o que levaria sua contaminao.
c) Como abrir placas de Petri: Coloque a placa fechada sobre a bancada, com a tampa para
baixo. Retire o fundo da placa com a mo esquerda e assim voc ter a mo direita livre para
semear microrganismos na superfcie do meio de cultura.
d) Quanto as Semeaduras: Semeie o material contido numa ala ou num fio ou num "swab",
numa placa, ou em um tudo ou etc.. Voc aprender todas as tcnicas em aula prtica de tcnicas
de semeadura, aguarde.
e) Como confeccionar um bom esfregao: Desengordure a lmina, passando-a levemente pela
chama e limpando-a com papel absorvente. Coloque no centro da lmina o material a ser corado,
evitando a concentrao excessiva num nico local, mas proporcionando a obteno de um
esfregao denso (algumas vezes voc ter que usar mais que uma alada). A seguir passe pela
chama a parte oposta da lmina, para fixar o esfregao que estar pronto quando todo o material
estiver seco. No se esquea de identificar o lado da lmina onde voc fez o esfregao. A seguir,
realize a colorao desejada. Aguarde as coloraes.

B. NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

Os principais organismos estudados em Microbiologia so as bactrias, os fungos, as algas


e os protozorios. Os vrus, apesar de no serem considerados vivos, tm algumas
caractersticas de clulas vivas e por isso so estudados como microrganismos. As aulas
prticas de Microbiologia tm como objetivo ensinar ao acadmico os princpios gerais e
mtodos utilizados no estudo de microrganismos. Em laboratrio, onde se realizam
analises microbiolgicas, deve-se obedecer a uma srie de normas que visam eliminar ou
minimizar os riscos de contaminao, visto que, sempre existe a possibilidade de se estar
trabalhando com material contaminado por patgenos. Nestas aulas utilizaremos uma
variedade de bactrias, sendo algumas patognicas para o homem, portanto essencial que
as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminaes acidentais:

O uso do jaleco obrigatrio.

Cabelos longos devem ser presos de forma a no interferir com materiais.

Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula prtica.

Higienizao das mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que for
necessrio. Caso tenha ferimentos nas mos, procurar no tocar no material.

Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise.

Utilizar exclusivamente material estril para a anlise.

No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a


descontaminao, limpeza e desinfeco.

No comer, beber ou fumar no laboratrio.

Manter canetas, dedos e outros longe da boca.

No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.

Avisar ao professor em caso de contaminao acidental.

Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre


a bancada.

Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.

Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na estufa ou


despejar na pia.

Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias


inflamveis por perto.

Trabalhe sempre prximo ao fogo.

OBS: A utilizao do Bico de Bunsen essencial, pois visa a diminuio de microrganismos no


campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel
selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a
CHAMA AZUL porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante
ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de
flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As
zonas da chama so: Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para
Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto,
j podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 1
C. PREPARO DO MATERIAL PARA LABORATRIO PESQUISA-MICROBIOLOGIA-E
OUTROS
O imprevisvel e diversificado comportamento das doenas infecciosas emergentes e reemergentes
tem acarretado a discusso das condies de Biossegurana nas instituies de ensino, pesquisa,
desenvolvimento tecnolgico e de prestao de servios. A despeito do avano tecnolgico, o
profissional de sade est frequentemente exposto a riscos biolgicos e de produtos qumicos, cujo
enfrentamento est consubstanciado na adequao das instalaes do ambiente de trabalho e na
capacitao tcnica desses profissionais. O conceito de Biossegurana e sua respectiva aplicao
tm como objetivo principal dotar os profissionais e as instituies de ferramentas para o
desenvolvimento de atividades com um grau de segurana adequado seja para o profissional de
sade, o meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. Nesse sentido, podemos definir
Biossegurana como sendo a condio de segurana alcanada por meio de um conjunto de
aes destinadas a prevenir, controlar, reduzir ou eliminar riscos inerentes s atividades que possam
comprometer a sade humana, animal, vegetal e o ambiente.
Quando se trabalha com pesquisa e microrganismo patognico e oportunista necessrio conhecer
todas as normas de segurana neste laboratrio, no podendo se esquecer do principal: ROTINAS
DE DESCONTAMINAO, LIMPEZA, ESTERILIZAO E DESINFECO.

PROCEDIMENTO DE ROTINA LABORATORIAL:


Os microrganismos podem ter seu crescimento controlado por agentes fsicos e qumicos, os quais
podem atuar eliminando totalmente os microrganismos ou impedindo o seu crescimento, criando
condies nas quais eles no podem se reproduzir. Uma grande variedade de mtodos pode ser
utilizada, como por exemplo, calor, radiaes ionizantes e no ionizantes e outros. A
descontaminao, limpeza, desinfeco e esterilizao num laboratrio devem ser rigorosas, uma
vez que qualquer matria estranha pode ser uma fonte de contaminao. A contaminao significa
que os microrganismos patognicos ou oportunistas esto presentes na superfcie ou no interior de
materiais inanimados.
OBJETIVOS DA AULA:

Evitar qualquer fonte de contaminao dentro de laboratrio, ambiente hospitalar, consultrios


odontolgicos, clnicas e outros...

Observar os mtodos mais usados na rea de sade para limpeza, esterilizao e desinfeco.

Observar a rotina de um laboratrio de microbiologia com material usado

MTODOS DE ESTERILIZAO E DESINFECO


De maneira geral, podemos informar que o termo esterilizao implica no uso de agentes fsicos
e/ou qumicos para eliminar totalmente os organismos vivos de um material. Em contrapartida, o
termo desinfeco se entende pelo uso de agentes qumicos germicidas para destruio da
infeciosidade potencial de um dado material, no implicando, portanto, na eliminao total dos
organismos vivos. Todo o material utilizado para o isolamento e cultivo de microrganismos no
laboratrio , obrigatoriamente, esterilizado, como tambm todos os instrumentais utilizados em
rotina na rea de sade. Os mtodos mais usados como esterilizao e desinfeco so:
Autoclave: usada para esterilizao de meios de cultura, soluo fisiolgica, outras solues, discos
de filtrao, bem como em instrumentais odontolgicos crticos.
Estufa: Forno (Forno Pasteur): usada para vidraria, instrumentos de metal, alas Drigalski (metal
ou vidro), Swabs, algodo, gaze, etc.
Flambagem: usado para ala e fio de platina, boca de tubos de ensaio e demais frascos com meio
de cultura, de forma a manter a cadeia assptica.
Filtrao: usada para solues que no podem ser autoclavados (antibiticos, acares, enzimas,
etc). Estas solues so esterilizadas por filtrao e geralmente adicionadas aos meios de cultura
previamente autoclavados.
Fervura: mtodo de desinfeco, no ocorre a eliminao total dos microrganismos, somente
microrganismos patognicos (atinge 100C).

ROTINA PARA ESTERILIZAO E DESINFECO EM GERAL


Lavagem do material:

toda a vidraria deve ser lavada com detergente e gua,

removendo todo tipo de resduo presente. Enxaguar vrias vezes em gua e a seguir em gua
destilada.

Secagem do material:

pode ser feita a temperatura ambiente ou quando necessrio em estufa temperatura de


80/100C.

Acondicionamento do material:

colocao de tampo (algodo + gaze) nos tubos de ensaio;

colocao de algodo nos orifcios das pipetas;

confeco dos swabs;

acondicionar todo material, embrulhando em papel grau cirrgico, papel alumnio, caixas
metlicas, etc

Esterilizao:

em forno esterilizante ou autoclave.

Armazenamento do material.

lugares apropriados.

verificao da data de validade.

Esterilizao terminal:

antes de desprezar o material esterilizado para descarte.

ORIENTAES PARA PROCEDIMENTOS COM SUCESSO NO CONTROLE DE


CONTAMINAO CRUZADA NA AREA DE SAUDE:
(1) Cho
Deve limpar todos os dias utilizando um pano mido contendo desinfetante (lisoforme ou
hipoclorito de sdio de 1 a 5%).
(2) Balces e Superfcies
Deve ser desinfetado com soluo de lisoforme bruto a 1% ou hipoclorito de sdio a 1%.
(3) Vidraria
Para a limpeza das vidrarias usada soluo detergente.
3.1-Placas de Petri

Quando novas so bem lavadas com gua e sabo, secas e preparadas para esterilizao.

Quando em uso, autoclavar e escorrer todo contedo na peneira; deixar de molho por
algumas horas; lavar com gua, sabo e Bombril; deixar secar.

A tampa das placas limpas deve ser revestida com um disco de papel de filtro (para reter
gua evaporada do meio de cultura e evitar que ela se condense sobre ele).

As placas podem ser embrulhadas com papel jornal ou colocar na lata de alumnio (porta
placa).

Colocar em forno Pasteur a 160/180C por 2 horas.

3.2-Bales, frascos de Erlenmeyer, ...

Autoclavar quando usado.

Escorrer seu contedo em peneira.

Deixar de molho com gua e sabo.

Lavar em gua corrente e deixar secar bem.

Colocar tampa de rosca ou tamponar com algodo e capuz de papel (alumnio...)

Esterilizar no forno de Pasteur a 160/180C por 2 horas.

3.3-Tubos de ensaio

Autoclavar os tubos usados durante 30 minutos, Desprezar seu contedo em peneira.

Deixar de molho com gua e sabo e lavar com escovas.

Deixar secar bem e prepar-los para esterilizao, tamponando com algodo (hidrfilo).

Cobrir o algodo com papel de alumnio, ou manilha.

Colocar no forno Pasteur a 160/180C por 2 horas.

3.4-Lminas e lamnulas

Retirar o leo de imerso, quando em uso, com auxlio de algodo embebido em xilol.

Colocar em cuba contendo soluo de sabo (nunca deix-las sobre a mesa), pois assim
evita que as preparaes ressequem, dificultando a limpeza posterior.

Lavar cuidadosamente, e deixar uma noite em soluo sulfocrmica.

Secar bem.

Para esterilizao:

Embrulhar uma a uma.

Colocar dentro de uma placa de Petri ou outro recipiente adequado.

Colocar no forno Pasteur a 160/180C por 2 horas.

3.5-Pipetas
3.5.1-Pipetas Graduadas

Deixar de molho em soluo sulfocrmica.

lavar em gua corrente ou colocar no lavador automtico de pipetas e passar em gua


destilada.

Secar bem.

Colocar algodo na base.

Embrulhar uma a uma em jornal ou papel manilha ou colocar na porta-pipeta de alumnio.

Colocar no forno Pasteur a 160/180C por 2 horas.

3.5.2-Pipetas Pasteur

Colocar algodo na base.

Embrulhar uma a uma em jornal ou papel manilha ou colocar no porta-pipeta de alumnio.

Colocar no forno Pasteur a 160/180C por 2 horas para esterilizao.

As pipetas Pasteur so usadas uma vez e aps o uso, autoclavadas e desprezadas.

(4) Diversos
4.1-Ala e fio de platina

Colocar a ala ou o fio de platina na chama do bico de Bnsen.

Deixar ficar rubro.

Passar rapidamente o cabo de Koole pela chama do bico de Bnsen.

Esfriar o fio ou ala em gua destilada esterilizada ou no prprio meio de cultura.

4.2-Ala de Drigalski

Mergulhar a ala num vidro que contenha lcool.

Passar pela chama do bico de Bnsen.

Pode esfriar na tampa da placa de Petri.

4.3-Pina

Mergulhar a ponta em um recipiente que contenha lcool.


Passar pela chama do bico de Bnsen.

4.4-Cotonetes (Swabs)

Enrolar algodo na ponta do palito de madeira.

Embrulhar um a um com papel alumnio.

Colocar dentro de um tubo de ensaio e tampar esse tubo.

Colocar no forno Pasteur a 160C por 2 horas ou autoclavar a 120C, 1 atm por 30 minutos.

4.5-Palitos de Madeira

Embrulhar um por um com papel alumnio.

Colocar dentro de tubo de ensaio e tampar o tubo.

Colocar no forno Pasteur a 160C por 2 horas ou na autoclave a 120C, 1 atm. por 20
minutos.

Observaes importantes: Ala e fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer
operao de semeadura. importante que se faa o esfriamento da ala antes de ser colhido o
material.
Em relao s semeaduras feitas em tubos de ensaio, deve ser flambada a boca dos mesmos, aps
a retirada e antes da colocao do tampo de algodo. Este deve ser mantido pelo dedo mnimo da
mo direita e nunca deixado sobre a mesa do laboratrio.

As placas de Petri devero ser

manuseadas com cuidado e no podero ficar abertas no ambiente, alm do cuidado de manuse-las
sempre prximo a uma chama. Uma vez semeadas, devem ser incubadas em estufa, com a tampa
voltada para baixo.

Atividades de aprendizagem
1. A que visam as normas em laboratrio de Microbiologia?
2. Como se deve proceder em um laboratrio de Microbiologia, para assegurar a sade do
manipulador?
3. Qual a importncia da desinfeco da bancada de trabalho?
4. Qual a sequncia de tratamento necessrio aos materiais de laboratrio de Microbiologia?
5. Qual a necessidade da esterilizao do cultivo microbiolgico aps a leitura?
6. Quais os detergentes mais utilizados na lavagem de vidrarias e utenslios de laboratrio?
7. Quando usar a soluo sulfocrmica?
8. Qual o perigo do resduo de detergentes nas vidrarias?
9. Qual a relao tempo/ temperatura utilizadas para esterilizao em estufa e em autoclave?
10. Diferencie esterilizao de desinfeco?
11. Quais os agentes fsicos e qumicos utilizados na esterilizao e desinfeco?
12. Quanto de lcool e de agua devemos utilizar para obteno de 1000 ml de lcool a 70%?
13. Porque de se utilizar o lcool a 70% para desinfeco?

CONCLUSO DA AULA PRTICA:


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